DD156374A1 - Verfahren zur herstellung eines antibioticums - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Antibioticums, das fuer die Chemotherapie von Virus- und durch Bakterien bei Mensch und Nutztier hervorgerufene Erkrankungen von potentiellem Nutzen ist. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des Antibioticums Granaticin-Methylester unter Verwendung des Mikroorganismus Streptomyces lateritius, Stamm ZIMET 43 646.Ziel der Erfindung ist die Gewinnung eines potentiell virostatisch und antimikrobiell wirksamen Antibioticums mit geringer Toxizitaet und fehlender Kreuzresistenz zu anderen klinisch eingesetzten Antibiotica, um die Palette derartiger Pharmaca zu erweitern. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentation des Stammes ZIMET 43 646 in Medien mit geeigneten Einsatzstoffen Granaticin-Methylester gebildet,mit geeigneten Methoden aus Mycel und Kulturfiltrat isoliert, gereinigt und gewonnen wird.

Description

Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung eines Antibioticum^

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer antibiotisch wirksamen Substanz_? die bei der Chemotherapie von Virus- und durch Bakterien hervorgerufene Erkrankungen bei Mensch und Nutztier von potentiellem Nutzen ist. Insbesondere betrifft die Erfindung die Ge?/innung eines Pigment-AntibioticumSj das aufgrund seiner physicochemisehen Eigenschaften als Granaticin-Methylester bezeichnet und erstmals mit Hilfe eines mikrobiologischen Herstellungsverfahrens erzeugt wird^ ,

Charakteristik der^;bekannten technischen lösung

Zum !Typ der Naphthochinon-Antibiotica. (Tauch Naphthocyclinone oder Isochromanchinone genannt) gehörende Naturstoffe sind Ze Be Granaticin, Granaticin B_} Litmocidin, Litmomycin, Antibioticum Yir-141} Antibioticum 1321 sowie dessen Komponenten A und B^ Antibioticum Zg und Zgg, sowie das Antibioticum XK-fy6_s ferner Dihydro-Granaticin und der Methylester des, Dihydro-Grana.ticin, die Granaticinsäure_$ o< _?ß_fy~Naphthociclinonj Purpuromycin₃ die Rubromycine» das Griseorhodin sowie die Grar« natomycine A₃C₅D und E₀ In jüngster Zeit sind noch die Griseusine A und B bekannt geworden* Mikrobiologische Herstellungs- ^: verfahren für Naphthoehinon-Antibiotica sind bisher mit Hilfe folgender Mikroorganismen-Arten bekannt geworden: Proactinomyces cyaneusj Streptomyces olivaceus ViAJCSMAN₁ Streptomyces litmogenes_s Actinomyces litmocidini, Actinomyces anthooyaneusj Streptomyoes thermoviolaceus var· Wr-141, Streptomyees granaticolor^ Streptomyces violaceo'ruber und Streptomyces arenae_e

Ziel, der Erfindung

Die Erfindung dient der Herstellung eines.neuen Antibioticmns aus der- Strukturklasse der Naphthochinone _% wie auch seiner Derivate und SaIKe₅ um die Palette potentiell virostatisch und antimikrobiell wirksamer Verbindungen durch ein neues Antibiotic·um zu erweitern«

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde_y ein technologisch einfaches Verfahren anzugeben j. das es gestattet_s das neue Antibioticum Granaticin-Methylester mit Hilfe eines Mikroorganismus aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen in guten Ausbeuten herzustellen.

ErfindLingsgemaß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff-, Stickstoff-Quelien und Mineralsalzen ein Mikroorganismus bzw« seine Mutanten oder Varianten gezüchtet werden« Der Mikroorganismus, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren Anwendung findet, wurde rn.it Hilfe. an sich bekannter .Mutagenese- und Selektions-Methoden aus Populationen des Wildstammes vom Granatomycin-Bildner ausgewählt ο Dieser Wildstamm ist aus einer Erdprobe' von der Ostsee-Insel Hiddensee (Fährinsel) isoliert und in der Hinterlegungsstelle für Patentstämme, der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie_$. Jena, der Akademie der Wissenschaften der DDR unter der Nummer ZIEET 43 62? hinterlegt. _: "

