CH668838A5 - Verfahren zum ermitteln von malignen tumorzellen mit metastatischer zellaktivitaet. - Google Patents

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CH668838A5
CH668838A5 CH2471/84A CH247184A CH668838A5 CH 668838 A5 CH668838 A5 CH 668838A5 CH 2471/84 A CH2471/84 A CH 2471/84A CH 247184 A CH247184 A CH 247184A CH 668838 A5 CH668838 A5 CH 668838A5
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Lance Allen Liotta
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Description

BESCHREIBUNG
Das erfindungsgemässe Verfahren ist im Patentanspruch 1 definiert. Die Basalmembran abbauenden Metallproteinase-Antigene werden im folgenden als Typ I V-Kollagenase-Anti-gene bezeichnet. Enzympräparate zur Ausführung des Verfahrens nach Patentanspruch 1 sind im Patentanspruch 6 definiert und Antikörperpräparate zur Ausführung des Verfahrens nach Patentanspruch 1 sind in den Patentansprüchen 9 und 10 definiert. Der Patentanspruch 13 definiert ein Reinigungsverfahren zur Herstellung von Antigenpräparaten, die zur Ausführung des Verfahrens nach Patentanspruch 1 dienen können.
Ein wesentliches Merkmal von malignen Zellen ist das Eindringen und die Bildung von Metastasen. Aus diesem Grunde sind Verfahren für die frühe Ermittlung und die Überwachung der Eindringvorgänge von grosser klinischer Bedeutung. Die Bildung von Metastasen stellt eine komplizierte Abfolge von Ereignissen dar, bei der maligne Zellen sich von dem Primärtumor lösen, in das benachbarte Gewebe eindringen, in die Lymphbahnen oder das Kreislaufsystem hindurchstossen, sich an einem entfernten Platz an die Wand des Gefässes heften und sie durchstossen, in das Gewebe eindringen und schliesslich wuchern und damit die Bildung des Metastaseherdes einleiten.
Die eindringenden Tumorzellen müssen an verschiedenen Stellen während des Ausbreitungsvorgangs Basalmembranen durchdringen. Basalmembranen sind extrazellulare Matrizen, die eine widerstandsfähige zusammenhängende Schicht bilden, die Epithel-, Endothel- und Parenchym-Zellen von dem interstitiellen Verbindungsgewebe trennt. Diese Strukturen setzen sich zusammen aus Kollagen (Typ IV) und Nichtkollagenkomponenten, wie Laminin, Proteoglykan, Entactin und Fibronectin. Basalmembrane stellen wesentliche Schranken für Tumorzellen dar, und ihr Abbau stellt deshalb einen wesentlichen Schritt bei dem Metastati-sierungsvorgang dar. Dieser Vorgang scheint durch proteolytische Enzyme gefördert zu werden. Erhöhte Gehalte an Proteasen wie Plasminogenaktivatoren, Kathepsin B und D und Protoglykan abbauende Enzyme wurden sowohl in Tumorgewebeextrakten als auch in Medien von Tumorzellenkulturen nachgewiesen, und diese Enzyme wurden als vielversprechende Sensoren zur Messung des Eindringpotentials von Zellen betrachtet. Jedoch konnte keine Korrelation zwischen der Freigabe der Enzyme und der Durchdringungsfähigkeit von malignen Zellen festgestellt werden. Plasminogenaktivatoren werden nämlich von vielen Zellreihen hergestellt, die keine Durchdringungseigenschaften aufweisen. Da ausserdem die obenerwähnten Proteasen Typ IV-Kollagen nicht abbauen, stellen sie kein ausreichendes Mittel für Tumorzellen dar, Basalmembrane zu durchsetzen.
Die Erfinder konnten zeigen, dass Tumorzellen eine neutrale Protease freigeben, die spezifisch Typ IV-Kollagen abbaut, und haben Verfahren zum Reinigen dieses Enzyms zur Homogenität aus einem metastatischen Mäusetumor
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angegeben (Liotla et al., J. National Cancer Inst., 58, 1427— 1431. 1977; Liotta et al., Proc. National Acad. Sci., 76, 2268 bis 2272, 1978: Salo et al., The Journal of Biological Chemi-stry, 258, Seiten 3058 bis 3063, 1983) und ebenso aus gezüchteten Tumorzellen des Menschen. Die Erfinder haben ausserdem gezeigt, dass die Aktivität dieses, hier als Typ I V-Koll-agenase bezeichneten Enzyms mit metastatischem Potential von Tumorzellen korreliert ist (Liotta et al., Nature, 284, 67-68, 1980).
