DE3432143A1 - Verfahren zur einkapselung eines einzuhuellenden materials - Google Patents

Verfahren zur einkapselung eines einzuhuellenden materials

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DE3432143A1 DE19843432143 DE3432143A DE3432143A1 DE 3432143 A1 DE3432143 A1 DE 3432143A1 DE 19843432143 DE19843432143 DE 19843432143 DE 3432143 A DE3432143 A DE 3432143A DE 3432143 A1 DE3432143 A1 DE 3432143A1
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Description

3432H3
Damon Biotech, Inc. Needham Heights, MA o2 194, V. St. A,
Verfahren zur Einkapselung eines einzuhüllenden
Materials
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einkapselung eines einzuhüllenden Materials in einer semipernveablen Membran, insbesondere ein Verfahren zur Einkapselung in einer Mikrokapsel eines Materials, einschließlich Lebendzellen, das gegenüber dem pH-Wert, der Temperatur oder der Ionenkonzentration empfindlich ist. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Einkapselung ermöglicht die Bildung einer semipermeablen Membran ohne Schaden für das einzuhüllende Material. Die Erfindung betrifft auch eine Kapsel, bei der eine Innenschicht aus einem aminierten Polymer an eine Außenschicht aus einem anionischen Polymer ionisch gebunden ist.
Obwohl eine Vielzahl von Verfahren zur Mikroeinkapselung von einzuhüllendem Material entwickelt worden sind, können die meisten dieser Verfahren wegen der dafür notwendigen scharfen Bedingungen nicht zur Einkapselung von Material, wie Lebendzellen, verwen-
0192-DBH-419-K1-E
det werden, das gegenüber dem pH-Wert, der Temperatur oder der Ionenkonzentration empfindlich ist. In der US-PS 4 352 883 ist das vermutlich erste Verfahren zur erfolgreichen Einkapselung von Lebendgewebe oder -zellen in einer semipermeablen Membran beschrieben. Dabei wird um das Gewebe oder die Zellen eine Zwischenkapsel aus einem gelierbaren Material, vorzugsweise aus einem anionischen Gummi, wie Natriumalginat, gebildet; durch Vernetzen der Oberflächenschichten der Zwischenkapsel wird eine dauerhafte, semipermeable Membran hergestellt. Typischerweise wird ein Gemisch des Gummis und des einzuhüllenden Materials zur Herstellung einer Zwischenkapsel mit einer Gelierlösung, vorzugsweise einer Calciumionenlösung, behandelt. Die entstandene Zwischenkapsel wird zur Herstellung einer dauerhaften Membran mit einer Lösung eines polykationischen Materials umgesetzt. Das Innere der Kapsel kann wieder verflüssigt werden, und zwar durch Wiederherstellen von Bedingungen, unter denen der anionische Gummi flüssig ist, z. B. durch Verändern der Ionenkonzentration bei Einbringen der Kapseln in eine phosphatgepufferte Salzlösung. Die Wiederverflüssigung des Kapselinneren erleichtert den Nährstofftransport durch die Membran und fördert das Zellwachstum. Da die Bedingungen für die Einkapselung, wie Temperatur, Ionenstärke oder pH-Bereich, nicht unbedingt scharf sein müssen, ist auch eine Schädigung des einzuhüllenden Materials oder eine Beeinträchtigung der Lebensfähigkeit der Zellen nicht unbedingt notwendig.
