DE3108152C2 - - Google Patents
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Description
Gegenstand der Erfindung sind bestimmte Restriktionsenzyme von bestimmten Bifidusbakterien
und ein Verfahren zu ihrer Gewinnung.
Restriktionsenzyme sind Endonucleasen, die bestimmte
Nucleotidsequenzen an doppelsträngigen Desoxyribonucleinsäuren
(DNA) erkennen und die DNA an oder nahe bei diesen Sequenzen
schneiden, wobei einzelne DNA-Bruchstücke erhalten werden.
Seit der Entdeckung eines Restriktionsenzyms in Haemophilus
influenzae wurde eine Anzahl von Restriktionsenzymen aus
einer Vielzahl von Bakterien isoliert; vgl. R. J. Roberts,
Gene 8 (1980), S. 329-343.
Wegen ihrer einzigartigen Eigenschaft, DNA an bestimmten
Stellen zu schneiden, haben sich diese Enzyme in einer Vielzahl
von Anwendungsmöglichkeiten bei der DNA-Rekombinationstechnologie
als wertvoll erwiesen, beispielsweise bei der
Aufstellung physikalischer Genkarten, DNA-Sequenzanalysen,
Genisolierung und Klonierungs-Verfahren.
Zwar sind zahlreiche Restriktionsenzyme mit unterschiedlicher
Spezifität bekannt. Trotzdem besteht nach wie vor
Bedarf an neuen Spezifitäten, um DNA-Moleküle weiter zu charakterisieren
und die Klonierung von DNA-Molekülen in vitro
(Aufbau neuer DNA) zu ermöglichen. Außerdem wird nach besseren
Quellen für einige der bekannten Enzyme zur praktischen
Verwendung gesucht.
Bei der Untersuchung zahlreicher Arten von nicht pathogenen
Bakterien des Verdauungsstraktes auf die Anwesenheit von
Restriktionsenzymen wurde festgestellt, daß Bifidusbakterien
eine Anzahl dieser Enzyme mit vorteilhaften Eigenschaften für
eine praktische Verwendung erzeugen.
Bifidusbakterien können leicht in großem Maßstab gezüchtet
werden und die Enzyme können einfach gereinigt werden,
da sie bemerkenswert stabil sind und störende Nucleaseaktivitäten
in den rohen Extrakten nur in geringem Maße
vorhanden sind.
Unter den Bifidusbakterien, die auf Restriktionsenzyme
geprüft wurden, zeigten zwei
Enzymaktivität. Diese Stämme sind nachstehend
aufgeführt.
B.bifidum YIT4007FERM BP-791 und
B.breve YIT4006FERM BP-752.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, bestimmte Restriktionsenzyme
und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu schaffen.
Diese Aufgabe wird gemäß den Patentansprüchen 1 bis 4
gelöst.
Die Kultivierung eines erfindungsgemäßen Restriktionsenzym erzeugenden
Stammes kann auf jede übliche Art in jedem
herkömmlichen Medium durchgeführt werden. Das Kultivierungsverfahren
und das verwendete Medium sind deshalb nicht
kritisch und unterliegen keiner besonderen Begrenzung.
Zur Gewinnung der Restriktionsenzyme aus Bifidusbakterien
werden die Zellen bei 37°C in einem geeigneten
anaeroben Medium bis zur frühen stationären Phase kultiviert.
Dies bedeutet, daß die Kultur nicht besonders sorgfältig
überwacht werden muß. Die Zellen werden dann durch
Zentrifugieren geerntet und bei -20°C bis zur Verwendung
aufbewahrt.
Ein typisches Verfahren zur Reinigung von Restriktionsenzymen
aus Bifidusbakterien wird nachstehend beschrieben:
Die gefrorenen Zellproben werden aufgetaut und in 4 Volumen
10 mmol K₂HPO₄-KH₂PO₄, pH-Wert 7,0, 7 mmol 2-Mercaptoäthanol
und 1 mmol EDTA (Äthylendiamintetraacetat) (Puffer A)
mit einem Gehalt von 25 µg Phenylmethylsulfonylfluorid
(PMSF), 1 mmol NaN₃ und 0,4 mol NaCl/l suspendiert.