Da nachgewiesen ist, dass das Typ IV-Kollagenase-Enzym-antigen zum Aufzeigen von malignen Zellen mit Metastaseneigung geeignet ist, kann das Enzym grosse Bedeutung für die Diagnose haben. Jedoch kann die Messung der Aktivität der Typ IV-Kollagenase nicht in biologischen Flüssigkeiten, also etwa in Körperflüssigkeiten, Gewebeextrakten oder Gewebeschnitten, vorgenommen werden, weil in derartigen Proben grosse Mengen von Proteaseinhibitoren auftreten.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Verfahren zum Ermitteln von malignen Tumorzellen mit metastatischer Zellaktivität durch immunologische Bestimmung von Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen in biologischen Flüssigkeiten, wie Körperflüssigkeiten, Gewebeextrakten, Gewebeschnitten, Organ- und Zellkulturen, Kulturmedien usw., anzugeben. Der Erfindung liegt ausserdem die Aufgabe zugrunde, Ansätze zu entwickeln, die sowohl markiertes und unmarkiertes hochreines Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen als auch markierte oder unmarkierte polyklonale und monoklonale Antikörper gegen das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen enthalten.
Verfahren zum Reinigen und Kennzeichnen des Typ IV-Kollagenase-Antigens von Zellen, die Basalmembrane durchdringen können, besonders von malignen Tumorzellen, sind eine zwingende Notwendigkeit für die Verwirklichung der vorliegenden Erfindung. Die Erfinder haben die Typ IV-Kollagenase entdeckt und haben Verfahren für die Reinigung und Kennzeichnung dieses Antigens entwickelt. (Liotta et al.. J. Nat. Cancer Inst., 58, 1427—1431,1977; Lio atta et al., Proc. National Acad. Sei., 78,2268-2272, 1978; Salo et al., The Journal of Biological Chemistry, 258, Seiten 3058 bis 3063, 1983); Salo et al., J. Biol. Chem., 1983. Zum Messen der Typ IV-Kollagenaseaktivität wird radioaktiv markiertes Typ IV-Prokallogen als Substrat verwendet, wobei dieses Präparat nach einem Verfahren hergestellt ist, das von den Erfindern entwickelt wurde (Tryggvason et al., Biochemistry, 19, 1284 bis 1289, 1980). Diese Aktivitätsuntersuchung ist erforderlich, um den Reinigungsgrad während aufeinanderfolgender Schritte des Reinigungsvorgangs zu bestimmen. Nach diesem Verfahren kann die Enzymaktivität in einem serumfreien Organ- oder Zellkulturmedium bestimmt werden.
Das Typ IV-Kollagenase-Enzym lässt sich aus serumfreien Organkulturmedien von malignem Tumorgewebe oder Medien von gezüchteten Tumorzellen gewinnen. DieGeWe-bestücke oder Zellen werden normalerweise fünf Tage lang in vitro gezüchtet und das Medium täglich gesammelt. Das das Typ IV-KolIagenase-Antigen enthaltende Mediumprotein wird mit Ammoniumsulfat gefällt und dann durch einige chromatographische Säulen geleitet, wie das in den untenstehenden Beispielen beschrieben ist.
Das gereinigte Typ IV-Kollagenase-Antigen hat ein Molekulargewicht von ungefähr 70 000 und besteht nach der Untersuchung durch Gel-Elektrophorese aus zwei Polypeptidketten mit einem Molekulargewicht von 62 000 und 68 000. Das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen bedarf keiner proteolytischen Aktivierung für maximale Aktivität und hat ein pH-Optimum von 7,4. Das Typ IV-KolIagenase-Enzym-antigen ist ein metallabhängiges Enzym und erfordert Calcium zur Aktivität. Das Enzymantigen ist spezifisch und baut interstitielles Kollagen vom Typ 1, II oder III, andere Basal-membranbestandteile oder Kasein nicht ab.