Aufgabe der Erfindung war es somit, ein Verfahren zur Einkapselung von Lebendzellen oder anderem empfind-
lichen Material in semipermeable Membranen zur Verfügung zu stellen. Auch sollte einzuhüllendes Material, das wegen seiner Empfindlichkeit gegenüber dem pH-Wert, der Ionenkonzentration oder -ladung oder der Temperatur in bekannten Verfahren schwer einzukapseln ist, im erfindungsgemäßen Verfahren eingekapselt werden. Eine weitere Aufgabe der Erfindung war es, eine verbesserte Kapsel mit einer semipermeablen Membran zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgaben werden erfindungsgemäß gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Einkapselung eines einzuhüllenden Materials in einer semipermeablen Membran, das dadurch gekennzeichnet ist, daß
A. das einzuhüllende Material in einem wäßrigen Medium, in dem ein Kationen enthaltendes Polysaccharid gelöst ist, suspendiert wird,
B. die Suspension zu das einzuhüllende Material enthaltende Tröpfchen geformt wird,
C. die Tröpfchen mit einer Anionen enthaltenden Lösung behandelt werden, wobei sie zu diskreten, formbeständigen Zwischenmatrizes gelieren, und
D. die Zwischenmatrizes mit einem Polymer, das mit den Kationen reagierende Anionen enthält, behandelt werden, wobei die Oberflächenschichten der Zwischenmatrizes zu Kapseln um die Tröpfchen vernetzt werden.
3A32U3
In erfindungsgemäßen Verfahren kann einzuhüllendes Material, wie Enzyme, Antikörper, Hormone oder Lebendzellen, z. B. Gewebekulturen oder genetisch modifizierte Zellen, in einer semipermeablen Membran eingekapselt werden. Das einzuhüllende Material wird in einem wäßrigen Medium suspendiert, indem ein Kationen enthaltendes Polysaccharid gelöst ist, vorzugsweise ein aminiertes Polysaccharid, wie ein Poly-D-Glucosamin (Chitosan). Die Tröpfchen der Suspension gelieren, wenn man sie mit einer Lösung eines zwei- oder mehrwertigen Anions behandelt, z. B. mit Phosphat-, Hydrogenphosphat-oder Sulfatsalzen. Eine dauerhafte Membran entsteht durch Vernetzen der Oberflächenschichten der Zwischenmatrix mit einem Polymer, das Anionen und vorzugsweise Carboxylgruppen enthält, die mit den Kationen der Matrix reagieren. Poly-L-Glutaminsäure und Poly-L-Asparaginsäure sind entweder als solche oder in Form ihrer Salze bevorzugte anionische Polymere. Das Innere der Kapsel kann durch Behandlung der Kapsel mit einer Lösung eines niedrig molekularen Polykations, z. B. Spermadin, Spermin oder Harnstoff, wieder löslich gemacht werden. Die Wiederverflüssigung des Kapselinneren fördert den Massentransport zwischen der extrakapsulären Flüssigkeit und dem intrakapsulären Raum.
Im erfindungsgemäßen Verfahren kann man Lebendzellen in einer semipermeablen Membran einkapseln. Die Zellen werden in einem wäßrigen Medium, das die Lebensfähigkeit der Zelle nicht beeinträchtigt und ein aminiertes Glucopolysaccharid enthält, suspendiert. Die Tröpfchen der Suspension werden mit einer Gelierlösung behandelt, wobei eine formbeständige, wasserunlösliche Zwischenmatrix entsteht. Die Gelierlösung ist eine wäßrige Lö-
sung eines zwei- oder mehrwertigen Anions, z. B. eine Lösung von Phosphat-, Hydrogenphosphat- oder Sulfatsalzen. Die Kapsel wird dann mit einem Polymer, das eine Vielzahl von Carboxylgruppen enthält, z. B. Polyglutaminsäure oder Polyasparaginsäure,behandelt, wodurch die Oberflächenschichten der Zwischenmatrix dauerhaft vernetzt werden. Das Kapselinnere wird in einer praktisch fällungsfreien Reaktion wieder verflüssigt, wenn man die Kapsel einer Lösung eines niedrigmolekularen Polykations, beispielsweise Spermadin, Spermin oder Harnstoff, aussetzt. Die Wiederverflüssigung erfolgt durch die Entfernung der mehrwertigen Anionen aus dem inneren Gel. Human- oder Tiergewebezellen aus einem Gewebewachstumsmedium und genetisch modifizierte,prokariotische oder eukariotische Zellen in einem Wachstumsmedium können im erfindungsgemäßen Verfahren eingekapselt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Einkapselung ist so schonend, daß die eingekapselten Zellen nicht beschädigt werden; die normalen metabolischen Prozesse, einschließlich Wachstum und Reproduktion, laufen innerhalb der Kapsel weiter ab.
