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KulturbrUhe von Myxococcus fulvus NCIB 12064, Wirkstoff-
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extrakt, Wirkstoffgemisch, Wirkstoffe und Herstellungsverfahren.
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Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine KulturbrUhe
von Myxococcus fulvusNCIB 12064r, die dadurch erhältlich ist, daß man Myxococcus
fulvus NCIB 12064 unter submersen aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff und Stickstoff
sowie Mineralsalze enthaltenden wässrigen Nährmedium bei 15 bis 40°C kultiviert.
Vorzugsweise kultiviert man Myxococcus fulvus NCIB 12064 bei 25 bis 35 und insbesondere
etwa 30 °C.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen
Wirkstoffextrakt, der dadurch erhältlich ist, daß man (a) ggf. die Zellen von Myxococcus
fulvus NCIB 12064 von erfindungsgemäßer KulturbrUhe abtrennt und (b) die Kulturbrühe
mit einem mit Wasser nicht unbegrenzt
mischbaren organischen Lösungsmittel
oder Adsorberharzen (z.B. Amberlite wie XAD 2, XAD 4, oder ER 180) extrahiert.
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Vorzugsweise verwendet man fUr die Stufe (b) Essigsäureethylester
als organisches Lösungsmittel.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Wirkstoffgemisch,
das dadurch erhältlich ist, daß man (a) einen mit Essigsäureethylester erhaltenen
Wirkstoffextrakt zwischen Methanol und Hexan verteilt, (b) die Methanolphase an
vernetztem Polysaccharid (wie Sephadex LH-20) chromatographiert und (c) die wirkstoffhaltige
Fraktion an Umkehrphasen-Kieselgel mit Methanol/Wasser/Essigsäure chromatographiert.
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Ausserdem betrifft die Erfindung zwei Wirkstoffe mit den im folgenden
angegebenen Eigenschaften.
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Gemäß weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung Verfahren
zur Herstellung der Kulturbrühe, des Wirkstoffextraktes und des Wirkstoffgemischs
mit den vorstehend angegebenen Maßnahmen.
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Die beiden Wirkstoffe lassen sich dadurch gewinnen, daß man das erfindungsgemäße
Wirkstoffgemisch durch präparative Hochleistungsflüssigehromatographie an Umkehrphasen-Kieselgel
ab- und auftrennt und danach die einzelnen Wirkstoffe durch Abdampfen des flüssigen
Mediums gewinnt. Vorzugsweise trennt man das flüssige Medium durch Gefriertrocknen
ab.
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Nachstehend wird die Erfindung durch experimentelle Daten anhand von
10 Figuren noch näher erläutert.
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A. Produktionsbedingungen A 1. Produktionsstamm: Das Bakterium Myxococcus
fulvus Stamm Mx f50 = NCIB 12064, Familie Myxococcaceae, Ordnung
Myxobacterales,
Klasse Flexibacteriae.
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A 2. Herkunft des Produktionsstamms: Isoliert im August 1977 von Kaninchenmist,
gesammelt in der Umgebung von Calpe, Provinz Alicante, Spanien.
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A 3. Beschreibung des Produktionsstamms: Die vegetativen Zellen sind
schlanke Stäbchen, 3,5-6 /um lang und 0,8 /um dick, mit leicht verjüngten Enden.
Auf geeigneten Nährböden, z.B. auf Wasseragar mit Ausstrichen des Bakteriums Escherichia
coli, bildet der Organismus rotbraune tropfenförmige weichschleimige Fruchtkörper
von rund 200 /um Durchmesser. In diesen befinden sich kugelige, im Phasenkontrast
stark lichtbrechende Myxosporen von 1,2-1,5 /um Durchmesser. Das Bakterium be wegt
sich gleitend fort. Die Kolonien oder Schwärme breiten sich deshalb allmählich über
die Kulturplatte aus.
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Der Organismus wächst gut auf Peptonagar, z.B. cy-Agar (Casitone,
Difco, 0,3 %; Hefeextrakt, Difco, 0,1 %; CaCl2.2H20 0,1 %; Agar 1,5 %; pH 7,2) oder
auf Hefeagar, z.B. vy/2-Agar (Backhefe 0,5 %, bezogen auf Frischgewicht; CaCl2.2H20
0,1 %; Agar 1,5 %; pH 7,2).
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In Flussigmedien wächst DSM 2549 in homogener Zellsuspension, sowohl
in Schttelkolben (bei etwa 160 Upm), als auch in Bioreaktoren (bis 700 1 getestet).