Die Isolierung und Reinigung des Typ IV-Kollagenase-Enzymantigens gestattet die Herstellung von spezifischen Antikörpern gegen das genannte Enzymantigen. Die Herstellung dieser Antikörper ermöglicht die Entwicklung von empfindlichen Immunverfahren zum Nachweis der metastatischen Zellaktivität durch qualitative oder quantitative Bestimmung des Typ IV-Kollagenase-Antigens in Körperflüssigkeiten, Gewebeextrakten, Gewebeschnitten, Zell-oder Organkulturen, Kulturmedien usw. oder anderen biologischen Proben.
Die Herstellung von Antiseren, polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern kann nach bewährten Methoden vorgenommen werden. Zur Herstellung von Antiseren wird das gereinigte Typ IV-Kollagenase-Antigen Versuchstieren, beispielsweise Kaninchen oder Meerschweinchen, mehrere Male subkutan injiziert, und nach Ablauf einer geeigneten Zeitspanne von dem Tier oder den Tieren abgenommen. Das auftreten der spezifischen Antikörper in dem Antiserum wird dann nach den verschiedensten Methoden geprüft.
Etwa mit dem ELISA-Test, der westlichen Immunaufsaugmethode (western immunblotting technique) und Immunfär-bemethoden, die dem Fachmann an sich bekannt sind.
Die Erfinder haben nach eigenen Verfahren Antisera gegen das Maus-Typ IV-Kollagenase-Antigen hergestellt. Diese Antisera reagieren mit dem Mausantigen, wie sich durch Immunaufsaug-, ELISA-und Immunfluoreszenzverfahren nachweisen Hess.
Für die Herstellung eines üblichen Antiserums muss das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen als hochreines und homogenes Protein vorliegen. Es ist ausserordentlich schwierig, ausreichende Mengen reinen menschlichen Typ IV-Kollagenase-Antigens zu erhalten, um übliche Antisera bei Kaninchen und Meerschweinchen zu erzeugen. Zur Überwindung dieser Schwierigkeit haben die Erfinder nach dem Verfahren von Köhler und Milstein (Nature, 256,496, 1975) gearbeitet, um monoklonale Antikörper herzustellen. Ein Vorteil bei diesem Verfahren ist, dass das Antigen nicht absolut rein zu sein braucht, weil die spezifische Antikörper erzeugenden Zellklone (Hybriden) unter in vitro-Bedin-gungen selektiert werden können.
Nach dem obenerwähnten Verfahren wurden BALB/C-Mäuse zweimal subkutan mit lOOjxghochreinerTyp IV-Kollagenase immunisiert, die aus Kulturmedium von menschlichen Fibrosarkomzellen isoliert waren. Sechs Wochen danach wurden die Antiseren nach dem ELISA-Verfahren geprüft. Wenn die erhaltenen Ergebnisse befriedigten, wurden die Mäuse noch einmal mit einer geeigneten Menge Typ IV-Kollagenase-Antigen intravenös immunisiert. Dann wurden Milzzellen von zwei immunisierten Mäusen und Mäuse-Myelomzellen (NS-1) gekreuzt und nach den üblichen Methoden auf Mikrotiterplatten gezüchtet. Von 453 Plattenquellen waren 46 positiv auf Antikörper, wie nach dem ELISA-Verfahren festgestellt wurde.
Durch die obenbeschriebene Methode wurden zehn geeignete Hybrid-Reihen ermittelt. Diese zehn Hybrid-Reihen reagierten stark positiv auf maligne menschliche Fibro-sarkom- und Mammakarzinomzellen, reagierten aber nur wenig mit normalen menschlichen Hautfibroblasten. Drei dieser zehn Hybridzellenreihen, die die höchsten Titer aufweisen, wurden zum in vitro-Klonen durch die Verdünnungsmethode und zur Erzeugung von monoklonalen Antikörpern ausgewählt.
Die polyklonalen und monoklonalen Antikörper gegen das Typ IV-Kollagenase-Antigen, die in der oben beschriebenen Weise erzeugt, isoliert und gereinigt werden, können nach den dem Fachmann an sich bekannten, üblichen
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Methoden mit geeigneten radioaktiven, enzymatischen oder Fluoreszenz-Markierungen versehen werden.
