DE69630291T2

DE69630291T2 - Proteinformulierung, die koajulationsfehler viii oder ix in einer saccharose wässriger lösung enthält

Info

Publication number: DE69630291T2
Application number: DE69630291T
Authority: DE
Inventors: Thomas Österberg; Angelica Fatouros
Original assignee: Biovitrum AB
Current assignee: Swedish Orphan Biovitrum AB
Priority date: 1995-03-31
Filing date: 1996-03-29
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2016-03-30
Also published as: SE9501189D0; DK0819010T3; AU709642B2; JPH11502833A; DE69630291D1; PT819010E; AU5293496A; EP0819010A1; WO1996030041A1; US5919908A; BR9607922A; CA2216098C; ES2208736T3; CA2216098A1; NZ305028A; ATE251467T1; JP3953102B2; EP0819010B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Arzneimittelendprodukt aus einem Plasmaprotein, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus dem Gerinnungsfaktor VIII und Faktor IX in einer wäßrigen Lösung, worin die Konzentration von Sauerstoff in der Lösung verringert worden ist durch ein Unterwerfen der Lösung an ein Inertgas, bzw. indem sie einem Inertgas ausgesetzt wurde und/oder die Lösung ein Antioxidationsmittel enthält, und worin die Lösung ferner Saccharose in einer Konzentration von mindestens 550 mg/ml enthält. Auf diese Weise kann die Proteinaktivität im wesentlichen nach einer Lagerung während mindestens 6 Monaten beibehalten werden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Verfahren zur Verbesserung der Langzeitstabilität des Gerinnungsfaktors VIII und Faktors IX in einer wäßrigen Lösung, worin die Lösung ein Kohlenhydrat in einer Konzentration von mindestens 550 mg/ml enthält und worin die Lösung in ihrem endgültigen Behältnis unter einer Atmosphäre mit verringertem Sauerstoff gelagert wird.
Hintergrund der Erfindung
Die Stabilität von Proteinen ist allgemein ein Problem in der pharmazeutischen Industrie. Es wurde oft gelöst, indem das Protein in verschiedenartigen Trocknungsverfahren getrocknet wurde, wie Gefriertrocknen. Das Protein wurde danach in getrockneter Form versandt und gelagert. Die Lösung vor dem Trocknen oder dem Gefriertrocknen, das getrocknete Material und das rekonstituierte Produkt sollten alle stabil sein, um einen wesentlichen Verlust der Aktivität in dem Trocknungsverfahren zu vermeiden, sowie während der Lagerung oder der Handhabung. Das Verfahren des Gefriertrocknens ist ein kostspieliger und zeitaufwendiger Verfahrensschritt, welcher den Ertrag des Produktes verringert. Es wäre daher ein großer Vorteil, falls dieser Schritt vermieden werden könnte, wenn ein kommerzielles Produkt hergestellt wird. Darüber hinaus muß der Patient das getrocknete Protein in einem Lösemittel vor der Verabreichung notwendigerweise rekonstituieren, was für den Patienten unbequem sein könnte.
Hämophilie ist eine Erbkrankheit, welche seit Jahrhunderten bekannt ist, aber erst innerhalb der letzten vier Dekaden war es möglich, zwischen den unterschiedlichen Formen zu unterscheiden; Hämophilie A und Hämophilie B. Hämophilie A ist die häufigste Form. Sie betrifft nur Männer mit einer Häufigkeit von ein oder zwei Individuen pro 10 000 männlicher lebend Geborener. Die Erkrankung wird durch ein in starker Weise verringertes Niveau oder die Abwesenheit von biologisch aktivem Gerinnungsfaktor VIII (antihämophiler Faktor), verursacht, welcher ein Protein ist, welches normalerweise in Plasma vorhanden ist. Die klinische Manifestation von Hämophilie A ist eine starke Tendenz zur Blutung und bevor eine Behandlung mit Konzentraten von Faktor VIII eingeführt wurde, war das durchschnittliche Alter der betroffenen Patienten geringer als 20 Jahre. Konzentrate von Faktor VIII, welche aus Plasma erhalten wurden, waren seit etwa 3 Dekaden verfügbar. Dies hat die Situation der Behandlung von Hämophiliepatienten beträchtlich verbessert und ihnen die Möglichkeit geboten, ein normales Leben zu führen.
Eine Formulierung mit einer niedrigen Konzentration von Protein wie dem Faktor VIII wird im allgemeinen an Aktivität während der Reinigung, der sterilen Herstellung, in der Verpackung und während der Verabreichung verlieren. Dieses Problem wird gewöhnlich durch die Zugabe von Humanserum-Albumin (HSA) gelöst, welches den Verlust des aktiven Proteins beträchtlich verringert. HSA funktioniert als ein allgemeines stabilisierendes Mittel während der Reinigung, der sterilen Herstellung und der Gefriertrockung (siehe Review bei Wang et al., J. of Parenteral Sci. and Tech., Bnd. 42, Nr. 2S, Supplement, 1988). Die Verwendung von HSA zur Stabilisierung von Faktor VIII ist bekannt und wird zur Zeit in allen hochgereinigten Produkten von Faktor VIII auf dem Markt verwendet. Die Verwendung von HSA ist jedoch kostspielig und es ist wünschenswert, die Zugabe von HSA zu einem therapeutischen Protein, welches durch eine rekombinante DNA-Technik hergestellt wurde, zu vermeiden. Zusätzlich limitiert die Verwendung von HSA als ein Inhaltsstoff der Formulierung oft die Verwendung von vielen der stärksten und sensitivsten analytischen Verfahren zur Charakterisierung von Proteinen.
