DE3428370A1

DE3428370A1 - Interferon, genetische sequenzen, die hierfuer codieren, und diese produzierende organismen

Info

Publication number: DE3428370A1
Application number: DE3428370A
Authority: DE
Inventors: Günther Dr. Adolf; Rudolf Dr. Hauptmann; Peter Dr. Wien Meindl; Eva Dr. New York N.Y. Rastl-Dworkin; Peter Dr. Wien Swetly
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1984-08-01
Filing date: 1984-08-01
Publication date: 1986-02-13
Also published as: SU1523054A3; ZA855759B; SU1551251A3

Description

Interferon, Genetische Sequenzen,. die^; hierfür codieren, und ' , . .' . diese produzierende Organismen ·■; ·*·■■--. ' ·

Gegenstand der vorliegenden Erfindung„sind neue Polypeptide mit Interfon-'Aktivitat sowie_: rekombinante DNA-Verfahren"zur Herstellung dieser Peptide und Produkte, die bei diesen Verfahren.benötigt werden,' beispielsweise Gensequenzen, rekomb.inante DNA Moleküle, Expressionsvehikel.Und Organismen.'

Interferon ist ein Wort, das geprägt wurde, um eine Auswahl von Proteinen zu beschreiben, die endogen zu menschlichen Zellen'sind und dadurch gekennzeichnet' sind, daß sie teilweise überlappende .und teilweise divergierende biologische · Aktivitäten aufweisen. Diese Proteine modifizieren die · körpereigene Immunantwört und,man nimmt an,^r daß sie zu einem „wirksamen Schutz gegen. Viruserkrankungen beitragen. Die. Interferone würden beispielsweise in drei Klassen einge-■ teilt, α-, ß- und γ-Interferon, von ß-; und/V -Interferon ist in menschlichem Organismus hvr jeweils ein Subtyp bekannt. (z.B. Ohno, S., et al, ProcV Natl. Acad. Sei. Vo. TJLr ^Nor ⁹/ 5305-5309 (1981)'; Gray et al. ,Nature 295, 503-508, (1982);

. ' Taya, et al., EMBO Journal .1^8; 953-958 (1982)).. Anderer-, seits werden verschiedene Subtypen der α-Interferon beschrieben {z;B. Phil. Trans, R. Soc. Lond.; 299, 7-28 \ "."· (1982)), Die reifen a-lnterferone unterscheiden sich untere.

. "einander durch maximal 23 % Divergenz und sind ca. 166 '. Aminosäuren lang. Bemerkenswert ist ein Bericht über, ein α-Interferon, das ein überraschend hohes Molekulargewicht ,

(26 000, bestimmt durch SDS Polyacrylamid/Gelelektophorese) aufweist (Goren, P. et al. Virology 130, 273-280 (1983)). Dieses Interferon wird IFN-ot 26K genannt. Von ihm wurde festgestellt, daß es die bisher höchste spezifische antivirale und antizelluläre Aktivität aufweist.

Die bekannten Interferone scheinen bei verschiedenen Krankheiten wirksam zu sein, zeigen aber eine geringe oder überhaupt keine Wirkung bei vielen anderen Krankheiten (z.B. Powledge, Bio/Technology, March 1984, 215-228 "Interferon On Trial"). Interferone weisen zudem Nebenwirkungen auf. Beispielsweise wurde bei Prüfungen der Anticancer-Wirkung' von rekombinanten α-Interferon festgestellt, daß Dosen von etwa 50 Millionen Einheiten, die nach den Ergebnissen der Phase I Prüfungen für sicher galten, akute Verwirrungszustände, bis zur Arbeitsunfähigkeit führende Gelenkschmerzen, sehr starke Ermüdung und Appetitlosigkeit, Verlust der Orientierungsmöglichkeit, epileptische Anfälle und Lebertoxizitat hervorriefen. 1982 verbot die französische Regierung Prüfungen mit a-IFN, nachdem Kuebspatienten, die damit behandelt worden waren, tödliche Herzanfälle erlitten. Über mindestens zwei cardiale Todesfälle wurde auch bei kürzlich durchgeführten Prüfungen in Amerika berichtet. Es ist zunehmend deutlich geworden, daß zumindest ein Teil der Nebenwirkungen, wie Fieber und Unpäßlichkeit, in unmittelbarem Zusammenhang mit dem Interferonmolekül selbst steht und nicht auf Verunreinigungen zurückzuführen, sind. , - -

Aufgrund der großen Hoffmangen,'die durch Interferon geweckt worden waren, und angeregt durch den Wunsch, neue Inter^ feron-ähnliche Moleküle mit verminderten Nebenwirkungen zu

inden, war es Aufgabe der vorliegenden Erfindung solche . η ue Substanzen aufzufinden und herzustellen.

.Die vorliegende Erfindung betrifft daher bestimmte neue Interferone und ihre N-glykosylierten Derivate " (hier als ^;: Interferon-Y oder IFN-y bezeichnet), die 168bis 174,· vor-

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V - Κ· -a t

zugsweise 172 Aminosäuren enthalten, und die eine Divergenz von 30 bis 50 %, vorzugsweise von 35-48 %, gegenüber den bisher bekannten Subtypen des ά-IFN's aufweisen und einerseits ähnliche Wirkungen wie α-Interferone zeigen, anderer-· seits viele therapeutische Nachteile dieser bekannten Substanzen nicht besitzen. Gegenstand der Erfindung· sind somit neue Interferone in. vollständig reiner Form, ihre nicht g.lykosylierten und glykosylierten Formen, die hierfür codierenden Gensequenzen ebenso wie rekombihante Moleküle, die diese Sequenzen enthalten. Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Expressions-Vehikel wie Plasmide, die besagte Gensequenzen enthalten, ebenso verschiedene Wirtsorganismen wie Mikroorganismen oder Gewebskulturen, die die Herstellung des neuen Interferons durch Fermentation oder Gewebskulturenmethode ermöglichen. \ . ·

Ein bevorzugter Gegenstand der Erfindung sind Interferone-Y ebenso wie die entsprechönden Gensequenzen der nachstehenden Formel': " . ' ■ '

5 ■ ■ 10 = 15

Cys Asp Leu Pro .Gin Asn His GIy Leu Leu Ser. Arg Asn Thr Leu TGT GAT CTG CCT CAG AAC CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG

• .20 25 · 30

VaI Leu Leu His Gin Met Arg Arg He Ser Pro Phe Leu Cys Leu GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT. TTC TTG TGT CTC.

' 35 "■"■■" 40 45

Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin GIu Met val Lys GIy AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG GAG ATG GTA AAA GGG

50 55 60

Ser GIn Leu Gin Lys Ala His VaI Met Ser VaI Leu His GIu Met AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG TCT GTC CTC CAT GAG ATG

65 , 70 ' ' . 75

Leu Gin Gin He Phe Ser Leu phe His Thr Glu Arg Ser Ser AIa CTG CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA-.GAG CGC TCC TCT GCT

copy

80 . ; 85 · 90

Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gin Leu His Thr GIy Leu His

GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT

95 100 105

Gin Gin Leu Gin His Leu GIu Thr Cys Leu Leu Gin VaI VaI GIy

CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA

110 115 . 120

:Glu GIy GIu Ser Ala GIy Ala He Ser Ser Pro AIa Leu Thr Leu

GAA GGA GAA TCT GCT GGG GCA ATT AGC AGC CCT GCA CTG ACC TTG

125 . 130 · 135

Arg Arg Tyr Phe GIn Gly He Arg VaI Tyr Leu Lys GIu Lys Lys

AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA \

140 - 145 150

Tyr Ser Asp Cys AIa Trp GIu VaI VaI Arg Met GIu He Met Lys

TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA GTT GTC AGA" ATG GAA ATC ATG AAA

155 ■"'.- 160 165

Ser Leu.Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin GIu Arg Leu Arg Ser Lys

TCC TTG TTC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTG AGA AGT AAA

170 ·. ·■■.-.'
Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser

GAT AGA GAC CTG GGC TCA TCT

In Position 111 kann die Sequenz GGG (codierend für Gly)
durch GAG (codierend für GIu) ersetzt werden. Die bevorzugten Moleküle beinhalten ebenfalls Derivate, die an der
Aminosäureposition 78 N-glykosyliert sind.