Hierauf wird die Zellsuspension auf Eis mit 100 µg/ml
Lysozym behandelt um die Zellen gegen Ultraschall
empfindlich zu machen. Die Behandlung mit Ultraschall wird
dann durchgeführt, bis mehr als 90% der Zellen aufgebrochen
sind. Dabei wird darauf geachtet, daß die Temperatur
unter 10°C bleibt. Alle weiteren Verfahrensschritte werden
unter 5°C durchgeführt.
Die mit Ultraschall behandelte Zellsuspension wird 1 Stunde
bei 100 000 g zentrifugiert und der Überstand abdekantiert.
Anschließend wird eine 10% (Gewicht/Volumen) Lösung
von Streptomycinsulfat langsam bis auf eine Endkonzentration
von 1,2% zugesetzt. Nach mindestens 30 Minuten Rühren
werden die ausgeschiedenen Nucleinsäuren durch Zentrifugieren
bei niedriger Geschwindigkeit entfernt.
Der DNA-freie Überstand wird mit Ammoniumsulfat fraktioniert
und die Restriktionsenzym-Aktivität enthaltenden
Fraktionen werden durch Kombinationen von Gelfiltration,
Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie weiter
gereinigt. Überlicherweise sind zwei oder drei Säulenchromatographieschritte
ausreichend, um ein teilweise gereinigtes
Enzym zu erhalten, das im wesentlichen frei von Nucleasen
als Verunreinigung ist.
Die durch Reinigung aus Bifidusbakterien gewonnenen
Restriktionsenzyme haben einige gemeinsame Eigenschaften.
Eine ihrer vorteilhaften Eigenschaften ist die bemerkenswerte
Stabilität. Deshalb können diese Enzyme ohne nennenswerten
Verlust an Aktivität in Abwesenheit von Glycerin
oder Serumalbumin gereinigt werden.
Wie erwähnt, zeigen acht von fünfzehn Stämmen aus neun Arten,
die untersucht wurden, Restriktionsenzym-Aktivität.
Diese Enzyme wurden nach der Nomenklatur von Smith and
Nathans (1973) benannt. Die Enzyme sind in nachstehender
Tabelle I aufgeführt. Bisher wurden noch nicht alle diese
Enzyme vollständig gereinigt und charakterisiert. Einige
allgemeine Eigenschaften wurden jedoch bereits an den teilweise
gereinigten Enzymen festgestellt.
Restriktionsenzyme von acht Stämmen von Bifidusbakterien
wurden auf ihre Substratspezifizität bei Standard DNA's
geprüft. Folgenden DNA's wurden verwendet:
E. coli Phage λ -DNA, E. coli Phage ϕ X174 RFI DNA, Animal Virus Adenovirus Typ 2 DNA und Animal Virus SV40 DNA. Die durch die Enzyme erzeugten Fragmente dieser DNA's werden durch Elektrophorese auf Agarosegel analysiert. Die Fragment-Muster werden unter UV-Licht photographiert. Aus nachstehender Tabelle II ist zu sehen, daß diese Enzyme in ihrer Substratspezifizität verschieden zu sein scheinen.
E. coli Phage λ -DNA, E. coli Phage ϕ X174 RFI DNA, Animal Virus Adenovirus Typ 2 DNA und Animal Virus SV40 DNA. Die durch die Enzyme erzeugten Fragmente dieser DNA's werden durch Elektrophorese auf Agarosegel analysiert. Die Fragment-Muster werden unter UV-Licht photographiert. Aus nachstehender Tabelle II ist zu sehen, daß diese Enzyme in ihrer Substratspezifizität verschieden zu sein scheinen.
Das pH-Optimum dieser Enzyme liegt zwischen pH 6,8 und 8,0.
Die optimale Temperatur für diese Enzyme liegt um 37°C.
Die Anwesenheit vom Mg2+ ist wesentlich, dagegen wird
aber weder Adenosintriphosphat noch S-Adenoxylmethionin
benötigt. Einwertige Kationen sind nicht erforderlich und
hemmen die Enzymaktivität bei höherer Konzentration.