Diese genannten polyklonalen und monoklonalen Antikörper und das genannte Typ IV-Kollagenase-Antigen, markiert oder unmarkiert, können an geeignete feste Träger gebunden werden und bei den immunologischen Methoden eingesetzt werden, die Teil dieser Erfindung sind.
Nach den Verfahren zum Nachweis von malignen Zellen mit metastatischer Zellaktivität wird das Vorhandensein von Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen in Körperflüssigkeiten, Gewebeextrakten, Gewebeschnitten und anderen biologischen Proben nach üblichen immunologischen Verfahren mit Hilfe von markierten oder unmarkierten, gebundenen oder nicht gebundenen Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen-Präparaten sowie markierten oder unmarkierlen, gebundenen oder nicht gebundenen polyklonalen oder monoklonalen Antikörperpräparaten bestimmt.
Bei den immunologischen Verfahren wurde Kaninchenan-tiserum benutzt, um die Anwesenheit von Typ IV-Kollagenase-Antigen zu bestimmen. Wie durch die westliche Aufsaugmethode (western blotting technique) gezeigt wurde, färbte das Antiserum zwei Proteine im Bereich 62 000 und 68 000, was dem gereinigten Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen entspricht. Darüber hinaus wurde das Antiserum zum immunologischen Färben von menschlichem Mammakarzinom- und normalem Mammagewebe benutzt. Gefrierschnitte des Gewebes wurden zunächst mit dem Antiserum und dann mit FITC-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG inkubiert. An den Ergebnissen zeigte sich, dass von zehn normalen Gewebeproben keine einzige eine positive Fluoreszenz lieferte, d.h. sie enthielten kein Typ I V-Kollagenase-Antigen. Andererseits zeigten alle fünfundzwanzig Mamma-karzinom-Gewebeproben starke Fluoreszenz im Randbereich des Tumors. Demnach kann mit den in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren die Anwesenheit von malignen Tumorzellen in Geweben festgestellt werden, und da die Färbung sich in erster Linie am Tumorrand einstellte, ist es offensichtlich, dass das Typ IV-Kollagenase-Antigen in eindringenden Zellen angereichert wird.
Aus Maus-Hybridklonen erzeugte Antikörper gegen menschliches Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen wurden zum immunologischen Färben von gezüchteten Zellen verwendet. Die untersuchten Zellen waren menschliches Fibro-sarkom(HT-1080), Mammakarzinomzellen (MCF-f) und normale menschliche Hautfibroblasten. Die Zellen wurden auf Mikrotiterplatten gezüchtet und mit den Antikörpern inkubiert. Dann wurden die Platten gewaschen und mit bioti-nyliertem Pferde-Antimaus-IgG/IgM inkubiert und gewaschen. Danach wurden die Avidin-Biotin-Peroxidase-Rea-genzien zugefügt, um die an die Zellen gebundenen Maus-I mmunglobulin-Antimaus-Immunglobulin-Komplexe zu färben. An den Ergebnissen zeigte sich, dass die malignen HT-1080 und MCF-7 gefärbt wurden, während die normalen Hautfibroblasten nicht gefärbt wurden. Danach ist offensichtlich, dass monoklonale Antikörper gegen menschliche Typ IV-Kollagenase angewandt werden kann, um maligne Zellen, die das Typ IV-Kollagenase-Enzymantigen enthalten, von normalen Zellen, die das genannte Enzymantigen nicht enthalten unterscheiden zu können.