Die erfindungsgemäßen Interferone enthalten 172 Aminosäuren und weisen eine Divergenz von mindestens 36,7 % und maximal 42,8 % gegenüber den Aminosäuren 1 bis 166 der literaturbekannten Interferone auf. , ■

hegende zu den Zeichnungen: -. \"

Figur 1 zeigt eine Restriktionskarte des Klons E76E9,

Figur· 2 zeigt eine Restriktionskarte des Klons P9A2,

Figur 3 zeigt die. DNA-Sequenz des Klons P9A2, .·■"-..·

Figur 4 zeigt die DNA-Sequenz des Klons.!E7.6E9. . · ,'

•Eine humane B-Zellymphon-Linie,z.B. Namalwa-Zellen-(siehe G. Klein et al., Int. J. Cancer 3J3, 44 .(1972) ), kann durch Behandlung mit einem Virus, z.B. Sendai Virus, zur gleichzeitigen Produktion von α- und ß-lnterferon angeregt werden. Wird hierbei die aus stimulierten Namalwa-Zellen gebildete mRNA isoliert, so kann diese als Template zur cDNA-Synthese dienen. Um die Ausbeute an Interferon-spezifischen Sequenzen beim Kloniervorgang zu erhöhen, wird die mRNA-Präparation über einen Zuckerdichtegradienten-entsprechend der verschiedenen Länge der individuellen mRNA-Molekiile aufgetrennt. Vorteilhafterweise wird die mRNA in dem Bereich um 12S (ungefähr 800 bis 1000 Basen Länge.der mRNA) gesammelt. In diesem Bereich sedimentiert die für a- und ß-Interferone spezifische mRNA. Die mRNA aus diesem Gradientenbereich wird durch Präzipitation und Auflösen in'Wasser, konzentriert.

Die Erstellung einer cDNA Bibliothek folgt im wesentlichen literaturbekahnten Methoden (siehe z.B.. E. Dworkin-Rastl, M.B« Dworkin,und P. Swetly,'Journal of Interferon Research 2/4, 575-585 (1982)). Die mRNA wird durch Zusatz von. oligo-dT geprimt. Anschließend.wird durch Zusatz der vier Desoxynukleosidtriphosphate (dATP, dGTP, dCTP_r dTTP) und dem Enzym Reverse Transkriptase in einer entsprechend gepufferten Lösung die cDNA 1 Stunde bei 45°C synthetisiert. Durch Chloroformextraktion und Chromatographie über eine Gelsäule, z.B. über Sephadex G50, wird das cDNA/mRNA Hybrid gereinigt. Die.RNA wird durch Alkalibehandlung (0,3 M NaOH bei 50⁰C,"1 Stunde) hydrolysiert, und die cDNA nach Neutralisieren mit saurer Natriumazetatlösung mit^; Äthanol prazipitiert. Nach

Zusatz der vier Desoxynukelosid-triphosphate und E.coli DNA-polymerase I in entsprechender Lösung wird die Doppelstrangsynthese ausgeführt, wobei die cDNA zugleich als Template und als Primer durch Haarnadelstrukturbildung an ihrem 3'-Ende fungiert (6 Stunden bei 15°C) (siehe A. Eftratiadis et al., Cell T_, 279 (1976)). Nach Phenolextraktion, Sephadex G50 Chromatographie und Äthanolpräzipitation wird die DNA in geeigneter Lösung einer Behandlung mit der Einzelstrangspezifischen Endonuklease Sl unterzogen. Dabei werden die Haarnadelstruktur, sowie nicht in Doppelstrang umgesetzte cDNA abgebaut. Nach Chloroformextraktion und Präzipitation mit Äthanol wird die Doppelstrang-DNA (dsDNA) auf einem Zuckerdichtegradienten der Größe nach aufgetrennt. Für die folgenden Schritte des Klonierens wird bevorzugt nur qsDNA der Größe 600 bp und mehr verwendet, um die Wahrscheinlichkeit zu steigern, daß nur Klone erhalten werden, welche die komplette kodierende Sequenz für die neuen Interferone enthalten. dsDNA von mehr als 600 bp Länge wird aus dem Gradienten durch Präzipitation mit Äthanol und Auflösen in Wasser konzentriert.

Um die entstandenen dsDNA-Moleküle_; zu vermehren, müssen " "■ diese zunächst in einem entsprechenden Vektor und an- , . schließend in das Bakterium E.coli eingebracht werden. Der verwendete Vektor ist vorzugsweise das Plasmid pBR322 (F. Bolivar et al., Gene 2, 95 (1977)). Dieses Plasmid besteht im wesentlichen aus einem Replikon und zwei Selektionsmarkern. Diese verleihen dem Wirt Resistenz gegen die Antibiotika Ampicillin und Tetracyclin (Apr, Tcr). Das Gen für die ß-Lactamase (Apr) enthält die Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease Psti. pBR322 kann mit Pstl geschnitt τ werden. Die überhängenden 3' -rEnden werden mit dem Enzym te Tiinale Desoxynukleotid Transferase (TdT) unter Vorlage voi dGTP in entsprechend gepufferter Lösung verlängert. Gleichzeitig wird die dsDNA ebenfalls mit dem Enzym TdT unter Verwendung von dCTP an den 3'-Enden verlängert. Die

·■■■■■ ^: . . _ ■^:..:-;V;;>·^;-:^;;^:: ^.-^;; ■ 3428370

Homqpolymerenden von Plasmid und. dsDNA sind komplementär und hybridisieren, wenn Plasmid DNA und dsDNA im entsprechenden Konzentrationsverhältnis und unter geeigneten Salz-, Puffer- und Temperaturbedingungen gemischt werden (T. Nelson et al., Methods in Enzymology 68Y 41-^5.0 (1980) ). ·■'■ ' ■

E. coli vom Stamm HBlOl (Genotyp F-, hsdS20 (r-B, Jn-B) ^:" . recAl3, ara-14 ,· proA2 , lacYl, galK2 , rpsL20 (Smr) , xyl-a, .^: •mtl-1, supE44, lambda-) wird zur Aufnahme der rekombinahten Vektor-dsDNA-Moleküle durch Waschen mit einer CaC^-Lösung vorbereitet. Kompetente E.coli HBlOl werden mit der DNA gemischt,und nach Inkubation bei 0⁰C wird die so erhaltene Plasmid-DNA durch Hitzeschock bei 42°C für 2 Minuten transformiert (M. Dagect et al.,Gene 6^, 23-28. (1979)). Anschließend werden die transformierten Bakterien auf Tetracycliri-haltigen Agarplatten (10 μ9 pro ml) plattiert. Auf diesem Agar können nur E.coli HBlOl wachsen, die ein Vektor- oder rekomfoinantes Vektormolekül aufgenommen haben (Tcr). Rekombinante Vektor-dsDNA Moleküle vermitteln dem Wirt den Genotyp ApsTcr, da durch das Einbringen der dsDNA in das a-Lactamasegen die Information, für die ß-Lactamase zerstört worden ist. DieKlone wurden auf Agarplatten über-■ tragen, die 50 μg/ml Ampicillin .enthielten. Nur etwa 3 % wuchsen an, was bedeutet, daß 97 % der Klone die Insertion eines dsDNA Moleküls enthielten. Ausgehend von 0,5 μg .dsDNA . wurden mehr als 30000 Klone erhalten. 28600 Klone davon .wurden individuell in die Näpfe von Mikrotiter'platten übertragen, die Nährmedium, 10 .^g/ml Tetracyclin und Glyzerin enthielten. Nachdem die Klone, darin angewachsen waren, . wurden die Platten zur Aufbewahrung." bei -70⁶C gehalten (cDNA/Bibliothek) . . : ' ■· <.-■·."_ "· /. , .