Die Erfindung betrifft ferner eine Kapsel, bei der eine Membran einen geschlossenen intrakapsulären Raum umgibt. Die Membran hat eine Innenschicht aus einem polyaminierten Polymer und vorzugsweise einem aminierten Polysaccharid, insbesondere einem aminierten Glucopolysaccharid, die ionisch an eine Außenschicht aus einem polyanionischen Polymer und vorzugsweise einem polycarboxylierten Polymer, wie Polyglutamin- oder Polyasparaginsäure, zu einer wasserunlöslichen dauerhaften Kapsel vernetzt ist. In den intrakapsulären Raum kann man eine
Zelle, vorzugsweise eine eukariotische, bakterielle oder genetisch modifizierte Zelle einbetten; in diesem Fall sollten die polyanionischen und polyaminierten Polymere mit der Zelle physiologisch verträglich sein.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Einkapselung eines einzuhüllenden Materials, wie eukariotische oder prokariotische, natürlich vorkommende oder genetisch modifizierte Lebendzellen oder Gewebekulturen in einer semipermeablen Membran. Die Erfindung betrifft auch eine neue Mehrschichtenkapsel.
Durch Reaktion eines Kationen enthaltenden PoIysaccharids oder Glucopolysaccharids mit einem mehrwertigen Anion entsteht eine Gel- oder Zwischenmatrix um das einzuhüllende Material oder die lebende Zelle. Die Oberflächenschichten der entstandenen Zwischenmatrix werden mit einem Polymer, das Anionen und vorzugsweise Carboxylgruppen enthält, zu einer dauerhaften, das einzuhüllende Material einkapselnde Membran ionisch vernetzt. Das Innere der Kapsel kann durch Behandeln der Kapsel mit einer Lösung eines niedrigmolekularen Polykations wieder verflüssigt werden.
Das einzuhüllende Material, z. B. Enzyme, Hormone, Antikörper oder Lebendzellen, wird in einem wäßrigen Medium suspendiert, das ein gelierbares, Kationen enthaltendes Polymer enthält. Ein bevorzugtes gelierbares Polymer ist ein aminiertes Glucopolysaccharid, insbesondere Chitosan (Poly-D-Glucosamin). Chitosan entsteht durch Säurehydrolyse von Chitin (Poly-D-N-Acetylglucosamin), das die erste Aufbausubstanz der wirbellosen Außenskelette ist. Chitosan ist ein langkettiges, aminiertes
Polymer, das mit den meisten Zellen physiologisch verträglich ist. Es ist in Wasser nur schwach löslich, es kann jedoch in verdünnter Essigsäure leicht gelöst werden.
Chitosan-Vorratslösungen werden durch Lösen des Chitosans in 0,5 M (Mol/l) Essigsäure hergestellt. Die Essigsäure wird durch wiederholte Dialyse gegen phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) aus der Lösung entfernt. Das Chitosan fällt aus dieser Lösung nicht aus, wenn sie unter 37 0C aufbewahrt wird. Die bevorzugte Vorratslösung, 1,4 % Chitosan in PBS, wurde erfolgreich längere Zeit bei 4 0C aufbewahrt.
Das wie oben beschrieben hergestellte Chitosan wird mit dem einzuhüllenden Material vermischt, wobei eine Lösung oder eine Aufschlämmung entsteht, die dann in Tröpfchen oder andere Formen geformt wird. Obwohl Lösungen mit einer Endkonzentration an Chitosan von 0,4 % (Gewicht/Volumen) gelieren, liegt das Optimum des Gelierens bei 0,8 bis 1,2 I (Gewicht/Volumen) Chitosan in isotoner, 125 mM Na-HPO.-Lösung. Die Suspension von Chitosan und einzuhüllendem Material kann mit jeder herkömmlichen tröpfchenbildenden Vorrichtung zu Tröpfchen geformt werden. Eine solche tröpfchenbildende Vorrichtung wird im folgenden erläutert.