Die Erfindung wird nun an den nachstehenden Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1
Isolierung von Typ IV-Kollagenase-Antigen. Zur Herstellung von Maus-Typ IV-Kollagenase werden zunächst meta-statische PMT-Tumore in C57B1/6J-Mäusen hervorgerufen. Nach etwa zwei Wochen Wachstum wurden die Tumore exzi-siert, zerkleinert und in einem serumfreien RPM1-1640-
Medium als Organkultur fünf Tage lang inkubiert. Das Medium wird täglich gesammelt und sein Protein mit Ammoniumsulfat (25 bis 60% Sättigung) gefällt. Der Niederschlag wird in dem Enzympuffer (0,05M Tris-HCl, pH 7,4, 0,2M NaCl, 10 mM CaCb) gelöst und durch eine Concana-valin-A-Agarose-Säule geleitet, in welcher der grösste Teil der Enzymaktivität gebunden wird. Die gebundene Aktivität wird mit 1M a-Methylmannosid eluiert und durch eine Typ IV-KolIagenagarose-Säule geleitet. Das mit der Säule gekoppelte Kollagen wird von der tumorbildenden EHS-Basal-membranmatrix extrahiert und gereinigt, und es enthält intakte Typ IV-Kollagenketten (185 000 und 175 000). Um den Abbau der Kollagenagarose durch das Enzym zu vermeiden, sind die Puffer während des Durchlaufs durch die Säule frei von CaCh. Die Enzymaktivität wird von der Säule mit Enzympuffer, der 1M NaCl oder 50% Ethylenalkohol enthält, eluiert. Die abschliessende Reinigung des Enzyms erfolgt durch Molekularsiebe, z.B. Bio-Gel A 0,5 m, wo es mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 160 000 wandert. Das auf diese Weise gereinigte Enzym weist zwei Poly-peptid-Ketten mit Molekulargewichten 68 000 und 82 000 auf.
Die Aktivität der menschlichen Typ IV-Kollagenase wird in gleicher Weise wie das Mausenzym gewonnen aus serumfreien Medien von gezüchteten menschlichen Fibrosarkom-Zellen (HT-1080). Die Zellen werden in DM EM gezüchtet, das 10% Fötal-Confluency in Kälberserum in Rollerflaschen enthält, wonach das Medium gegen das gleiche serumfreie Medium ausgetauscht wird. Das Medium wird fünf Tage lang täglich gesammelt.
Beispiel 2
Herstellung von Antiserum gegen Maus-Typ IV-KoIlage-nase. Das Antigen ( 100 bis 200 ug) wird subkutan in gleichen Volumina von phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und vollständigem Freund-Adjuvans injiziert und nochmals vier Wochen später mit unvollständigem Freund-Adjuvans. Verstärkungsinjektionen werden dann zweimal mit drei Wochen Abstand gegeben. Drei Wochen nach der letzten Verstärkungsinjektion wird Blut abgenommen, und das Serum wird auf Spezifität und Titer mit ELISA, westlichem Aufsaug- und Immunfärbeverfahren geprüft.
Beispiel 3
Herstellung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern. BALB/C-Mäuse werden mit 100 (ig teilgereinigtem HT-1080-Enzym in vollständigem Freund-Adjuvans immunisiert und noch zweimal immunisiert mit 50 jj.g Antigen im Abstand von drei Wochen. Die Titer der Antisera werden drei Wochen nach der letzten Injektion geprüft, und wenn sie befriedigend sind (Verdünnung ^ 1:500) nach dem ELISA-Verfahren, erhalten die Tiere 50 (ig Antigen intravenös. VierTage danach wird die Hybridisierung nach Köhler und Milstein (Nature, 256,496, 1975) vorgenommen. Immunisierte Milzzellen von zwei Mäusen werden mit NS-1 oder entsprechenden Myelom-Zellen vereinigt, und die vereinigten Zellen werden auf 96-Quell Mikrotiterplatten mit ungefähr 2.105 Zellen/Quelle plattiert, und Mäuse-Perito-neumzellen (Makrophagen) werden als Feeder-Zellen (6.103) benutzt. Die Zellen werden in einem selektiven HAT-Medium (DMEM) mit 10"4M Hypoxanthin, 10_7M Amino-peptin, 1,6* 105M und 20% FCS) drei bis vier Wochen lang gezüchtet. Dieses Medium lässt nur die Hybridzellen wachsen. Die Zellen werden durch ELISA auf Antikörperproduktion untersucht, und gewöhnlich sind etwa 10% der Quellen positiv. Die Spezifität der Antikörper wird ebenfalls durch die westliche Aufsaugmethode und immunologische Färbung geprüft.