Zum Durchsuchen der cDNA-Bibliothek auf. neue Interferon-Gene enthaltende Klone werden die Klone nach dem Auftauen auf Nitrozell.ülosefilter übertragen. Diese Filter liegen auf Tetracyclin-ha'ltigem Mähragar i. Nach, dem Anwachsen der- Bakterienkqlonien anschließend wixd die DNA der Bakterien auf ' dem· Filter fixiert.· \ , -.' .."■-. \ -'.'■-' '.-';-'

I* * ■*

Als Probe dient vorteilhafterweise das Insert des Klons pER33 (E. Rastl et al., Gene 2LL, 237-248 (1983) - siehe auch Europäische Patentanmeldung Nr. 83112812.9 vom 20. Dezember _: 1983), das das Gen für IFN-a-2-Arg enthält. Durch Nicktranslation wird dieses Stück DNA radioaktiv markiert, wobei DNA-Polymerase I, dATP, dGTP, dTTP und a-32P-dCTP verwendet wir.d. Die Nitrozellulosefilter werden unter geeigneten, \ nicht stringenten Hybridisierbedingungen ohne Zugabe der radioaktiven Probe zunächst vorbehandelt und danach ca, 16 . Stunden unter Zusatz der radioaktiven Probe hybridisiert. Danach werden die Filter, ebenfalls unter nicht stringenten Bedingungen gewaschen. Durch die niedrige Stringenz der Hybridisierung und Waschung werden nicht nur Interferon- . ■ · ' α-2-Arg-haltige Klone erfaßt, sondern auch andere Inter- · .feron-haltige Klone,.deren Sequenzen beträchtlich von der ■ des bihser bekannten Interferon-α abweichen können..-Nach dem Trocknen werden die Filter auf einen Röntgenfilm exponiert. Eine Schwärzung, die .deutlich über dem Niveau des-".Hinter- "._'-, grundes liegt, zeigt das Vorhandensein eines Klons mit ; '--■".;. -_· ' Interferon-spezifischen Sequenzen an·. , ■; : . '■ , ■ ^:' '

Da die Radioaktivitätssignale unterschiedlicher Güte sind,. '. ' ' werden die positiven Klone bzw. die positiv-verdächtig.rea- "- ^r. gierenden Klone im Kleinmaßstab angezüchtet. Die Plasmid-- ·. ■ .; '.,. DNA-Moleküle werden isoliert, mit. der Restriktionsendphukle- "".-.-." '. ase Pstl verdaut und auf einem Agarosegel elekrophoretisch · der-Größe nach aufgetrennt (Birnboim et al., Nucl.. Acid. , ' \ Res. 7, 1513 (1979)). Die DNA im Agarosegel wird nach der : .. Methode von Southern (E.M. Southern, J. Mol. Biol. 9_8_, : 503-517 (1975)) auf ein Nitrozellulosefilter übertragen. Die'. DNA dieses Filters wird mit der radioaktiven, IFN-Gen-hal- .. "■ ". igen, denaturierten Probe hybridisiert. Als positive Kon- " trolle dient das Plasmid E10F7, das das Gen für- Interferon α " ; . 2-Arg enthält. Das Autoradiogramm macht deutlich, daß der _; .. * ^; Klon E76E9 und der Klon P9A2 eine-.Sequenz enthalten,, welche . - V₁ .'-"-'I

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unter nicht stringenten Bedingungen.init dem Gen des Ihter-■ ferons-a2-Arg hybridisiert^ um die dsDNÄ Inserts, der Klone ^: _u E76E9 und· P9A2 näher .zu G|iarak-.terisiere'n> werden die Plas-■'" mi'de die sei: .'.Klone in größfer-em^: Mäßstab,; h4^:rgesteTit; Die; .DNA wird mit'verschiedenen Restriktiorisenäonuk-leasen verdaut, so/ "z.B. ■ mit.· AIuIV ^;Sau3A, Bgill^ Hinfl, pstliund Haelll. .i)ie.■,■;■- > ·: •e^:ntstehencfen^; Fragmente werden in-einem Agarosegel aufger ·!

trennt. Durch Vergleich, mit .entsprechehden.Größeninarkerri, so ' z.B. -den Fragmenten, die. durch !verdauung von pBR322 mit der '■;".' ReSitrikfrionsendonuklease ;HinfI bzw. Hae'III entstehen:/ werden i_: die Größen der Fragmente bestimmt. Durch Kartieren-"nach

Smith und.'.Birhstiel '(H.O. "Smith et al... Nucl. Acid. Res,!· 3_,, ;' '.2387-2398 .".(1967;)) wird ,die⁵ ^Reihenfolge "dieser Fragmente be- - stimmt.'.Aus. den-so ermittelten Restr'iktio.risenzymkarten ' ■;..-■" (Figur !.und .-2). läßt"sich", über'raschenäerweise ableiten, daß . es sich bei. den Inserts de'c·"'Klöhe- E7ÖB9.''und;. P9Ä2' um' eini-'bis-,,her unbekanntes. Interferoh'gen ,-namlioh: · jjenes. des Inter-; ;-.-. .. V , f.eron-.-Y;,. handelt. V;'^: .-■:■'■ ,. i"Ä ' ^.'.T;■■;'"'.'·■-% '- ■·■■ '■■', ■ •■'■'_:^^ '■'■>

... ..-Diese;.. Information über das' Inte_:rferon.r.Y^: wird benutzt, um. das '/'.cDNA insert mit "geeigneten; Res-tr ikti^?ön~sendohuklea$en,· zu 'ver-, ^r dauen. Die entstehenden- Fragmente: werden in; die dsDNA-Form ■:

■ - ■ ■ - ■-;-►"■ : '" ;■■■?■■ ^-v? - % «; :·; ^H -■■ \ '■/ ■'

-■. · : -Messing' et al..-,/Gene 19/, ^6^-276 ^.(19_;ff2_:)-.).-.Jiimd mit'der ■,,;/■'.■ .·■-.-.'"

.. ^s Sanger ' sc.hen Dideoxy Methode sequenzieret '(,F. Sänger et al.,. ;■'·'-.'·'"■". .■-'·· Proc Nat'l; ."'Acad., 'Sei.. '74%'j5463-r5467^(i9.,ⁱ77jj . Die Einzel- ■ " ,

'■' ''.. str:äng-DNÄ^:def _rekombinahtejV Phageri wirä_;, isoliert. Nach dem ^:. •.. Binden eines synthetischen^.Oligomers iwerdeh. in vier separa-.' ^! '. -,ten Ansätzen gWeitstrangsynthesen. unter Verwendung, des >. ·.' ." großen Fragments der .DNA-Polymerase ί aus; EV coli (Klehow'- . '. Fragment)' durchgeführt;;' Zu jeder Ider; .vier Teilreaktionen "; wird eine^ der ^:vier DidesoxynukleosidtripKosphate (ddATP^ . . _; -.■'·". ddGTP, ddCTP, ddTTP) zugegeben. JÖas ^rführ\t izu 'statistisch' '.-'- ■ ■ ..-,': verteilten Kett'enabbruehen an jenen ;Steilen, an denen sich " \'- ":_: in der Template-DNA die zu dem jeweiligen Didesoxynukleosidtr!phosphat komplementäre Base befindet. Außerdem wird zu-

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sätzlich radioaktiv markiertes dATP verwendet. Nach Beendigung der Synthesereaktionen werden die Produkte denaturiert, und die Einzelstrang-DNA-fragmente der Größe nach in einem denaturierenden polyacrylamidgel getrennt (F..Sanger et al·., FEBS Letters 8_7_, 107-111 (1978)). Danach wird das Gel auf einen Röntgenfilm exponiert. Aus dem Autoradiogramm läßt sich die DNA-Sequenz des rekombinanten M13 Phagen ablesen. Die Sequenzen der Inserts der verschiedenen rekombinanten . Phagen werden mittels geeigneter Computerprogramme verarbeitet (R. Staden, Nucl. Acid. Res. 1Ό_, 4731-4751 (1982)).

Figur 1 und 2 zeigen die Strategie des Sequenzierens. Figur 4 zeigt die DNA-Sequenz des Inserts des Klons E76E9, Figur 3 die des Klons P9A2. Der. nicht kodierende DNA-Strang ist in ö'-> 3' Richtung gezeigt, zusammen mit eier daraus abzulei- . tenden Aminosäuresequenz. . .

Die isolierte cDNA des Klons E75E9 .für Interferon-Y ist 858 · Hasenpaare lang und besitzt eine "3 ' nicht translatierte Region. Die Region, die für reifes Interferon-Y kodiert, reicht von dem Nukleotid 9 bis zum Nukleotid 524. Die isolierte cDNA des Klons P9A2 für Interferon-Y ist 877 Basenpaare lang, wobei die für reifes Interferon-Y kodierende , • Sequenz von dem Nukleotid 8 .bis zum Nukleotid 523 reicht. ^z-Die 3' nicht translatierte Region reicht im Fall des P9A2 bis zum poly-A-abschnitt. ■ ..

