DE3689384T2

DE3689384T2 - Arzneimittel zur topischen Anwendung.

Info

Publication number: DE3689384T2
Application number: DE3689384T
Authority: DE
Inventors: Valle Francesco Della; Silvana Lorenzi; Aurelio Romeo
Original assignee: Fidia SpA
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA
Priority date: 1985-04-05
Filing date: 1986-03-27
Publication date: 1994-07-07
Anticipated expiration: 2006-03-28
Also published as: FR2579895B1; AU592077B2; FI83966C; FI83966B; EP0555898A2; AU5566286A; BE904547A; DE3689384T3; EP0197718B2; NZ215676A; IT1229075B; FR2579895A1; AR245369A1; CH672886A5; ES8800055A1; EP0555898A3; ES553714A0; ZA862463B; IE64440B1; NO861331L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Arzneimittel zur örtlichen Anwendung.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0138572 offenbart Hyaluronsäurefraktionen mit pharmazeutischer Wirkung und Arzneimittel, welche diese Fraktionen enthalten. Es werden zwei Fraktionen offenbart: eine mit einem Molekulargewicht zwischen 50.000 und 100.000; und die andere mit einem Molekulargewicht zwischen 500.000 und 730.000. Die offenbarten Arzneimittel umfassen Gemische der Hyaluronsäurefraktionen mit ophthalmischen Arzneistoffen. In Chemical Abstracts 68, Nr. 27273g (1968) wird eine Untersuchung der hydrodynamischen Eigenschaften von Hyaluronsäurelösungen in Gegenwart und Abwesenheit von Corticosteron offenbart.
Die U.K. Patentanmeldung Nr. 2099826 offenbart kosmetische Zubereitungen, die Zusammensetzungen auf Hyaluronatbasis enthalten. Eine Zubereitung auf Wasserbasis umfaßt laut Beschreibung ein Gemisch von Hyaluronatfraktionen mit Protein. Die kosmetischen Zubereitungen umfassen 0,05 bis 5% der Zusammensetzung mit einem Erweichungsmittel, einem Zuckeralkohol, einem neutralen oder anionischen Polysaccharid, einem Konservierungsmittel und Wasser. Als Konservierungsmittel wird ein bakteriostatisches oder fungistatisches Mittel, das mit der Hyaluronsäure nicht reagiert oder die Hyaluronsäure nicht zersetzt, offenbart.
In Chemical Abstracts 102, Nr. 137591n (1985) werden Hautkonditionierer offenbart, die Hyaluronsäuresalze enthalten. Eine Hautlotion wird ebenfalls offenbart.
In Chemical Abstracts 80, Nr. 79756j (1974) wird die Trennung von Hyaluronat durch Adsorption an und Elution von Calciumphosphat, Bariumsulfat und Aluminiumoxid offenbart.
Die Anwendung eines örtlich wirksamen Arzneimittels kann unterstutzend wirken oder, insbesondere in der Dermatologie, Erkrankungen der Schleimhäute im allgemeinen und der Membranen der Mund- und Nasenhöhlen im besonderen, Erkrankungen des Außenohres und besonders Erkrankungen der äußeren Augenoberfläche heilen. Die Anwendung dieser örtlichen Arzneimittel ist besonders in der Kinderheilkunde und auf dem veterinärmedizinischen Gebiet empfehlenswert.
Die Vorteile der Behandlung mit den Arzneimitteln gemäß der vorliegenden Erfindung beruhen auf einem wirksameren Vehiculum für die Arzneistoffe, das durch das saure Polysaccharid des Hyaluronsäurebestandteils unterstutzt wird, und auf einer besseren Bioverfügbarkeit des Wirkstoffes, verglichen mit der Bioverfügbarkeit, die mit bekannten pharmazeutischen. Zubereitungen erzielbar ist. Außerdem haben die neuen Arzneimittel der Erfindung besondere Bedeutung für ophthalmische Arzneimittel, da aufgrund der vorstehend angeführten Eigenschaften eine zusätzliche spezielle Verträglichkeit mit dem Hornhautepithel und daher ein sehr hohes Verträglichkeitsniveau ohne Sensibilisierungswirkungen besteht. Wenn die Arzneimittel in Form konzentrierter Lösungen mit elastischviskosen Eigenschaften oder als Feststoffe verabreicht werden, ist es möglich, auf dem Hornhautepithel homogene, stabile, vollständig transparente und gut haftende Filme zu erhalten, die eine anhaltende Bioverfügbarkeit des Arzneistoffes gewährleisten, wodurch hervorragende Arzneimittel mit Verzögerungswirkung erzeugt werden.
Solche ophthalmischen Arzneimittel sind besonders auf dem veterinärmedizinischen Gebiet von außerordentlichem Wert, wenn man zum Beispiel berücksichtigt, daß derzeit keine Chemotherapeutika enthaltenden veterinärmedizinischen Spezialitäten für die augenärztliche Anwendung vorhanden sind. Tatsächlich werden üblicherweise Arzneimittel verwendet, welche für die Humananwendung bestimmt sind, und diese gewährleisten nicht immer einen speziellen Wirkungsbereich und erfüllen auch nicht die besonderen Bedingungen unter denen die Behandlung durchgeführt werden sollte.
Dies ist zum Beispiel bei der Behandlung von infektiöser Keratokonjunktivitis, ansteckender Bindehautentzündung oder IBK, einer Infektion die hauptsächlich Rinder, Schafe und Ziegen befällt, der Fall. Wahrscheinlich haben diese drei Arten spezielle ätiologische Faktoren gemeinsam. Im besonderen scheint bei Rindern der hauptsächlich beteiligte Mikroorganismus Moraxella bovis zu sein (jedoch sollten andere Ursachen virologischen Ursprungs nicht ausgeschlossen werden, wie Rhinotracheitis virus, Micoplasma, Rickettsia und Chlamydia bei Schafen und Rickettsia bei Ziegen). Die Erkrankung manifestiert sich in akuter Form und neigt zur schnellen Ausbreitung. In den Anfangsstadien ist die Symptomatologie gekennzeichnet durch Blepharospasmen und übermäßige Tränensekretion, gefolgt von eitrigem Exsudat, Konjunktivitis und Keratitis, oft begleitet von Fieber, verringertem Appetit und verringerter Milchproduktion. Hornhautläsionen sind besonders gefährlich und können in den Endstadien sogar Perforationen der Hornhaut selbst bewirken. Der klinische Verlauf variiert von einigen Tagen bis zu mehreren Wochen.
Zur Behandlung wird ein weiter Bereich an Chemotherapeutika verwendet, die sowohl örtlich (oft assoziiert mit entzündungshemmenden Steroiden) als auch systemisch verabreicht werden. Unter diesen Chemotherapeutika sind: Tetracycline, wie Oxytetracyclin, Penicilline, wie Cloxacillin und Benzylpenicillin, Sulfamide, Polymyxin B (assoziert mit Miconazol und Prednisolon), Chloramphenicol, Tylosin und Chlormycetin. Trotz ihrer scheinbaren Einfachheit stellt die örtliche Behandlung der Erkrankung immer noch ein ungelöstes Problem dar, da es sich aus welchem Grund auch immer bisher als unmöglich erwiesen hat, Augenarzneimittel mit Antibiotika- oder Sulfonamidkonzentrationen zu erhalten, die in der Tränenflüssigkeit therapeutisch wirksam sind. Dies ist im Fall von Lösungen völlig verständlich, wenn man die größtenteils zurückgelehnte Position des Kopfes dieser Tiere bedenkt. Aber es ist auch für halbfeste Arzneimittel zutreffend, da die normalerweise in ihnen verwendeten Exzipienten nicht die Eigenschaften aufweisen, die zur Haftung an der Hornhautoberfläche erforderlich sind, und sie üblicherweise keine ausreichend hohe Wirkstoffkonzentration aufweisen und keine ideale Verteilung erreichen können (das bedeutet die Gegenwart eines Verteilungsgradienten). Diese Mängel herkömmlicher Augentropfen zur ophthalmischen Anwendung wurden von Slatter et al. in "Austr. vet. J.," 1982, 59 (3), S. 69-72, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Arzneimittel zur Verfügung, umfassend
(a) einen pharmazeutischen Wirkstoff oder ein Gemisch von pharmazeutischen Wirkstoffen, geeignet zur örtlichen Anwendung; und
(b) Hyaluronsäure oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz der Hyaluronsäure, gegebenenfalls zusammen mit einem zur örtlichen Anwendung geeigneten zusätzlichen Exzipienten, mit der Maßgabe, daß der Wirkstoff keinen ophthalmischen Arzneistoff darstellt, wenn die Hyaluronsäure eine Fraktion mit einem mittleren Molekulargewicht von 50.000 bis 730.000 ist und im wesentlichen frei von Hyaluronsäure ist, die ein Molekulargewicht von weniger als 30.000 aufweist.
Es wird auch ein Arzneimittel zur örtlichen Anwendung zur Verfügung gestellt, umfassend ein Teil- oder stöchiometrisch neutrales Salz der Hyaluronsäure mit mindestens einem zur örtlichen Anwendung geeigneten pharmakologischen Wirkstoff basischer Natur.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung neuer Arten von Augentropfen, mit denen die vorstehenden Nachteile überwunden wurden. Die Verwendung von Hyaluronsäure als Vehiculum für ophthalmische Arzneistoffe erlaubt die Herstellung hervorragender Arzneimittel, die frei von Konzentrationsgradienten des Wirkstoffes und daher vollständig homogen und transparent sind, am Hornhautepithel haften, keine Sensibilisierungswirkungen aufweisen, einen hervorragenden Träger für den Wirkstoff darstellen und gegebenenfalls eine Verzögerungswirkung besitzen.
Die vorstehend angeführten Eigenschaften der neuen Arzneimittel können natürlich neben der Ophthalmologie auch auf anderen Gebieten verwendet werden. Wie bereits erwähnt können sie in der Dermatologie und bei Erkrankungen der Schleimhäute, wie der Mundschleimhäute, zum Beispiel in der Odontologie, verwendet werden. Sie können auch verwendet werden, um aufgrund der transcutanen Reabsorptionswirkung eine systemische Wirkung, zum Beispiel in Zäpfchen, zu erreichen. All diese Anwendungen sind sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin möglich. In der Humanmedizin sind die neuen Medikamente insbesondere zur Verwendung in der Kinderheilkunde geeignet. Die vorliegende Erfindung schließt insbesondere auch jede der therapeutischen Anwendungen ein.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher als wesentlichen Gesichtspunkt die Verwendung von Hyaluronsäure als Vehiculum in Assoziation mit einem pharmazeutischen Wirkstoff, wobei ein verbessertes Arzneistoff-Nachliefersystem zur Verfügung gestellt wird. Neue Arzneimittel gemäß der Erfindung enthalten im wesentlichen zwei Bestandteile:
Bestandteil (1) - ein pharmakologischer Wirkstoff, einschließlich, wie nachstehend diskutiert, Gemische verschiedener solcher Wirkstoffe.
Bestandteil (2) - Hyaluronsäure, einschließlich, wie nachstehend diskutiert, Molekulargewichtsfraktionen von Hyaluronsäure und verschiedene Salze von Hyaluronsäure oder Molekulargewichtsfraktionen davon, mit der Maßgabe, daß der Wirkstoff keinen ophthalmischen Arzneistoff darstellt, wenn die Hyaluronsäure eine Fraktion mit einem mittleren Molekulargewicht von 50.000 bis 730.000 ist und im wesentlichen frei von Hyaluronsäure ist, die ein Molekulargewicht von weniger als 30.000 aufweist.
Die vorliegende Erfindung ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß sie physikalische Gemische von Bestandteil (1) und Bestandteil (2), Komplexe des Wirkstoffes in Bestandteil (1) mit der Hyaluronsäure in Bestandteil (2) oder verschiedene Kombinationen oder Gemische davon einschließt.