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Das ELISA-Verfahren wird mit96-Quellen-Mikrotiler-platien ausgeübt. Ungefähr 50 bis 100 ng Antigen werden in jede Quelle gegeben und getrocknet. Freie Bindungsplätze werden für die Dauer von 30 min blockiert mit 50 jj.1 1% FCS, und die Quellen werden mit PBS gewaschen. Dann werden Hybridüberstände als Antisera zu den Quellen gegeben (50 ul) und inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS werden 50 ul biotinylierte Pferd-Antimaus-IgG-Lösung mit 1% FCS zugegeben und 30 min lang inkubiert; anschliessend wird mit PBS gewaschen. Danach wird ein Avidin-Biotin-Peroxidas-Reagens zugefügt und inkubiert. Danach wird das Peroxidasesubstrat (0,01%0-Dianisidin, 0,01% H2O2 in PBS) zugegeben, und die entstandene braune Färbung wird in einem Titertek-Multiscan-Spektrophotometer gemessen.
Die westliche Aufsaugmethode kann angewandt werden, um die Antikörper besser zu charakterisieren, weil sie anzeigt, mit genau welchen Polypeptidketten der Antikörper reagiert. Das Antigen oder ein das Antigen enthaltendes Proteingemisch wird zuerst durch eine 10%-Natriumdodecylsul-fatpolyacrylamid-Gelelektrophorese getrennt, wonach Flecke der Proteine horizontal auf eine Nitrozellulosefolie gegeben werden bei 0,1 A Strom während einer Nacht. Dann wird die Folie mit einer Heparin-Toluidin-Färbelösung gefärbt. Die proteinhaltenden Nitrocellulosestreifen werden dann ausgeschnitten und die Färbung mit einer Lösung (50% Ethanol, 8°/o Essigäsure, 42% Wasser) beseitigt. Die Immunfärbung des Streifens wird dann mit der gleichen Methode vorgenommen wie bei ELISA. Positive Antikörper geben nur eine Braunfärbung der Antigene, es ist aber zu beachten, dass man, wenn der Antikörper gegen tertiäre Strukturen des Antigens gerichtet ist, zu einem negativen Ergebnis kommen kann, weil die Proteine während der Gel-Elektrophorese denaturiert werden.
Beispiel 4
Immunfärbung von Typ IV-Kollagenase. Kaninchen-Anti-serum gegen gereinigte Maus-Typ IV-Kollagenase wurde verwendet, um die Lokalisierung des Enzyms bei normalem Mammagewebe und bei menschlichem malignen Mamma-karzinom-Gewebe zu untersuchen. Gefrierschnitte (5 (im stark) von zehn normalen Mammagewebeproben und fünf-5 undzwanzig Mammakarzinomgewebeproben wurden mit 1% FCS präinkubiert und dann mit PBS gewaschen. Danach wurde das Antiserum, 1:50 verdünnt, mit den Proben zwei Stunden lang bei 20°C inkubiert und dann mit PBS gewaschen. Dann wurden die Schnitte mit FITC-konjugiertem 1« Ziegen-Antikaninchen-Serum über Nacht bei 4°C inkubiert und mit PBS gewaschen. Danach wurde die Fluoreszenz untersucht. Die Ergebnisse lassen erkennen, dass keines der normalen Gewebe gefärbt wurde, während alle fünfundzwanzig Krebsgewebe eine deutliche Fluoreszenz lieferten. 15 Die Färbung war am intensivsten an der Randlinie invasiver Tumoren, und zwischen 10 und 80% der Tumorzellen waren positiv.
Monoklonale Antikörper gegen menschliche HT-1080-Sakromzellen-Typ IV-Kollagenase wurden zum Färben von 20 gezüchteten HT-1080-Zellen, menschlichen Mammakarzi-nomzellen (MCF-7) und menschlichen Hautfibroblasten benutzt. Die Zellen wurden auf Deckgläsern zu Subconflu-ency gezüchtet und mit Methanol bei -20°C zehn Minuten lang fixiert. Dann wurden die Zellen mit 1% FCS präinku-25 biert und mit PBS gewaschen, woraufhin sie mit den Maus-Antikörpern zwei Stunden lang bei 20°C inkubiert und dann gewaschen wurden. Dann wurden die Zellen 30 min lang mit biotinlyiertem Pferd-Antimaus-IgG inkubiert, gewaschen und mit einem Avidin-Biotin-Peroxidase-Reagens inkubiert. 30 Schliesslich wurden die Zellen mit dem Peroxidasesubstrat inkubiert. Die Antikörper zeigten eine deutliche Färbung der malignen HT-1080- und MCF-Zellen, während die Fibroblasten negativ waren.