Die für reifes Interferon kodierenden DNA-Sequenzen sind .in .den Klonen E76E9 und P9A2 komplett enthalten. .Sie beginnen am N-terminälen Ende mit den Aminosäuren Cystein-Asparagin- ;äure-Leucin. überraschenderweise sind die beiden reifen

iterferon-Y 172 Aminosäuren lang,, was ,deutlich von der L ige von bisher bekannten Interferonen, z.B. 166 (bzw. 165) A· inosäuren bei a-Interferonen abweicht. Überraschenderweise besitzt das interferon-Y' eine potentielle N-GlykosylLerungs- ; stelle an der Aminösäureposition 78 (Asparagin-Methionin-Threonin}·.. -. '/■■ ' / " ' . "·-·.

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Ein Vergleich der DNA der Klone E76E9*und P9A2 zeigt einen Unterschied. Das für die Aminosäure 111 kodierende Triplett im Klon E76E9 ist GAG und kodiert für. Glutaminsäure, während dieses Triplett im Klon P9A2 GGG ist,". und. für Glycin fco- . diert. Die beiden Interferon-Y proteine unterscheiden sich . daher in·einer Aminosäure und werden mit Interferon-Y-Glü , (E76E9) und Inter feron-Y-Gly (P9A2) bezeichnet. '.' .' -■ ..

Der Vergleich der Interferone Y-GIu bzw. Y-GIy mit den bisher bekannten menschlichen α-interferon Subtypen ergibt folgendes Bild: , ' ■ ' . ; . " ,·

Y . ;. · alpha .

Länge des Proteins in Aminosäuren

166

potentielle N-Glykosylierungssstelle an Position

+ ) Interferon alpha Ä besitzt nur Ϊ6-5 Ariiinosäuren .

++): Interferon alpha H besitzt eine potentielle N-Glykosylierungsstelle an Position_ .75 (D.'Goeddel et al», Nature 290, 20-26 , (1981)). ^r' - ^-': .]:':% ■; -' . ·> ■ ■'■ '. ■

EPO GQPY

Es sei erwähnt/daß es sich bei den erfindungsgemäßen Polypeptiden nicht nur.um die zwei reifen Y-Interferone, die im einzelnen beschrieben sind, handelt, sondern eben- \ falls um jedwede Modifikation dieser Polypeptide,, die die IFN-Y-Aktivität unbeeinflußt läßt. Diese Modifikationen beinhalten z.B. Verkürzung des Moleküls am N- oder C-terminalen Ende, Austausch von Aminosäuren durch andere Reste, wodurch die Aktivität nicht wesentlich verändert wird, chemische oder biochemische Bindungen des Moleküls an ' andere Moleküle, die inert oder aktiv sind. Bei den letztgenannten Modifikationen kann es sich beispielsweise um Hybridmoleküle aus einem oder mehreren Y-Interferonen und/oder bekannten·:*-- oder ß-Interferonen handeln.

Gegenstand der Erfindung sind nicht nur Gen-Sequenzen, die spezifisch für die angegebenen Y-Interferone codieren, sondern ebenfalls Modifikationen, die leicht und routinemäßig durch Mutation, Abbau., Transposition oder Addition erhalten werden können. Jede Sequenz, die"für* die beschriebenen humanen Y-Interferone codiert (d. h. die das biologische Aktivitätsspektrum aufweist, das ■ ■ hier beschrieben ist) und im Vergleich mit den.gezeigten degeneriert ist, .ist ebenfalls eingeschlossen;: Fachleute auf ..diesem Gebiet sind in der Lage, DNA-Sequenzen' der codierenden Regionen₍zu degenerieren. Ebenso ist ' jede Sequenz, die für ein P'olypeptid mit dem Äktivitätsspektrum des IFN-Y codiert, und die mit den gezeigten. * ; Sequenzen (oder Teilen davon) unter stringenten Be- ■- ·'_"·" .dingungen hybridisiert·, (beispielsweise Bedingungen-, die -, für mehr als 85. %", bevorzugtmehr als 90 % Homologie '.'■'■ selektieren) beinhaltet. ... '''--■ ' ' ..''' ^;·

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Die Hybridisierungen werden in 6 χ SSC/5 χ Denhardt's-Lösung/0,1 % SDS bei 65°C durchgeführt. Der Grad der Stringents wird im Waschschritt festgelegt. So sind die Bedingungen, die für eine Selektionierung auf DNA-Se- . quenzen mit ca. 85 % oder mehr Homologie geeignet sind, wie folgt: 0,2 χ SSC/0,01 %, SDA/65°C , für die Selektionierung auf DNA-Sequenzen mit ca. 90 % oder mehr Homologie: 0,1 x SSC/0,01 % SDS/65°C.

Interferon-Y-Gene können unter Bedingungen in jeden Organismus eingebracht werden, die zu hohen Ausbeuten führen. Geeignete Wirte und Vektoren sind dem Fachmann bestens bekannt; als Beispiel sei auf die EPA 00 93 619, veröffentlicht am 9. November 1983, hingewiesen.

Insbesondere sind Prokaryoten für die .Expression bevorzugt. Beispielsweise ist E. coli K 12, Stamm 294 (ATCC No. 31 446) geeignet. Andere Stämme, die geeignet sind, beinhalten E. coli X1776 (ATCC Nr. 31 537). Ebenso wie die vorerwähnten Stämme können auch E. coli W 3110 (F~, Lambda", Prototroph, ATCC Nr.' 27325), Bazillen wie Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriaceae, wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcesens ' und verschiedene Pseudomonaden verwendet werden. . ·

Im allgemeinen können Plasmid-Vektoren, die Replikon und Kontrollsequenzen, die aus Spezies stammen, die kompatibel mit den Wirtszellen sind, enthalten, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet werden. Der Vektor trägt üblicherweise neben einer Replikationsstelle Erkennungssequenzen, die es ermöglichen, in transformierten Zellen phenotypisch zu selektionieren. Zum Beispiel wird E. coli üblicherweise mit pBR322 transformiert, ein Plasmid, das aus E. coli Spezies stammt (Bolivar, et al., Gene 2, 95 (1977)). '

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pBR 322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und liefert damit einfache Mittel, transformierte Zellen zu identifizieren. Das pBR322-Plasmid oder auch andere Plasmide müssen außerdem von sich aus enthalten oder müssen dahingehend modifiziert sein, daß sie Promo toren enthalten, die vom mikrobiellen.Organismus zur Expression ihrer eigenen Proteine verwendet werden können.

Die Promotoren, die am häufigsten bei der Herstellung rekombinanter DNA verwendet werden, beinhalten die *Beta-Lactamase (Penicillinase) und Lactose-Promotor-Systeme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Itakura eta al., Science 198, 1056 (1977); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)) und Tryptophan (trp) Promotor-Systeme (Goeddel et al.,. Nucleic Acids Res. §, 4057 (1980).; Europa-Anmeldung, Offenlegungs-Nr. 00 36 776). Während die erwähnten die gebräuchlichsten Promotoren sind, sind darüber hinaus : auch andere mikrobielle Promotoren entwickelt und benutzt worden. Die Gen-Sequenz für IFN-Y kann beispielsweise unter der Kontrolle des Leftward-Promotors des Bakteriophagen Lambda (P_T ) eingesetzt werden. Dieser Promotor ist einer .--

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der als besonders stark bekannten Promotoren, der steuerbar ist. Die Steuerung wird möglich durch den Lambda- . Repressor,von dem-benachbarte Restriktionsschnittstellen■' bekannt s.inc¹.. ■ . ■'..'. '

Ein temperaturempfindliches Allel dieses Gens kann in einem Vektor, der eine vollständige IFN-Y-Sequenz enthält, eingefügt .werden. Wird die Temperatur auf 42°C erhöht, wird der Repressor inaktiviert und der Promotor bis zu seiner maxi- · nalen Konzentration exprimiert. Die Summe der mRNA, die

lter diesen Bedingungen produziert.wird, sollte ausreic .?nd sein, um. eine Zelle zu erhalten, die unter ihren m ien synthetischen Ribonukleinsäuren ungefähr 10 % ent- . ■" hä.it, die von dem P-Promotor stammt. Auf diese Weise-· · ist es möglich, eine Clon-Bank zu-.fit&b] ieren", in der eine funktionell e IFN-Y-Sequenz ' --._'. ''■ : ■' '

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in Nachbarschaft, zu einer Ribösom-Bindungsstelle plaziert wird in variierenden Abständen zu dem Lambda-P_T -Promotor .· Diese Klone können dann überprüft und der mit der höchsten Ausbeute.· selektiert werden. ·-"■■' - - ,.r. ■"■ - - _:

Die Expression und Translation einer■IFN-Y-Sequenz kann·.' auch unter Kontrolle anderer Regulationssysteme, die als ."homoLog" zu dem Organismus in seiner untransformierten Form gelten können, ablaufen.;. So enthält z.B. chromosomale DWA von einem Lactose-abhängigen E. coli ein Lactose oder Lac-Operon,. der durch Ausschüttung des Enzyms . Beta-Galactosidase den Lactose-Abbau ermöglicht.