Bestandteil (1) - Pharmazeutischer Wirkstoff

Der Bestandteil (1) kann erstens hinsichtlich seiner Verwendung in verschiedenen Therapiebereichen eingeordnet werden, angefangen mit der Unterscheidung zwischen Human- und Veterinärmedizin, mit anschließender Spezifizierung der verschiedenen Anwendungsbereiche unter Bezug auf die zu behandelnden Organe oder Gewebe, wie Dermatologie, Otorhinolaryngologie, Geburtshilfe, Angiologie, Neurologie oder jede Art der Erkrankung der inneren Organe, die örtliche behandelt werden kann, wie zum Beispiel rektale Anwendungen. Gemäß einem besonderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung, in dem das Arzneimittel ein Teil- oder stöchiometrisch neutrales Salz der Hyaluronsäure mit mindestens einem pharmakologischen Wirkstoff basischer Natur umfaßt, dient der pharmakologische Wirkstoff (1) zuallererst zur ophthalmischen Anwendung. Gemäß einem anderen Kriterium ist der pharmakologische Wirkstoff (1) hinsichtlich seiner Wirkung verschiedenartig und kann daher zum Beispiel als anästhesierendes, schmerzstillendes, gefäßverengendes, antibakterielles, antivirales oder entzündungshemmendes Mittel verwendet werden. Für den ophthalmischen Bereich kann er insbesondere wegen seiner miotischen, entzündungshemmenden, wundheilenden und antimikrobiellen Wirkungen angezeigt sein.
Gemäß der Erfindung kann der Bestandteil (1) auch ein Gemisch aus zwei oder mehr Wirkstoffen sein. Zum Beispiel kann in der Ophthalmologie ein Antibiotikum mit einem entzündungshemmenden und einem gefäßverengenden Mittel assoziiert sein, oder mehrere Antibiotika können mit einem oder mehreren entzündungshemmenden Mittel assoziiert sein, oder ein oder mehrere Antibiotika können mit einem pupillenerweiternden, miotischen, wundheilenden oder antiallergischen Mittel assoziiert sein. Es ist zum Beispiel möglich, folgende Assoziationen ophthalmischer Arzneistoffe zu verwenden: (a) Kanamycin + Phenylephrin + Dexamethasonphosphat; (b) Kanamycin + Betamethasonphosphat + Phenylephrin oder ähnliche Assoziationen mit anderen in der Ophthalmologie verwendeten Antibiotika, wie Rolitetracyclin, Neomycin, Gentamycin und Tetracyclin.
In der Dermatologie ist es möglich, als Wirkstoff den Bestandteil (1) oder Gemische verschiedener Antibiotika, wie Erythromycin, Gentamycin, Neomycin, Gramicidin, Polymyxin B, oder Gemische solcher Antibiotika mit entzündungshemmenden Mitteln, zum Beispiel Corticosteroide, zu verwenden. Zum Beispiel Gemische, umfassend: (a) Hydrocortison + Neomycin; (b) Hydrocortison + Neomycin + Polymyxin B + Gramicidin; (c) Dexamethason + Neomycin; (d) Fluormetholon + Neomycin; (e) Prednisolon + Neomycin; (f) Triamcinolon + Neomycin + Gramicidin + Hystatin oder jedes andere in herkömmlichen dermatologischen Arzneimitteln verwendete Gemisch. Die Gemische verschiedener Wirkstoffe sind natürlich nicht auf dieses Gebiet beschränkt, sondern in jedem der vorstehend angeführten medizinischen Gebiete ist die Verwendung von Gemischen, ähnlich den bereits für die bekannten Arzneimittel des Fachgebietes verwendeten, möglich.
Beispiele für den pharmakologischen Wirkstoff (1) zur Verwendung in ophthalmischen Arzneimitteln gemäß der Erfindung sind: basische und nicht basische Antibiotika, zum Beispiel Aminoglucoside, Macrolide, Tetracycline und Peptide, wie zum Beispiel Gentamycin, Neomycin, Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Kanamycin, Amikacyn, Tobramycin, Spectinomycin, Erythromycin, Oleandomycin, Carbomycin, Spiramycin, Oxytetracyclin, Rolitetracyclin, Bacitracin, Polymyxin B, Gramicidin, Colistin, Chloramphenicol, Lincomycin, Vancomycin, Novobiocin, Ristocetin, Clindamycin, Amphotericin B, Griseofulvin, Nystatin und gegebenenfalls deren Salze, wie Sulfate oder Nitrate, oder Gemische davon oder Gemische mit anderen wirksamen Grundbestandteilen, wie den nachstehend angeführten.
Andere ophthalmische Arzneistoffe, die gemäß der vorliegenden Erfindung vorteilhaft verwendet werden können, sind: andere infektionsverhindernde Mittel, wie Diethylcarbamazin, Mebendazol, Sulfonamide, wie Sulfacetamid, Sulfadiazin, Sulfisoxazol; antivirale und Antitumormittel, wie Ioddesoxyuridin, Adeninarabinosid, Trifluorthymidin, Aciclovir, Ethyldesoxyuridin, Bromvinyldesoxyuridin, 5-Iod-5'-amino-2',5'-didesoxyuridin; steroide entzündungshemmende Mittel, wie zum Beispiel Dexamethason, Hydrocortison, Prednisolon, Fluormetholon, Medryson und gegebenenfalls deren Ester, zum Beispiel Phosphorsäureester; nicht steroide entzündungshemmende Mittel, wie zum Beispiel Indomethacin, Oxyphenbutazon, Flurbiprofen; wundheilende Mittel, wie der epidermale Wachstumsfaktor EGF; Ijokalanästhetika, wie Benoxinat, Proparacain, und gegebenenfalls deren Salze; cholinergische agonistische (Promotor)-Arzneistoffe, wie Pilocarpin, Metacholin, Carbaylocholin, Aceclidin, Physiostigmin, Neostigmin, Demecarium, und gegebenenfalls deren Salze; cholinergische antagonistische Arzneistoffe, wie Atropin, und deren Salze; die adrenergischenagonistischen (Promotor)- Arzneistoffe, wie Noradrenalin, Adrenalin, Naphozolin, Methoxamin, und gegebenenfalls deren Salze; und adrenergische antagonistische Arzneistoffe, wie Propanolol, Timolol, Pindolol, Bupranolol, Atenolol, Metoprolol, Pindolol, Bupranolol, Atenolol, Metoprolol, Oxyprenolol, Practolol, Butoxamin, Sotalol, Budarin, Labetalol, und gegebenenfalls deren Salze.
Wie vorstehend angeführt kann der Wirkstoff-Bestandteil (1) in Form eines Gemisches aus zwei oder mehreren Wirkstoffen vorliegen. Beispiele für Wirkstoffe, die alleine oder miteinander vermischt oder mit anderen dermatologischen wirksamen Grundbestandteilen vermischt verwendet werden, sind: therapeutische Mittel, wie infektionsverhindernde, antibiotische, antimikrobielle, entzündungshemmende, cytostatische, cytotoxische, antivirale und anästhesierende Mittel, und vorbeugende Mittel, wie Sonnenschutzmittel, Deodorants, Antiseptika und Desinfektionsmittel. Von den Antibiotika sollten besonders beachtet werden: Erythromycin, Bacitracin, Gentamycin, Neomycin, Aureomycin, Gramicidin und deren Gemische; von den antibakteriellen und Desinfektionsmitteln: Nitrofurazon, Mafenid, Chlorhexidin und Derivate von 8- Hydroxychinolin und gegebenenfalls deren Salze; von den entzündungshemmenden Mitteln vor allem die Corticosteroide, wie Prednisolon, Dexamethason, Flumethason, Clobetasol, Triamcinolonacetonid, Betamethason oder deren Ester, wie Valeriansäureester, Benzoesäureester, Dipropionsäureester; von den cytotoxischen Mitteln: Bluorouracil, Methotrexat, Podophyllin; von den Anästhetika: Dibucain, Lidocain, Benzocain.
Die Liste dient natürlich nur zur Veranschaulichung, und es kann jedes andere in der Literatur beschriebene Mittel verwendet werden.
Aus den für die Ophthalmologie und die Dermatologie angeführten Beispielen kann durch Analogieschluß auf die in den vorstehenden medizinischen Gebieten zu verwendenden Arzneimittel gemäß der vorliegenden Erfindung geschlossen werden, wie zum Beispiel in der Otorhinolaryngologie oder der Odontologie oder in der inneren Medizin, zum Beispiel in der Endokrinologie, wo es möglich ist, Behandlungen mit Arzneimitteln zur intradermalen Absorption oder zur Absorption durch die Schleimhaut, zum Beispiel zur rektalen oder intranasalen Absorption, zum Beispiel mit Nasensprays oder Inhalationen in die Mund- und in die Rachenhöhle, durchzuführen.
Diese Arzneimittel können daher zum Beispiel entzündungshemmende, gefäßverengende oder gefäßerweiternde Mittel, wie sie bereits für die Ophthalmologie angeführt wurden, Vitamine, die vorstehend angeführten Antibiotika, Hormone, Chemotherapeutika, antibakterielle Mittel usw. sein, einschließlich der vorstehend zur dermatologischen Anwendung angeführten.

Bestandteil (2) - Hyaluronsäurevehiculum

Wie vorstehend angeführt enthalten die Arzneimittel der Erfindung als Bestandteil (2) Hyaluronsäure, deren Molekulargewichtsfraktionen oder verschiedene Salze davon. Hyaluronsäure (nachstehend manchmal mit "HY" bezeichnet) ist ein natürliches Heteropolysaccharid, das aus alternierenden D-Glucuronsäure- und N-Acetyl-D-glucosaminresten besteht. HY kommt in perizellulären Gelen, in der extrazellulären Grundlage von Bindegeweben in Wirbeltierorganismen, in der Synovialflüssigkeit der Gelenke, in der Glaskörperflüssigkeit, in menschlichem Umbilikalgewebe, in Hahnenkämmen und in einigen Bakterien vor. Sein Molekulargewicht beträgt etwa 8- 13 Millionen.
Die erste Untersuchung über HY wurde von Balazs (siehe US-A-4.141.973) durchgeführt, der eine HY-Fraktion isolierte, die endobulbäre Flüssigkeiten ersetzen kann und für andere therapeutische Anwendungen geeignet ist. Hyaluronsäure und deren Molekulargewichtsfraktionen mit niederen Molekulargewichten bewiesen tatsächlich eine breite medizinische Anwendbarkeit; eine kosmetische Verwendung- wird ebenfalls in Betracht gezogen (siehe zum Beispiel Balazs et al., Cosmetics & Toiletries, italienische Ausgabe Nr. 5/84). Sie wurde insbesondere als Therapeutikum in der Arthropatiebehandlung, zum Beispiel auf dem veterinärmedizinischen Gebiet zur Behandlung von Arthritis bei Pferden, verwendet (Acta Vet. Scand. 167, 379 (1976).
Hyaluronsäure und ihre Molekularfraktionen werden in der ophthalmischen Chirurgie als Therapeutika, Hilfs- und Ersatzmittel für natürliche Organe und Gewebe verwendet (siehe zum Beispiel E.A. Balazs et al., Modern Problems in Ophthalmology, 10, 3 (1970), E.B. Strieff, S. Karger, Hrsg., Basel, und Balazs et al., Viscosurgery and the Use of Sodium Hyaluronat During Intraocular Lens Transplantation, Vortrag auf dem "International Congress and First Film Festival on Intraocular Implantation", Cannes, 1979).
In der veröffentlichten europäischen Patentanmeldung Nr. EP-A-0138572, angemeldet am 10. Oktober 1984, wird eine Molekularfraktion von Hyaluronsäure beschrieben, die für intraokuläre und intraartikulare Injektionen verwendet werden kann, und als Ersatz für die endobulbären Flüssigkeiten im Auge und zur Behandlung von Arthropathie geeignet ist.
Im Gegensatz zu dieser therapeutischen Verwendung als plastischer Hilfsstoff in der Chirurgie oder der Kosmetik werden Hyaluronsäure und deren Molekularfraktionen in der vorliegenden Erfindung als Vehicula zur Verabreichung pharmakologischer Wirkstoffe bei der örtlichen Anwendung verwendet.
Als Vehiculum zur Verwendung als Bestandteil (2) der vorliegenden Erfindung kann Hyaluronsäure jeden Ursprungs verwendet werden, wie die aus den vorstehend angeführten natürlichen Ausgangsmaterialien, einschließlich Hahnenkämme, extrahierten Säuren. Die Herstellung von Rohextrakten solcher Säuren wird in der Literatur beschrieben. Vorzugsweise sollten gereinigte Hyaluronsäuren verwendet werden. Gemäß der Erfindung ist es möglich, anstelle der direkt durch Extraktion erhaltenen integralen Hyaluronsäuren deren Fraktionen mit stark variierenden Molekulargewichten, wie zum Beispiel von 90-80% (MW = 11,7-10,4 Millionen) bis 0,23% (MW = 30.000), vorzugsweise zwischen 5% und 0,23%, des Molekulargewichtes einer integralen Säure mit einem Molekulargewicht von 13 Millionen zu verwenden. Solche Fraktionen können durch verschiedene Verfahren, wie Hydrolyse, Oxidation, enzymatisch chemische Mittel oder physikalische Verfahren, wie mechanische Verfahren oder Bestrahlungsverfahren, erhalten werden und werden daher oft mit den gleichen Reinigungsverfahren erzeugt, wie die Primärextrakte (siehe zum Beispiel Balazs et al., Cosmetics and Toiletries, vorstehend zitiert). Die Trennung und Reinigung der erhaltenen Fraktionen wird zum Beispiel durch Molekularfiltration erreicht.
Von besonderer Bedeutung bei der Verwendung als Vehiculum (2) gemäß der vorliegenden Erfindung sind zwei gereinigte Fraktionen, die aus Hyaluronsäure, zum Beispiel aus Hahnenkämmen, erhalten werden können und als Hyalastin und Hyalectin bekannt sind. Die als Hyalastin bekannte Fraktion weist ein mittleres Molekulargewicht von 50.000 bin 100.000 auf. Hyalectin weist ein mittleres Molekulargewicht von 500.000 bis 730.000 auf. Eine kombinierte Fraktion dieser zwei Fraktionen, die durch ein mittleres Molekulargewicht von 250.000 bis 350.000 gekennzeichnet ist, wurde ebenfalls isoliert. Diese kombinierte Fraktion kann mit einer Ausbeute von 80% der gesamten aus dem jeweiligen Ausgangsmaterial erhältlichen Hyaluronsäure erhalten werden, während die Hyalectin-Fraktion mit einer Ausbeute von 30% und die Hyalastin-Fraktion mit einer Ausbeute von 50% der Ausgangs- HY erhalten werden kann. (Die Herstellung dieser Fraktionen wird nachstehend in den Beispielen 20-22 beschrieben.) Die vorzugsweise verwendete Hyaluronsäure ist eine Molekulargewichtsfraktion mit einem Molekulargewicht im allgemeinen im Bereich von 30.000 bis 13 Millionen, vorzugsweise von 30.000 bis 730.000. Am stärksten bevorzugt werden Hyaluronsäurefraktionen mit einem Molekulargewicht von 50.000 bis 100.000 oder von 500.000 bis 730.000 oder eine kombinierte Fraktion mit einem Molekulargewicht von 250.000 bis 350.000. Diese bevorzugten Fraktionen sind im wesentlichen frei von niedermolekularer Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von weniger als 30.000 und sind daher frei von entzündlichen Nebenreaktionen bei der Verabreichung. (Die weiteren Bezugnahmen auf Hyaluronsäure oder HY schließen, wenn im einzelnen Zusammenhang Übereinstimmung besteht, sowohl Hyaluronsäure als auch deren Molekulargewichtsfraktionen ein.) Gemäß der Erfindung ist es auch möglich, als Bestandteil (2) der Arzneimittel anstelle der Hyaluronsäuren und deren Molekulargewichtsfraktionen deren Salze mit anorganischen Basen, wie Alkalimetalle (Natrium, Kalium, Lithium), Erdalkalimetalle (Calcium, Barium, Strontium), Magnesium oder Aluminium, zu verwenden. Diese Salze können stöchiometrisch neutral sein, wobei alle Säuregruppen als Salz vorliegen, oder Teilsalze oder -säuren darstellen, wobei nur eine bestimmte Zahl der Säuregruppen mit den vorstehend angeführten Metallen als Salz vorliegt. Solche Salze werden einfach zum Beispiel durch Umsetzung von HY oder der vorstehend angeführten Fraktionen mit der berechneten Basenmenge erhalten, und es ist auch möglich, gemischte Salze mit verschiedenen Basen zu verwenden.
Zusätzlich zu den vorstehenden Salzen ist es auch möglich, Salze von HY mit Verbindungen, die allgemein als Ammonium oder substituiertes Ammonium (Amine) bezeichnet werden können, zu verwenden, zum Beispiel Mono-, Di-, Tri- und Tetraalkylammonium, mit Alkylresten mit vorzugsweise 1 bis 18 Kohlenstoffatomen oder Arylalkylresten mit der gleichen Anzahl Kohlenstoffatome im aliphatischen Teil, wobei ein Arylrest einen Benzolrest bedeutet, der gegebenenfalls mit 1 bis 3 Methylgruppen, Halogenatomen oder Hydroxygruppen, substituiert ist. Diese Ammonium- oder substituierten Ammoniumsalze von HY werden durch chemische Umsetzung von Hyaluronsäure und primären, sekundären oder tertiären Aminanteilen oder Ammoniumhydroxidanteilen von Verbindungen oder Arzneistoffen mit pharmazeutischer Wirkung, das heißt mit den Anteilen der Verbindungen, welche den Wirkstoff-Bestandteil (1) umfassen, gebildet. Wie die vorstehend angeführten Salze können auch diese Salze stöchiometrisch neutral sein, wobei alle Säuregruppen als Salz vorliegen, oder sie können als Teilsalze oder -säuren vorliegen, und sie können gemischte Salze mit verschiedenen Basen umfassen.
Hyaluronsäure oder deren Molekularfraktionen als Bestandteil (2) können daher durch deren Salze mit anorganischen Basen, wie Alkalimetalle (Natrium, Kalium, Lithium), Erdalkalimetalle (Calcium, Barium, Strontium), Magnesium oder Aluminium, Ammonium oder substituiertes Ammonium, ersetzt werden. Dieses Prinzip hat auch für die vorstehend angeführten Teilsalze der Säuren, in denen alle vorhandenen Säuregruppen teilweise oder vollständig mit den vorstehenden Metallen oder mit Ammoniak oder Aminen neutralisiert sind, Gültigkeit, wobei die Ammoniumsalze durch chemische Umsetzung von Hyaluronsäure und primären, sekundären oder tertiären Aminanteilen oder Ammoniumhydroxidanteilen der Verbindungen oder Arzneistoffe mit pharmazeutischer Wirkung, d. h. Bestandteil (1), gebildet werden.