Ein die Suspension enthaltendes Rohr ist mit einem Verschluß ausgerüstet, an dem die tröpfchenbildende Vorrichtung angebracht ist. Die Vorrichtung besteht aus einem Gehäuse, das eine Lufteinblasdüse oben und einen länglichen Reibungshohlkörper, der in den Verschluß einge-
paßt ist, aufweist. Eine 10-ml-Spritze, die mit einer Schrittpumpe verbunden ist und eine Nadel aufweist, die über die Länge des Gehäuses reicht, beispielsweise eine Teflon-beschichtete Nadel mit einem inneren Durchmesser von 25 mm, wird oben am Gehäuse angebracht. Das Innere des Gehäuses ist so ausgelegt, daß die Spitze der Nadel einem ständigen laminaren Luftstrom ausgesetzt ist, der als Luftmesser wirkt. Beim Betrieb drückt die Schrittpumpe Tröpfchen der Lösung von der Nadelspitze. Jeder Tropfen wird durch den Luftstrom "abgeschnitten" und fällt etwa 2,5 cm in die Gelierlösung, vorzugsweise eine Dinatrium-hydrogenphosphatlösung, wo er durch Reaktion mit den negativen Ionen sofort geliert. Der Abstand zwischen der Nadelspitze und der Oberfläche der Gelierlösung ist vorzugsweise groß genug, um der Suspension von Chitosan und einzuhüllendem Material die physikalisch günstigste Form zu verleihen, d. h. eine Kugelform (maximales Volumen bei einer minimalen Oberfläche). Die Luft aus dem Rohr strömt durch eine öffnung in den Verschluß. Dieses Verfahren gewährt ein "Vernetzen" des Gels und die Bildung einer hochviskosen, formbeständigen schützenden Zwischenmatrix, die das suspendierte, einzuhüllende Material und sein Medium enthält. Die Zwischenmatrizes sammeln sich in der Lösung als getrennte Phase und können durch Absaugen abgetrennt werden.
Als mehrwertige Gelierlösung ist eine 125 mM Na^ Lösung bevorzugt; jedoch geben auch einbasische Natriumphosphat- und Natriumsulfatlösungen annehmbare Zwischenmatrizes. Auch Natriumeitrat geliert die Suspension; die besten Ergebnisse werden jedoch mit ein- oder zweibasi-
sehen Phosphat- und Sulfatlösungen erhalten. Ist die Anionenkonzentration zu niedrig (beispielsweise unter etwa 100 mM), so geliert die Suspension nicht.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Zwischenmatrizes werden gesammelt und zur Entfernung der überschüssigen Gelierlösung gewaschen. Die Matrizes werden dann mit einer Überzugs- oder Vernetzungslösung eines polyanionischen und vorzugsweise polycarboxylierten Polymers behandelt. Eine bevorzugte Vernetzungslösung ist eine 1 %-ige Poly-L-Asparaginsäure- oder PoIy-L-Glutaminsäurelösung, die im Verhältnis 1 : 15 mit 150 mM Natriumchlorid zu einer Polymerendkonzentration von 6,6 χ 10~ g/100 ml verdünnt ist. Das Molekulargewicht der Poly-L-Asparagin- oder Poly-L-Glutaminsäure liegt im Bereich von 3000 bis 100.000 Dalton oder darüber, wobei der Bereich von 25.000 bis 60.000 Dalton bevorzugt ist. Eine Reaktionszeit von 3 bis 6 min bei Raumtemperatur ist zufriedenstellend.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Eine wie oben angegeben hergestellte Vorratslösung von 1,4 % Chitosan (CSN-Sigma Chemical Co.) in 14 bis 17 mM (mMol/1) isotoner phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) wurde zur Bestimmung der optimalen CSN-Konzentration für die Bildung der Zwischenmatrix verwendet, wobei verschiedene Chitosan-Konzentrationen untersucht wurden. Der CSN-Vorratslösung wurden 1-ml-Proben entnommen und mit Kalbsfötusserum (FCS-Flow Laboratories)
versetzt. Die Tröpfchen wurden gebildet und in die unten beschriebenen Lösungen unter Verwendung einer wie oben beschriebenen tröpfchenbildenden Vorrichtung eingebracht. In Tabelle 1 sind drei verschiedene Chitosan-Konzentrationen angegeben, nämlich 0,6, 0,8 und 1 % (Gewicht/Volumen).