Als Kulturmedium ist z.B. geeignet f50 Pep l.m.: Pepton aus Casein, tryptisch verdaut,
Merck (Darmstadt) 0,6 %; Hefeextrakt, Difco, 0,05 %; MgS04.7H20 0,2 %; CaCl2.2H20
0,04 X; pH 7,2.
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NCIB 12064 wächst streng aerob. Alle Kulturen wurden bei 30 0C gehalten.
Die Generationszeit liegt um 10 Stunden (/u = 0,1 Stunden 1). In f50 Pep 1.m. erhält
man pro
Liter 4,5-5,6 g Zellmasse (Feuchtgewicht). NCIB 12064 ist
auf die Verwertung von Proteinen und Peptonen eingestellt und besitzt Enzyme zum
Abbau anderer Mikroorganismen (Bakterien und Hefen).
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NCIB 12064 läßt sich konservieren: 1. Durch Einfrieren vegetativer
Zellen von Platten oder Flüssigkulturen in Pepton-Lösung bei -80 C (mehrere Jahre
lebensfähig).
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2. Durch Trocknen von Fruchtkörpern auf Filterpapier (mehrere Jahre
bei Zimmertemperatur lebensfähig). 3.
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Durch Trocknen von Myxosporen in Milch, Lagerung unter Stickstoff
bei Zimmertemperatur (mehrere Jahre lebensfähig).
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A 4. Leistungen: Die zellfreien Oberstände von Flüssigkulturen von
NCIB 12064 zeigten antibiotische Aktivität gegen gram-positive Bakterien (z.B. Staphylococcus
aureus). Die im folgenden gemachten Angaben gelten jeweils für ein gemisch aus zwei
aktiven Substanzen, die als AB-Mx f50-A)und AB-Mx f50-B)bezeichnet werden.
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A 5. Zugänglichkeit des Stamms: Der Produktionsstamm ist unter Nr.
NCIB 12064 hinterlegt.
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A 6. Produktionsbedingungen für die Antibiotika: In Schüttelkolben
und Bioreaktoren kann antibiotische Aktivität, gemessen gegen Staphylococcus aureus,
schon während
- /o.D. (623 nm, 1 cm LichtwaR) aer logalinmiscnen wacnstumspnase aD einer voner;wa
U,d-U,/ nacugewiesen werden. Die maximal erreichbare o.D. beträgt etwa 3. Die höchsten
Aktivitäten werden während der späten logarithmischen Wachstumsphase erreicht.
sich im Kulturüberstand.
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Ein typischer Kulturverlauf unter Antibiotikabildung in Schüttelkolben
ist im folgenden dargestellt: 11 Erlenmeyer Kolben Wrden mit je 200 ml Medium beschickt.
Das Medium enthielt Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck (Darmstadt) 0,6
%; Hefeextrakt, Difco, 0,1 %; MgS04.7H20 0,2 t; CaCl2.2H20 0,04 X; pH 7,2. Die Kolben
wurden aus einer Vorkultur bis zu einer o.D. von 0,175 beimpft. Bei einer o.D. von
0,355 war noch kein Hemmhof zu sehen. Die nächste Probe bei einer o.D. von 1,15
ergab im üblichen Plattendiffusionstest gegen StaphylococcusaureuseinenHemmhofdurchmesser
von 9 mm. In den ersten 35 Stunden betrug die Generationszeit (gemessen als Zunahme
der o.D.) etwa 10 .
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Stunden. Danach flacht die o.D.-Kurve allmählich ab. Zwischen der
47. und 52.
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Stunde änderte sich die maximale o.D. von 3 nicht mehr. Die Kultursuspension
zeigte dann einen pH von 7,8. Der Hemmhofdurchmesser betrug 14 mm.
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Eine typische Fermentation unter Antibiotikabildung verläuft wie folgt:
Der Bioreaktor (Firma Giovanola, Manthey, Schweiz, mit Umwurfsystem) enthielt 320
1 f50 Pep l.m. und wurde mit 35 1 aus einem 70 1 Vorfermenter beimpft. Die Luftzufuhr
wurde auf 1800 Nl/h, die Drehzahl auf 400 Upm eingestellt. Der P02 erreichte
zu
Beginn der Fermentation 90-95 % Sättigung. Im Verlauf der Fermentation sank der
p02 kontinuierlich ab und erreichte nach 30-33 Stunden das Minimum von etwa 40 %
Sauerstoffsättigung. Dieser Wert blieb etwa 3-4 Stunden lang konstant und stieg
danach langsam wieder an. Die Fermentation wurde nach einer Gesamtdauer von etwa
40 Stunden während der Phase des ansteigenden p02 abgebrochen, indem die Zellen
aus der Kulturbrühe abzentrifugiert wurden. Die End-o.D. betrug 2,5, der End-pH
7,7, der Antibiotikagehalt 10 mg/l Kulturüberstand.