Arzneimittel mit Kombination der Bestandteile (1) und (2)

Die verschiedenen Möglichkeiten zur Verwirklichung der Arzneimittel gemäß der Erfindung schließen ein:
(a) Verwenden eines neutralen oder sauren Wirkstoff-Bestandteils (1) als Gemisch mit Hyaluronsäure oder deren Molekulargewichtsfraktionen oder Metallsalze davon;
(b) Verwenden von Teilsalzen von HY mit einem basischen Wirkstoff-Bestandteil (1), wobei die restlichen Säuregruppen von HY frei bleiben oder mit den vorstehend angeführten Metallen oder Basen neutralisiert sind;
(c) Verwenden von stöchiometrisch neutralen Salzen von HY mit einem basischen Wirkstoff-Bestandteil (1), gegebenenfalls unter Zugabe von HY oder einem ihrer Teil- oder vollständigen (neutralen) Metallsalze;
(d) Verwenden von stöchiometrisch neutralen Salzen von HY mit einem basischen Wirkstoff-Bestandteil (1) unter Zugabe weiterer Mengen von Bestandteil (1);
(e) Verwenden von ad libitum Gemischen der vorstehend beschriebenen Salze oder Gemische.
Eine besondere Form von Arzneimittel gemäß der Erfindung stellen Gemische des pharmakologischen Wirkstoff-Bestandteils (1) mit Hyaluronsäuren oder deren Molekularfraktionen dar, wobei der Wirkstoff (1) basischer Natur ist, zum Beispiel im Falle basischer Antibiotika. In diesem Fall bilden der Hyaluronsäurebestandteil (2) und der Wirkstoff (1) stöchiometrische Teilsalze oder saure Salze, in denen ein aliquoter Teil aller Säuregruppen des HY-Bestandteils (2) mit den basischen Gruppen des Wirkstoff-Bestandteils (1) als Salz vorliegt; oder stöchiometrisch neutrale Salze, in denen alle Gruppen des HY-Bestandteils (2) als Salz vorliegen, oder Gemische dieser Neutralsalze mit einer weiteren Menge des basischen Wirkstoffes (1).
Wenn ein basischer Wirkstoff (1) verwendet wird, ist es daher möglich, für die Lösung der Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Gemische der Bestandteile (1) und (2) durch die vorstehend angeführten sauren oder stöchiometrisch neutralen Salze oder natürlich durch Gemische solcher Salze sowohl mit Bestandteil (1) als auch mit Bestandteil (2) zu ersetzen.
Als Wirkstoff-Bestandteil (1) gemäß der Erfindung können auch Gemische von Arzneistoffen untereinander und gegebenenfalls mit anderen Grundstoffen verwendet werden. Falls anstelle nur eines Wirkstoffes (1) Wirkstoffgemische, wie die vorstehend angeführten, verwendet werden, können die Salze der basischen Wirkstoffe mit Hyaluronsäure und deren Molekulargewichtsfraktionen als gemischte Salze mit einem oder mehreren solcher basischer Wirkstoffe oder gegebenenfalls als gemischte Salze dieses Typs vorliegen, wobei eine bestimmte Anzahl anderer Säuregruppen des HY-Polysaccharids mit den vorstehend angeführten Metallen oder Basen als Salz vorliegt. Es ist zum Beispiel möglich, Salze von Hyaluronsäure oder einer der Molekularfraktionen Hyalastin oder Hyalectin herzustellen, wobei ein bestimmter Prozentsatz der Säuregruppen als Salz mit dem Antibiotikum Kanamycin vorliegt und ein anderer Prozentsatz der Säuregruppen als Salz mit dem gefäßverengenden Mittel Phenylephrin vorliegt und ein verbleibender Prozentsatz der Säuregruppen frei ist oder zum Beispiel mit Natrium oder einem anderen vorstehend angeführten Metall als Salz vorliegt. Es ist auch möglich, diese Art des gemischten Salzes mit anderen Mengen Hyaluronsäure oder deren Fraktionen oder Metallsalzen davon zu vermischen, wie vorstehend für das Arzneimittel, das Salze nur eines Wirkstoffes mit den vorstehenden sauren Polysacchariden enthält, gezeigt wird.
Es ist daher gemäß einem besonderen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung möglich, die vorstehend angeführten Salze, isoliert und gegebenenfalls bis zum festen wasserfreien Zustand gereinigt, als amorphes Pulver zu verwenden. Wenn das Pulver mit dem zu behandelnden Gewebe in Kontakt kommt, bildet das Pulver eine konzentrierte wäßrige Lösung mit Gelatineeigenschaften mit viskoser Beschaffenheit und elastischen Eigenschaften. Diese Eigenschaften werden auch bei stärkeren Verdünnungen aufrechterhalten, so daß anstelle der vorstehend angeführten wasserfreien Salze Lösungen mit verschiedenen Konzentrationsgraden in Wasser oder in Salzlösung, gegebenenfalls unter Zugabe anderer pharmazeutisch verträglicher Exzipienten oder Zusätze, wie anderer Mineralsalze zur Regulierung des pH-Wertes und des osmotischen Druckes, verwendet werden können. Es ist natürlich auch möglich, die Salze zur Herstellung von Gelen, Einlagen, Cremes oder Salben zu verwenden, in denen andere, in herkömmlichen Zubereitungen dieser Arzneimittel verwendete, Exzipienten oder Bestandteile vorhanden sind. Gemäß einem besonderen Gesichtspunkt der Erfindung werden die Arzneimittel, die Hyaluronsäure, deren Molekulargewichtsfraktionen oder Mineralsalze davon oder deren Teil- oder neutrale Salze mit dem Wirkstoff (1) als alleiniges Vehiculum (mit der möglichen Ausnahme eines wäßrigen Lösungsmittels) enthalten, bevorzugt.
Die quantitativen Gewichtsverhältnisse der zwei Bestandteile (1) und (2) gemäß der Erfindung können innerhalb weiter Grenzen variieren, wobei diese natürlich auch von der Art der zwei Bestandteile und als erstes von der Art des Wirkstoffes abhängen. Solche Grenzen sind zum Beispiel die Verhältnisse 0,01 : 1 und 100 : 1 zwischen den zwei Bestandteilen (1) und (2). Der Variationsbereich liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von 0,01 : 1 bis 10 : 1 für die zwei Bestandteile, und insbesondere zwischen 0,1 : 1 und 2 : 1.
Die Arzneimittel gemäß der Erfindung können als Feststoff vorliegen, zum Beispiel als gefriergetrocknete Pulver, die nur die zwei Bestandteile als Gemisch oder einzeln gepackt enthalten.
Als Feststoff bilden solche Arzneimittel bei Kontakt mit dem zu behandelnden Epithel, abhängig von der Art des einzelnen Epithels, mehr oder weniger konzentrierte Lösungen mit den gleichen Eigenschaften wie die vorstehend in vitro hergestellten Lösungen, was einen anderen besonders wichtigen Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung darstellt. Solche Lösungen liegen vorzugsweise in destilliertem Wasser oder steriler Salzlösung vor und enthalten vorzugsweise neben Hyaluronsäure oder einem ihrer Salze kein anderes pharmazeutisches Vehiculum. Die Konzentrationen solcher Lösungen können auch innerhalb weiter Grenzen, zum Beispiel zwischen 0,01 und 75% für jeden einzelnen der zwei Bestandteile und für Gemische oder Salze davon, variieren. Lösungen mit ausgeprägter elastisch-viskoser Eigenschaft werden besonders bevorzugt, zum Beispiel mit einem Gehalt von 10% bis 90% des Arzneimittels oder jedes seiner Bestandteile. Arzneimittel dieses Typs sind, sowohl in wasserfreier Form (gefriergetrocknetes Pulver)als auch als konzentrierte Lösungen oder verdünnt in Wasser oder Salzlösung, gegebenenfalls mit Zusatz von Zusatz- oder Hilfsstoffen, wie besondere Desinfektionsmittel oder Mineralsalze mit Pufferwirkung oder andere, für die ophthalmische Verwendung von besonderer Bedeutung.
Von den Arzneimitteln der Erfindung sollten, abhängig vom Anwendungsfall, insbesondere die mit einem für den Anwendungsort geeigneten Säuregrad, das heißt, mit einem physiologisch verträglichen pH-Wert, gewählt werden. Die Einstellung des pH-Wertes, zum Beispiel in den vorstehend angeführten Salzen von Hyaluronsäure mit einem basischen Wirkstoff, kann durch geeignete Regulation der Mengen des Polysaccharids, seines Salzes und des basischen Wirkstoffes selbst bewirkt werden. Sollte zum Beispiel die Azidität eines Hyaluronsäuresalzes mit einem basischen Wirkstoff zu hoch sein, wird der Überschuß freier Säuregruppen mit den vorstehend angeführten anorganischen Basen, zum Beispiel mit Natrium- oder Kaliumhydroxid oder Ammoniakhydrat, neutralisiert.
Die folgenden Zubereitungen sind beispielhaft für die Arzneimittel gemäß der vorliegenden Erfindung, umfassend eine Assoziation eines pharmazeutischen Wirkstoff-Bestandteils (1) und des Vehiculum-Bestandteils (2), umfassend Hyaluronsäure, wie in den Ansprüchen definiert.
Zubereitung 1 - 100 mg Einlage mit Pilocarpin, umfassend:
- ein gemischtes Salz von Hyaluronsäure mit Pilocarpin und mit Natrium (Herstellung siehe Beispiel 18), 100 mg.
Zubereitung 2 - Gentamycin und Naphazolin enthaltende Augentropfen, wobei 100 ml:
- ein gemischtes Salz von Hyaluronsäure mit Gentamycin, mit Naphazolin und mit Natrium (Herstellung siehe Beispiel 16), 2,910 g,
- Propyloxybenzoat, 0,050 g,
- Natriumphosphat, 1,500 g,
- destilliertes Wasser, q.b.a. 100 ml, enthalten.
Zubereitung 3 - Augentropfen mit Chloramphenicol, Neomycin, Phenylephrin, Nitrofurazon, wobei 100 ml:
- ein gemischtes Salz von Hyaluronsäure mit Neomycin, mit Phenylephrin und mit Natrium (Herstellung siehe Beispiel 17), 2,890 g,
- Chloramphenicol, 0,500 g,
- Nitrofurazon, 0,02 g,
- destilliertes Wasser, q.b.a. 100 ml, enthalten.
Zubereitung 4 - Augentropfen mit Dexamethasonphosphat, Kanamycin, Phenylephrin, wobei 100 ml:
- ein gemischtes Salz von Hyaluronsäure mit Kanamycin und Phenylephrin (Herstellung siehe Beispiel 15), 3,060 g,
- Dexamethasonphosphat-Natriumsalz, 0,100 g,
- Methyl-p-hydroxybenzoat, 0,060 g,
- destilliertes Wasser, q.b.a. 100 ml, enthalten.