Verschiedene Lösungen wurden zur Stabilisierung verschiedener Proteine vorgeschlagen, ohne eine Verwendung von HSA. Zum Beispiel schlägt die WO-A-94/26286 an Pharmacia, die Verringerung der Sauerstoffkonzentration als ein Mittel zur Verbesserung der Stabilität von gebrauchsfertigen Lösungen von Faktor VIII vor. Darüber hinaus wurden Kohlenhydrate wie Disaccharide oder Zuckeralkohole zuvor zur Stabilisierung von Lösungen, welche konventionelle Produkte von Faktor VIII mit einer niedrigen Reinheit enthielten, verwendet. Daher offenbart die Patentbeschreibung WO-A-91/10439 an Octapharma injizierbare Lösungen, welche Faktor VIII oder Faktor IX enthalten, umfassend natürliche oder synthetische Disaccharide in einer Konzentration von 0,1 bis zu 0,9 Mol/l.
Kohlenhydrate wie Disaccharide oder Zuckeralkohole wurden zuvor ebenfalls zur Stabilisierung von Zusammensetzungen von Faktor VIII während einer Wärmebehandlung zur Inaktivierung von Viren verwendet. Daher offenbart die Patentanmeldung EP-B-0 117 064 an Green Cross das Vorhandensein von mindestens 1 500 mg/ml eines Zuckeralkohol- oder eines Disaccharid-Stabilisierungsmittels, bevorzugtermaßen Sorbitol oder Saccharose. Das Verfahren kann während 3 bis zu 24 Stunden bei 30–80°C oder während 1 Minute bei 90°C durchgeführt werden. Der Zuckeralkohol oder das Disaccharid werden nach der Wärmebehandlung entfernt, z. B. durch eine Ultrafiltration. Die Patentbeschreibung EP-A-0 018 561 an Behringwerke offenbart das Vorhandensein einer Aminosäure und von 20 bis 60% (Gew./Gew.) eines Monosaccharids, eines Oligosaccharids oder einer Zuckeralkohols. Dies entspricht 500 bis 1500 mg/ml Saccharid oder Alkohol unter der Annahme, daß die relative Dichte der Lösung 1 ist. Das Verfahren kann während einer Minute bis zu 48 Stunden bei 30– 100°C durchgeführt werden. Die Patentbeschreibung WO-A-94/17834 an Octapharma offenbart die Wärmebehandlung von Zusammensetzungen, welche ein Protein und ein Dialkylphosphat oder Trialkylphosphat enthalten während 5 bis zu 30 Stunden bei 55 bis zu 67°C, um Viren, welchen Lipidhüllen fehlen, zu inaktivieren. Die Zusammensetzung kann des weiteren Stabilisierungsmittel wie Saccharose, Sorbitol oder kurzkettige neutrale Aminosäuren enthalten.
Die WO-A-87/00196 an Quadrant Bioresources offenbart die Verwendung von Trehalose zum Schutz von Proteinen und anderen Makromolekülen vor einer Denaturierung während des Trocknens bei Umgebungstemperatur. Die Beispiele legen offen, daß die getesteten Verbindungen, hauptsächlich Antikörper und Enzyme, nicht nur während des Trocknungsverfahrens stabilisiert werden, sondern ebenfalls gegenüber einer Langzeitlagerung bei relativ hohen Umgebungstemperaturen stabilisiert werden. Es liegt keine Information vor über entweder Faktor VIII oder Faktor IX noch über wäßrige Lösungen mit einer verringerten Konzentration an Sauerstoff.
In der WO-A-91/18 091 an Quadrant Holdings Cambridge wird festgestellt, daß Zucker im allgemeinen von einem beschränkten Nutzen zur Stabilisierung von biologischen Substanzen oder organischen Verbindungen sind. In einer spezifischen Weise wird festgestellt, daß nichtreduzierende Zucker wie Saccharose eine sehr minderwertige Langzeitstabilisierung bereitstellen. Um dieses Problem zu überwinden, offenbart die WO-A-91/18 091 die Verwendung bestimmter Zucker oder Zuckerderivate, welche ohne ein Kristallisieren getrocknet werden können, und welche nicht-reduzierende Polyhydroxyverbindungen sind, die in der Lage sind, die Wirkung von Trehalose nachzubilden. Im besondereren werden die Zucker oder die Zuckerderivate ausgewählt aus (i) einem nicht-reduzierenden Glycosid einer Polyhydroxyverbindung, ausgewählt aus Zuckeralkoholen und anderen geradkettigen Polyalkoholen oder (i) einem nicht-reduzierenden Oligosaccharid, ausgewählt aus Raffinose, Stachyose und Melezitose. Es liegt keine Information über entweder den Faktor VIII oder den Faktor IX vor, noch über wäßrige Lösungen mit einer verringerten Konzentration an Sauerstoff.
Es würde die Verwendung und die Herstellung von Plasmaproteinen erleichtern, falls das Protein formuliert und dem Patienten geliefert werden könnte als eine stabile Lösung ohne die Zugabe von Albumin und mit einer verlängerten Lagerungszeit bzw. Haltbarkeitsdauer. Für den Patienten würde eine solche Lösung ebenfalls die Handhabung des Arzneimittelendproduktes erleichtern. Der Patient könnte daher den Inhalt des Arzneimittelendproduktes verabreichen, z. B. injizieren, in einer direkten Weise ohne ein Rekonstituieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Lösungen von Faktor VIII werden daher virusinaktiviert durch eine Wärmebehandlung der Lösungen, welche verschiedenartige stabilisierende Mittel enthalten, während einer Zeitperiode, welche kleiner ist als etwa 2 Tage. Techniken, um Proteine zu stabilisieren, welche einer hohen Temperatur während einer kurzen Zeitperiode unterzogen werden, können jedoch nicht direkt auf die Stabilität während der Lagerung bei einer geringen oder der Umgebungstemperatur während einiger Monate oder Jahre übertragen werden. Dies ist insbesondere wahr, da im allgemeinen die Saccharide oder Zuckeralkohole, die zugegeben werden, entfernt werden, absichtlich oder unvermeidlich, in den Verfahrensschritten, welche der Wärmebehandlung folgen. Hier wird bezug genommen auf Schwinn et. al., Arzneim. Forsch./-Drug Res., Bnd. 39 (II) 10, S.1302–1305 (1989). Ebenfalls muß die Durchführbarkeit der Formulierung bei der sterilen Herstellung in Erwägung gezogen werden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben überraschenderweise gefunden, daß die Lagerungsstabilität gebrauchsfertiger wäßriger Lösungen, welche Gerinnungsfaktor VIII oder IX in einer dramatischen Weise durch das Vorhandensein eines hohen Anteils an Saccharose verbessert werden kann.
Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Arzneimittelendprodukt eines Plasmaproteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gerinnungsfaktor VIII und Faktor IX in einer wäßrigen Lösung, worin die Konzentration von Sauerstoff in der Lösung verringert worden ist durch Unterwerfen der Lösung an ein Inertgas, und/oder die Lösung ein Antioxidationsmittel enthält, worin die Lösung ferner ein Kohlenhydrat in einer Konzentration von mindestens 550 mg/ml enthält, um im wesentlichen die Proteinaktivität nach einer Lagerung während mindestens 6 Monaten beizubehalten.
Die Proteinaktivität wird in einem höheren Maß beibehalten, wenn die Konzentration von Saccharose in dem Bereich von 550 mg/ml bis zur Sättigung unter den Bedingungen, welche in dem Arzneimittelendprodukt herrschen, liegt. Die Sättigungskonzentration von Saccharose wird zum Beispiel beeinflußt durch die Temperatur, die Ionenstärke, den pH und andere Inhaltsstoffe, falls vorhanden. Die hohe Konzentration von Saccharose in der Lösung des Plasmaproteins ergibt ein Arzneimittelendprodukt mit merklich verbesserter Lagerungsstabilität im Vergleich zu zuvor bekannten Plasmaproteinprodukten. Daher wird das Arzneimittelendprodukt der vorliegenden Erfindung während mindestens 6 Monaten mit einer im wesentlichen beibehaltenen Proteinaktivität gelagert. Der zuletztgenannte Bereich stimmt überein mit den Erfordernissen des Tests für die Potenz (potency) von gefriergetrocknetem humanem Gerinnungsfaktor VIII. Daher wird in der European Pharmacopeia, 1994, S. 275 festgestellt, daß die Aktivität innerhalb des Bereiches von 80 bis zu 120% des vermerkten Wertes beibehalten werden muß. Geeigneterweise werden die gegenwärtigen Arzneimittelendprodukte während mindestens 12 Monaten gelagert und bevorzugtermaßen während mindestens 18 Monaten, mit einer im wesentlichen beibehaltenen Aktivität von Faktor VIII. Mehr zu bevorzugen, werden die gegenwärtigen Arzneimittelendprodukte während mindestens 24 Monaten gelagert.
Die hohe Konzentration von Saccharose in der Plasmaproteinlösung gestattet ebenfalls eine Lagerung bei einer höheren Temperatur als sie zuvor als möglich erachtet wurde, um eine Abnahme bei der Proteinaktivität zu vermeiden. Daher kann das gegenwärtige Arzneimittelendprodukt bei einer Temperatur in dem Bereich von 0 bis 40°C gelagert werden. Das gegenwärtige Arzneimittelendprodukt wird geeigneterweise bei einer Temperatur in dem Bereich von 2 bis zu 30°C gelagert und bevorzugtermaßen bei einer Temperatur in dem Bereich von 4 bis zu 20°C. Es ist sogar recht wahrscheinlich möglich, das gegenwärtige Arzneimittelendprodukt während einer Langzeitperiode bei einer Temperatur in dem Bereich von 10 bis zu 25°C zu lagern.
Das Arzneimittelendprodukt bezieht sich auf eine stabile, im allgemeinen injizierbare wäßrige Lösung in ihrem endgültigen Behältnis. Das Arzneimittelendprodukt umfaßt daher eine stabile, wäßrige, gebrauchsfertige Lösung. Das Arzneimittelendprodukt wird nach einer Reinigung erhalten, einschließlich von einem oder mehreren sterilfiltrierenden Schritten und wahlweise einem oder mehreren Virus inaktivierenden Schritten. Geeignete Behältnisse in der vorliegenden Erfindung sind z. B. Ampullen, Spritzen und Injektionsvorrichtungen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Zur Herstellung des Arzneimittelendproduktes wird das Plasmaprotein mit einer wäßrigen Lösung gemischt oder das Plasmaprotein wird aus dem letzten Reinigungsschritt mit einer wäßrigen Pufferlösung eluiert. Danach wird Saccharose zu der erhaltenen wäßrigen, das Plasmaprotein enthaltenden Lösung gegeben. Saccharose wird bis zu einer Konzentration von mindestens 550 mg/ml in dem Arzneimittelendprodukt zugegeben.
Die wäßrige, das Plasmaprotein und ein Kohlenhydrat enthaltende Lösung wird dann sterilfiltriert. Danach wird die sterile Plasmaproteinlösung, welche Kohlenhydrat enthält, dispergiert in ihrem endgültigen Behältnis, wonach die Sauerstoffkonzentration der Plasmaproteinlösung verringert wird. Die zwei Schritte, welche auf die Sterilfiltration folgen, können ebenfalls in der umgekehrten Reihenfolge durchgeführt werden, d. h. die Sauerstoffkonzentration der sterilen Plasmaproteinlösung, welche Kohlenhydrat enthält, wird erst verringert, wonach die Plasmaproteinlösung in ihrem endgültigen Behältnis dispensiert wird.