Die Lac-Kontrollelemente können.aus dem Bacteriophagen Lambda-pl'aC5, der infektiös für E. coli ist, erhalten werden. Das, Lac-Operon des Phagen kann durch Transduktion aus derselben Bakterien-Spezies stammen. Regulationssyteme, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Verwendung finden können, können aus plasmidischer DNA stammen, die dem Organismus eigen ist. Das Lac-Promotor-Operator-System kann durch IPTG induziert werden.

Andere Promotor-Operator-Systeme' oder Teile hiervon können genausogut verwendet werden: beipsielsweise Arabinose-Operator, Colicine E,-Operator, Galactose-Operator,⁴ alkalischer Phosphatase-Operator, trp-Ope'rator, Xylose A operator, tac-Promotor u.ä.i

Die Gene können vorzugsweise in dem Expressions-Plasmid pERlO3 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983); vergleiche auch europäische Patentanmeldung No. 83112812.9, Hinterlegung DSM 2773', 20. Dezember 1983) exprimiert ^: werden. Diese Vektoren enthalten alle Regulationselemente die zu einer hohen Expressionsrate der klonierten Gene ' ■ führen. ■ . .· ^: -.;·-. ' ^!

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Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroorganismen, wie Hefekulturen verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae ist die am meisten verwendete unter den eukaryotischen Mikroorganismen, obwohl eine Anzahl anderer Spezies allgemein erhältlich ist. zur Expression in ;. Saccharömyces wird beispielsweise das Plasmid YRp7 (Stinchcomb, et al. Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschumper, et al., Gene 10, 157 (198O)) und das Plasmid YEp 13 (Bwach of al., Gene 8, 121-133 (1979)) üblicherweise verwendet. Das Plasmid YRp7 enthält das TRPl- · Gen, das eine Selektionierungsmarkierung :

für eine. Hefemutante, die unfähig ist, in tryptophanhaltigem Medium zu wachsen, bereitstellt; beispielsweise ATCC Nr. 44076. . . '

Das Vorhandensein des TRPl Schadens als Charakteristikum des Hefe-Wirts Genoms stellt dann'ein wirksames Hilfsmittel dar, um die Transformation nachzuweisen, indem ohne Tryptophan kultiviert wird." Ganz ähnlich verhält es sich bei dem ' Plasmid YEpI3, das das Hefe-Gen LEU 2, das zur Ergänzung einer i/EU-2-Mu tan te verwendet werden kann,. enthält. Geeignete Promotor-Sequenzen für Hefe Vektoren beinhalten' die 5'-flankierende Region des ADH I (Ammerer, G./ Methods , ' of Enzymology 101, 192-201 (1983)), 3-Phosphoglycerate Kinase (Hitzeman, et al., J. Biol. Chem. 255, 2073 (1980) _-'' oder andere glykolytische Enzyme (Kawasaki und Fraenkel, ..". BBRC 108, 1107-1112 (1982) )·,' -wie " Enolase, Glyceraldehyd-3-phösphat, Dehydrogenase,. Hexokinäse, Pyruvat, Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-Phosphat Isomerase,. Phos- ; phoglucose Isomerase und Glucokinase. Bei der Konstruktion * geeigneter Expressions Plasmide können die mit diesen Genen assoziierten .Terminationssequenzen ebenfalls in.den ' Expressions-Vektor am 3'-Ende der zu exprimierenden Sequenz eingesetzt werden, um Polyadenylierung und _; ·. Termination der mRNÄ vorzusehen. ". . . ' _; . .

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Andere Promotoren, die zudem noch den Vorteil der durch Wachstümsbedingungen kontrollierten Transkription besitzen, sind die Prömotor-Regionen der'Alkohol-Dehydrogenase-2,. Isocytochrom C, Säure-Phosphatase, abbauende Enzyme, die mit dem. .Stickstof f-Metabolismus gekoppelt sind, die obenerwähnte Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase und Enzyme, die für die Verarbeitung von Maltose und Galaktose verantwortlich sind. Promotoren, die durch den Hefe Mating Typ Locus· reguliert werden, beispielsweise Promotoren der Gene BARI, MFCl, STE2, STE3,' STE5 können bei temperaturregulierten Systemen durch die Verwendung von temperaturabhängigen s_iv Mutationen eingesetzt werden. (Rhine, Ph.D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon .(1979), Herskowitz and Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, part I, 181-209 (1981 ), Cold Spring Harbor Laboratory). Diese Mutationen beeinflussen die Expression der ruhenden Mating Typ Kassetten von Hefen und dadurch indirekt die Mating Typ abhängigen Promotoren. Generell ist jedoch jeder Plasmid Vektor, der einen Hefekompatiblen Promotor, originäre Replikations- und Terminationssequenzen enthält,'geeignet .· - _ ' :

Zusätzlich zu Mikroorganismen sind Kulturen multizellulärer Organismen ebenfalls geeignete Wirtsorganismen. Im Prinzip ist jede dieser Kulturen einsetzbar, Qb von Wirbeltier- oder wirbellosen Tierkulturen- Größtes Interesse besteht jedoch an Wirbeltier-Zellen, so daß . ■ die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebe-Kultur) in den letzten Jahren zu einer routinemäßigen Methode wurde. . : ■

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(Tissue, Culture,■Academic Press, Kruse and Patterson, Editors (1973)). Beispiele solcher nützlichen Wirtszellinien sind VERO- und HeLa-Zellen, Goldhamster-Eierstock (CHO)-Zellen und W138, BHK, COS-7 und MDCK-Zellinien. Expressionsvektoren für diese Zellen enthalten üblicherweise (wenn nötig) eine Replikationsstelle, einen Promotor der vor dem zu exprimierenden Gen lokalisiert ist, gemeinsam mit jeder notwendigen Ribosomenbindungsstelle, RNA-SpleißstelIe, Polyadenylierungsstelle und transkriptionelle Terminations-Sequenzen.

Bei der Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen auf den Expressions-Vektoren oftmals aus viralem Material vorgesehen. Beispielsweise stammen die üblicherweise verwendeten Promotoren au.= Polyoma Adenovirus 2, und besonders häufig aus Simian Virus 40 (SV 40). Die Anfangs- und Endpromotoren des SV 40 sind besonders nützlich, da beide leicht aus dem Virus als Fragment zu erhalten ist, das auch noch die virale Replikationsstellc des SV 40 enthält. (Fiers et al.,

Nature 273, 113 /1978)). Auch können kleinere oder _·- größere Fragmente des SV 40 verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthalten die annähernd 250 bp lange Sequenz die von der Hind III Sclvo/V-.stel le bis .zur ΗσΙ 1 Schnittstelle in der viralen ReplikationssteiIe reicht. Außerdem ist es ebenfalls möglich und oft empfehlenswert, Promotor- oder Kontroll-Sequenzen zu verwenden, die normalerweise mit den gewünschten Gense.quenzen verknüpft sind, vorausgesetzt, diese Kontroll-Sequenzen sind kompatibel zu den Wirtsze11systemen.

Eine Replikationsstelle kann entweder durch entsprechende Vektorkonstruktion vorgesehen werden, um eine exogene stelle einzubauen, beispielsweise aus SV 40 oder anderen viralen Quellen (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, PBV, etc,) .