Herstellungsverfahren

Verfahren A

Die Herstellung der Salze gemäß der Erfindung kann auf bekannte Art und Weise durch Vereinigen von Lösungen oder Suspensionen der zwei Bestandteile (1) und (2) und gegebenenfalls von Basen oder basischen Salzen mit den vorstehend angeführten Alkalimetallen, Erdalkalimetallen, Magnesium, Aluminium oder Ammonium, in berechneten Mengen in Wasser oder organischen Lösungsmitteln und durch Isolieren der Salze in amorpher wasserfreier Form mit bekannten Verfahren durchgeführt werden. Es ist zum Beispiel möglich, zuerst eine wäßrige Lösung der zwei Bestandteile (1) und (2) herzustellen, indem die Bestandteile aus wäßrigen Lösungen ihrer Salze mit Säuren der Metallsalze freigesetzt werden, zum Beispiel durch Behandlung von Sulfaten im Fall von Bestandteil (1) und Natriumsalzen in Fall von Bestandteil (2) mit den betreffenden Ionenaustauschern, und die zwei Lösungen bei niedriger Temperatur, zum Beispiel zwischen 0ºC und 20ºC, vereinigt werden. Wenn das so erhaltene Salz in Wasser leicht löslich ist, sollte es gefriergetrocknet werden, während Salze, die nicht leicht löslich sind, durch Zentrifugieren, Filtrieren oder Dekantieren abgetrennt und danach gegebenenfalls im Exsikkator getrocknet werden können.
Die folgenden Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung von Verfahren A der vorliegenden Erfindung und sind nicht als Einschränkung zu betrachten.

Beispiel 1 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Streptomycin

2,34 g Streptomycinsulfat (10 mEq) werden in 25 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml quartäres Ammoniumharz (Dowex® 1·8) in OH&supmin;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das sulfatfreie Eluat wird in einem thermostatisierten Behälter bei 5ºC gesammelt. 4,0 g des Natriumsalzes von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 255.000 (entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit) werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird unter Rühren in der Lösung der Streptomycinbase gesammelt. Die erhaltene Lösung wird gefroren und sofort gefriergetrocknet. Im so erhaltenen Salz liegen alle Säuregruppen der Hyaluronsäure als Salz mit den basischen Funktionen von Streptomycin vor. Ausbeute: 5,5 g.
Die mikrobiologische Bestimmung an Bacillus subtilis ATC- C 6633 im Vergleich zu Standard-Streptomycin zeigt einen Gehalt von 33,8 Gew.-% Streptomycinbase, was dem theoretisch berechneten Gewicht entspricht.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. (Anal. Biochem. 4, 330, 1962) zeigt einen Gehalt von 66,2 Gew.-% für HY-Säure (theoretischer Prozentsatz 66,0 Gew.-%).

Beispiel 2 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Erythromycin

4,0 g des Natriumsalzes von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 77.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird bei einer Temperatur von 5ºC gehalten. 7,34 g Erythromycinbase (10 mEq) werden zur HY- Lösung zugegeben, wobei bei 5ºC bis zum vollständigen Lösen gerührt wird. Die erhaltene Lösung wird gefroren und gefriergetrocknet. Im so erhaltenen Salz liegen alle Säuregruppen der Hyaluronsäure als Salze mit Erythromycin vor. Ausbeute: 10,8 g.
Die mikrobiologische Bestimmung an Staphylococcus aureus ATCC 6538p im Vergleich zu Standard-Erythromycin zeigt einen Gehalt von 66,0 Gew.-% Erythromycinbase, was dem theoretisch berechneten Gewicht entspricht. Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen Gehalt von 34,0 Gew.-% HY-Säure, was dem theoretisch berechneten Prozentsatz entspricht.

Beispiel 3 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Kanamycin

1,46 g Dikanamycinsulfat (10 mEq) werden in 25 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml quartäres Ammoniumharz (Dowex® 1·8) in OH&supmin;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das sulfatfreie Eluat wird in einem thermostatisierten Behälter bei 5ºC gesammelt. 4,0 g des Natriumsalzes von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von 165.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird unter Schütteln mittels Vortex in der Lösung der Kanamycinbase gesammelt. Die so erhaltene Lösung wird sofort gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 4,8 g.
Im erhaltenen Salz liegen alle Säuregruppen von HY als Salz mit Kanamycin vor. Die mikrobiologische Bestimmung an B. subtilis ATCC 6633 im Vergleich zu Standard-Kanamycin zeigt einen Gehalt von 24,2 Gew.-% Kanamycinbase, was dem theoretisch berechneten Prozentsatz entspricht.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen Gehalt von 75,8 Gew.-% HY-Säure, was ebenfalls dem theoretischen Gehalt entspricht.

Beispiel 4 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Neomycin

1,52 g Neomycinsulfat (10 mEq) werden in 20 ml destilliertem H&sub2;O gelöst und bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml quartäres Ammoniumharz (Dowex® 1·8) in OH&supmin;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das sulfatfreie Eluat wird in einem thermostatisierten Behälter bei 5ºC gesammelt. 4,0 g des HY- Natriumsalzes mit einem Molekulargewicht von 170.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst und bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird unter Rühren in der Lösung der Neomycinbase gesammelt. Der sich bildende viskoelastische Niederschlag wird abdekantiert und gefriergetrocknet. Ausbeute: 4,76 g.
Im erhaltenen Salz liegen alle HY-Säuregruppen als Salz mit Neomycin vor. Die quantitative mikrobiologische Bestimmung an S. aureus ATCC 6538p im Vergleich zu Standard- Neomycin zeigt einen Gehalt von 21,2 Gew.-% Neomycinbase, was dem theoretisch berechneten Wert entspricht.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen HY-Säuregehalt von 78,8 Gew.-%.

Beispiel 5 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Gentamycin

1,45 g Gentamycinsulfat (10 mEq) werden in 25 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml quartäres Ammoniumharz (Dowex® 1·8) in OH&supmin;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das sulfatfreie Eluat wird in einem thermostatisierten Behälter bei 5ºC gesammelt. 4,0 g des Natriumsalzes von HY mit einem Molekulargewicht von 170.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird unter Schütteln mittels Vortex in der Lösung der Gentamycinbase gesammelt. Der sich bildende dichte und sehr viskose Niederschlag wird abdekantiert und gefriergetrocknet. Ausbeute: 4,65 g.
Im so erhaltenen Salz liegen alle HY-Säuregruppen als Salz mit Gentamycin vor. Die quantitative mikrobiologische Bestimmung an S. epidermidus ATCC 12228 im Vergleich zu Standard-Gentamycin zeigt einen Gehalt von 20,0 Gew.-% Gentamycinbase, was dem theoretischen Gehalt entspricht.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen HY-Säuregehalt von 80,0 Gew.-%.

Beispiel 6 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Amikacin

1,47 g Amikacinbase (10 mEq) werden in 100 ml destilliertem H&sub2;O bei 500ºC gelöst. 4,0 g des Natriumsalzes von HY mit einem Molekulargewicht von 170.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 4000 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird unter Schütteln mittels Vortex in der Lösung der Amikacinbase gesammelt. Der sich bildende dichte und äußerst viskose Niederschlag wird abdekantiert und gefriergetrocknet. Ausbeute: 5,16 g.
Im so erhaltenen Salz liegen alle HY-Säuregruppen als Salz mit Amikacin vor. Die quantitative mikrobiologische Bestimmung an S. aureus ATCC 29737 im Vergleich zu Standard- Amikacin zeigt einen Gehalt von 27,7 Gew.-% Amikacinbase, was dem theoretischen Gehalt entspricht.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen HY-Säuregehalt von 72,3 Gew.-%.

Beispiel 7 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Rolitetracyclin

4,0 g HY-Natriumsalz mit einem Molekulargewicht von 170.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird bei einer Temperatur von 5ºC gehalten. 5,3 g Rolitetracyclinbase (10 mEq) werden bei 5ºC unter Lichtausschluß und unter Rühren bis zum vollständigen Lösen zur HY- Säurelösung zugegeben. Die so erhaltene Lösung wird sofort gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 8,9 g.
Im so erhaltenen Salz liegen alle HY-Säuregruppen als Salz mit Rolitetracyclin vor. Die mikrobiologische Bestimmung an B. pumilus ATCC 14884 im Vergleich zu Standard-Rolitetracyclin zeigt einen Gehalt von 58,2 Gew.-% Rolitetracyclinbase, was dem theoretischen Wert entspricht. Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen HY- Säuregehalt von 41,8 Gew.-%.

Beispiel 8 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Polymyxin B

2,4 g Polymyxin B-Base (10 mEq) werden in 100 ml destilliertem H&sub2;O bei 5ºC suspendiert. 4,0 g HY-Natriumsalz mit einem Molekulargewicht von 170.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird bei 5ºC unter heftigem Schütteln in der Suspension der Polymyxinbase gesammelt. Nach einer Anfangsphase, während der die Lösung klar wird, findet eine zunehmende Bildung eines schwer löslichen Produktes statt, das durch 5 Volumenteile Aceton vollständig ausgefällt wird. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 6,05 g.
Im so erhaltenen Salz liegen alle HY-Säuregruppen als Salz mit Polymyxin B vor. Die quantitative mikrobiologische Bestimmung an B. bronchiseptica ATCC 4617 im Vergleich zu Standard-Polymyxin B zeigt einen Gehalt von 38,7 Gew.-% Polymyxin B-Base, was dem theoretischen Wert entspricht.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen HY-Säuregehalt von 61,3 Gew.-%.

Beispiel 9 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Gramicidin S

6,7 g Gramicidin S-Hydrochloridsalz (10 mEq) werden in 200 ml Ethanol/H&sub2;O (80 : 20) suspendiert. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml quartäres Ammoniumharz (Dowex® 1·8) in OH&supmin;-Form enthaltenden, Säule eluiert. 4,0 g des Natriumsalzes von HY mit einem Molekulargewicht von 165.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. 200 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) werden zum natriumfreien Eluat zugegeben, und das Gemisch wird unter Rühren bei 5ºC gehalten. Die Lösung der Gramicidinbase wird dann langsam zugegeben. Die erhaltene Lösung wird mit 10 Volumenteilen Aceton gefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 9,55 g.
Im so erhaltenen Salz liegen alle HY-Säuregruppen als Salz mit Gramicidin S vor. Die quantitative mikrobiologische Bestimmung an S. faecium ATCC 10541 im Vergleich zu Standard- Gramicidin S zeigt einen Gehalt von 60,0 Gew.-% Gramicidin S- Base, was dem theoretischen Wert entspricht.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen HY-Säuregehalt von 40,0 Gew.-%.

Beispiel 10 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Naphazolin

Reine Naphazolinbase wird wie folgt hergestellt: 4,94 g Naphazolin-HCl (20 mM) werden bei 5ºC in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. 20 ml NH&sub4;OH (5 M) werden zugegeben und zweimal mit 100 ml Ethylacetat extrahiert. Die organischen Schichten werden zweimal mit 50 ml H&sub2;O extrahiert, wieder vermischt und mit wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Die Lösung wird auf etwa 50 ml eingeengt und dann zum Kristallisieren in einen Gefrierschrank gestellt. Das kristallisierte Produkt wird abfiltriert, mit Ethylacetat gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 4,0 g reine Naphazolinbase.
4,0 g HY-Natriumsalz mit einem Molekulargewicht von 625.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird bei einer Temperatur von 5ºC gehalten. 2,1 g Naphazolinbase (10 mEq) werden zur HY-Säurelösung zugegeben, und das Gemisch wird bei 5ºC bis zum vollständigen Lösen gerührt. Die erhaltene Lösung wird sofort gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 5,72 g.
Im so erhaltenen Salz liegen alle HY-Säuregruppen als Salz mit Naphazolin vor. Die quantitative spektrophotometrische Bestimmung im Vergleich zu einem Naphazolin-Standard (USP) zeigt einen Gehalt von 35,7 Gew.-% Naphazolinbase, was dem theoretischen Wert entspricht.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen HY-Säuregehalt von 64,3 Gew.-%.

Beispiel 11 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Phenylephrin

2,04 g L-Phenylephrin-HCl (10 mEq) werden in 25 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml quartäres Ammoniumharz (Dowex® 1·8) in OH&supmin;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das chloridfreie Eluat wird in einem thermostatisierten Behälter bei 5ºC gesammelt. 4,0 g eines HY-Natriumsalzes mit einem Molekulargewicht von 820.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird unter Rühren in der Lösung der Phenylephrinbase gesammelt. Das erhaltene Gemisch wird sofort gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 5,25 g.
Im so erhaltenen Salz liegen alle HY-Säuregruppen als Salz mit Phenylephrin vor. Die UV-spektrophotometrische Bestimmung mit dem Standard-Additionsverfahren (USP) an S. epidermidus ATCC 12228 zeigt einen Gehalt von 30,6 Gew.-% Phenylephrinbase, was dem theoretischen Gehalt entspricht.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen HY-Säuregehalt von 69,4 Gew.-%.

Beispiel 12 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Atropin

4,0 g HY-Natriumsalz mit einem Molekulargewicht von 1.300.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird bei einer Temperatur von 5ºC gehalten. 2,89 g Atropinbase (10 mEq) werden zur HY-Säurelösung zugegeben, und das Gemisch wird bei 5ºC gerührt. Das erhaltene Gemisch wird gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 6,5 g.
Im so erhaltenen Salz liegen alle Hyaluronsäuregruppen als Salz mit Atropin vor. Die im Vergleich zu Standard- Atropin durchgeführte quantitative gaschromatographische Bestimmung (USP) zeigt einen Gehalt von 43,3 Gew.-% Atropinbase, was dem theoretischen Wert entspricht.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen HY-Säuregehalt von 56,7 Gew.-%.