Probe
, ml Tabelle 1 43
CSN 57 58
o, 42 FCS, ml 28
o, 72 0,
o,
o,
CSN-Konzentration (Gew./Vol.)
0,8 I 0,6 % 1,0 i
Es wurden zwei Gelierpuffer hergestellt, nämlich 110 mM Natriumeitrat (Sigma) und 125 mM Dinatriumhydrogenphosphat (Sigma). In allen Proben waren die mit diesen Pufferlösungen gebildeten Zwischenmatrizes annehmbar, mit dem Natriumeitratpuffer war jedoch das Gelieren der Probe 1 mangelhaft. Während mit allen Proben annehmbare Zwischenmatrizes im Dinatrium-hydrogenphosphatpuffer gebildet wurden, gab Probe 3 die beste Gelierung.
Eine 1 l-ige Lösung von Poly-L-Asparaginsäure (Molekulargewicht: 40.000 Dalton; Sigma) wurde im Verhältnis 1:15 mit 150 mM Natriumchlorid (Sigma) zu einer Konzentration von 6,6 χ 10~ g/100 ml Lösung verdünnt. Die mit der Probe 3 gebildeten Zwischenmatrizes wurden aus dem Gelierpuffer entfernt, wiederholt mit isotoner PBS
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gewaschen und in der Poly-L-Asparaginsäurelösung wieder suspendiert. Nach einer Reaktionszeit von 6 min bei Raumtemperatur in der Poly-L-Asparaginsäurelösung war die Vernetzung vollständig, es waren dauerhafte Membranen entstanden. Die Kapseln waren im wesentlichen kugelförmig mit einem Durchmesser von etwa 380 bis 480 μπι. Einige Kapseln hatten kleine Schwänze. Die auf diese Weise hergestellten Kapseln waren nicht klebrig und hatten keine Neigung zum Verklumpen. Die Porosität der Kapseln wurde empirisch auf etwa 80.000 Dalton bestimmt. Das Beispiel zeigt, daß im erfindungsgemäßen Verfahren annehmbare Kapseln gebildet, werden können.
Beispiel 2
Es sollte gezeigt werden, daß die Lebensfähigkeit von Zellen durch die Einkapselung nicht beeinträchtigt wird. Die in diesem Versuch verwendete Zellkultur war eine Friend-Erythroleukämie-Zellinie CFEL745), d. h. eine Maus-Erythroleukämie-Zellinie, die in einer Suspensionskultur schnell wächst.
Eine Kultur von FELy.r-Zellen wurde 5 min zentrifugiert; der entstandene Kuchen wurde in Kalbsfötusserum (Flow Labs) als Aufschlämmung wieder suspendiert. Eine wie oben beschriebene Vorratslösung von 1,4 % Chitosan wurde hergestellt und mit der Zellkulturlösung vermischt, wobei die Endkonzentration an Chitosan 1 % (Gewicht/Volumen) und an Zellen etwa 5x10 Zellen/ml betrug. Es wurden Zwischenmatrizes hergestellt, indem das Chitosan-Zellengemisch durch eine tröpfchenbildende Vorrichtung (wie oben beschrieben) gedrückt wurde und die entstandenen
flüssigen Mikrokügelchen mit einer 125 mM Phosphatlösung (wie oben beschrieben) behandelt wurden. Die entstandenen Zwischenmatrizes wurden wiederholt mit isotoner PBS gewaschen und in einer Poly-L-Asparaginsäurelösung (mit einem Molekulargewicht von 40.000 Dalton) in einer Konzentration von 6,6 χ 10 g/100ml in.150 mM Natriumchlorid wieder suspendiert. Nach einer Reaktionszeit von 6 min bei Raumtemperatur in der Poly-L-AsparaginsäurelÖsung wurden die entstandenen Kapseln zweimal mit dem Kulturmedium RPMI-1640 (Flow Labs), das 10 I Kalbsfötusserum und Antibiotika enthält, gewaschen. Die Mikrokapseln wurden mit dem Kulturmedium in Gewebekulturflaschen eingebracht und bei 37 0C und einer 5 2-igen CO2-Atmosphäre inkubiert.