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oder kann durch die chromosonalen Replikationsmechanismen der.Wirtszelle vorgesehen werden. Wird der Vektor in das VJirtszel lenchromosom integriert, reicht die zuletztgenannte Maßnahme meistens ar.~, ;

Transformation der Zellen mit den Vehikeln kann durch eine '· Vielzahl an Verfahren erreicht werden. Beispielsweise kann sie durch Kalzium erfolgen, wobei entweder die Zellen in . ' Magnesium gewaschen und die DNA den in Kalzium suspendierten Zellen zugibt oder die Zellen einem Kopräzipitat von DNA und Kalziumphosphat ausgesetzt werden. Bei nachfolgender Genexpression werden die Zellen auf Medien übertragen, di/? für transformierte Zellen selektieren, ,

Nach erfolgter Transformation des Wirtes, Expression des Gens und Fermentation oder Zeilkultivierung unter Bedingungen, bei denen IFN-Y exprimiert wird, kann das Produkt üblicherweise durch bekannte chromatogr^phische Trennmethoden extrahiert werden, um so ein Material zu erhalten, das IFN-Y mit oder ohne Leader und: Trailing-Sequenzen enthält. IFN-Y kann mit 'einer Leader-Sequenz am N-Terminus exorimiert werden (Pre-IFN-Y), die von einigen Wirtszellen entfernt werden kann. Wenn nicht, so ist eine Abspaltung des Leader-Polypeptides (wenn vorhanden) erforderlich, um reifes IFN-Y zu erhalten. Alternativ kann der IFN-Y Klon .so modifiziert werden, daß das reife Protein im Mikroorganismus direkt statt des Pre-IFN-Y produziert wird. Für diesen Fall kann die Precursor Sequenz des He.fe-Mating-Pheromons MF-alpha-1 verwendet werden, um eine korrekte "Reifung" des fusionierten Proteins und die Ausscheidung der Produkte in das Wachstumsmedium oder den periplasmischen Raum zu gewährleisten. Die DNA-Sequenz für funktionelles'oder reifes IFN-Y kann

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mit MF-alpha-1 an der, vermuteten cathepsin-ähnlichen Schnittstelle (nach Lys-Arg). an Position 256 vom Initiätionscodon ATG aus (Kurjan, Herskowitz, Cell 30, 933-943 (1982)) verbunden sein.

E. coli HB 101 mit dem Plasmid E76E9 und E. coll HB 101 mit dem Plasmid P9A2 sind bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen (DSM Göttingen) unter der Nummer DSM 3003 _; respektive DSM 3004 hinterlegt. ·

Eine Kultur von E. coli HB 101 ,,ein rekombinantes Plasmid mit dem Klon E76E9, der das IFN-Y Gen enthält, beinhaltend; wurde auf Interferon-Aktivität überprüft. Hierzu wurde ein Lysat des Bakteriums nach dem Wachstum hergestellt und in einem Plaque-Reduktions-Test überprüft. Das Bakterium . produzierte Interferon-ähnliche Aktivität.

Basierend auf ihrem biologischen Wirkungsspektrum sind die neuen, erfindungsgemäßen Interferons verwendbar für jede Art der Behandlung' für die auch .die bekannten Interferone eingesetzt .werden. Diese beinhalten beispielsweise Herpes, Rhinovirus, opportunistischeAIDS-Infektionen,- verschiedene Krebsarten und ähnliches. Die neuen Interferone können alleine oder iri Kombination mit anderen bekannten Interferonen oder biologisch aktiven Produkten eingesetzt werden, beispielsweise mit IFN-alpha, I.L-2, anderen Inunun-Modulatoren und ähnlichen. .··.--·'■·■_■-. . ·

IFN-Y -kann parenteral verabreicht werden in Fällen, in denen Antitumor oder antivirale Behandlung erforderlich ist. und in Fällen, in. denen sich ummunosuppressive Eigenschaften zeigen, dosierung.und Dosierungsrate können ähnlich denen sein, > ie zur Zeit bei klinischen Untersuchungen für IFN^£- haterialien gelten z.B.; ca. (1-10). χ 10 Einheiten täglich und bei Präparaten, die zu mehr als 1 %· rein sind bis zu', beispielsweise 5.x 10 Einheiten 'täglich. "."; . -. ·

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Beispielsweise können . für eine ^: zweckmäßige Dosierungs--. form bei- einem im v;esentliehen .homogenen Bakterien-I-FN'-Y, bei .parenteraler Verwendung ,3 .mg IPN-Y' in, 25 ml 5%igem menschlichem Serum Albumin gelöst werden; Diese Lösung ;. wird dann durch ein bakteriologisches filter gegeben und die gefilterte Lösung, aseptisch adf 100'Fläschchen verteilt,:'... von dem jedes 6 χ 10 Einheiten reines IFN-Y. zur paren- . teralen Applikation geeignet,.enthält. Die Gläschen werden vor Verwendung vorzugsweise in der Kälte (-20.C) aufbev/ahrt. Die erfindungsgemäßen Substanzen können in bekannter Weise formuliert werden,um pharmazeutisch verwendbare Mittel zu erhalten, wobei das erf indungsgemäße , Polypeptid mit einer

pharmazeutischen akzeptablen Trägersubstanz vermischt wird. Gebräuchliche Trägerstoffe und ihre Formulierung sind bei E'.W-. Martin in Remington's Pharmaceutical Sciences ' beschrieben, worauf "aLisdrüchlich- Bezug genommen wird. ·. IFN-Y wird mit einer angemessenen Menge , des Trägerstoffes vermischt/um geeignete pharmazeutische Mittel' zu schaffen, di.e.-.f:ür eine effektive'Anwendung beim Empfänger (Patienten) geeignet .sind;„ Bevorzugt wird eine parenterale Applikation'vorgenommen;

Die folgenden Beispiele, die die Erfindung nicht eingrenzen sollen, beschreiben die Erfindung im Detail» ■_■ ·

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Beispiel 1 Auffinden IFN-Sequenz-spezifischec Klone

a) Herstellung der cDNA-Bibliothek

rnRNA aus Sendai-Virus-stimulierten Zellen wurde als Ausgangsina terial zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek nach literaturbekannten Methoden verwendet (E. Dworkin-Rastl et al., Journal of Interferon Research VoI 2/4, 575-585 (1982)). Die angefallenen 30.000 Klone wurden individuell in die Näpfe von Mikroticerplatten übertragen. Folgendes Medium wurde zum Wachstum und Einfrieren der Kolonien verwendet:

10	g	Trypton
5	g	Yeast Extract
5	g	NaCl
0,51	g	Na-Citrat χ 2 H₂C
⁷'⁵	g	Κ,-,ΗΡΟ χ 2 H₉O
1,8	g	KH₂PO₄
0,09	g	MgSO χ 7 HO
0,9	g	(NH₄J₂SO₄
44	g	Glyzerin
0,01	g	Tetracyclin x HCl
1	1	H₂O

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Die Mikrotiterplatten mit den individuellen Klonen wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und danach bei -70⁰C aufbewahrt.

b Hybridisierungsprobe

Als Ausgangsmaterial für die Hybridisierungsprobe diente das rekombinante Plasmid pER33 (E. Dworkin-Rastl et al., Gene 21, 237-248 (1983)). Dieses Plasmid enthält die kodierende

Region für das reife Interferon IFNa2arg plus 190 Basen der 3" nichttranslatierten Region. 20 μg pER33 wurden mit 30 Einheiten' Hindlll Restrikt.ionsendonuklease in 200 μΐ Reaktionslösung (10 mM Tris-HCl, pH-7,5, 10 mM MgCl₂, 1 mM Dithiotrei.tol (DTT), 50 mMNaCl) 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 1/25 vol 0,5 M Äthylendlnitrilotetraessigsäure (EDTA) und Erhitzen auf 7O⁰C für 10 Minuten beendet. Nach Zusatz von 1/4 vol 5 χ Puffer (80 % Glyzerin, 40 mM Tris-Essigsäure pH=7,8, 50 mM EDTA, 0,05 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1 % Bromphenolblau) wurden die entstandenen Fragmente der Größe nach elektrophoretisch in einem 1 % Agarosegel getrennt. (Gel- und Laufpuffer (TBE): 10,8 g/l Trishydroxymethylaminomethan (Tris-Base), 5,5 g/l Borsäure, 0,93 g/l EDTA). Nach Inkubation des Gels in einer.0,5 μg/ml· Äthidiumbromidlösung wurden die DNA-Banden im UV-Licht sichtbar gemacht, und der Gelbereich, der das iFN-Gen-hältige DNA StücK (ca. 800 bp lang) enthielt, ausgeschnitten. Durch Anlegen einer Spannung wurde die DNS in 1/10 χ TBE-Puffer elektroeluiert. Die DNA Lösung wurde einmal mit Phenol und viermal mit Äther extrahiert und die DNA durch Zusatz von 1/10 vol 3 M Natriumacetat (NaAc) pH-5,8 und 2,5 vol EtOH aus der wäßrigen Lösung bei -2O⁰C präzipitiert. Nach dem Abzentrifugieren wurde die DNA einmal mit 70 % Äthanol gewaschen und 5 Minuten im Vakuum getrocknet. Die DNA wurde in 50 μΐ Wasser aufgenommen (ca. 50μg/μl). Diese DNA wurde durch Nicktranslation (modifiziert nach T. Maniatis et al., Molecular Cloning, ed. CSH) radioaktiv markiert. 50 μΐ Inkubationslösung enthielten: 50 mM Tr is pH=7,8, 5 mM MgCl", 10 mM Mercaptoäthanol, 100 ng Insert-DNA von pER33, 16 pg DNasel, 25 μΜ dATP, 25 25 μΜ dTTP, 20 μα a³²P-dCTP (> 3000 Ci/mMol) sowie 3 units DNA-Polymerase I (E.coli). Die Inkubation erfolgte bei 14⁰C für 45 Minuten. Die Reaktion wurde durch Zusatz von. 1 vol 50 mM EDTA, 2 % SDS, 10 mM Tr is pH=7,6 Lösung und Erhitzen auf -TJ)⁰C für 10 Minuten beendet. Die DNA wurde durch Chromatographie über Sephadex G-100 in TE-puffer (10 mM .. ■·.- - . " · "■■;■" ■■ ' Epo copy:

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pH=8,0,i niM EDTA) von nicht eingebauter Radioaktivität getrennt. Die radioaktiv markierte Probe hatte eine spezifische Aktivität von ca. 4 χ 10 cpm/ug. ,

c) Screening der Klone-auf IFN-Gen-haltige Inserts

Die in den Mikrotiterplatten eingefrorenen Bakterienkulturen wurden aufgetaut (a) . Ein Stück Nitrozelliilosef ilter der entsprechenden Größe (Schleicher und Schüll, BA 85#. 0,45 Jim Porengröße) wurde auf LB-Agar aufgelegt (LB-Agar: 10 g/l Trypton,_;5 g/l Yeast Extrakt, 5 g/l NaCl, 15 g/l Bacto Agar, 20 mg/1 Tetracyclin-HCl). Mit einem den Mikrotiterplatten angepaßten Stempel wurden die individuellen Klone auf das Nitrozellulosefilter übertragen. Die Bakterien wuchsen über Nacht bei 37°C zu etwa 5 ram Durchmesser großen Kolonien. Zum Zerstören der Bakterien und Denaturieren der DNA wurden die Nitrozelluiosefilter der Reihe nach auf einen Stapel mit folgenden.Lösungen" getränkte Whatman 3MM Filter gelegt: 1} 8 Minuten.auf 0,5 M NaOH, 2) 2 Minuten 1 M Tris pH=7,4i 3) 2 Minuten 1 M Tris pH=7,4- und 4) 4 Minuten 1,5 M ,NaCl_f ,' . 0,5 M TrispH=7,4. Die Filter wurden luf.tge trocknet und dann 2 Stunden bei 80⁰C gehalten. Die Vorbehandlung d;er Filter erfolgte 4 Stunden bei\65°C in der Hybridisierlösqng, be-. _ stehend aus 6 χ SSC (1 χ SSC entspricht 0,15 MNaCl; Ö,015 M Trinatriumcitrat; pH=7,0), 5 χ Denhardt's Lösung (Ix Den- . hardt's Lösung entspricht 0>02 % PVP (Polyvinylpyrrolidon); 0,02 '% Ficoll (MG: 40.0.00 D) ,-0,02·% BSM (Bovine; Serum Al- ^; bunexnin) und 0,1 % SbS. (Sodium dodecylsulfate) . Ca 1 χ 10 cpm pro Filter der in b) hergestellten Probe werden durch ; Kochen denaturiert und;der"Hybridisierlösung zugesetzt. Hybridisierung erfolgte. 16 Stunden bei 65°C. Das Waschen der· Filter erfolgt bei 65°C viermal. 1 Stunde mit .3 "x.SSC/O/l %

DS. Die. Filter wurden; luftgetrocknet, rn.it Satan. Wrap be^ ι. eckt und auf. Kodak X-OmatS Film exponiert." Γ . , ■"■"-. ■/.'

Beispiel 2 :' ■...·'.;._". ■■ .'"■ "V' \\ -', ·^:

Southern Transfer zur Bestätigung von ■I.FN-Gen-haltigen c.ekomhinanten Plasmiden -> '-'-■-' . '· '·> ', ■ '-"·/' '

Von den positiv oder positiv verdächtig reagierenden Kolonien; wurden 5 ml Kulturen in L-Broth (10 g/l-Trypton, 5 g/Ί Yeast Extract, 5 g/l NaCl, 20 mg/1 Tetracyclin χ HCl) über Nacht bei 37°C gezüchtet. Die Plasmid-DNA ,wurde modifiziert nach Birnboim und DoIy (Nucl. Acid Res. l__f 1513, (1979)) isoliert. Die Zellen von 1,5 ml Suspension wurden abzentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge) und bei 0⁰C in ΙΟΟμΙ Lysozymlösung aus 50 mM Glucose, 10 mM EDTA, '25 mM Tris-HCl pH=8,0, 4 mg/ml Lysozym resuspendiert. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden 2 Volumteile eiskalter 0,2 m NaOH, 1 % SDS Lösung zugegeben und weitere 5. Minuten inkubiert. Dann wurden 150 μΐ eiskalte. Kaliumacetatlösung pH= 4,8 zugesetzt und 5 Minuten inkubiert. Die ausgefallenen Zellbestandteile wurden abzentrifugiert. Die DNA-Lösung wurde mit 1 VoIumteil Phenol/CHCl (1:1) extrahiert und die DNA durch Zugabe von 2 Volumteilen Äthanol ausgefällt. Nach dem Abzentrifuieren wurde das Pellet einmal mit 70 % Ethanol gewaschen und 5 Minuten im Vakuum getrocknet. Die. DNA wurde in 50 μΐ (TE)-Puffer gelöst.: 10 μΐ davon wurden in 50 μΐ Reaktionslösung (10 mM Tris-HCl pH=7,5> 10 mM MgCl₂/ .50 mM NaCl, 1 mM DTT) mit 10 Einheiten Pstl-Restriktionsendonuklease 1 Stunde bei 37°C verdaut. Nach Zusatz von 1/25 Volumteilen 0,5 M EDTA sowie 1/4 Volumteilen 5 χ Puffer (siehe Beispiel Ib)) wurde 10 Minuteri bei 70⁰C erhitzt und die DNA anschließend in einem 1 % Agarosege'l (TBE-puffer) elektrophoretisch aufgetrennt. Die DNA im Ägarosegel, wurde nach der Methode von Southern (E.M. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517 (1975)) auf. ein Nitrozellulosefilter übertragen. Die DNA im Gel wurde durch einstündige Inkubation des Gels mit einer 1,5 M NaCl/0,5 M NaOH Lösung denaturiert. An-'-', schließend wurde 1 Stunde mit einer 1 M Tris χ HCl

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pH=8/l,5 M NaCIi Lösung neutralisiert. Die DNA wurde mit 10 χ . SSC (1,5 M NaCl, 0,15 M Natriumcitrat, · pH=7,0) auf das Nitrozellulosefilter übertragen. Nach vollendetem Transfer (ca. 16 Stunden)'wurde das Filter kurz in 6 χ SSC Puffer gespült, dann luftgetrocknet und abschließend 2 Stunden bei ^! 80⁰C gebacken. Das-filter wurde 4 Stunden mit einer 6 χ : SSC/5 χ Denhardt's Lösung/0,1 % SDS (siehe Beispiel Ic) bei'. 65°C vorbehandelt.'Ca. 2;x 10 cpm der Hybridisierungsprobe (siehe Beispiel Ib) wurden durch Erhitzen auf 100°C denaturiert und anschließend in die Hybridisierlösung einge-. bracht. Die Hybridisierdauer betrug 16 Stunden bei 65°C. An-, schließend wurde das Filter 4x1 Stunde bei 65°C mit einer · 3 χ SSC/0,1 % SDS-Lösung gewaschen.. Nach dem Lufttrocknen wurde das Filter mit Saran Wrap bedeckt und auf Kodak -, ■-X-OmatS Film exponiert.. \_. · . .· '- " ;.- ·_: - .

Beispiel 3 · '; ^;.;? . t .. ■ ■ " ,"'"-'■- - : · Nachweis von Interferonaktivität im Klon E76E9 . .'■■■.