Beispiel 13 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Pilocarpin

2,45 g Pilocarpin-Hydrochlorid (10 mEq) werden in 50 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml quartäres Ammoniumharz (Dowex® 1·8) in OH&supmin;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das chloridfreie Eluat wird bei 5ºC in einem thermostatisierten Behälter gesammelt. 4,0 g HY-Natriumsalz mit einem Molekulargewicht von 170.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird unter Rühren in der Lösung der Pilocarpinbase gesammelt. Die so erhaltene Lösung wird sofort gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 5,25 g.
Im so erhaltenen Salz liegen alle HY-Säuregruppen als Salz mit Pilocarpin vor. Die mit einem Pilocarpin-Standard als Vergleich durchgeführte spektrophotometrische Bestimmung gemäß USP zeigt einen Gehalt von 35,1 Gew.-% Pilocarpinbase, was dem theoretischen Wert entspricht.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen HY-Säuregehalt von 64,6 Gew.-%.

Beispiel 14 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Neomycin und mit Polymyxin

4,0 g HY-Natriumsalz mit einem Molekulargewicht von 170.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird bei 5ºC in einem thermostatisierten Behälter gesammelt. 0,150 g Polymyxin B-Base (0,63 mEq) werden unter heftigem Rühren zugegeben. 1,425 g Neomycinsulfat (9,37 mEq) werden in 25 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml quartäres Ammoniumharz (Dowex® 1·8) in OH&supmin;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das sulfatfreie Eluat wird unter heftigem Rühren in der Lösung von HY-Säure und Polymyxin B gesammelt. Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert und im Vakuum getrocknet; es gibt keinen Verlust des Produktes in der verbleibenden Lösung. Ausbeute: 4,85 g.
17,25 g dieses Produktes enthalten:
Neomycin, entsprechend 5,0 mg Neomycinsulfat Polymyxin, entsprechend 0,63 mg (etwa 5000 UI) Polymyxinsulfat.
Diese Bestimmungen wurden nach der Trennung der zwei Wirkstoff-Grundbestandteile mittels HPLC (Hochleistungsflüssigchromatographie) durchgeführt.

Beispiel 15 - Herstellung des gemischten Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Kanamycin und mit Phenylephrin

4,0 g HY-Natriumsalz mit einem Molekulargewicht von 65.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird bei 5ºC in einem thermostatisierten Behälter gesammelt. 0,85 g Kanamycinsulfat (5,82 mEq) werden in 10 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird bei 5ºC in einer thermostatisierten, 10 ml quartäres Armnoniumharz (Dowex® 1·8) in OH&supmin;-Form enthaltenden, Säule eluiert.
Das sulfatfreie Eluat wird bei 5ºC in einem Behälter gesammelt. Die Phenylephrinbase wird durch Lösen von Phenylephrin-Hydrochlorid in destilliertem H&sub2;O bei 5ºC in einer Konzentration von 100 mg/ml und Zugeben von NH&sub4;OH (6 N) bis zur vollständigen Ausfällung hergestellt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit destilliertem H&sub2;O gewaschen, bis das Waschwasser chloridfrei ist und dann im Vakuum getrocknet. Die HY-Säure- und Kanamycinbase-Lösungen werden vermischt und bei einer Temperatur von 5ºC gehalten. 699 mg Phenylephrinbase (4,18 mEq) werden unter Rühren bis zum vollständigen Lösen zugegeben. Die erhaltene Lösung wird gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 5,1 g.
Die mikrobiologische Bestimmung an B. subtilis ATCC 6633 im Vergleich zu Standard-Kanamycin zeigt einen Gehalt von 13,55 Gew.-% Kanamycinbase. Die UV-spektrophotometrische Bestimmung unter Verwendung des Standard-Additionsverfahrens (USP) zeigt einen Gehalt von 13,45 Gew.-% Phenylephrinbase.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen Gewichtsanteil von 73,0%.

Beispiel 16 - Herstellung des gemischten Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Gentamycin, mit Naphazolin und mit Natrium

4,0 g HY-Natriumsalz mit einem Molekulargewicht von 50.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird bei 5ºC in einem thermostatisierten Behälter gesammelt. 1,245 g Gentamycinsulfat (8,59 mEq) werden in 25 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird bei 5ºC in einer thermostatisierten, 12 ml quartäres Ammoniumharz (Dowex® 1·8) in OH&supmin;-Form enthaltenden, Säule eluiert.
Das sulfatfreie Eluat wird bei 5ºC in einem thermostatisierten Behälter gesammelt. Die reine Naphazolinbase wird durch Lösen von Naphazolin-Hydrochlorid in destilliertem H&sub2;O bei 5ºC in einer Konzentration von 50 mg/ml, Zugeben von NH&sub4;OH (5 M) bis zum Erreichen von pH 12 und zweimaligem Extrahieren der Lösung mit Ethylacetat hergestellt. Die organischen Schichten werden mit H&sub2;O gewaschen und mit wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Das Produkt wird zum Kristallisieren in einen Gefrierschrank gestellt und der Niederschlag abfiltriert, mit Ethylacetat gewaschen und im Vakuum getrocknet. 2,5 g HY-Natriumsalz und 0,297 g Naphazolinbase werden zur HY-Säure (1,41 mEq) zugegeben und bis zum vollständigen Lösen gerührt. Die Lösung der Gentamycinbase wird dann zugegeben, homogenisiert, gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 7,35 g.
Die mikrobiologische Bestimmung an B. epidermidus ATC- C 12228 im Vergleich zu einem Gentamycin-Standard zeigt einen Gehalt von 11,1 Gew.-% Gentamycinbase. Die im Vergleich zu Standard-Naphazolin (USP) durchgeführte quantitative spektrophotometrische Bestimmung zeigt einen Gehalt von 4,0 Gew.-% Naphazolinbase.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen Gewichtsanteil von 83,0%.

Beispiel 17 - Herstellung des gemischten Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Neomycin, mit Phenylephrin und mit Natrium

4,0 g HY-Natriumsalz mit einem Molekulargewicht von 65.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird bei 5ºC in einem thermostatisierten Behälter gesammelt. 1,28 g Neomycinsulfat (8,42 mEq) werden in 25 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird bei 5ºC in einer thermostatisierten, 12 ml quartäres Ammoniumharz (Dowex® 1·8) in OH&supmin;-Form enthaltenden, Säule eluiert.
Das sulfatfreie Eluat wird bei einer Temperatur von 5ºC in einem Behälter gesammelt. Die Phenylephrinbase wird durch Lösen von Phenylephrin-Hydrochlorid in destilliertem H&sub2;O bei 5ºC in einer Konzentration von 100 mg/ml und Zugeben von NH&sub4;OH (6 N) bis zur vollständigen Ausfällung hergestellt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit destilliertem H&sub2;O gewaschen, bis im Waschwasser keine Chloride mehr vorhanden sind, und dann im Vakuum getrocknet.
2,5 g HY-Natriumsalz und 0,266 g Phenylephrinbase (1,58 mEq) werden zu einer Lösung von HY-Säure zugegeben und bis zum vollständigen Lösen gerührt. Die Lösung der Neomycinbase wird dann zugegeben und nach der Homogenisierung gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 7,35 g.
Die UV-spektrophotometrische Bestimmung unter Verwendung des Standard-Additionsverfahrens (USP) zeigt einen Gehalt von 3,57 Gew.-% Phenylephrinbase.
Die quantitative mikrobiologische Bestimmung an S. aureus ATCC 6538p im Vergleich zu einem Neomycin-Standard zeigt einen Gehalt von 11,64 Gew.-% Neomycinbase.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen Gewichtsanteil von 82,8%.

Beispiel 18 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Pilocarpin und mit Natrium

98,31 g HY-Natriumsalz mit einem Molekulargewicht von 170.000, entsprechend 245 mEq einer monomeren Einheit, werden in 8,5 l destilliertem H&sub2;O gelöst.
Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 300 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird bei 5ºC in einem thermostatisierten Behälter gesammelt.
2,34 g Pilocarpin-Hydrochlorid (9,6 mEq) werden in 50 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird bei 5ºC in einer thermostatisierten, 15 ml quartäres Ammoniumharz (Dowex® 1·8) in OH&supmin;-Form enthaltenden, Säule eluiert.
Das chloridfreie Eluat wird unter Rühren in der HY-Säurelösung gesammelt. 235,4 ml einer Natriumhydroxidlösung (1 M) werden unter Rühren langsam zugegeben. Die so erhaltene Lösung wird sofort gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 99,8 g.
100 mg des Produktes enthalten 2 mg Pilocarpin als Base.

Beispiel 19 - Herstellung des Salzes von Hyaluronsäure (HY) mit Streptomycin und mit Natrium

98,68 g HY-Natriumsalz mit einem Molekulargewicht von 255.000, entsprechend 246 mEq einer monomeren Einheit, werden in 8,5 l destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird dann bei 5ºC in einer thermostatisierten, 300 ml Sulfonharz (Dowex® 50·8) in H&spplus;-Form enthaltenden, Säule eluiert. Das natriumfreie Eluat wird bei 5ºC in einem thermostatisierten Behälter gesammelt.
1,88 g Streptomycinsulfat (7,74 mEq) werden in 20 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. Die Lösung wird bei 5ºC in einer thermostatisierten, 12 ml quartäres Ammoniumharz (Dowex® 1·8) in OH&supmin;-Form enthaltenden, Säule eluiert.
Das sulfatfreie Eluat wird unter Rühren in einer HY- Säure-Lösung gesammelt. 238,3 ml einer NaOH-Lösung (1 M) werden unter Rühren langsam zugegeben, und die erhaltene Lösung wird sofort gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 99,8 g.
100 mg des Produktes enthalten 1,5 mg Streptomycin als Base.

Beispiel 20 - Verfahren zur Herstellung eines Gemisches der Fraktionen Hyalastin und Hyalectin ohne entzündliche Wirkung (Hyalistin ist ein Warenzeichen)

Frische oder gefrorene Hahnenkämme (3000 g) werden in einem Fleischhacker zerhackt und dann in einem mechanischen Homogenisator sorgfältig homogenisiert. Die so erhaltene Paste wird dann in einem Edelstahl- (AISI 316) oder Glasbehälter mit 10 Volumenteilen wasserfreiem Aceton behandelt. Das Gemisch wird dann 6 Stunden mit einer Geschwindigkeit von 50 U/min gerührt. Es wird 12 Stunden zur Trennung stehengelassen, und danach wird das Aceton abgesaugt. Die Extraktion mit Aceton wird wiederholt, bis das abgezogene Aceton den richtigen Feuchtigkeitsgrad (Karl- Fischer-Methode) erreicht.
Das Gemisch wird dann zentrifugiert und bei einer geeigneten Temperatur 5-8 Stunden im Vakuum getrocknet. Etwa 500-600 g trockenes Pulver aus Hahnenkämmen werden so erhalten.
300 g trockenes Pulver werden in Gegenwart einer geeigneten Menge Cysteinhydrochlorid dem enzymatischen Abbau mit Papain (0,2 g) unter wäßrigen Bedingungen mit einem Phosphatpuffer ausgesetzt.
Das erhaltene Gemisch wird 24 Stunden mit 60 U/min gerührt, wobei die Temperatur bei 60-65ºC gehalten wird. Es wird dann auf 25ºC abgekühlt, Celite® (60 g) wird zugegeben und das Rühren eine weitere Stunde fortgesetzt. Das so erhaltene Gemisch wird filtriert, bis eine klare Lösung erhalten wird. Die klare Lösung durchläuft dann eine Molekular- Ultrafiltration unter Verwendung von Membranen mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 30.000, wobei an der Membran die Moleküle mit einem Molekulargewicht über 30.000 zurückgehalten werden.
Das Produkt wird aus dem 5-6fachen des Originalvolumens ultrafiltriert, wobei während des Ultrafiltrationsprozesses kontinuierlich destilliertes Wasser zum Produkt zugegeben wird. Die Zugabe von Wasser wird beendet und die Ultrafiltration fortgesetzt, bis das Volumen auf 1/3 des Originalvolumens verringert ist. Die Restflüssigkeit wird durch Zugabe von Natriumchlorid auf 0,1 M eingestellt und die Temperatur auf 50ºC erhöht. 45 g Cetylpyridinchlorid werden unter Rühren mit 60 U/min zugegeben. Die Lösung wird 60 Minuten gerührt, und dann werden 50 g Celite® zugegeben. Unter Rühren wird die Temperatur des Ganzen auf 25ºC verringert und der durch Zentrifugation gebildete Niederschlag gesammelt. Der erhaltene Niederschlag wird in einer, 0,05% Cetylpyridinchlorid enthaltenden, 0,01 M Natriumchloridlösung (5 Liter) suspendiert. Die erhaltene Suspension wird 60 Minuten bei 50ºC gerührt, die Temperatur wird dann auf 25ºC verringert und der Niederschlag abzentrifugiert. Der Waschprozeß wird 3mal wiederholt, wonach der Niederschlag in einem Behälter mit 3 Litern einer, 0,05% Cetylpyridinchlorid enthaltenden, 0,05 M Natriumchloridlösung gesammelt wird. Das Gemisch wird 60 Minuten mit 60 U/min gerührt und die Temperatur 2 Stunden konstant bei 25ºC gehalten. Der Überstand wird durch Zentrifugation entfernt. Der Prozeß wird mehrere Male mit 0,05% Cetylpyridinchlorid enthaltenden 0,1 M Natriumchloridlösungen wiederholt. Das Gemisch wird zentrifugiert und der Überstand verworfen. Der Niederschlag wird in einer, 0,05% Cetylpyridinchlorid enthaltenden, 0,30 M Natriumchloridlösung (3 Liter) dispergiert. Das Gemisch wird gerührt, und sowohl der Niederschlag als auch die klare Flüssigkeit werden gesammelt. Die Extraktion des Niederschlages wird noch dreimal wiederholt, wobei jedesmal 0,5 Liter der gleichen wäßrigen Lösung verwendet werden.
Schließlich wird der Restniederschlag entfernt, und die klaren Flüssigkeiten werden zusammen in einen Behälter gegeben. Die Temperatur der Flüssigkeit wird unter konstantem Rühren auf 50ºC eingestellt. Die Flüssigkeit wird dann mit Natriumchlorid auf 0,23 M eingestellt. 1 g Cetylpyridinchlorid wird zugegeben und die Flüssigkeit 12 Stunden gerührt. Das Gemisch wird auf 25ºC abgekühlt und dann zuerst durch ein Celite®-Pack und dann durch ein Filter filtriert. Es durchläuft dann wieder eine Molekular-Ultrafiltration an einer Membran mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 30.000, wobei das dreifache Anfangsvolumen unter Zugabe einer 0,33 M Natriumchloridlösung ultrafiltriert wird. Die Zugabe von Natriumchloridlösung wird beendet und das Volumen auf 1/4 des Anfangsvolumens verringert. Die so konzentrierte Lösung wird bei 25ºC unter Rühren (60 U/min) mit 3 Volumenteilen Ethanol (95%) gefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Der Niederschlag wird in 1 Liter einer 0,1 M Natriumchloridlösung gelöst und das Ausfällen mit 3 Volumenteilen Ethanol (95%) wiederholt. Der Niederschlag wird gesammelt und zuerst dreimal mit Ethanol (75%), dann mit absolutem Ethanol (dreimal) und schließlich mit absolutem Aceton (dreimal) gewaschen. Das so erhaltene Produkt (Hyalastin- und Hyalectin-Fraktionen) weist ein mittleres Molekulargewicht zwischen 250.000 und 350.000 auf. Die HY- Ausbeute entspricht 0,6 Gew.-% des ursprünglichen frischen Gewebes.