Proben der Zellkultur wurden zu verschiedenen Zeiten entnommen und in einem Mikroskop untersucht, wobei festgestellt wurde, daß die Zellen wachsen und sich reproduzieren, was die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Einkapselung beweist. Es sollte festgestellt werden, daß die Stufe der Wiederverflüssigung nicht angewendet wurde, da Friend-Zellen sowohl in einer Gelkultur als auch in einer Suspensionskultur wachsen können. Viele Zellarten benötigen jedoch zur Reproduktion ein flüssiges Kulturmedium. Die Lebensfähigkeit der Zelle sollte durch die Wiederauflösung des Kapselinneren nicht beeinträchtigt werden. Die Kapsel stellt eine von äußeren Verunreinigungen freie MikroUmgebung zur Verfügung.
Für den Fachmann liegen andere Modifikationen- oder Ausführungsformen des beschriebenen Verfahrens und des Produkts innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung. Dem-
entsprechend fallen andere Ausführungsformen auch unter die Ansprüche.

Claims (30)

Ansprüche
1.Verfahren zur Einkapselung eines einzuhüllenden Materials in einer semipermeablen Membran,
A.
das einzuhüllende Material in einem wäßrigen Medium, in dem ein Kationen enthaltendes PoIysaccharid gelöst ist, suspendiert wird,
B. die Suspension zu das einzuhüllende Material enthaltende Tröpfchen geformt wird,
C. die Tröpfchen mit einer Anionen enthaltenden Lösung behandelt werden, wobei sie zu diskreten, formbeständigen Zwischenmatrizes gelieren, und
D. die Zwischenmatrizes mit einem Polymer, das mit den Kationen reagierende Anionen enthält, behandelt werden, wobei die Oberflächenschichten der Zwischenmatrizes zu Kapseln um die Tröpfchen vernetzt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß das Kationen enthaltende Polysaccharid ein aminiertes Polysaccharid ist.
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3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das aminierte Polysaccharid Chitosan ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Anionen unter Phosphat, zweibasischem Phosphat und/oder Sulfat ausgewählt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Anionen enthaltende Lösung durch Lösen eines Salzes des Anions in einer wäßrigen Lösung hergestellt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Anionen enthaltende Polymer Carboxylgruppen enthält.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Carboxylgruppen enthaltende Polymer unter PoIyasparaginsäure und/oder Polyglutaminsäure und/oder deren Salze ausgewählt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es eine zusätzliche Stufe enthält, in der das Gel innerhalb der Kapsel wieder löslich gemacht wird.
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9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel durch Behandeln der Kapsel mit einer Lösung eines niedrigmolekularen Polykations wieder löslich gemacht wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das niedrigmolekulare Polykation unter Spermadin, Spermin und/oder Harnstoff ausgewählt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das einzuhüllende Material unter Enzymen, Antikörpern, Hormonen und Lebendzellen ausgewählt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lebendzellen eine Gewebekultur oder deren Einzelzellen umfassen und das wäßrige Medium ein Gewebekulturmedium ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Lebendzellen genetisch modifizierte Zellen umfassen.