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B. Biologische Charakterisierung der Antibiotika aus NCIB 12064 B
1. Wirkungsspektrum: Die reine Komponente A des Antibiotikums wurde zu 2 mg/ml in
Methanol gelöst. Diese Lösung wurde stufenweise verdünnt, von jeder Verdünnung wurden
5 pl auf ein Filterblättchen übertragen und die Aktivität im Plattentest anhand
des Hemmhofdurchmessers bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
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Zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) wurde das Antibiotikum
zu 100 pg/ml einem geeigneten Flüssigmedium zugesetzt. Diese Ausgangslösung wurde
dann in Zweierschritten verdünnt, die einzelnen Röhrchen wurden jeweils mit dem
Testorganismus (etwa 105 Zellen/ml) beimpft und 18 Stunden bei 300lauf einem Schütteltisch
inkubiert. Als Medien wurden verwendet: 1. für Bakterien: Pepton aus Casein, tryptisch
verdaut, Merck (Darmstadt) 0,5 t; Proteose Pepton, Difco, 0,5 %; Fleischextrakt,
Oxoid, 0,1 %; Agar 1,5 %; pH 7,0.
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2. für Hefen und Pilze: Mycophil Agar (Phytone Pepton, BBL, 1 %;
Glucose 1 t; Agar 1,6 %).
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Für die Bestimmung der MHK wurden dieselben Medien ohne Agar benutzt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Ferner wurde die MHK für die Komponente
B des Antibiotikums in Flüssigkulturen für Staphylococcus aureus bestimmt. Sie betrug
etwa 0,29 pg/ml.
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B 2. Wirkungsweise des AntibiotikuDer Einfluß des Antibiotikums auf
die DNS-, RNS- und Protein-Synthese wurde bei Staphylococcus aureus anhand des Einbaus
von 14C-markierten Vorstufen dieser Makromoleküle studiert. Durchführung des
Versuchs:
Eine Obernachtkultur von Staphylococcus aureus wurde auf eine o.D. (623 weg nm,lem
LlChtVon u,i veraunnt. mealum: repton aus xaseln, tryptiscn verdaut, Merck (Darmstadt)
0,3 %; Hefeextrakt, Difco, 0, OS %; MgS04.7H20 0,2 %; CaCl2.2H20 0,05 t; pH 7,0.
Die verdünnten Kulturen wurden bei 370Cweiterinkubiert, bis sie eine o.D. von 0,4
erreicht hatten. Dann wurden sie erneut auf eine o.D. von 0,1 verdünnt, 10 Min.
inkubiert und darauf die radioaktiven Vorstufen zugegeben (jeweils 0,1 pCi/ml von
U-14C-Leucin bzw. U-14C-Uracil bzw. U-14C-Thymidin). Nach weiteren 6 Min. wurden
jeweils 3 ug Antibiotikum, reine Komponente A/ml zugegeben. Die Kontrolle erhielt
eine entsprechende Menge Methanol. Sofort nach Zugabe des Antibiotikums wurde eine
erste Probe entnommen. In Abständen von einigen Minuten wurden weitere Proben entnommen.
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Jede Probe bestand aus 0,5 ml. Sie wurde in 2 ml kalte 3 %ige Perchlorsäure
gegeben und die entstandene Fällung auf Glasfaserfiltern (Whatman GF/B) gesammelt.
Die Filter wurden dann viermal mit 5 ml Perchlorsäure und zweimal mit 4 ml 95 %igem
Ethanol gewaschen, getrocknet und die Radioaktivität im Szintillationszähler bestimmt.
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Ergebnis: 1. Die DNS-Synthese (Einbau von 14C-Thymidin) wird nicht
beeinflußt (Abb. 1).
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2. Die Protein- und RNS-Synthese werden beide gehemmt. Nach 40 Min.
erreicht der Einbau von Uracil (RNS-Synthese) in Anwesenheit des Antibiotikums nur
etwa 10 % des Kontrollwertes (Abb. 2). Die Hemmung der Protein-Synthese (Einbau
von 14C-Leucin) erfolgt langsamer, so daß nach 40 Min. prozentual erheblich mehr
Radioaktivität eingebaut ist als bei der RNS-Synthese (Abb. 3).