Beispiel 21 - Verfahren zur Herstellung der Hyalastin- Fraktion aus dem Gemisch, das mit dem in Beispiel 20 beschriebenen Verfahren erhalten wurde

Das mit dem in Beispiel 20 beschriebenen Verfahren erhaltene Gemisch wird in zweifach destilliertem, pyrogenfreiem Wasser im Verhältnis von jeweils 10 mg Produkt pro 1 ml Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird der Molekularfiltration durch Membranfilter mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 200.000 ausgesetzt, gefolgt von einem Konzentrierungsverfahren an der Membran ohne Zugabe von Wasser. Bei der Ultrafiltration durch Membranen mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 200.000 treten die Moleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als 200.000 nicht durch die Membran, während die kleineren Moleküle zusammen mit dem Wasser durch die Membran treten. Während des Filtrationsprozesses wird kein Wasser zugegeben, so daß das Volumen abnimmt und daher eine Konzentrationszunahme der Moleküle mit einem Molekulargewicht über 200.000 stattfindet. Das Produkt wird ultrafiltriert bis das Volumen auf der Membran auf 10% des Anfangsvolumens verringert ist. Zwei Volumenteile pyrogenfreies,zweifach destilliertes Wasser werden zugegeben, und die Lösung wird nochmals ultrafiltriert bis das Volumen auf 1/3 verringert ist. Der Prozeß wird noch zweimal wiederholt. Die durch die Membran getretene Lösung wird mit Natriumchlorid auf 0,1 M eingestellt und dann mit 4 Volumenteilen 95%igem Ethanol gefällt. Der Niederschlag wird dreimal mit Ethanol (75%) gewaschen und dann im Vakuum getrocknet.
Das so erhaltene Produkt (Hyalastin-Fraktion) weist ein mittleres Molekulargewicht zwischen 50.000 und 100.000 auf. Die HY-Ausbeute entspricht 0,4 Gew.-% des ursprünglichen frischen Gewebes.

Beispiel 22 - Verfahren zur Herstellung der Hyalectin- Fraktion

Die, wie in Beispiel 21 im Behälter auf der Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 200.000 gesammelte, konzentrierte Lösung wird mit Wasser verdünnt, bis eine 5 mg/ml Hyaluronsäure enthaltende Lösung erhalten wird, bestimmt durch quantitative Analyse auf der Basis der Glucuronsäuremenge. Die Lösung wird mit einer wäßrigen Natriumchloridlösung auf 0,1 M eingestellt und dann mit 4 Volumenteilen 95%igem Ethanol gefällt. Der Niederschlag wird dreimal mit Ethanol (75%) gewaschen und dann im Vakuum getrocknet.
Das so erhaltene Produkt (Hyalectin-Fraktion) weist ein Molekulargewicht zwischen 500.000 und 730.000 auf. Dies entspricht einer spezifischen Hyaluronsäure- Fraktion mit einer definierten Molekülkettenlänge von etwa 2.500 bis 3.500 Saccharideinheiten mit hohem Reinheitsgrad.
Die HY-Ausbeute entspricht 0,2 Gew.-% des ursprünglichen frischen Gewebes.

Verfahren B

Die Erfindung betrifft auch ein neues Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäuresalzen mit dem Bariumsalz der Hyaluronsäure als Ausgangsmaterial. Das neue Verfahren betrifft die wasserlöslichen Salze und insbesondere die Hyaluronsäuresalze mit Wirkstoffen, in denen alle Carboxylgruppen von Hyaluronsäure oder nur ein Teil der Gruppen als Salz vorliegen. In den Teilsalzen können die restlichen Carboxylgruppen der Hyaluronsäure in freier Form oder als Salz mit anderen Wirkstoffen oder mit Alkalimetallen, Magnesium, Aluminium, Ammonium oder substituiertem Ammonium vorliegen.
Das neue Verfahren besteht aus der Herstellung einer wäßrigen Lösung des Bariumsalzes einer Hyaluronsäure und der Zugabe einer wäßrigen Lösung, die eine Anzahl Schwefelsäureäquivalente enthält, die vollständig oder teilweise als Salze mit einer oder mehreren organischen oder anorganischen Basen vorliegen, wobei die Anzahl der Schwefelsäureäquivalente der Anzahl der in der wäßrigen Bariumsalzlösung vorhandenen Hyaluronsäureäquivalente entspricht. Die wäßrige Lösung des Hyaluronsäuresalzes wird durch Abfiltrieren des abgetrennten Bariumsulfates erhalten. Das heißt, durch Abfiltrieren des abgetrennten Bariumsulfates ist es möglich, die wäßrige Lösung des Hyaluronsäuresalzes zu erhalten, aus der das, Salz durch Einengen in seiner wasserfreien Form erhalten werden kann.
Das Bariumsalz von Hyaluronsäure wird in der Literatur nicht beschrieben und war überraschenderweise in Wasser löslich. Es kann einfach durch Behandlung des nicht sehr gut löslichen Hyaluronsäuresalzes von Cetylpyridin mit einer wäßrigen Bariumchloridlösung und Ausfällen des Bariumhyaluronsäuresalzes aus der Lösung mit Ethanol oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel hergestellt werden. Das Hyaluronsäuresalz von Cetylpyridin ist ein Zwischenprodukt, das gewöhnlich in Hyaluronsäure-Herstellungsverfahren zur Abtrennung und Reinigung der aus verschiedenen organischen Materialien extrahierten Hyaluronsäure verwendet wird.
Die wäßrige Lösung, die eine Anzahl Schwefelsäureäquivalente enthält, die vollständig oder teilweise als Salze mit einer oder mehreren organischen oder anorganischen Basen vorliegen, wird durch Lösen der neutralen Sulfate der Basen in Wasser und gegebenenfalls Zugeben von Schwefelsäure hergestellt. Im Falle einer aus neutralen Sulfaten einer oder mehrerer organischer oder anorganischer Basen gebildeten Lösung, die eine Anzahl Schwefelsäureäquivalente enthält, die der Anzahl der Hyaluronsäureäquivalente in der wäßrigen Bariumsalzlösung entspricht, ist das Endergebnis ein stöchiometrisch neutrales Salz von Hyaluronsäure mit den in der jeweiligen wäßrigen Lösung vorliegenden Basen (Sulfate). Wenn ein stöchiometrisches Teil- oder saures Salz von Hyaluronsäure erwünscht ist, sollte Schwefelsäure zu der wäßrigen Lösung der Sulfate zugegeben werden, oder es sollten basische Säuresulfate verwendet werden.
Das Verfahren B der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 23 - Verfahren zur Herstellung eines Gemisches der Hyalastin- und Hyalectin-Fraktionen in Form von Bariumsalzen und ohne entzündliche Wirkung

Frische oder gefrorene Hahnenkämme (3000 g) werden in einem Fleischhacker zerhackt und dann in einem mechanischen Homogenisator sorgfältig homogenisiert. Die erhaltene Paste wird dann in einem Edelstahl- (AISI 316) oder Glasbehälter mit 10 Volumenteilen wasserfreiem Aceton behandelt. Das Gemisch wird 6 Stunden mit einer Geschwindigkeit von 50 U/min gerührt. Es wird 12 Stunden zur Trennung stehengelassen, und das Aceton wird abgesaugt. Die Extraktion mit Aceton wird wiederholt, bis das abgezogene Aceton den richtigen Feuchtigkeitsgrad (Karl-Fischer-Methode) erreicht. Das Gemisch wird dann zentrifugiert und bei einer geeigneten Temperatur 5-8 Stunden im Vakuum getrocknet. Auf diese Weise werden etwa 500-600 g trockene pulverisierte Hahnenkämme erhalten.
300 g trockenes Pulver werden in Gegenwart einer geeigneten Menge Cysteinhydrochlorid dem enzymatischen Abbau mit Papain (0,2 g) unter wäßrigen Bedingungen mit einem Phosphatpuffer ausgesetzt. Das erhaltene Gemisch wird 24 Stunden mit 60 U/min gerührt, wobei die Temperatur konstant bei 60-65ºC gehalten wird. Dann wird das Ganze auf 25ºC abgekühlt, Celite® (60 g) zugegeben und das Rühren eine weitere Stunde fortgesetzt. Das Gemisch wird filtriert, bis eine klare Lösung erhalten wird. Die klare Lösung durchläuft dann eine Molekular-Ultrafiltration unter Verwendung von Membranen mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 30.000. Es wird das 5-6fache des Originalvolumens des Produktes ultrafiltriert, wobei kontinuierlich destilliertes Wasser zum ultrafiltrierten Produkt zugegeben wird. Die Zugabe von Wasser wird beendet und die Ultrafiltration fortgesetzt, bis das Volumen auf 1/3 des Originalvolumens verringert ist.
Die Restflüssigkeit wird durch Zugabe von Bariumchlorid auf 0,1 M eingestellt und die Temperatur auf 50ºC erhöht.
45 g Cetylpyridinchlorid werden unter Rühren mit 60 U/min zugegeben. Die Lösung wird 60 Minuten gerührt, und dann werden 50 g Celite® zugegeben. Unter Rühren wird die Temperatur des Ganzen auf 25ºC verringert und der durch Zentrifugation gebildete Niederschlag gesammelt. Der erhaltene Niederschlag wird in einer, 0,05% Cetylpyridinchlorid enthaltenden, 0,01 M Bariumchloridlösung (5 Liter) suspendiert. Die Suspension wird 60 Minuten bei 50ºC gerührt; die Temperatur wird dann auf 25ºC verringert und der Niederschlag abzentrifugiert. Der Waschprozeß wird noch dreimal wiederholt, und schließlich wird der Niederschlag in einem Behälter mit 3 Litern einer, 0,05% Cetylpyridinchlorid enthaltenden, 0,05 M Bariumchloridlösung gesammelt. Die erhaltene Suspension wird 60 Minuten mit 60 U/min gerührt und die Temperatur 2 Stunden konstant bei 25ºC gehalten. Der klare Überstand wird durch Zentrifugation entfernt.
Der Prozeß wird mehrere Male mit einer, 0,05% Cetylpyridinchlorid enthaltenden, 0,1 M Bariumchloridlösung wiederholt. Das Gemisch wird zentrifugiert und der Überstand verworfen. Der Niederschlag wird in einer, 0,05% Cetylpyridinchlorid enthaltenden, 0,30 M Bariumchloridlösung (3 Liter) dispergiert. Das Gemisch wird gerührt, und sowohl der Niederschlag als auch die klare Flüssigkeit werden gesammelt. Die Extraktion des Niederschlages wird noch dreimal wiederholt, wobei jedesmal 0,5 Liter der gleichen wäßrigen Lösung verwendet werden.
Schließlich wird der Restniederschlag entfernt, und die klaren Flüssigkeiten werden in einem Behälter zusammengegeben. Die Temperatur der Flüssigkeit wird unter konstantem Rühren auf 50ºC eingestellt. Die Flüssigkeit wird dann mit Bariumchlorid auf 0,23 M eingestellt. 1 g Cetylpyridinchlorid wird zugegeben und die Flüssigkeit 12 Stunden weitergerührt. Das Gemisch wird auf 25ºC abgekühlt und dann zuerst durch ein Celite®-Pack und dann durch ein Filter filtriert. Es durchläuft dann wieder eine Molekular-Ultrafiltration an Membranen mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 30. 000, wobei unter Zugabe einer 0,33 M Bariumchloridlösung das dreifache Anfangsvolumen ultrafiltriert wird. Die Zugabe von Bariumchloridlösung wird beendetund das Volumen auf 1/4 des Anfangsvolumens verringert. Die so konzentrierte Lösung wird bei 25ºC unter Rühren (60 U/min) mit 3 Volumenteilen Ethanol (95%) gefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Der Niederschlag wird in 1 Liter einer 0,1 M Bariumchloridlösung gelöst und das Ausfällen mit 3 Volumenteilen Ethanol (95%) wiederholt.
Der Niederschlag wird gesammelt und zuerst dreimal mit 75%igem Ethanol, dann mit absolutem Ethanol (dreimal) und schließlich mit absolutem Aceton (dreimal) gewaschen. Das so erhaltene Produkt (Hyalastin- und Hyalectin-Fraktionen) weist ein mittleres Molekulargewicht zwischen 250.000 und 350.000 auf. Die HY-Ausbeute entspricht 0,6 Gew.-% des ursprünglichen frischen Gewebes.