Die Sauerstoffkonzentration wird verringert durch ein Unterwerfen, bzw. ein Aussetzen der wäßrigen Lösung einer Atmosphäre von Inertgas, durch das Verringern des Drucks, oder indem erst der Druck verringert und danach ein Inertgas eingeführt wird. Das zuletzt genannte Verfahren wird bevorzugtermaßen in mehreren Zyklen wiederholt. Durch dieses Verfahren wird die resultierende Konzentration von Sauerstoff in der Lösung wesentlich niedriger sein, als sie es in dem Fall sein würde, wenn die Umgebungsatmosphäre aus Luft bestünde. Daher kann durch dieses Verfahren die Sauerstoffkonzentration in der Lösung auf ein niedriges Niveau verringert werden, ohne einen wesentlichen Verlust bei der Aktivität des Plasmaproteins. Der Sauerstoffgehalt in der Lösung kann unterhalb von 200 ppm sein, geeigneterweise unterhalb von 50 ppm, bevorzugtermaßen unterhalb von 10 ppm und mehr zu bevorzugen unterhalb von 2 ppm. Der Sauerstoffgehalt in dem verwendeten Behältnis kann verringert werden und bei einem niedrigen Niveau auf dieselbe Weise gehalten werden, indem das Behältnis einer Inertgasatmosphäre unterzogen wird.
Die wäßrige Lösung, welche ein Plasmaprotein und Saccharose enthält, wird geeigneterweise gelagert unter einem Inertgas, wie Stickstoff, Argon oder Helium, um im wesentlichen den niedrigen Gehalt an Sauerstoff aufrechtzuerhalten. Das Inertgas ist bevorzugtermaßen ein unedles Inertgas und mehr zu bevorzugen Stickstoff.
Der niedrige Gehalt an Sauerstoff kann ebenfalls im wesentlichen aufrechterhalten werden durch die Zugabe eines Antioxidationsmittels zu der wäßrigen Lösung. Daher wird in einer anderen Ausführungsform ein Antioxidationsmittel zugegeben vor dem Schritt des Sterilfiltrierens und die Konzentration des Sauerstoffs wird verringert, entweder indem die wäßrige Lösung einer Inertgasatmosphäre unterzogen wird durch die Verringerung des Drucks oder indem zuerst der Druck verringert und danach ein Inertgas eingeführt wird, bevorzugtermaßen wiederholt in mehreren Zyklen.
In noch einer anderen und weniger bevorzugten Ausführungsform wird ein Antioxidationsmittel zu der wäßrigen Lösung vor dem Schritt des Sterilfiltrierens zugegeben ohne die Sauerstoffkonzentration durch andere Mittel zu verringern.
Das Antioxidationmittel kann ausgewählt werden aus Glutathion, Acetylcystein, Methionin, Tocopherol, Butylhydroxytoluol, Butylhydroxyanisol oder phenolischen Verbindungen. Bevorzugtermaßen ist das Antioxidationsmittel mindestens eine Verbindung ausgewählt aus der aus Glutathion, Acetylcystein und Methionin bestehenden Gruppe.
Die Konzentration und die Gesamtmenge des Antioxidationsmittels hängt von der verwendeten Verbindung ab. Daher kann keine Konzentration oder Menge in allgemeiner Weise angegeben werden. Es ist jedoch wichtig, daß die Gesamtmenge des Antioxidationsmittels, falls verwendet, eine pharmazeutisch akzeptable Menge ist.
Komplexbildende Mittel wie EDTA und Citronensäure können ebenfalls in niedrigen Konzentrationen zur Stabilisierung der Formulierung vorhanden sein, falls sie eine stärkere Affinität für destabilisierende Metallionen aufweisen, als für die Metallionen, welche die Ketten von z. B. Faktor VIII assoziieren.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Verbesserung der Langzeitstabilität von Plasmaproteinen in einer wäßrigen Lösung, worin die Lösung des weiteren Saccharose in einer Konzentration von mindestens 550 mg/ml enthält, und die Lösung in ihrem endgültigen Behältnis unter einer Sauerstoff-verringerten Atmosphäre gelagert wird, unter einer Inertgasatmosphäre. Geeigneterweise ist das Plasmaprotein der Faktor VIII und die Konzentration des Kohlenhydrates in der in ihrem endgültigen Behältnis gelagerten wäßrigen Lösung liegt in dem Bereich von 550 mg/ml bis zur Sättigung.
Die Erfindung ist hauptsächlich anwendbar auf Plasmaproteine, ausgewählt aus der aus Gerinnungsfaktor VIII und Faktor IX bestehenden Gruppe. Die Erfindung wird im folgenden detaillierter unter Bezug auf den Faktor VIII beschrieben werden.
Der pH-Wert der Lösung liegt geeigneterweise in dem Bereich von 6,0 bis 8,8, bevorzugtermaßen 6,5 bis 7,5.
Ein nichtionisches Tensid ist bevorzugtermaßen in der Lösung vorhanden. Das nichtionische Tensid, falls vorhanden, wird bevorzugtermaßen ausgewählt aus Blockcopolymeren wie Poloxamer oder Polyoxyethylensorbitanfettsäureester wie Polysorbat 20 oder Polysorbat 80.
Das nichtionische Tensid sollte, falls vorhanden, in einer Konzentration oberhalb der kritischen Micellenkonzentration (CMC) verwendet werden. Siehe Wan und Lee, Journal of Pharm. Sci. 63, S. 136–137, 1974. Der Polyoxyethylensorbitanfettsäureester wird daher bevorzugtermaßen in einer Konzentration von mindestens 0,01 mg/ml verwendet.
Die wäßrige Lösung kann des weiteren Natrium- oder Kaliumchlorid enthalten, geeigneterweise in einer Konzentration von mehr als 0,1 M, bevorzugtermaßen mehr als 0,25 M.
Die wäßrige Lösung enthält geeigneterweise ein pufferndes Mittel in einer Konzentration von mehr als 1 mM, bevozugtermaßen 10–95 mM. Das puffernde Mittel ist bevorzugtermaßen eine Aminosäure ausgewählt aus der aus L-Histidin, Lysin und Arginin oder Mischungen davon bestehenden Gruppe. Mehr zu bevorzugen ist das puffernde Mittel L-Histidin.
Das Arzneimittelendprodukt umfaßt bevorzugtermaßen eine wäßrige Lösung, welche enthält