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Daraus ist zu schließen, daß Myxopyroniniunmittelbar die die RNS-Synthese
hemmt und die Protein-Synthese erst als Folge davon abnimmt.
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Zur Bestätigung dieser Aussage wurde ein Hemmtest mit isolierter RNS-Polymerase
(aus Escherichia coli; Boehringer, Mannheim) durchgeführt. Das Enzym wurde stark
gehemmt. Bei einer Konzentration von 4 tug/ml des Antibiotikums war die halbmaximale
Hemmung erreicht. Die Konzentrationsabhängigkeit der Hemmung ist in Abb. 4 dargestellt.
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Tabelle 1. Das Hemmspektrum von Myxopyronin
Testorganismus Durchmesser der Hemmzone im Minimale Hemm-Plattentest bei verschiedenen
konzentration Antibiotikum-Konzentrationen pg/Blättchen Jug/ml Gram-positive Bakterien
1 2 5 10 Mycobacterium phlei 0 0 0 0 Corynebacterium mediolanum 0 9 13 17 Bacillus
megaterium 0 10 13 17 6 Bacillus subtilis 0 0 8 9 50 Brevibacterium ammoniagenes
0 0 8 10 Staphylococcus aureus 11 16 19 22 1,0 Micrococcus luteus 0 0 8 10 12 Arthrobacter
simplex 0 9 10 12 6 Gram-negative Bakterien Acinetobacter calcoaceticus 20 24 28
30 0,8 Agrobacterium tumefaciens 10 16 20 24 0,8 Serratia marcescens 0 0 0 0 Salmonella
typhimuriun 0 0 0 0 >100 Pseudomonas fluorescens 0 0 0 0 Pseudomonas aeruginosa
>100 Proteus mirabilis >100 Escherichia coli 0 0 0 0 >100 Mucor hiemalis
0 0 0 0 Hefen Candida albicans 0 0 0 0 Schizosaccharomyces pombe 0 0 0 0 Saccharomyces
cerevisiae >100
EXTRAKT Der Wirkstoff-Extrakt wird erhalten
durch Abtrennen der Zellen von Myxococcus fulvus NCIB 12064 von der Kulturbrühe
und Extraktion der letzteren mit einem organischen Lösungsmittel z.B. Essigester
oder mit Hilfe von Adsorberharzen (z.B. Amberlite wie XAD2, XAD4 oder ER180).
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ISOLIERUNG DES WIRKSTOFFGEMISCHES Das Wirkstoffgemisch wird aus dem
Extrakt der Kulturbrühe isoliert durch: a. Verteilung zwischen Methanol und Hexan
b. Chromatographie der Methanol phase an Sephadex LH-20 c. Chromatographie der das
Wirkstoffgemisch enthaltenden Fraktion an Reversed-Phase-Kieselgel mit Methanol/Wasser/Essigsäure.
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Auf diese Weise erhält man das zu etwa 90% reine Wirkstoffgemisch,
dasszwei
Komponenten A und B enthält (HPLC-Diagramm s. Abb. X). Das Mengenverhältnis der
beiden Komponenten variiert von Ansatz zu Ansatz.
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Auf Kieselgeldünnschichtplatten können die beiden Wirkstoffe durch
Anfärbung mit Joddampf oder Besprühen mit Anisaldehyd-Sprühreagenz (Gelb- bis Blaugraufärbung
je nach Konzentration, Temperatur und Einwirkungsdauer) sichtbar gemacht werden.
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Durch präparative HPLC an Reversed-Phase-Kieselgel können die beiden
Wirkstoffkomponenten getrennt und völlig rein erhalten werden.
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CHARAKTERISIERUNG DES WIRKSTOFFES A 1. Chromatographisches Verhalten
auf Kieselgelplatten: Laufmittelsystem Rf-Wert CH2Cl2/MeOH 95:5 0.8 EE 0.9 Totuol/Aceton
80:20 0.4 CH2C12/iPrOH 98:2 0.4 Hex/Ac/AcOH 80:20:4 0.2
2. Retentionszeit in der HPLC auf Kieselgel RP-18 (s. Abb. @ : 3.86 min 3. Massenspektru:
m/e 417, 374, 342, 255, 233; 219, 175, 149 Elementarzusamzensetzung (Hochauflösung):
r U yn C23H31NO6
4. UV-Spektrum: Lösungsmittel Methanol,/# max
= 295 nm ( # = 20 624), 213 nm ( E = 34 772) (s. b 5. IR-Spektrum: (s.
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6. lH-NMR-Spektrum: (s.¼)bb.