Beispiel 24 - Verfahren zur Herstellung der Hyalastin- Fraktion in Form des Bariumsalzes aus dem Gemisch, das mit dem in Beispiel 23 beschriebenem Verfahren erhalten wurde

Das mit dem in Beispiel 23 beschriebenen Verfahren erhaltene Gemisch wird in pyrogenfreiem, destilliertem Wasser in einer Menge von 10 mg Produkt pro 1 ml Wasser gelöst. Die so erhaltene Lösung wird der Molekularfiltration durch eine Membran mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 200.000 ausgesetzt, gefolgt von einem Konzentrierungsverfahren ohne Zugabe von Wasser auf der Membran. Während des Ultrafiltrationsverfahrens durch Membranen mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 200.000 werden die Moleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als 200.000 zurückgehalten, während die kleineren Moleküle zusammen mit Wasser durch die Membran treten. Während des Filtrationsprozesses wird auf der Membran kein Wasser zugegeben, so daß das Volumen abnimmt und folglich die Konzentration der Moleküle mit einem Molekulargewicht über 200.000 zunimmt. Die Ultrafiltration wird aufrechterhalten, bis das Volumen auf der Membran auf 10% des Anfangsvolumens verringert ist. Zwei Volumenteile pyrogenfreies, destilliertes Wasser werden zugegeben, und das Ganze wird nochmals ultrafiltriert bis das Volumen auf 1/3 verringert ist. Der Prozeß wird noch zweimal wiederholt. Die durch die Membran getretene Lösung wird mit Bariumchlorid auf 0,1 M eingestellt und dann mit 4 Volumenteilen 95%igem Ethanol gefällt. Der Niederschlag wird dreimal mit 75%igem Ethanol gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Das so erhaltene Produkt (Hyalastin-Fraktion) weist ein mittleres Molekulargewicht zwischen 50.000 und 100.000 auf. Die HY-Ausbeute entspricht 0,4 Gew.-% des ursprünglichen frischen Gewebes.

Beispiel 25 - Verfahren zur Herstellung der Hyalectin- Fraktion in Form des Bariumsalzes

Die, wie in Beispiel 24 im Behälter auf der Ultrafiltrationsmembran mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von 200.000 gesammelte, konzentrierte Lösung wird mit Wasser verdünnt, bis eine 5 mg/ml Hyaluronsäure enthaltende Lösung erhalten wird, bestimmt durch quantitative Analyse auf der Basis der Glucuronsäuremenge. Die Lösung wird mit Bariumchlorid auf 0,1 M eingestellt und dann mit 4 Volumenteilen 95%igem Ethanol gefällt. Der Niederschlag wird dreimal mit 75%igem Ethanol gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Das so erhaltene Produkt (Hyalectin-Fraktion) weist ein Molekulargewicht zwischen 500.000 und 730.000 auf. Die HY-Ausbeute entspricht 0,2 Gew.-% des frischen Ausgangsgewebes.

Beispiel 26 - Herstellung des Salzes einer Hyaluronsäure (HY) mit Streptomycin

4,47 g HY-Bariumsalz (10 mEq) werden in 300 ml destilliertem Wasser gelöst.
2,43 g Streptomycinsulfat (10 mEq) werden in 100 ml destilliertem H&sub2;O gelöst und dann unter Rühren tropfenweise zur Lösung des HY-Salzes zugegeben. Das Gemisch wird 30 Minuten mit 6000 U/min zentrifugiert. Die Lösung wird abgetrennt und der Niederschlag zweimal mit 25 ml destilliertem H&sub2;O gewaschen. Die Lösung und die Waschlösungen werden vereinigt und dann gefriergetrocknet. Im so erhaltenen Salz liegen alle Säuregruppen der Hyaluronsäure als Salz mit den basischen Funktionen von Streptomycin vor. Ausbeute: 5,5 g.
Die mikrobiologische Bestimmung an B. subtilis (ATCC 6633) im Vergleich zu Standard-Streptomycin zeigt einen Gehalt von 33,8 Gew.-% basisches Streptomycin, was dem theoretisch berechneten Gewicht entspricht. Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. (Anal. Biochem. 4, 330, 1962) zeigt einen Gehalt von 66,2 Gew.-% HY-Säure (theoretischer Prozentsatz: 66,0 Gew.-%).

Beispiel 27 - Herstellung des Salzes einer Hyaluronsäure (HY) mit Naphazolin

4,47 g des Bariumsalzes von HY mit einem Molekulargewicht von 625.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem Wasser gelöst.
2,6 g neutrales Naphazolinsulfat (10 mEq Sulfat) werden in 50 ml destilliertem H&sub2;O gelöst und zur Lösung des HY- Bariumsalzes zugegeben. Das Gemisch wird bei 5ºC gerührt, bis das Bariumsalz vollständig ausgefällt ist. Nach der Zentrifugation wird die erhaltene Lösung sofort gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 5,72 g.
In dem so erhaltenen Salz liegen alle Säuregruppen der HY- Säure als Salz mit Naphazolin vor. Die quantitative spektrophotometrische Bestimmung im Vergleich zu Standard-Naphazolin (USP) zeigt einen Gehalt von 35,7 Gew.-% basisches Naphazolin, was dem theoretisch berechneten Wert entspricht. Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen HY-Säuregehalt von, 64,3 Gew.-%.

Beispiel 28 - Herstellung des Teilsalzes einer Hyaluronsäure (HY) mit Naphazolin

4,47 g des Bariumsalzes von HY mit einem Molekulargewicht von 625.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem Wasser gelöst.
1,54 g saures Naphazolinsulfat (10 mEq Sulfat) werden in 50 ml bidestilliertem H&sub2;O gelöst und zur Lösung des HY- Bariumsalzes zugegeben. Das Gemisch wird bei 5ºC bis zur vollständigen Ausfällung von Bariumsulfat gerührt. Nach der Zentrifugation wird die erhaltene Lösung sofort gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 4,5 g.
In dem so erhaltenen Salz liegen 50% der Säuregruppen von HY-Säure als Salz mit Naphazolin und 50% in freier Form vor. Die quantitative spektrophotometrische Bestimmung im Vergleich zu Standard-Naphazolin (USP) zeigt einen Gewichtsanteil basischen Naphazolins, der dem theoretisch berechneten Wert entspricht.

Beispiel 29 - Herstellung des Salzes einer Hyaluronsäure (HY) mit Phenylephrin

2,16 g neutrales L-Phenylephrinsulfat (10 mEq) werden in 25 ml destilliertem H&sub2;O gelöst.
4,47 g des Bariumsalzes von HY mit einem Molekulargewicht von 820.000, entsprechend 10 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem Wasser gelöst und zur Lösung des Phenylephrinsulfates zugegeben. Das Gemisch wird gerührt, bis das Bariumsalz vollständig ausgefällt ist. Nach der Zentrifugation wird die erhaltene Lösung gefroren und gefriergetrocknet. Im erhaltenen Salz liegen alle Säuregruppen von HY als Salz mit Phenylephrin vor.
Die UV-spektrophotometrische Bestimmung mit dem Standard- Additionsverfahren (USP) zeigt einen Gehalt von 30,6 Gew.-% basisches Phenylephrin, was dem theoretisch berechneten Wert entspricht.
Die colorimetrische Bestimmung der im Polysaccharid verbundenen Glucuronsäure nach dem Verfahren von Bittner et al. zeigt einen HY-Säuregehalt von 69,4 Gew.-%.

Beispiel 30 - Herstellung des gemischten Salzes einer Hyaluronsäure (HY) mit Neomycin, mit Phenylephrin und mit Natrium

7,15 g HY-Bariumsalz mit einem Molekulargewicht von 65.000, entsprechend 16 mEq einer monomeren Einheit, werden in 400 ml destilliertem Wasser gelöst.
1,28 g Neomycinsulfat (8,42 mEq) werden in 150 ml destilliertem H&sub2;O gelöst. 0,34 g neutrales Phenylephrinsulfat (1,58 mEq) und 0,43 g Na&sub2;SO&sub4; (6 mEq) werden zu der Lösung zugegeben. Die erhaltene Lösung wird zu der Lösung des HY- Bariumsalzes zugegeben, und nach der vollständigen Ausfällung des Bariumsulfates wird das Gemisch zentrifugiert.
Das Bariumsalz wird abgetrennt und die Lösung gefroren und gefriergetrocknet. Ausbeute: 7,35 g.

Pharmakologische Untersuchungen

Die örtliche Wirkung der neuen Arzneimittel gemäß der vorliegenden Erfindung kann in vivo durch Versuche am Auge des Hasen demonstriert werden, wobei sich ihre Überlegenheit im Vergleich zur herkömmlichen Verabreichung von Bestandteil (1) zeigt. Als Beispiel wird nachstehend über Versuche berichtet, die mit Hyaluronsäuresalzen mit den folgenden Antibiotika durchgeführt wurden: Streptomycin, Erythromycin und Neomycin. Die Vollsalze, in denen alle Säuregruppen von Hyaluronsäure mit einer basischen Gruppe des Antibiotikums als Salz vorliegen, werden in den Beispielen 1, 2, 4, und 5 beschrieben. Es wurden Lösungen dieser Salze in destilliertem Wasser verwendet, wobei die Konzentrationen den Antibiotikagehalten wie folgt entsprachen:
Hyaluronsäure + Streptomycin (HYA1) - 33,8%
Hyaluronsäure + Erythromycin (HYA2) - 66,0%
Hyaluronsäure + Neomycin (HYA4) - 21,2%
Die Wirkung dieser Antibiotika wurde mit der Wirkung der gleichen, in Phosphatpuffer gelösten und in der gleichen Antibiotikakonzentration vorliegenden, Antibiotika verglichen. Die Wirkung der zwei Gruppen von Produkten wurde auf der Basis der Zeit bestimmt, die zur Unterdrückung einer bakteriell verursachten trockenen Entzündung des Hasenauges erforderlich war. Genauer gesagt, wurde die durch intraokulare Injektion einer Maßlösung einer der folgenden Bakterienarten: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella typhi (0,1 ml) verursachte trockene Entzündung in beiden Augen von 24 Hasen bestimmt.
Die verschiedenen Salzderivate der Antibiotika wurden in das rechte Auge (RA) der Hasen verabreicht (3 Tropfen alle 6 Stunden), während in das linke Auge (LA) die entsprechenden Mengen der in Phosphatpuffer gelösten Antibiotika eingeträufelt wurden. Die Behandlung wurde unmittelbar nach der Injektion der Bakteriensuspension begonnen und wurde fortgesetzt, bis die Entzündung verschwand. Beide Augen jedes Hasen wurden mit einer Spaltlampe beobachtet. Insbesondere wurde folgendes untersucht: der Zustand der Bindehaut und des Hornhautepithels, Augenvorderkammer (Gegenwart des Tyndall- Effektes) und der Zustand der Iris des hinteren Augenabschnittes. Der Zustand des Augenhintergrundes wurde mit einer Goldman-Linse untersucht. Das Vorhandensein von Hinweisen auf eine Entzündung (Hyperämie, Exsudate, Trübung der Flüssigkeiten usw.) wurde aufgezeichnet. Der Prozentsatz der Augen, die keine Zeichen einer Entzündung zeigten, wurde dann berechnet.
Die Ergebnisse der Untersuchungen werden in Tabelle 1 angegeben, wobei ersichtlich ist, daß die Verabreichung der Salzderivate gemäß der vorliegenden Erfindung von einer schnelleren Genesung von der Entzündung gefolgt war, verglichen mit der Verabreichung der entsprechenden nicht als Hyaluronsäuresalze vorliegenden Antibiotika. Tabelle 1: Wirkung der Verabreichung der Derivate HYA auf die Genesung von trockener Entzündung des Hasenauges Behandlung Tage ab Entzündungsbeginn
Die Werte sind in Prozent angegeben (Anzahl der Augen in denen die Entzündung gemildert wurde zur Gesamtzahl der behandelten Augen). In Klammern die Anzahl der behandelten Augen.
* Injektion von Pseudomonas aeruginosa
** Injektion von Staphylococcus aureus
*** Injektion von Salmonella typhi
Die Wirkung der Arzneimittel gemäß der Erfindung wird ferner durch die folgenden anderen Beispiele demonstriert.

Miotische Wirkung des Salzes von Pilocarpin mit Hyaluronsäure Materialien

Für die verschiedenen Zubereitungen des als Salz vorliegenden Pilocarpin wurden die folgenden Produkte verwendet:
- Hyaluronsäure mit niedrigem Molekulargewicht (Hyalastin, MW. 100.000) [HY&sub1;];
- Hyaluronsäure-Natriumsalz mit hohem Molekulargewicht (Hyalectin, MW. zwischen 500.000 und 730.000) [HY&sub2;-Na] in Konzentrationen von 10 mg/ml und 20 mg/ml;
- 5% Polyvinylalkohol als ophthalmisches Vehiculum für Referenzzubereitungen
Es wurden die folgenden unterschiedlichen Zubereitungen hergestellt:
1) Salzlösung mit 2% Pilocarpinnitrat (PiNO&sub3;) (als Referenz verwendet);
2) 2%ige PiNO&sub3;-Lösung mit 5% Polyvinylalkohol als Vehiculum (als Referenz verwendet);
3) wäßrige Lösung von Pilocarpinbase/HY&sub1;-Säure. Der Pilocarpinbasegehalt entspricht 2%;
4) Pilocarpinsalz/HY&sub1;-Säure enthaltende Lösung mit HY&sub2;-Na als Vehiculum, 10 mg/ml. Der Pilocarpinbasegehalt entspricht 2%;
5) Pilocarpinsalz/HY&sub1;-Säure enthaltende Lösung mit HY&sub2;-Na als Vehiculum, 20 mg/ml. Der Pilocarpinbasegehalt entspricht 2%;
6) Einlagen aus HY&sub2;-Na, die das Salz der Pilocarpinbase mit Hyaluronsäure [HY&sub1;] enthalten. Der Pilocarpinbasegehalt entspricht 6,25%.