i) 10–50 000 IU/ml von rekombinantem Gerinnungsfaktor VIII
ii) mindestens 0,01 mg/ml eines Polyoxyethylensorbitanfettsäureesters
iii) Natriumchlorid, geeigneterweise in einer höheren Konzentration als 0,1 M und bevorzugtermaßen höher als 0,25 M
iv) ein Calciumsalz, wie Calciumchlorid oder Calciumgluconat, bevorzugtermaßen in einer Konzentration von mehr als 0,5 mM.
v) ein pufferndes Mittel wie L-Histidin in einer Konzentration von mehr als 1 mM.
vi) Saccharose in einer Konzentration von mindestens 550 mg/ml.

Konzentrate von Faktor VIII, welche aus humanem Plasma stammen, enthalten verschiedene fragmentierte vollständig aktive Formen von Faktor VIII, wie beschrieben von Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, S. 2979–83 (Mai 1986). Die kleinste aktive Form hat ein Molekulargewicht von 170 kDa und besteht aus zwei Ketten von 90 kDa und 80 kDa, welche durch eine Metallionenbrücke zusammengehalten werden. Hier wird Bezug genommen auf EP-A-0197901.
Pharmacia AB aus Stockholm, Schweden hat ein rekombinantes Faktor VIII Produkt entwickelt, welches der 170 kDa Form des Plasmafaktors VIII in therapeutischen Faktor VIII-Konzentraten entspricht. Das trunkierte rekombinante Molekül von Faktor VIII wird als r- VIII SQ bezeichnet und durch Ovarzellen vom Chinesischen Hamster (CHO) in einem Zellkulturverfahren in serumfreiem Medium produziert. Die spezifische Aktivität von r-VIII SQ ist etwa 15 000 IU VIII : C pro mg des Gesamtproteins. Die Struktur und die Biochemie von r-VIII SQ wurden beschrieben in der WO-A-91/09 122, erteilt an Pharmacia AB.
In der vorliegenden Erfindung kann der Faktor VIII entweder Plasmafaktor VIII oder rekombinanter Faktor VIII sein. Wenn Faktor VIII rekombinant ist, kann er der Volllängenfaktor VIII sein, oder bevorzugtermaßen ein Deletionsderivat des Vollängen-Faktors VIII. Mehr bevorzugt ist das Deletionsderivat rekombinanter Faktor VIII SQ (r-VIII SQ. In diesem Zusammenhang wird ein Deletionsderivat definiert als ein Gerinnungsfaktor VIII in welchem die gesamte oder ein Anteil der B-Domäne fehlt.
Die Assoziation der schweren und leichten Ketten von Faktor VIII ist abhängig von der Gegenwart von Calcium (oder anderen divalenten Metallionen). Hier wurde Calcium als Calciumchlorid (CaCl₂) zugegeben, aber andere Salze wie Calciumgluconat, Calciumglubionat oder Calciumgluceptat können ebenfalls verwendet werden, bevorzugtermaßen in einer Konzentration von mehr als 0,5 mM.
Die vorliegende Erfindung kann vorteilhafterweise für eine weite Vielfalt von Faktor VIII Produkten verwendet werden. Daher kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um des weiteren Plasmafaktor VIII zu stabilisieren, welcher bereits durch eine Assoziation mit seinem Trägerprotein, dem von Willebrandfaktor (vWf) stabilisiert ist. Der Vorteil der vorliegenden Erfindung wird jedoch stärker hervorgehoben mit in hohem Maße gereinigten Faktor VIII-Produkten, da diese Produkte instabiler sind als weniger gereinigte Produkte, welche z. B. den vWf enthalten. Daher ist es viel wahrscheinlicher, daß Faktor VIII-Produkte, welche kleine Mengen von dem vWf oder überhaupt kein vWf enthalten, degradieren. Daher wird die vorliegende Erfindung geeigneterweise mit Faktor VIII-Produkten verwendet, welche ein Verhältnis von Faktor VIII : C (IU) zu vWF : Ag (IU) von mindestens 2 : 1 aufweisen, geeignetererweise von mindestens 10 : 1 und bevorzugtermaßen von mindestens 100 : 1. Mehr bevorzugt enthält das Faktor VIII-Produkt der vorliegenden Erfindung kein vWf.
Die spezifische Faktor VIII-Aktivität in dem Arzneimittelendprodukt der vorliegenden Erfindung ist geeigneterweise mindestens 1000 IU/mg Gesamtprotein und geeignetererweise mindestens 3 000 IU/mg Gesamtprotein. Die spezifische Aktivität von Faktor VIII in dem Arzneimittelendprodukt der vorliegenden Erfindung ist bevorzugtermaßen mindestens 5 000 IU/mg Gesamtprotein und mehr zu bevorzugen mindestens 10 000 IU/mg Gesamtprotein.
Die Aktivität von Faktor VIII in dem Arzneimittelendprodukt kann in dem Bereich von 10– 50 000 IU/ml liegen, geeigneterweise von 50 bis zu 25 000 IU/ml und bevorzugtermaßen von 100 bis zu 10 000 IU/ml.
Die vorliegende Erfindung wird vorteilhafterweise für Arzneimittelendprodukte von Faktor VIII und Faktor IX verwendet, welche ohne eine Zugabe von Albumin stabilisiert wurden.