14. Verfahren nach Anspruch 1 zur Einkapselung von Lebendzellen in einer semipermeablen Membran,
dadurch gekennzeichnet, daß
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a. die Zellen in einem wäßrigen Medium, das die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigt und ein aminiertes Glucopolysaccharid enthält, suspendiert werden,
b. die Suspension in die Zellen enthaltende Tröpfchen geformt wird,
c. die Tröpfchen mit einer wäßrigen^Anionen enthaltenden Gelierlösung behandelt werden, wobei sie zu formbeständigen, wasserunlöslichen Zwischenmatrizes gelieren, und
d. die Zwischenmatrizes mit einem eine Vielzahl von Carboxylgruppen enthaltenden Polymer behandelt werden, wobei die Oberflächenschicht der Zwischenmatrizes dauerhaft zu einer Membran um die Tröpfchen vernetzt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 1 oder 14, dadurch gekennzeichnet,
daß es eine zusätzliche Stufe enthält, in der das Innere der Membran wieder löslich gemacht wird durch Behandeln des Produkts der Stufe d. mit einer Lösung eines niedrigmolekularen Polykations, das die Anionen in einer praktisch fällungsfreien Reaktion aus dem Gel entfernt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 14 und 15, dadurch gekennzeichnet,
daß die Gelierlösung eine wäßrige Lösung des Salzes eines Anions, ausgewählt unter Phosphat, zweibasischem Phosphat und/oder Sulfat, ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet,
343214:
daß das eine Vielzahl von Carboxylgruppen enthaltende Polymer unter Polyasparaginsäure und/oder Polyglutaminsäure und/oder einem ihrer Salze ausgewählt wird.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet,
daß das niedrigmolekulare Polykation unter Spermadin, Spermin und/oder Harnstoff ausgewählt wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet,
daß die Lebendzellen Human- und Tiergewebezellen umfassen und das wäßrige Medium ein Gewebewachstumsmedium ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet,
daß die Lebendzellen genetisch modifizierte Zellen umfassen und das wäßrige Medium ein Wachstumsmedium ist.
21. Kapsel,
gekennzeichnet durch
eine einen geschlossenen intrakapsulären Raum umgebende Membran aus im wesentlichen einer Innenschicht aus einem polyaminierten Polymer und einer Außenschicht aus einem polyanionischen Polymer, die durch ionische Wechselwirkung zwischen den Aminiumgruppen des polyaminierten Polymers und den Anionen des polyanionischen Polymers zu einer wasserunlöslichen permeablen Kapsel vernetzt werden, hergestellt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20.
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22. Kapsel nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das polyaminierte Polymer ein aminiertes PoIysaccharid ist.
23. Kapsel nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß das aminierte Polysaccharid ein polyaminiertes Glucopolysaccharid ist.
24. Kapsel nach einem der Ansprüche 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das polyanionische Polymer ein polycarboxyliertes Polymer einschließt.
25. Kapsel nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das polyanionische Polymer Polyasparaginsäure oder eines ihrer Salze ist.
26. Kapsel nach einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß das polyanionische Polymer Polyglutaminsäure oder eines ihrer Salze ist.
27. Kapsel nach einem der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß sie im intrakapsulären Raum eine Zelle in ihrem Kulturmedium enthält.
28. Kapsel nach einem der Ansprüche 21 bis 27, dadurch gekennzeichnet,
daß das polyaminierte Polymer und das polyanionische Polymer mit der Zelle physiologisch verträglich sind.
29. Kapsel nach einem der Ansprüche 21 bis 28, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen eukariotische Zellen umfassen.
30. Kapsel nach einem der Ansprüche 21 bis 28, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen genetisch modifizierte Zellen umfassen.
DE19843432143 1983-09-01 1984-08-31 Verfahren zur einkapselung eines einzuhuellenden materials Granted DE3432143A1 (de)

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SE (1) SE8404343L (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3590071C2 (de) * 1984-02-23 1988-05-05 Snow Brand Milk Products Co Ltd Verfahren zur Herstellung von Kapseln
DE3941873A1 (de) * 1989-12-19 1991-06-20 Jakob Dr Bodziony Hohlfaser mit der beschichtung von zellen, die mehrjaehrige implantation in arterien und venen ermoeglichen
DE4012079A1 (de) * 1990-04-14 1991-10-24 Jakob Dr Bodziony Implantable semipermeable austausch- und diffusionskammer

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NO166836C (no) * 1985-03-14 1991-09-11 Univ California Fremgangsmaate for behandling av et organtransplantat.