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7. 13C-NMR-Spektrum: (#/ppm): 11-8(q), 14.0(q), 17.2(q), 18.4(q),
22.0(t), 28.5(t), 35.8(t), 39.0(d), 43.8(t), 52.6(q), 102,4(s), 102.7(d), 110.8(d),
122.3(d), 125.9(d), 135.4(s), 137.8(d), 150.5(s), 156.8(s), 165.3(s), 172.5(s),
176.5(s), 199.6(s) 8. Drehwert: [0C]D = -65.8 Grad, Lösungsmittel Methanol CHARAKTERISIERUNG
DES WIRKSTOFFES B: 1. Chromatographisches Verhalten auf Kieselgelplatten: s. Wirkstoff
A 2. Retentionszeit in der HPLC auf RP-18
5.72 min 3. Massenspektrum: m/e 431, 400, 374, 342, 299, 255, 233, 219, 175, 149
El ementarzusarmensetzung (Hochauflösung): 024H33N06 4. UV-Spektrum: Lösungsmittel
Methanol, # max = 297 (#= 20 613), 213 (= 28942) 5. IR-SDektrum:
6. ¹H-NMR-Seektrun:
7. l3c-NMR-spektrs: ( S/ppm, Multiplizität, Lösungsmittel Methanol) 12.4(q)} 14.3(q),
17.3(q), 18.2(9), 23.3(t), 28.4(t), 31.0(t), 35.6(t), 39.0(d), 41.5(t), 52.6(q),
100.8(d), 101.7(s), 110.4(d), 121.8(d), 125.9(d), 134.7(s), 136.8(d), 150.7(s),
156.4(s), 174.4(s), 175.9(s), 199.3(s).
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8. Drehwert: = = -74.9 Grad, Lösungsmittel Methanol BEISPIEL 1 Die
Aufarbeitung wird am Beispiel eines 320 1 Fermenters erläutert: Die Zellen wurden
vom Nährmedium abfiltriert und dieses im Geaenstrom mit Essigester extrahiert. Der
Extrakt wurde
MeOH/H20 98:2 gelöst und mit Hexan extrahiert. Die MeOH-Phase enthielt nach dem
Abdampfen des Lösungsmittels 8 g Rohgemisch. Dieses wurde an einer Sephadex LH-20-Säule
mit Methanol als Eluens chromatographiert wobei 4 g biologisch aktives Material
erhalten wurde. Dieses Material wurde an einer präparativen RP-8-Säule mit MeOH/H20/Eisessig
80:20:4 chromatographiert, wobei 2.5 g ca.
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90%iges Wirkstoffgemisch erhalten wurde, das etwa gleiche Mengen der
Komponenten A und B enthielt. Zur chemischen und spektroskopischen Charakterisierung
und zur Bestimmung der biologischen Daten wurde das Gemisch durch präparative HPLC
an 16 mm-RP-18-Säulen mit MeOH/H20/Essigsäure 80:20:4 als Eluens aufgetrennt.
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BEISPIEL 2 Der Oberstand eines 320 1 Fermenter wurde durch eine Chromatographiesäule
mit 8 1 Amberlite XAD 4 gepumpt, wobei das Antibiotikum quantitativ gebunden wurde.
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Die Elution erfolgte mit Methanol/Wasser Gemischen (von 1:1 bis reinem
Methanol).
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Antibiotika-haltige Fraktionen wurden im Vakuum eingedampft und das
erhaltene Rohgemisch (6 g), wie bei Beispiel 1 beschrieben, durch Chromatographie
an LH-20 und RP-8 gereinigt.
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EE = Essigsäureethylester iPr OH = i-Propanol Hex = Hexan Ac = Aceton
AcOH = Essigsäure HPLC = HochleistungsflUssigchromatographie uCi = /u Curie cpm
= Counts per minute (d.h.
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Zählerereignisse pro min)
| /ug/ml = mcg/ml |
| cy-Agar = Laborabkürzungen für bestimm- |
| te im Text im einzelnen be- |
| vy/2-Agar schriebene Medien, d.h. |
| Eigennamen; 1 m steht fUr |
| f50 Pep 1 m liquid medium = FlUssigmedium |
| Phytone Pepton, BBL = Becton, Dickinson and |
| Company, Cockeysville, |
| Maryland, USA |
| Sephadex LH-20 |
| Kieselgel RP-18 |
| RP- 8 Firmenangaben beiliegend |
| Casitone (Difco) |
| Mycophil Agar, BBL |
| Amberlite XAD 2 |
| Amberlite XAD 4 |
| Amberlite ER 180 |