Der Stamm ZIIyIET 43 62? ist ein Vertreter der Art Strep_tomj£es. iäiSi^ÜiiS (Sveshnikova) Pridham, Hesseltine and Benedict 1958 und ist in der.Patentanmeldung YIF G 12d/216.415 ausführlich charakterisiert« Die aus dem Stamm ΖΙΜΕΪ 43 62? durch Mutagenese und Selektion erhaltene Mutante mit Biosynthese vermögen für das neue Antibiotic um Granaticin-Methyl.-ester ist in der Hinterlegungsstelle für Patentstamme der DDR im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle

-i-ΐ'ΙΊΊ

Therapie, Jena, der Akademie der Wissenschaften der DDR unter der Nummer ZIMET 43 646 hinterlegt, . . Die Kultivierung des Stammes ZIMET 43 646 sowie seiner Mutanten und Varianten erfolgt unter aeroben Bedingungen. An'Erde lyophil getrocknetes Sporenmaterial bzw. in Glucose-Bouillon lyophilisierte Mycelfragmente werden zur Anzucht in geeignete Agarnährböden und nachfolgend.in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft und das entstehende Mycel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 und 37 ⁰C (vorzugsweise 28 ⁰C) über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen (vorzugsweise 4 Tagen) bei einer Acidität kultiviert » die zu Beginn des Fermentationsprozesses bei pH 6,2 bis pH 7$0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7»5 und pH 8,5 liegt».Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoff-QueIlen sowie aus anorganischen Salzen» Als Kohlenstoff-Quellen können Glucose, Stärke, Mannose, Glycerin, Dextrin, Sojamehl und andere Mehle verwendet werden. Als Stickstoff-QueIlen kommen Sojamehl, Sojaöl, Trockenhefe, Fleischpepton und Casein in Frage. Gute Ergebnisse können bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt werden. Letztere begünstigen den Fermentationsverlauf in Abhängigkeit vom eingesetzten Nährmedium. In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Kalziumkarbonat, Natriumphosphat bzw. Kaliumphosphat als vorteilhaft erwiesen.

Die Fermentation des Bildners von Granaticin~MethyIester, ZIIvIET 43 646 kann in Steilbrustflaschen verschiedenen Inhalts, in Rundkolben und Glasfermentern sowie in V2A-Stahltanks ausgeführt werden.

Die Isolierung des Granaticin-Methy!esters wird in der V/eise durchgeführt, daß nach Abtrennen des Mycels von der Kulturlösung und nach Auswaschen des Mycels mit wäßriger, alkalischer Losung, nach Vereinigen der Waschlösung mit dem KuI-turfiltratj nach Einstellen eines schwach sauren pH-Wertes mit Hilfe von organischen oder anorganischen Säuren in der vereinigten antibiotikahaltigen; Lösung, nach Extraktion

des ^Antibiotikums mit HxiLfe eines rait Wasser nicht oder wenig mischbaren Extraktionsm.itteIs₅ nach Konzentrieren desselben auf ein Mininialvolumen und nach Ersetzen des Extrak™ tionsmlttels mit Hilfe der azeotropen Destillation durch Wassers nach Eeextr-aktion des Wirkstoffgemisch^ mittels eines mit V/asser nicht oder wenig' mischbaren Extrakt!onsrnitteis höherer Dichte als Wasser, nach Abtrennen des Reextraktes, nach Konzentrieren des Eeextraktes auf ein Minimalvolumen, nach chromatographischer Reinigung und Trennung an Dextrangelj die den Granaticin~Methy!ester enthaltende Fraktion getrennt aufgefangen und aus dieser das Antibiotikum durch Verdampfen des Lösungsmittels.. gewonnen, wird. Bei in bezug auf den zu gewinnenden Granaticin-Methy!ester ungünstig verlaufender 'Fermentation, und der damit verbundenen verstärkten. Bildung von Nebenkomponenten.wird eine Trennung zwischen diesen und dem Granaticin-Methy!.ester dadurch erreicht, daß das Extrakti:.onz(3ntrat mit einer Fraktion niedrigsiedenden Kohlenwasserstoffs versetzt, der ausgefallene Niederschlag abfiltriert und das .PiItrat konzentriert und der azeotropen Destillation.unterworfen wird» Die wäßrige Suspension wird' dann wie. o<.a_e reextrahiert_s das Antibiotikum dadurch in die organische Phase überführt, mittels Gelchromatografie gereinigt und von den restlichen Nebenbestandteilen befreit.