Verfahren

Es wurden Neuseeland Albinohasen (2-2,5 kg) verwendet. Die zu testende Lösung wurde mittels Mikrospritze (10 ul) in ein Auge jedes Hasen eingeträufelt; das andere Auge diente als Referenz. Die Einlage wurde mittels einer geeigneten Pinzette in den Bindehautsack eingebracht. In allen Fällen wurde der Pupillendurchmesser in geeigneten Zeitabständen gemessen. Jede Zubereitung wurde an mindestens 8 Hasen getestet. Jedes Auge wurde nicht mehr als dreimal behandelt; zwischen den Behandlungen wurde jeweils eine Ruhepause von mindestens einer Woche eingehalten.

Parameter

Der Pupillendurchmesser wurde in verschiedenen Zeitabständen gemessen, um die miotische Wirkungs/Zeit-Kurve zu bestimmen und danach aus der Miosis/Zeit-Kurve die folgenden Wirkparameter zu bestimmen:
Imax = Maximale Differenz des Pupillendurchmessers zwischen dem behandelten Auge und dem Referenzauge;
Peakzeit = zum Erreichen von Imax erforderliche Zeit;
Dauer = zur Rückkehr zu den Ausgangsbedingungen erforderliche Zeit;
Plateau = Zeitraum der absoluten miotischen Wirkung;
AUC = Fläche unter der Miosis/Zeit-Kurve.

Ergebnisse

Wie aus Tabelle 2, in der für jede getestete Lösung die Werte der verschiedenen, aus der miotischen Wirkungs/Zeit- Kurve registrierten, Parameter angegeben werden, ersichtlich, kann gezeigt werden, wie die Bildung eines Salzes von Hyaluronsäure mit 2% Pilocarpin eine Zunahme der miotischen Wirkung des Arzneistoffes bewirkt, wobei die Wirkung das zweifache der Wirkung einer wäßrigen Lösung mit 2% Pilocarpinnitrat (Zubereitung 1) erreichen kann.
Eine statistisch, signifikante Zunahme der Wirkung wird auch beobachtet, wenn Hyaluronsäure mit einem hohen Molekulargewicht sowohl mit 10 mg/ml als auch mit 20 mg/ml als Vehiculum verwendet wird (Zubereitung 4-5).
Die Bildung, eines Salzes mit Hyaluronsäure ist zum Teil auch in in Bezug auf die längere Dauer der miotischen Wirkung von Pilocarpin bei Verwendung solcher Zubereitungen als Vehiculum interessant: die zur Rückkehr zum normalen Pupillendurchmesser unter Grundbedingungen benötigte Zeit erreicht Werte von 160 Minuten (Zubereitung 3), verglichen mit 110 Minuten für Pilocarpin (Zubereitung 1). Tabelle 2: Biologische Wirkungsparameter der Hyaluronsäure enthaltenden ophthalmischen Vehicula Formulierung Peakzeit min Dauer min Plateau min Relatives

Stabilität der Kornealfilme der Hyaluronsäure- und Pilocarpinderivate

Die Aufgabe der Versuche war die Beurteilung der Haftfähigkeit und der filmbildenden Eigenschaften der Salzderivate von Pilocarpin und Hyaluronsäure nach der Anwendung auf die tierische Hornhaut.

Methode

Der Test bestand aus der visuellen Beurteilung der Bildung, Stabilität und Dauerhaftigkeit des durch die Zubereitungen auf der Hornhaut erzeugten Filmes. Zu diesem Zweck wurde Natriumfluorescein zu den ophthalmischen Arzneimitteln zugegeben (0,1%), und das Auge wurde nach dem Einträufeln in UV-Licht bei 366 nm untersucht.
12 Albinohasen (Neuseeland, 2-2,5 kg) beiderlei Geschlechtes wurden verwendet. Ein Tropfen (50 ul) jedes Vehiculums wurde in ein Auge jedes Hasen eingeträufelt, wobei das andere Auge als Kontrolle diente.

Verwendete Lösungen

1. Salzlösung mit 2% Pilocarpinnitrat (PiNO&sub3;);
2. Lösung mit 2% Pilocarpin, mit 5% Polyvinylalkohol (Wacker Chemie, PVA W 48/20) eingedickt;
3. Pilocarpinbasesalz/HY&sub1;-Säure enthaltende Lösung. Der Pilocarpinbasegehalt entspricht 2%;
4. Pilocarpinbasesalz/HY&sub1;-Säure enthaltende Lösung mit HY&sub2;- Na als Vehiculum, 10 mg/ml. Der Pilocarpinbasegehalt entspricht 2%;
5. Pilocarpinbasesalz/HY&sub1;-Säure enthaltende Lösung mit HY&sub2;- Na als Vehiculum, 20 mg/ml. Der Pilocarpinbasegehalt entspricht 2%;
Alle Lösungen enthielten 0,1% Natriumfluorescein. Der pH-Wert der Lösungen betrug in allen Fällen etwa 5,8.

Ergebnisse

Die Parameter unter Bezug auf das Fluorescein:
a) Dauerhaftigkeit des integralen Kornealfilmes,
b) Dauerhaftigkeit des Fluoresceins (Zeit, die zum vollständigen Verschwinden des Fluoresceins aus dem Auge erforderlich war), c) Vorhandensein von Fluorescein in der Nase (Zeit, die erforderlich war, bis die Lösung nach der Anwendung am Nasenniveau erschien), werden in Tabelle 3 angegeben.
Die Derivate von Hyaluronsäure mit Pilocarpin erzeugen über Zeiträume von über 2 Stunden einen stabilen Kornealfilm.
Die transkorneale Penetration von Pilocarpin scheint daher von der Fähigkeit der Hyaluronsäure, durch Erzeugung eines homogenen und stabilen Filmes auf der Hornhautals als Vehiculum für den Arzneistoff zu wirken, abzuhängen. Tabelle 3 Lösung Dauerhaftigkeit des integralen Filmes (min) Dauerhaftigkeit von Fluorescein (min) Erscheinen von Fluorescein in der Nase (min)

Claims

1. Arzneimittel, umfassend

(a) einen pharmazeutischen Wirkstoff oder ein Gemisch von pharmakologischen Wirkstoffen, geeignet zur örtlichen Anwendung; und

(b) Hyaluronsäure oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz der Hyaluronsäure, gegebenenfalls zusammen mit einem zusätzlichen, zur örtlichen Anwendung geeigneten Exzipienten, mit der Maßgabe, daß der Wirkstoff keinen ophthalmischen Arzneistoff darstellt, wenn die Hyaluronsäure eine Fraktion mit einem mittleren Molekulargewicht von 50 000 bis 730 000 ist und im wesentlichen frei von Hyaluronsäure ist, die ein Molekulargewicht von weniger als 30 000 aufweist.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, wobei der Wirkstoff intradermal oder über die nasale oder rektale Schleimhaut absorbiert werden kann.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Wirkstoff basischer Natur ist und in Form eines Salzes mit der Hyaluronsäure vorliegt.

4. Arzneimittel zur örtlichen Verwendung, umfassend ein Teil- oder stöchiometrisch neutrales Salz der Hyaluronsäure mit mindestens einem zur örtlichen Anwendung geeigneten pharmakologischen Wirkstoff basischer Natur.

5. Arzneimittel nach Anspruch 4, wobei der Wirkstoff intradermal oder über die nasale oder rektale Schleimhaut absorbiert werden kann.

6. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 4 oder 5, das einen zur örtlichen Anwendung geeigneten zusätzlichen Exzipienten enthält.

7. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei das Salz ein Teilsalz ist und mindestens ein Teil der Säuregruppen der Hyaluronsäure mit einem Alkali- oder Erdalkalimetall, Magnesium, Aluminium oder Ammonium als Salz vorliegt.

8. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 4 und 6 bis 7, wobei der Wirkstoff zur ophthalmischen Verwendung geeignet ist.

9. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 4 bis 7, wobei der Wirkstoff zur dermatologischen, otorhinolaryngologischen, odontologischen, angiologischen, geburtshilflichen oder neurologischen Verwendung geeignet ist.

10. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der pharmakologische Wirkstoff ein antibiotisches, infektionsverhinderndes, antivirales, antimikrobielles, entzündungshemmendes, wundheilendes, cytostatisches, cytotoxisches, anästhesierendes, cholinergisches Promotor-, cholinergisch antagonistisches, adrenergisches Promotor- oder adrenergisch antagonistisches Mittel ist.

11. Arzneimittel nach Anspruch 10, wobei der pharmakologische Wirkstoff ausgewählt ist aus Gentamycin, Neomycin, Aureomycin, Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Kanamycin, Amikacyn, Tobramycin, Spectinomycin, Erythromycin, Oleandomycin, Carbomycin, Spiramycin, Oxytetracyclin, Rolitetracyclin, Bacitracin, Polymyxin B, Gramicidin, Colistin, Chloramphenicol, Lincomycin, Vancomycin, Novobiocin, Ristocetin, Clindainycin, Amphotericin B, Griseofulvin, Nystatin, Diethylcarbamazin, Mebendazol, Sulfacetamid, Sulfadiazin, Sulfisoxazol, Uridin, Adeninarabinosid, Idox, Trifluorthimidin, Aciclovir, Ethyldesoxyuridin, Pilocarpin, Metacholin, Carbamylcholin, Aceclidin, Fisostigmin, Neostigmin, Demecarium, Atropin, Noradrenalin, Adrenalin, Norfazolin, Methoxamin, Propanolol, Timolol, Pindolol, Bupranolol, Atenolol, Metoprolol, Oxyprenolol, Practolol, Butoxamin, Sotalol, Butadrin, Labetalol, Dexamethason, Triamcinolon, Prednisolon, Fluormetholon, Medrison, Fluorocil, Methotrexat und Podophyllin.

12. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 4 bis 9, wobei der Wirkstoff ausgewählt ist aus Streptomycin, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin, Gentamycin, Pilocarpin, Triamcinolon und epidermaler Wachstumsfaktor.

13. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Hyaluronsäure eine Molekulargewichtsfraktion darstellt, die im wesentlichen frei von Hyaluronsäure mit einem Molekulargewicht von weniger als 30 000 ist.

14. Arzneimittel nach Anspruch 13, wobei die Fraktion ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 50 000 und 100 000 aufweist.

15. Arzneimittel nach Anspruch 13, wobei die Fraktion ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen 500 000 und 730 000 aufweist.

16. Verwendung eines Salzes der Hyaluronsäure mit einem pharmakologischen Wirkstoff basischer Natur zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur ophthalmischen Verabreichung geeignet ist.

17. Verwendung eines Gemisches von Hyaluronsäure mit einem nicht-opthalmischen pharmakologischen Wirkstoff zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur örtlichen Anwendung geeignet ist.

18. Verwendung eines Salzes der Hyaluronsäure mit einem pharmakologischen Wirkstoff basischer Natur zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur örtlichen Anwendung geeignet ist und durch die nasale oder rektale Schleimhaut intradermal absorbiert werden kann.

19. Verfahren zur Herstellung eines Hyaluronsäuresalzes umfassend:

a) Vereinigen einer wäßrigen Lösung eines Bariumsalzes von Hyaluronsäure mit einem Sulfat eines pharmazeutischen Wirkstoffs und

b) Abtrennen des gefällten Bariumsulfats, wobei das Hyaluronsäuresalz in wäßriger Lösung erhalten wird.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Sulfat in einer Menge zugegeben wird, daß die Zahl der Sulfatäquivalente gleich der Zahl der Hyaluronsäureäquivalente ist, wobei ein stöchiometrisch neutrales Hyaluronsäuresalz hergestellt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Sulfat in einer Menge zugegeben wird, daß die Menge der Sulfatäquivalente geringer als die Zahl der Hyaluronsäureäquivalente ist, wobei ein teilweise als Salz vorliegendes Hyaluronsäuresalz hergestellt wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei das Bariumsalz der Hyaluronsäure zusätzlich mit einem Sulfat mindestens einer Verbindung ausgewählt aus Alkali- oder Erdalkalimetall, Aluminium oder Ammonium vereinigt wird.

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Sulfate in einer Menge zugegeben werden, daß die Zahl der Sulfatäquivalente gleich der Zahl der Hyaluronsäureäquivalente ist.

24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Sulfate in einer Menge zugegeben werden, daß die Zahl der Sulfatäquivalente geringer als die Zahl der Hyaluronsäureäquivalente ist.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, wobei der Wirkstoff mindestens eine Verbindung ist, ausgewählt aus Erythromycin, Gentamycin, Neomycin, Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Kanamycin, Amikacyn, Tobramycin, Aureomycin, Spectinomycin, Erythromycin, Oleandomycin, Carbomycin, Spiramycin, Oxytetracyclin, Rolitetracyclin, Bacitracin, Polymyxin B, Gramicidin, Colistin, Chloramphenicol, Lincomycin, Amphotericin B, Griseofulvin, Nystatin, Diethylcarbamazin, Mebendazol, Sulfacetamid, Sulfadiazin, Sulfisoxazol, Iodeoxyuridin, Adenin, Arabinosid, Tricarpin, Metacholin, Carbamylcholin, Aceclidin, Fisostigmin, Neostigmin, Demacarium, stropina, Propanolol, Timolol, Pindolol, Bupranolol, Atenolol, Metoprolol, Oxprenolol, Practolol, Butoxamin, Sotalol, Butadrin, Labetalol, Dexamethason, Triamcinolon, Prednisolon, Fluormetholon und Medrison.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, wobei die Hyaluronsäure eine Molekulargewichtsfraktion mit einem Molekulargewicht zwischen 90-80% und 0,23% des Molekulargewichts einer integralen Hyaluronsäure, die ein Molekulargewicht von 13 Millionen aufweist, darstellt.

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Hyaluronsäurefraktion frei von Hyaluronsäure ist, die ein Molekulargewicht von weniger als 30 000 aufweist.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei die Molekulargewichtsfraktion ein durchschnittliches Molekulargewicht von 50 000 bis 100 000, 500 000 bis 730 000 oder 250 000 bis 350 000 aufweist.