P:TAB
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Ein Stamm Bifidobacterium breve YIT 4006 (FERM BP-752)
wird auf einem modifizierten VL-G Medium (Azuma und Suto,
1970) gezüchtet, das nach der modifizierten Hungate-Methode
hergestellt wurde (Azuma und Suto, 1970; Hungate, 1969).
Das modifizierte VL-G Medium enthält in 1 Liter:
75 ml 0,1% K₂HPO₄ (Salzlösung I), 75 ml Salzlösung II, bestehend aus 0,6% KH₂PO₄, 1,2% (NH₄)₂SO₄, 1,2% NaCl, 0,12% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,12% CaCl₂ · 2 H₂O, 0,1 ml 0,1% Resazulin, 1 g Trypticase, 0,5 g Hefeextrakt, 0,2 g Fleischextrakt, 0,5 g Glucose, 5 ml 8% Na₂CO₃, 1 ml 3% Cystein-HCl und 790 ml destilliertes Wasser.
75 ml 0,1% K₂HPO₄ (Salzlösung I), 75 ml Salzlösung II, bestehend aus 0,6% KH₂PO₄, 1,2% (NH₄)₂SO₄, 1,2% NaCl, 0,12% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,12% CaCl₂ · 2 H₂O, 0,1 ml 0,1% Resazulin, 1 g Trypticase, 0,5 g Hefeextrakt, 0,2 g Fleischextrakt, 0,5 g Glucose, 5 ml 8% Na₂CO₃, 1 ml 3% Cystein-HCl und 790 ml destilliertes Wasser.
Für die Herstellung in kleinem Maßstab wird modifiziertes
VL-G Medium (6 × 1 Liter) mit 1/250 Volumen der über Nacht
gezüchteten Kultur von B. breve überimpft. Die Zellen
werden dann etwa 15 Stunden bei 37°C bis zur frühen
stationären Phase gezüchtet, durch Zentrifugieren geerntet
und bei -20°C gelagert. Die Ausbeute beträgt etwa 35 g.
Der DNA-freie Zellextrakt wird in der vorstehend beschriebenen
Weise erhalten. Der DNA-freie Extrakt wird sodann
innerhalb von 30 Minuten mit festem Ammoniumsulfat versetzt.
Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und gegen 3× gewechselte
Pufferlösung von 10 mmol Tris-HCl/l, pH 7,4, 7 mmol 2-Mercaptoäthanol/l
und 1 mmol EDTA/l (Puffer B) dialysiert. Hierauf wird
das Produkt auf eine Whatman DEAE-Cellulose DE-52-Säule
(1,0 × 20 cm) aufgebracht, die vorher mit Puffer B
äquilibriert wurde. Nach dem Waschen mit 30 ml Puffer wird
die Säule mit 150 ml linearem Gradienten von 0 bis 0,5 mol NaCl/l
eluiert. Die Enzymaktivität enthaltenden Fraktionen,
die bei 0,25 bis 0,35 mol NaCl/l eluiert werden, werden
vereinigt, gegen Puffer B mit einem Gehalt von 0,25 mol NaCl/l
dialysiert und danach auf eine Heparin-Sepharose CL-6B Säule
(1,0 × 7 cm) aufgebracht, die vorher mit dem gleichen
Puffer äquilibriert wurde. Nach dem Waschen wird die Säule
mit 60 ml linearem Gradienten von NaCl in Puffer B
entwickelt. Die Enzymaktivität wird bei 0,4 bis 0,5 mol NaCl/l
eluiert. Die aktiven Fraktionen werden wieder vereinigt,
durch Dialyse gegen Puffer B, der 50% Glycerin enthält,
konzentriert und bei -20°C aufbewahrt.
Nach der Inkubation mit überschüssigem Enzym über längere
Zeit ergibt der BthI-Verdau von λ -DNA scharfe Banden ohne
Geschmier auf Agarosegel. Wie in Tabelle II zu sehen ist,
wird SV40 DNA durch BthI nicht gespalten. Wenn superhelicale
SV40 DNA mit überschüssigem Enzym über längere Zeit
inkubiert wird, erfolgt keine nennenswerte Umwandlung dieser
DNA in die entspannte Ringform. Diese Ergebnisse zeigen
an, daß keine feststellbare Verunreinigung des partiell
gereinigten BthI mit nicht spezifischen Nucleasen vorliegt.