Die folgenden Beispiele sind dazu gedacht, die Erfindung weiter zu erläutern, indem Stabilitätsdaten für wäßrige Lösungen, welche Saccharose enthalten gezeigt werden.
Experimentelles
Herstellung von rekombinantem Faktor VIII SQ
Die Herstellung von rekombinantem Faktor VIII SQ (r-VIII SQ wurde im wesentlichen durchgeführt wie beschrieben in dem Patent WO-A91/09 122 Beispiele 1–3. Eine DHFRdefiziente CHO-Zelllinie (DG44N.Y.) wurde mit einem Expressionsvektor elektroporiert, welcher das r-VIII SQ Gen, und einen Expressionsvektor, welcher das Dihydrofolatreduktase-Gen enthielt. Auf die Selektion auf Selektionsmedium folgend wurden überlebende Kolonien amplifiziert durch das Wachstum in schrittweise ansteigenden Mengen von Methotrexat. Der Überstand der resultierenden Kolonien wurde einzeln auf die Aktivität von Faktor VIII geskreent. Ein Produktionsklon wurde ausgewählt, und dieser wurde anschließend an serumfreies Suspensionswachstum in einem definierten Medium adaptiert und schließlich wurde ein Fermentationsverfahren in großem Maßstab entwickelt. Der Überstand wird nach bestimmten Zeitperioden gesammelt und weiter wie nachstehend beschrieben gereinigt.
Der pH des geklärten konditionierten Mediums wurde eingestellt, und es wurde auf eine S-Sepharose FF Säule aufgetragen. Nach dem Waschen wurde der Faktor VIII mit einem Salzpuffer, welcher 5 mM CaCl₂ enthielt, eluiert.
Die Immunadsorption wurde durchgeführt auf einem Immunaffinitätsharz, worauf der Ligand ein monoklonaler Antikörper war (8A4), welcher gegen die schwere Kette von Faktor VIII gerichtet war. Vor dem Laden auf die Säule wurde das S-Eluat mit 0,3% TNBP und 1% Octoxynol 9 behandelt. Die Säule wurde äquilibriert, gewaschen und der Faktor VIII wurde mit einem 0,05 M CaCl₂ und 50% Ethylen enthaltenden Puffer eluiert.
Das mAb-Eluat wurde auf eine Q-Sepharose FF-Säule geladen, äquilibriert mit dem Elutionspuffer in dem Immunaffinitätsschritt. Nach dem Waschen wurde der Faktor VIII mit 0,05 M L-Histidin, 4 mM CaCl₂, 0,6 M NaCl, pH 6,8 eluiert.
Das Q-Eluat wurde auf eine Gelfiltrationssäule (Superdex 200 p.g.) aufgetragen. Die Äquilibrierung und die Elution wurden durchgeführt mit einem Formulierungspuffer, welcher L-Histidin, Natriumchlorid, Calciumchlorid und Polysorbat 80 enthielt (siehe Beispiel 1 nachstehend), wobei die Zusammensetzung gemäß den nachstehenden Beispielen gegeben war.
Das Rohmaterial von r-VIII SQ wurde aus dem letzten Reinigungsschritt erhalten. Die Aktivität von Faktor VIII und die Konzentration der inaktiven Bestandteile wurde eingestellt durch das Verdünnen mit einem geeigneten Puffer, welcher ein Kohlenhydrat enthielt. Die Lösung wurde dann sterilfiltriert (0,22 μm) und dispensiert und desoxygeniert, indem die Lösung einem verringerten Druck unterzogen wurde und danach das Inertgas in mehreren Zyklen eingeführt wurde.
Die Aktivität des Gerinnungsfaktors VIII (Faktor VIII : C) wurde untersucht durch einen chromogenen Substratassay (Coatest Faktor VIII, Chromogenix AB, Mölndal, Schweden). Aktivierter Faktor X (Xa) wird über den intrinsischen Weg generiert, wo der Faktor VIII als ein Kofaktor wirkt. Der Faktor Xa wird dann bestimmt durch die Verwendung eines synthetischen chromogenen Substrats S-2222 in Gegenwart eines Thrombininhibitors I-2581, um die Hydrolyse des Substrats durch Thrombin zu verhindern. Die Reaktion wird mit Säure gestoppt und das VIII : C, welches proportional zu der Freisetzung von pNA (para-Nitroanilin) ist, wird photometrisch bei 450 nm gegen einen Reagenznullwert bestimmt. Die Einheit von Faktor VIII : C wird ausgedrückt in internationalen Einheiten (IU) wie definiert durch den gegenwärtigen internationalen Konzentratstandard (IS), etabliert von der WHO. Die relative Standardabweichung (RSD) des Verfahrens ist 7%.
Beispiel 1
Rekombinanter Faktor VIII (r-VIII SQ wurde hergestellt gemäß dem Verfahren, welches unter Experimentelles beschrieben wurde. Der in den Beispielen verwendete Faktor VIII ist hochgereinigt, d. h. er hat eine spezifische Aktivität von mehr als 5 000 IU/mg Gesamtprotein und ist ohne die Zugabe von Albumin stabilisiert.
Alle Zusammensetzungen in diesem Beispiel enthielten:

r-VIII SQ IU/ml 125

L-Histidin, mg/ml 3

Natriumchlorid mg/ml 18

Calciumchlorid, mM 3,4

Polysorbat 80, mg/ml 0,2
Das dispensierte Volumen in den Ampullen war 1 ml, der Halsbereich enthielt Stickstoff und der pH-Wert war etwa 7.
Die in den Lagerungstests von Beispiel 1 verwendeten Stabilisierungsmittel waren von Ph. Eur. Qualität.
Tabelle I Die wäßrigen, in den Lagerungstests von Beispiel 1 verwendeten Faktor VIII Zusammensetzungen
Tabelle II Anfängliche Faktor VIII-Aktivität (vor der Lagerung)
Tabelle III Faktor VIII-Aktivität nach der Lagerung während eines Monats bei 25°C bzw. 37°C. Der Prozentsatz wird von dem Mittelwert der anfänglichen Aktivität jeder Zusammensetzung berechnet.
Tabelle IV Faktor VIII nach zwei Monaten Lagerung bei 37°C Der Prozentsatz wird von dem Mittelwert der anfänglichen Aktivität jeder Zusammensetzung berechnet.
Tabelle V Faktor VIII nach drei Monaten Lagerung bei 25°C Der Prozentsatz wird von dem Mittelwert der anfänglichen Aktivität jeder Zusammensetzung berechnet.
Tabelle VI Faktor VIII-Aktivität nach der Lagerung während sechs Monaten bei 7°C bzw. 25°C. Mittelwert von zwei Proben pro Zusammensetzung bei 7°C Der Prozentsatz wird von dem Mittelwert der anfänglichen Aktivität jeder Zusammensetzung berechnet.
Tabelle VII Faktor VIII-Aktivität nach der Lagerung während neun Monaten bei 7°C bzw. 25°C. Der Prozentsatz wird von dem Mittelwert der anfänglichen Aktivität jeder Zusammensetzung berechnet.
Tabelle VIII Faktor VIII-Aktivität nach der Lagerung während zwölf Monaten bei 7°C bzw. 25°C. Mittelwert von zwei Proben pro Zusammensetzung bei 7°C Der Prozentsatz wird von dem Mittelwert der anfänglichen Aktivität jeder Zusammensetzung berechnet.
Rekombinanter Faktor VIII (r-VIII SQ) wurde hergestellt gemäß dem unter Experimentelles beschriebenen Verfahren. Der Faktor VIII, der in den Beispielen verwendet wurde, ist hochgereinigt, d.h er hat eine spezifische Aktivität von mehr als 5 000 IU/mg Gesamtprotein und ist ohne die Zugabe von Albumin stabilisiert.
Alle Zusammensetzungen in diesem Beispiel enthielten:

r-VIII SQ IU/ml 500

L-Histidin, mg/ml 3

Natriumchlorid mg/ml 18

Calciumchlorid, mM 3,4

Polysorbat 80, mg/ml 0,2
Das dispensierte Volumen in den Ampullen war 1 ml.
Die in den Lagerungstests von Beispiel 2 verwendeten Stabilisierungsmittel waren von Ph. Eur. Qualität.
Tabelle IX Faktor VIII-Aktivität nach achtzehn Monaten Lagerung bei 7°C. Der Prozentsatz wird von dem Mittelwert der anfänglichen Aktivität jeder Zusammensetzung berechnet.
Beispiel 2
Rekombinanter Faktor VIII (r-VIII SQ) wurde hergestellt gemäß dem unter Experimentelles beschriebenen Verfahren. Der Faktor VIII, der in den Beispielen verwendet wurde, ist hochgereinigt, d.h er hat eine spezifische Aktivität von mehr als 5 000 IU/mg Gesamtprotein und ist ohne die Zugabe von Albumin stabilisiert.
Alle Zusammensetzungen in diesem Beispiel enthielten:

r-VIII SQ IU/ml 500

L-Histidin, mg/ml 3

Natriumchlorid mg/ml 18

Calciumchlorid, mM 3,4

Polysorbat 80, mg/ml 0,2
Das dispensierte Volumen in den Ampullen war 1 ml.
Die in den Lagerungstests von Beispiel 2 verwendeten Stabilisierungsmittel waren von Ph. Eur. Qualität.
Tabelle X Die wäßrigen in den Lagerungstests von Beispiel 2 verwendeten Zusammensetzungen von Faktor VIII
Tabelle XI Anfängliche Aktivität von Faktor VIII (vor der Lagerung)
Tabelle XII Aktivität von Faktor VIII nach Lagerung während eines Monats bei 37°C Der Prozentsatz wird von dem Mittelwert der anfänglichen Aktivität jeder Zusammensetzung berechnet.
Tabelle XIII Aktivität von Faktor VIII nach Lagerung während zwei Monaten bei 25 bzw. 37°C Der Prozentsatz wird von dem Mittelwert der anfänglichen Aktivität jeder Zusammensetzung berechnet.
Tabelle XIV Aktivität von Faktor VIII nach Lagerung während drei Monaten bei 25 bzw. 37°C Der Prozentsatz wird von dem Mittelwert der anfänglichen Aktivität jeder Zusammensetzung berechnet.
Tabelle XV Aktivität von Faktor VIII nach Lagerung während neun Monaten bei 7 bzw. 25°C Der Prozentsatz wird von dem Mittelwert der anfänglichen Aktivität jeder Zusammensetzung berechnet.

Claims

Arzneimittelendprodukt aus einem Plasmaprotein, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gerinnungsfaktor VIII und Faktor IX, in einer wässrigen Lösung, worin die Konzentration an Sauerstoff in der Lösung verringert worden ist durch Unterwerfen der Lösung an ein Inertgas und/oder die Lösung ein Antioxidationsmittel enthält, und worin die Lösung ferner Saccharose in einer Konzentration von mindestens 550 mg/ml enthält.
Arzneimittelendprodukt gemäß Anspruch 1, welches zusätzlich ein Inertgas umfasst.
Arzneimittelendprodukt gemäß Anspruch 2, wobei das Inertgas Stickstoff ist.
Arzneimittelendprodukt nach einem beliebigen vorausgehenden Anspruch, in welchem das Antioxidationsmittel eine Verbindung ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glutathion, Acetylcystein und Methionin, und Mischungen hiervon.
Arzneimittelendprodukt nach einem beliebigen vorausgehenden Anspruch, in welchem das Plasmaprotein ein rekombinanter Faktor VIII ist, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Vollängen-Faktor VIII und Deletionsvarianten von Vollängen-Faktor VIII.
Arzneinttelendprodukt gemäß Anspruch 5, worin die Faktor-VIII-Aktivität im Bereich von 50 bis zu 25000 IU/ml ist.
Arzneimittelendprodukt gemäß Anspruch 5, worin die spezifische Faktor-VIII-Aktivität mindestens 1000 IU/mg Gesamtprotein beträgt.
Verfahren zur Verbesserung der Langzeit-Stabilität eines Plasmaproteins, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gerinnungsfaktor VIII und Faktor IX, in einer wässrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung ferner Saccharose in einer Konzentration von mindestens 550 mg/ml enthält und dass die Lösung in ihrem letztlichen Behälter unter einer Sauerstoff-verringerten Atmosphäre aufbewahrt wird.