Beide Beispiele für Immunfärbung zeigen, dass die Anti-35 körper gegen Typ IV-Kollagenase maligne Tumorzellen mit Eindringfähigkeiten nachweisen können.
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Claims (13)

  1. 668 838
    PATENTANSPRÜCHE
    1. Verfahren zum Ermitteln von malignen Tumorzellen mit metastatischer Zellaktivität durch immunologische Bestimmung von Basalmembran abbauenden Metallprotei-nase-Antigenen. deren Substrat Typ IV-Kollagen ist und die ein Molekulargewicht von ungefähr 70 000 haben, in biologischen Proben.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Antigene durch kompetitiven Immuntest bestimmt werden.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch I oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:
    a) Gewebeschnitle oder Zellen werden mit einem ersten Antikörper inkubiert, der spezifisch für das genannte Antigen ist;
    b) man lässt den ersten Antikörper sich an die Antigene anlagern;
    c) ein zweiter markierter Antikörper gegen den ersten Antikörper wird zugefügt, und der zweite markierte Antikörper lagert sich an den ersten Antikörper an und zeigt die Anwesenheit von Antigen in der Probe an.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:
    a) ein markiertes genanntes Antigen wird in Gegenwart der zu prüfenden Probe mit einem ersten Antikörper inkubiert, der spezifisch ist für das genannte Antigen;
    b) man lässt die Reaktion ablaufen, wodurch das Antigen der Probe mit dem markierten Antigen um den Antikörper konkurriert;
    c) der entstandene Antigen-Antikörper-Komplex wird abgetrennt;
    d) die Menge des markierten Antigens in dem Komplex oder dem Überstand wird bestimmt.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst;
    a) Antikörper gegen die genannten Metallproteinase-Anti-gene werden mit der Probe inkubiert;
    b) man lässt das genannte Antigen in der Probe sich an den Antikörper anlagern ;
    c) ein zweiter markierter Antikörper, der sich an einen anderen Platz an das genannte Antigen anlagert, wird zugegeben ;
    d) die Menge des markierten Antikörpers, die sich nicht an das genannte Antigen anlagern kann, wird gemessen.
  6. 6. Enzympräparate zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie gereinigte, Basalmembran abbauende Metallproteinasen enthalten, deren Substrat Typ IV-Kollagen ist und die ein Molekulargewicht von ungefähr 70 000 haben.
  7. 7. Enzympräparate nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit Markierungen versehen sind.
  8. 8. Enzympräparate nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie an feste Träger gebunden sind.
  9. 9. Antikörperpräparale zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie polyklo-nale Antikörper gegen Basalmembran abbauende Metallpro-teinase-Antigene, deren Substrat Typ IV-Kollagen ist und die ein Molekulargewicht von ungefähr 70 000 haben, enthalten.
  10. 10. Antikörperpräparate zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie monoklonale Antikörper gegen Basalmembran abbauende Metallproteinase-Antigene, deren Substrat Typ IV-Kollagen ist und die ein Molekulargewicht von ungefähr 70 000 haben, enthalten.
  11. 11. Antikörperpräparate nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit Markierungen versehen sind.
  12. 12. Antikörperpräparate nach einem der Ansprüche 9 bis
    11, dadurch gekennzeichnet, dass sie an festeTräger gebunden sind.
  13. 13. Reinigungsverfahren zur Herstellung von Antigenprä-paralen zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Basalmembran abbauende Metallproteinase-Antigene, deren Substrat Typ IV-Kollagen ist und die ein Molekulargewicht von ungefähr 70 000 haben, gereinigt werden mit Hilfe von Antikörpern gegen die genannten Antigene, wobei die genannten Antikörper an feste Träger angelagert sind.
CH2471/84A 1983-05-19 1984-05-18 Verfahren zum ermitteln von malignen tumorzellen mit metastatischer zellaktivitaet. CH668838A5 (de)

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