Der Vergleich der mit verschiedenen DNA-Molekülen erhaltenen
Spaltprodukte zeigt, das BthI ein Isoschizomeres
von XhoI ist, das die Nucleotidsequenz 5′-CTCGAG- 3′
erkennt.
Die meiste Enzymaktivität wird im Abschnitt 40 bis 60% gefunden
und in Puffer A mit einem Gehalt von 0,1 mol NaCl/l suspendiert.
Nach der Dialyse gegen den gleichen Puffer wird das
Dialysat auf eine Whatman Phosphocellulose P-11 Säule
(1,5 × 35 cm) aufgebracht, die vorher mit Puffer A mit
einem Gehalt von 0,1 mol NaCl/l äquilibriert wurde. Die
Säule wird gespült und mit 450 ml linearem Gradienten von
0,1 bis 0,6 mol NaCl/l in Puffer A entwickelt. Die bei
0,25 bis 0,35 mol NaCl/l eluierte Enzymaktivität wird
gesammelt und gegen Puffer B dialysiert.
Eine Whatman DEAE-Cellulose DE-52-Säule (1,0 × 15 cm) wird
vorbereitet und mit Puffer B äquilibriert. Die
Phosphocellulosefraktionen werden auf die Säule aufgebracht. Nach
dem Waschen wird die Säule mit 120 ml Gradienten von
0 bis 0,5 mol NaCl/l in Puffer B eluiert.
Die aktiven Fraktionen, die bei 0,20 bis 0,25 mol NaCl/l
eluiert werden, werden vereinigt, gegen Puffer B mit einem
Gehalt von 0,25 mol NaCl/l dialysiert und auf eine Heparin-
Sepharose CL-6B Säule (1,0 × 5 cm) aufgebracht, die vorher
mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde. Nach dem Waschen
wird die Säule mit 40 ml Gradienten von 0,25 bis 0,75 mol NaCl/l
entwickelt. Enzymaktivität wird in den Fraktionen mit
0,4 bis 0,5 mol NaCl/l erhalten. Diese Fraktionen werden
vereinigt, durch Dialyse gegen Puffer B, der 50% Glycerin enthält,
konzentriert und bei 20°C aufbewahrt.
Es wird festgestellt, daß das teilweise gereinigte Enzym
BbeI praktisch keine nicht-spezifischen Nucleasen als
Verunreinigung enthält. Nach längerer Inkubation mit
überschüssigem Enzym ergibt nämlich der BbeI-Verdau von λ -DNA
ein Bruchstückmuster, das keine Bandaufweitung auf Agarosegel
zeigt, und nur eine Spurenmenge von Nicht-Substrat
SV40 DNA wird aus der superhelicalen in die entspannte Form
umgewandelt.
BbeI schneidet verschiedene Standard DNA's in der in Tabelle II
angegebenen Weise. Aufgrund dieser Schnittmuster ist
die Erkennungssequenz für BbeI vermutlich das palindrome
Hexanucleotid GGCGCC. Da dieses Enzym demnach eine neue
Sequenzspezifizität zeigt, ist es besonders wertvoll für
die DNA-Forschung.
B. bifidum YIT 4007 (FERM BP-791) wird in modifiziertem VL-G
Medium in der in Beispiel 1 Für B. breve beschriebenen Weise
gezüchtet. Die Ausbeute beträgt etwa 25 g aus 6 Liter Kultur.
Der DNA-freie Extrakt wird wie vorstehend beschrieben
hergestellt und mit festem Ammoniumsulfat bis zu 65prozentiger
Sättigung versetzt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren
gesammelt, in 10 mmol K₂HPO₄-KH₂PO₄, pH 7,4,
7 mmol 2-Mercaptoäthanol und 1 mmol EDTA (Puffer C) gelöst
und gegen den Puffer dialysiert.
Es wird eine Whatman Phosphocellulose P-11 Säule
(1,5 × 35 cm) vorbereitet und mit Puffer C äquilibriert.