Granaticin-Methyiester ist eine intensiv rote Substanz, mit schwach sauren Eigenschaften und besitzt Indikatornatur, löst sich gut in praktisch allen organischen Lösungsmitteln, aber schlecht in Wasser«, Die Summcnformel lautet ι ^p3^24^11^? das Molekulargewicht beträgt 476» Die amorphe Substanz hat eine W-Absorption in Methanol von 285_s 525 und 560 nm, mit Schulter bei 490 mn. Die Maxima des IR-Spektrums (in KBr) betragen:"74Oy 775, 910, .960, 990,. 10.75, ·. 1140, 1170, 1190, 1260, 140O₅ 1440, 1560, 1605, 1740, 2925, 3440 cdT¹ (Abb.1).

Der Granaticin-Methylester unterscheidet sich, von-den bekannten mikrobiellen Metaboliteii Granat ic.in und Granat ic ins äure durch das Methoxy!signal bei 3 * 70-3f80 ppm im Protonen-

resonanzspektrum.und von 4-De soxy-Granat ic insäur e-Methylester (^Dihydrogranaticin-Methylester) durch das Signal bei 4,75 Ppm» bzw* das Fehlen der Signalebei 3*00 und 2,34 ppm (Protonen 4a und 4e im Dihydrogranaticin-Methy!ester). (Abb.2).

Das Verfahren zur Herstellung des Granaticin-Methylesters wird durch nachfolgende Ausführungsbeispiele ergänzt, aber nicht begrenzt.

Ausführungsbeispiel 1

Die Kulturlösung der Streptomyces lateritius-Mutante, Stamm ZIMBT 43 646, wird im Originalzustand separiert und das abgetrennte Mycel wird mit dem gleichen Volumen alkaliäierten V/assers von pH 7 bis 10, vorzugsweise pH 7,5 bis pH 8,0, wie die Kulturlösung ausgewaschen. KulturfiItrat und Waschlösung werden vereinigt und mit Säure auf einen pH-Wert von 4,2 ί 1,0 eingestellt. Anschließend wird mit einem Drittel und im zweiten Arbeitsgang mit einem Fünftel·,des Bezugsvolumens an Essigsäure-Ethylester extrahiert. Der Extrakt wird unter schonenden Bedingungen im Vakuum konzentriert und die organische Phase mittels azeotroper Destillation" durch Wasser ersetzt. Die wäßrige Suspension wird auf ein Zehntel bis ein Fünftel des Bezugsvolumens mit Wasser verdünnt und nach erneutem Einstellen des pH-Wertes auf.3»5 i 0»5 mittels Mineralsäure, vorzugsweise mittels verdünnter Schwefelsäure, mit einem Extraktionsmittel'höherer Dichte als Wasser,· vorzugsweise Chlorkohlenwasserstoffe, insbesondere Chloroform, reextrahiert. Der Chloroformextrakt wird getrocknet und konzentriert, dabei wird ein Endvolumen von 0,5 - 2% des Bezugsvolumens Kulturlösüng erreicht.

AusführungsbeispieLv2

Der Essigsäureethylester-Extrakt wird im Gegensatz zum Ausführungsbeispiel 1 nicht in die wäßrige Suspension des Anti-

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biotikums übergeführt_? sondern nach der Konzentration auf i $ des Bezugsvolumens, mit der fünffachen Menge eines niedrigsiedenden KohlenwasserstoffSj vorzugsweise mit Petroläther_? ver- · mischt und der ausgefallene Miederschlag wird nach einer Ab-.setzzeit von. einigen Stunden abfiltierte Das Filtrat wird auf das Ursprungsvolumen des Essigsäureethylester~Konzentrats eingeengt und durch Nachführen von Wasser wird eine wäßrige Suspension des Antibiotikums erzielt© Diese wird_s wie in Beispiel 1 ausgeführt _$ weiterverarbeitet©

Ausführungsbeispiel 3

Das nach den Beispielen 1 bzw© 2 erzielte Chloroformextrakt-Konzentrat wird in Anteilen zu 100 ml auf Gelsäulen, welche 2 kg Gel enthalten aufgetragen und anschließend wird mit Chloroform eluiert« Die zweite aus der Säule austretende _s rotfarbige Fraktion !enthält den Granaticin-Methylestero Dieße Fraktion wird auf ein Minimalvolumen konzentriert«'Zur Reinigung "insbesondere von einer schnellerlaufenden Begleitkomponente. .wird die Reinigungs- und Trennoperation an Dextrangel? vorzugsweise Sephadex IH 20 mit Chloroform in 'Chloroform wiederholt«