Eine 100 ml Kultur des .-Klons. E76E9 Wurde in L-Broth. (10 g/1 Trypton, 5 g/l Yeast Extract, 5 g/l NaCl, 5 g/l Glucose, ----20 mg pro 1 Tetracyclin 'x HCl) bei 37°C-bis zu der optischen Dichte AgQ₀= 0,8 angezüchtet. Die Bakterien wurden 10 .. ""·;■·.· Minuten mit 7000 rpm abzentrifugiert, einmal mit einer 50 rnM Tris x^: HCl pH=8,0, 30 mM NaCl Losung gewaschen und in 1,5 ml; .Waschlösung resuspendiert. Nach Inkubation mit 1 mg/ml Lysozym bei 0°C eine halbe Stunde lang,¹wurde die Bakterierisuspensioh fünfmal gefroren und getaut. Die Zelltrümmer wurden Ci¹TCh Zentrifugatiön mit 40.000 rpmeine Stunde -lang pelle- _; t srt. Der Überstand wurde sterilfiltriert und auf Znterfe onaktivität. geprüft. Als Test wurde der Plaque Reduk- ._; ti^nstest mit V3~Zellen;,und .Vesicular Stomatitis Virus verwencet (G;R. Adolf et al., Arch. νίχοΓ. 72_, 169-175' (1'982)). überraschenderweise produzierte der Klon, bis zu 9000 IU · Interferon· pro Liter Ausgangskultur.' '

Claims

S. * Α Patentansprüche

1. Menschliches Interferon Y (IFN-Y) im wesentlichen frei von anderen Proteinen menschlicher Herkunft.

2. Menschliches Interferon Y in im wesentlichen reiner Form. :

3. IFN-Y gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen frei von. nativer Glykosilierung vorliegt. ' .

4. IFN-Y gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Leader-Peptid enthält.

5. IFN-Y gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die Aminosäuresequenz

' ^: 5 · : 10 . 15

Cys Asp Leu Pro Gin Asn His GIy LTeu Leu" Ser Arg-Asn ThrLeu

20 ■■■■'. .25 .■■■·'■■ · . 30 VaI Leu Leu His Gin Met Arg Arg He Ser Pro Phe Leu Cys Leu

35 ".." · 40 45

Lys Asp Arg^Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gin GIu Met VaI Lys Gly

. 50 .· - -55' ■■■...■■..■■- : .-60 Ser GIn Leu Gin Lys Ala His VaI Met Ser VaI Leu His GIu Met ;

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110 115 ■ 120 ^;

GIu Gly GIu Ser Ala Gly Ala He Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu

125 130 135 ί

Arg Arg Tyr Phe Gin Gly Ue Arg, VaI Tyr Leu Lys GIu Lys Lys j

140 145 . ' 150

Tyr Ser Asp Cys AIa Trp GIu VaI VaI Arg Met GIu He Met Lys

. . 155 ' 160 165

Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met Gin Glu Arg'Leu Arg Ser Lys

170

Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser enthält.

6. IFN-Y gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure an Position 111 anstelle von Gly GIu ist.

7. Rekombinantes DNA Molekül, eine codierende Gensequenz für IFN-Y enthaltend. . . .-.'..

8. DNA-Molekül gemäß Anspruch 7, dadurch -gekennzeichnet, daß die codierende Sequenz als Insert in der Pst-l Schnittstelle a) des Plasmids E76E9 in E. coli HB 101, hinterlegt bei der DSM unter der Nummer DSM 3003 oder b) des Plasmids P9A2 in E. coli HB 101, hinterlegt bei der DSM unter der Nummer DSM 3004 vorhanden ist, oder degenerierte Variationen dieser Inserts.

9.. DNA-Molekül gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die codierende Sequenz unter stringenten Bedingungen, die es erlauben, eine Homologie, die größer als 85 % beträgt, zu erkennen, mit den Inserts in der Pst-l Schnittstelle a) des Plasmids E76E9 in-E. coli HB 101, hinterlegt bei der DSM unter der Nummer DSM 3003 oder b) des Plasmids P9A2 in E. coli HB 101, hinterlegt bei der DSM unter der Nummer DSM 3004

. oder mit degenerierten Variationen dieser Inserts hybridisiert. - · " ' · ■ ·. ' ■ .

10. DNA-Molekül gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die stringenten Bedingungen eine Homologie von mehr als 90 % nachweisen lassen,

11. DNA-Molekül gemäß.Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Expressionsvehikel ist, replizierbar in Mikroorganismen oder in Säugetierzellen.

12. DNA-Molekül gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, . daß das Vehikel ein Plasmid ist, replizierbar in Prokaryoten.

13. DNA-Molekül gemäß Anspruch 11, replizierbar in Eukaryoten. ·

14. DNA-Molekül gemäß Anspruch Ii, die Sequenz

TGT GAT CTG CCT CAG AAC .CAT GGC CTA CTT AGC AGG AAC ACC TTG GTG CTT CTG CAC CAA ATG AGG AGA ATC TCC CCT TTC TTG TGT CTC AAG GAC AGA AGA GAC TTC AGG TTC CCC CAG'GAG ATG-GTA AAA GGG AGC CAG TTG CAG AAG GCC CAT GTC ATG- '1¹CT GTC CTC CAT GAG ATG · . CTC CAG CAG ATC TTC AGC CTC TTC CAC ACA GAG CGC TCC TCT GCT . GCC TGG AAC ATG ACC CTC CTA GAC CAA CTC CAC ACT GGA CTT CAT CAG CAA CTG CAA CAC CTG GAG ACC TGC TTG CTG CAG GTA GTG GGA \\ GAA GGA GAA TCT GCT GGG .GCA ATT AGC. AGC CCT GCA CTG ACC TTG /. AGG AGG TAC TTC CAG GGA ATC CGT GTC TAC CTG AAA GAG AAG AAA. ". TAC AGC GAC TGT GCC TGG GAA .GTT GTC AGA ATG GAA ATC ATG AAA · TCC TTG TiC TTA TCA ACA AAC ATG CAA GAA AGA CTiVAGA AGT AAA AT AGA GAC CTG GGC TCA TCT enthaltend. ' . ' .-. ;

EPO COPY

15. DNA-Molekül gemäß Anspruch 14, dadurch gekennnzeichnet, daß das Cödon,codierend für die Aminosäure 111 GAG ist.

16. DNA-Molekül gemäß ,Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß es a) das Plasmid Ε76Ξ9 in E. coli HB 101.hinterlegt bei- der DSM- unter der Nummer DSM 3003 oder b) das Plasmid P9A2 in E. coli ΉΒ 101,hinterlegt bei der DSM· unter der Nummer DSM 3004 ist. , .

17. Transformierter Wirtsorganismus, der die für IFN-Y codierende genetische Information enthält.

18. Wirtsorganismus gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Prokaryot ist. .·

19. Wirtsorganismus gernäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Eukaryot ist.

20. Wirtsorganismus gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die genetische Sequenz in einem Vehikel enthalten ist, das in dem Wirtsorganismus replizierbar

21. Wirtsorganismus gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß er eine Säugetierzellinie ist.

22. Wirtsorganismus gemäß Anspruch 17 dadurch gekennzeichnet, daß er E. coli ist. :

23. Wirtsorganismus gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß er E. coli mit der DSM Nr. 3003 oder E. coli mit der DSM Nr. 3004 ist. .

EPO COPY

24. Verfahren zur Herstellung von IFN-Y, dadurch gekennzeichnet, .

daß ein geeigneter Wirtsorganismus mit genetischen Informationen, codierend für IFN-Y transformiert wird;

daß diese Information exprimiert wird, um IFN-Y in dem Wirtsorganismus zu produzieren und —

daß IFN-Y aus diesem Wirtsorganismus isoliert wird.

25. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Information in jedem rekombinanten DNA-Molekül gemäß den Ansprüchen 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 oder 16 enthalten ist. , ". .

26. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der VJirtsorganismus, nach der Transformation, gemäß einem der Ansprüche 18 - 23 definiert ist.

27. Verfahren gemäß Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet,

- daß das IFN-Y gemäß den Ansprüchen 5 oder 6 definiert ist. '■ ; ί' ' ..'"■

28. IFN-Y herstellbar durch-.das Verfahren gemäß Anspruch 2A .\

29. Mischung geeignet für. die Behandlung viraler Erkrankungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie neben pharmazeutisch .inerten Trägerstoffen eine wirksame Menge IFN-Y gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 enthält.."¹ -'n

30. Verwendung von IFN-Y zur therapeutischen Behandlung.. %