Das Dialysat wird auf die Säule aufgebracht. Nach dem Waschen
wird die Säule mit 450 ml Gradienten 0 bis 0,7 mol NaCl/l
In Puffer C entwickelt. Es werden mindestens zwei
verschiedene Enzymaktivitäten aufgelöst, die als Bbi I und
BbiII bezeichnet werden. BbiI fließt durch die Säule, während
BbiII bei 0,1 bis 0,2 mol NaCl/l eluiert wird.
Der Durchfluß und die Waschflüssigkeit, die BbiI-Aktivität
enthalten, werden vereinigt, durch Zusatz von Ammoniumsulfat
auf 60% Sättigung gefällt und in einem möglichst kleinen
Volumen Puffer B mit einem Gehalt von 0,1 mol NaCl/l
suspendiert. Die erhaltene Suspension wird auf eine
Sphadex G-200 Säule (2,5 × 55 cm) aufgebracht, die vorher
mit dem genannten Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird
mit Puffer B mit einem Gehalt von 0,1 mol NaCl/l entwickelt.
Die bei 0,6 bis 0,8 Bettvolumen eluierte BbiI-Aktivität wird
vereinigt und erschöpfend gegen Puffer B dialysiert.
Eine Whatman DEAE-Cellulose DE-52-Säule (1,0 × 10 cm) wird
vorbereitet und mit Puffer B äquilibriert. Sodann wird die
BbiI Sephadex-Fraktion auf die Säule aufgebracht. Nach dem
Waschen wird die Säule mit 80 ml Gradienten 0 bis 0,5 mol NaCl/l
in Puffer B entwickelt. Die bei 0,25 bis 0,30 mol NaCl/l
eluierte Enzymaktivität wird vereinigt und gegen Puffer A
mit einem Gehalt von 0,2 mol NaCl/l dialysiert.
Das Dialysat wird auf eine Hydroxylapatitsäule (1,0 × 10 cm)
aufgebracht, die vorher mit Puffer A mit einem Gehalt von
0,2 mol NaCl/l äquilibriert wurde. Die Säule wird gewaschen
und mit 80 ml Gradienten von 0,01 bis 0,5 mol Kaliumphosphat/l
in Puffer A mit einem Gehalt von 0,2 mol NaCl/l
eluiert. Das BbiI wird bei 0,1 bis 0,25 mol Kaliumphosphat/l
eluiert.
Die Spezifität von Bbi I wird mit einigen Standard-DNA's
geprüft und mit dem Schnittmuster von bekannten Enzymen
verglichen. Dabei wird eine Ähnlichkeit der Schnittmuster
von BbiI und PstI festgestellt. Die Muster der Bruchstücke,
die von g -DNA oder Adenovirus Typ 2 DNA, verdaut mit PstI
allein erhalten werden, sind identisch mit denen, die aus
den gleichen DNA's erhalten werden, wenn sie mit BbiI und
danach mit PstI verdaut werden. Dies weist darauf hin, daß
BbiI isochizomer mit PstI ist und das symmetrische
Hexanucleotid CTGCAG erkennt.
BbiI ist viel stabiler als PstI und deshalb für den praktischen
Gebrauch in vorteilhafter Weise geeignet.
Die BbiII-aktiven Fraktionen werden vereinigt und gegen
Puffer A mit einem Gehalt von 0,2 mol NaCl/l dialysiert.
Das Dialysat wird sodann auf eine Hydroxylapatit-Säule
(1,0 × 10 cm) aufgebracht, die vorher mit dem vorstehend
genannten Puffer äquilibriert wurde. Nach dem Waschen
wird die Säule mit 80 ml Gradienten von 0,01 bis 0,5 mol Kaliumphosphat/l
in Puffer A mit einem Gehalt von 0,2 mol NaCl/l
entwickelt. Die Enzymaktivität wird bei 0,05 bis 0,1 mol Kaliumphosphat/l
eluiert.