Die antibiotisch einheitliche Chloroformlösung von Granaticin~^;Metbylester wird schonend zur Trockne gebracht oder der Granaticin-Methylester wird aus dem Eluatkonzentrat durch Zugabe der fünf- bis zehnfachen Menge Petroläther verdrängt _$. abfiltriert und getrocknet*

Aufgrund der physicοchemischen Charakterisierung des Pigment-Antibibticums aus dem Stamm ZIMET 43 646 der Art Streptomyoes, l§jfce_ritiu£ kann Identität mit · der Struktur des Granaticin-Methylesters festgestellt werden* Der entsprechend dem vorgeschlagenen Verfahren herzustellenden Granaticin-Methylester läßt sich damit, erstmals als Naturstoff aus Fermentationslösungen der Mut ante ZIMET. 43 &h& der Art Stre^gtom^ce^ late^ci."* tius gewinnen und auf diese Weise im technischen Maßstab erzeugen. ....·

Sov/ohl frische Fermentationslösungen des Bildners von Grana-" ticin-'Methylesterj ZIMET 43 646_s als auch der aus ihnen iso™

lierte Granatiein—Methylester besitzen antibiotische Aktivität· -Bevorzugt werden Vertreter grampositiver und bestimmter gramnegativer Bakterien in ihrem Wachstum gehemmte Gegen Hefen und Pilze entfaltet der Granaticin-Methylester dagegen eine deutlich schwächere wachstumsinhibitorisehe Wirkung«

In Tabelle 1 ist die "Minimale Hemmkonzentration" (MHK) des Granaticin-Methylesters gegen Vertreter grampositiver, gramnegativer und von Mycobakterien zusammengestellt. Es wird deutlich, daß der grampositive Sporenbildner, Bacillus sub-» tills. ATCG 6633, in Abhängigkeit vom Medium die höchste Empfindlichkeit gegen den mikrobiell hergestellten Granaticin-Methylester aufweist* Eine überraschend starke Wirksamkeit zeigt die Verbindung auch gegen einen Vertreter gramnegativer Bakterien, Proteus morganii (Stamm SG 464), während für den Stamm OX 19der Art Proteus vulgaris der MHK-Wert unter vergleichbaren Bedingungen mehr als 1Ofach höher liegt«

Tabelle 1

Minimale Henunkonzentration (MK) des Granaticin-Methylesters gegen grampositivej gramnegätive' Bakterien und Mycobakterien in einem standardisierten Agardiffusions-Test

Testorganismus MJ-IK (mcg/Diffusionszone)

Bacillus subtilis ATGC 6633¹^ 0,2

Bacillus subtilis ATGC 6633²^ , 0,1

Micrococcus flavus ATGC 10240 . 0,9

Mycobacterium phlei SG 346 2_s 5

Escherichia coli C 600 ' y5₉O

Proteus morgariii SG- 464 ' 0_s4

Proteus vulga'ris OX 19 . . 5*0

Pseudomonas aeruginosa NGTC 10701 >5₅O

Salmonella gallinarum ATCC 9184 · >5_}0

1) Komplexmedium (Pepton-Sojabohnenextrakt-Agar)

2) Synthetisches Medium (Ammoniumtartrat-Agar)

Claims (1)

1. ·* Ι'ίΊΊ

   Erfindungsanspruch

   Verfahren zur Herstellung eines Antibioticums, gekennzeichnet dadurch j daß der Mikroorganismus Streptomyces lateritius (Sveshnikova) Pridham et al. 1958, Stamm ZIMET 43 646 unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und Stickstoff-Quelle sowie Mineralsalze enthalten, „.bei einer Temperatur zwischen 25 und 37 ⁰C, vorzugsweise 28 ⁰C während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4.Tagen, kultiviert wird und das dabei gebildete Antibioticum Granaticin-Methylester sowohl aus dem Mycel als auch aus dem Kulturfiltrat extrahiert, nachfolgend mit üblichen Methoden angereichert, von unerwünschten Begleitstoffen gereinigt und gewonnen wird·

   lenu...^..Seitßn Tabellen