GB8705464D0 (en) * 1987-03-09 1987-04-15 Atomic Energy Authority Uk Composite material
JPS6434436A (en) * 1987-07-28 1989-02-03 Sanyo Chemical Ind Ltd Gel cellular beads and manufacture thereof
CA1319632C (en) * 1988-04-22 1993-06-29 Carol Louise Nolan Method for microbial immobilization
US4952618A (en) * 1988-05-03 1990-08-28 Minnesota Mining And Manufacturing Company Hydrocolloid/adhesive composition
US5562099A (en) * 1990-10-05 1996-10-08 Massachusetts Institute Of Technology Polymeric microparticles containing agents for imaging
US5487390A (en) * 1990-10-05 1996-01-30 Massachusetts Institute Of Technology Gas-filled polymeric microbubbles for ultrasound imaging
US5149543A (en) * 1990-10-05 1992-09-22 Massachusetts Institute Of Technology Ionically cross-linked polymeric microcapsules
FR2694894B1 (fr) * 1992-08-20 1994-11-10 Coletica Utilisation d'une réaction de transacylation entre un polysaccharide estérifié et une substance polyaminée ou polyhydroxylée pour la fabrication de microparticules, procédé et composition.
FR2703927B1 (fr) * 1993-04-13 1995-07-13 Coletica Utilisation d'une réaction de transacylation entre un polysaccharide estérifié et une polyamine pour former en milieu aqueux une membrane au moins en surface de particules gélifiées.
DE4312970A1 (de) * 1993-04-21 1994-10-27 Juergen Dr Schrezenmeir Mikrokapsel sowie Verfahren und Vorrichtung zu ihrer Herstellung
DE4426396A1 (de) * 1994-07-26 1996-02-01 Ulrich Prof Dr Zimmermann Verfahren zur Herstellung konzentrierter Lösungen von mikroverkapselten Zellen oder von suspendierten Wirkstoffen in mikroverkapselter Form
US5540927A (en) * 1995-04-12 1996-07-30 Monsanto Company Microencapsulation process by coacervation
US7101575B2 (en) 1998-03-19 2006-09-05 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Production of nanocapsules and microcapsules by layer-wise polyelectrolyte self-assembly
DE59915041D1 (de) * 1998-03-19 2009-07-30 Max Planck Gesellschaft Verfahren zum Aufbringen mehrerer Schichten von Beschichtungssubstanzen auf Templatpartikel
DE102004013637A1 (de) 2004-03-19 2005-10-13 Capsulution Nanoscience Ag Verfahren zur Herstellung von CS-Partikeln und Mikrokapseln unter Verwendung poröser Template sowie CS-Partikel und Mikrokapseln
DE102005002483A1 (de) * 2005-01-18 2006-08-03 Ehrfeld Mikrotechnik Bts Gmbh Verfahren zum Einkapseln von Sensormolekülen mit einer semipermeablen Membran
FR2986165B1 (fr) 2012-01-31 2015-07-24 Capsum Procede de preparation de capsules rigidifiees

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3209045A1 (de) * 1981-03-13 1982-09-30 Damon Corp., 02194 Needham Heights, Mass. Verfahren zum selektiven aufbrechen permeabler membranen
US4352883A (en) * 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4352883A (en) * 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
DE3209045A1 (de) * 1981-03-13 1982-09-30 Damon Corp., 02194 Needham Heights, Mass. Verfahren zum selektiven aufbrechen permeabler membranen

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3590071C2 (de) * 1984-02-23 1988-05-05 Snow Brand Milk Products Co Ltd Verfahren zur Herstellung von Kapseln
DE3941873A1 (de) * 1989-12-19 1991-06-20 Jakob Dr Bodziony Hohlfaser mit der beschichtung von zellen, die mehrjaehrige implantation in arterien und venen ermoeglichen
DE4012079A1 (de) * 1990-04-14 1991-10-24 Jakob Dr Bodziony Implantable semipermeable austausch- und diffusionskammer
DE4012079C2 (de) * 1990-04-14 1997-11-06 Jakob Dr Bodziony Implantierbare Austausch- und Diffusionskammer

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Publication number Publication date
GB2145992A (en) 1985-04-11
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DK419184D0 (da) 1984-08-31
IL72787A (en) 1987-12-31
AU563653B2 (en) 1987-07-16
IL72787A0 (en) 1984-11-30
CH664472A5 (de) 1988-03-15
DE3432143C2 (de) 1987-05-14
IT1196742B (it) 1988-11-25

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