In vorläufigen Versuchen wurde festgestellt, daß BbiII
isoschizomer mit AcyI ist, das Hexanucleotide GRCGYC
erkennt, wobei R eine Purinbase und Y eine Pyrimidinbase
ist. AcYI wird aus Anabaena cylindrica isoliert, einem
Stamm von blaugrünen Algen. Die Kultur dieses Mikroorganismus
ist mühsam und zeitraubend. Deshalb ist B. bifidum
YIT4007 eine wesentlich bessere Quelle für dieses Enzym
als A. cylindrica.
Claims (4)
1. Restriktionsenzym BbiI, das die DNA-Sequenz CTGCAG
erkennt, erhält durch
Kultivierung von Bifidobacterium bifidum FERM BP 791 bis zur frühen stationären Phase, Ernten, Aufbrechen bei einer Temperatur von unter 10°C und Abzentrifugieren der Zellen, wobei die Temperatur bei diesem wie bei allen weiteren Verfahrensschritten unter 5°C bleibt, Entfernen der Nucleinsäuren aus dem Überstand, Fraktionierung des DNA- freien Überstands mit Ammoniumsulfat und weitere Reinigung der Enzymaktivität aus der aktiven Fraktion durch Chromatographie an Phosphocellulose P-11, Sephadex G 200, DEAE- Cellulose DE 52, wobei mit einem NaCl-Gradienten eluiert wird, und an Hydroxylapatit, wobei mit einem Kaliumphosphatgradienten eluiert wird.
Kultivierung von Bifidobacterium bifidum FERM BP 791 bis zur frühen stationären Phase, Ernten, Aufbrechen bei einer Temperatur von unter 10°C und Abzentrifugieren der Zellen, wobei die Temperatur bei diesem wie bei allen weiteren Verfahrensschritten unter 5°C bleibt, Entfernen der Nucleinsäuren aus dem Überstand, Fraktionierung des DNA- freien Überstands mit Ammoniumsulfat und weitere Reinigung der Enzymaktivität aus der aktiven Fraktion durch Chromatographie an Phosphocellulose P-11, Sephadex G 200, DEAE- Cellulose DE 52, wobei mit einem NaCl-Gradienten eluiert wird, und an Hydroxylapatit, wobei mit einem Kaliumphosphatgradienten eluiert wird.
2. Restriktionsenzym BbiII, das die DNA-Sequenz GRCGYC
erkennt, wobei R eine Purinbase und Y eine Pyrimidinbase ist,
erhältlich durch Kultivierung von Bifidobacterium
bifidum FERM BP 791 bis zur frühen stationären Phase,
Ernten, Aufbrechen bei einer Temperatur von unter 10°C
und Abzentrifugieren der Zellen, wobei die Temperatur
bei diesem wie bei allen weiteren Verfahrensschritten
unter 5°C bleibt, Entfernen der Nucleinsäuren aus dem
Überstand, Fraktionierung des DNA-freien Überstands mit
Ammoniumsulfat und weitere Reinigung der Enzymaktivität
aus der aktiven Fraktion durch Chromatographie an Phosphocellulose
P-11, wobei mit einem NaCl-Gradienten eluiert
wird, und an Hydroxylapatit, wobei mit einem Kaliumphosphatgradienten
eluiert wird.
3. Restriktionsenzym BbeI mit der (angenommenen) Erkennungssequenz
GGCGCC, erhältlich durch Kultivierung von Bifidobacterium
breve FERM BP 752 bis zur frühen stationären Phase, Ernten,
Aufbrechen bei einer Temperatur von unter 10°C und Abzentrifugieren
der Zellen, wobei die Temperatur bei diesem wie bei
allen weiteren Verfahrensschritten unter 5°C bleibt, Entfernen
der Nucleinsäuren aus dem Überstand, Fraktionierung des DNA-
freien Überstands mit Ammoniumsulfat und weitere Reinigung
der Enzymaktivität aus der aktiven Fraktion durch Chromatographie
an Phosphocellulose P-11, an DEAE-Cellulose DE-52 und
an Heparin-Sepharose CL-6B, wobei jeweils mit einem NCl-
Gradienten eluiert wird.
4. Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsenzyme nach
den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man
jeweils die im entsprechenden Anspruch angegebenen Maßnahmen
in der dortigen Reihenfolge durchführt.
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