DE3327447C2 - Carcinostatisches Mittel - Google Patents

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein carcinostatisches Mittel mit immunverstärkender carcinostatischer Wirkung, das als Wirkstoff Eisenin, ein Tripeptid der Sequenz $A L-Pyroglu-L-Glu-L-Ala $A enthält, in der Pyroglu, Glu und Ala Pyroglutaminsäure, Glutaminsäure bzw. Alanin bedeuten.

Description

Beschreibung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues carcinostatisches Mittel mit immunverstärkender carcinostatischer Wirkung bereitzustellen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst

Gegenstand der Erfindung ist ein carcinostatisches Mittel mit immunverstärkender carcinostatischer Wirkung, das als Wirkstoff Eisenin enthält Dieses ist ein durch Extraktion aus dem Seetang Eisenia bicyclis oder auf synthetischem Weg erhältliches Tripeptid. Die Erfindung betrifft somit ein carcinostatisches Mittel mit immunverstärkender carcinostatischer Wirkung, das als Wirkstoff Eisenin, ein Tripeptid mit der Sequenz
L-Pyroglu—L-GIn- L-AIa

enthält, in der Pyroglu, GIn und AIa Pyroglutaminsäure, Glutamin bzw. Alanin bedeuten.

Eisenin hl sin Tripeptid, das aus dem Seetang Eisenia bicyclis extrahiert werden kann. In jüngster Zeit ist auch seine Synthese gelungen. Es hat die Form von farblosen langen Nadeln mit dem Glanz von Seidenfäden, zeigt positive Biuret-Reaktion, eine gewisse Schrumpfung beim Schmelzpunkt von 180°C und zersetzt sich beim Schmelzen bei 225 bis 226° C.

Seine wäßrige Lösung reagiert sauer.

Die Antitumorwirkung von Eisenin ist vermutlich keine direkte Wirkung, sondern sie zeigt sich derart, daß die nicht spezifische Abwehrkraft des lebenden Körpers verstärkt wird. Da Eisenir? eine einfache Tripeptid-Struktur hat, kann es leicht synthetisiert werden. Ferner kann es, da es kristallin ist, als feines Pulver erhalten werden und kann infolge seiner Wasserlöslichkeit zu verschiedenen pharmazeutischen Zubereitungsarten, wie Injektionspräparaten, Tabletten, Salben und Suppositorien verarbeitet werden, wobei pharmakologisch anwendbare Träger- und Hilfsstoffe benutzt werden, die üblicherweise in der pharmazeutischen Praxis eingesetzt werden.

In der beiliegenden Zeichnung zeigt

Fig. 1 in graphischer Darstellung die Antitumorwirkung von Eisenin gegen einen isologen allogenen Tumor,

Fig. 2 in graphischer Darstellung die lebensverlängernde Wirkung von Eisenin beim Einsatz gemäß Fig. 1,

Fig. 3 in graphischer Darstellu: % die Antitumorwirkung ohne Beteiligung von T-Zellen,
Fig. 4 in graphischer Darstellung die lebensverlängernde Wirkung von Eisenin beim Einsatz gemäß Fig. 3, und Fig. 5 in graphischer Darstellung die Antitumorwirkung von Eisenin gegen einen isologen xenogenen Tumor.

Eisenin, das durch Extraktion aus dem Seetang Eisenia bicyclis oder durch Synthese erhalten wurde, zeigte sich als wirksames carcinostatisches Mittel mit immunverstärkender (immunopotentierender) carcinostatischer Wirkung. Die Ergebnisse von Tierversuchen, die im Hinblick auf die immunverstärkende carcinostatische Wirkung von Eisenin durchgeführt wurden, sind nachstehend beschrieben. In den Figuren und Tabellen bedeuten die Begriffe "mit Eisenin behandelt" bzw. "nicht behandelt", daß Eisenin verabreicht bzw. nicht verabreicht wurde.

(1) Tierversuche

Als Versuchstiere werden Balb/^i-Mäuse und nackte Mäuse verwendet. Die eingesetzten Tumoren sind Colon (Balb/C Colon-Krebs) und Sarcoma 180.

a) 1 000 000 Zellen Colon 26 werden subcutan auf BaIb/ ^-Mäuse transplantiert. Das Eisenin wird intrapcri- j toneal den Mäusen jeden zweiten Tag dreimal in einer Menge von 5 mg/Tier gegeben. Das Gewichi der \

Tumoren und die Oberlebensrate werden ermittelt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 1 und 2 angegeben.

b) 1 000 000 Zellen Colon 26 werden subcutan nackten Mäusen eingesetzt. Eisenin wird intraperitoneal den Mäusen jeden zweiten Tag in einer Menge von 5 mg/kg gegeben. Das Gewicht der Tumoren und die Überlebensrate werden bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Fig. 3 und 4 angegeben.

c) 1 000 000 Zellen Sarcoma 180 werden subcutan Balb/^2 -Mäusen eingesetzt. Eisenin wird intraperitoneal und oral den Mäusen jeden zweiten Tag dreimal in einer Menge von 5 mg/Tier gegeben. Das Gewicht der Tumoren wird bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 angegeben.

d) 10⁶ rote Blutzellen vom Schaf (S R bc) werden BaIb/^ -Mäusen intravenös injiziert. 4 Tage danach werden 10⁸ rote Blutzellen vom Schaf und Phosphatpufferlösung (PBS) subcutan in die linke Fußsohle injiziert. Gleichzeitig wird Phosphatpufferlösung (PBS) allein subcutan in die rechte Fußsohle injiziert. 2 Tage später wird die Dicke bei der Füße zur Prüfung auf verzögerte Hypersensitivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben.

.ί^ΐ

ίτκ

«ivä^S* wi^ÄVi&t*·?*¹·^

Tabelle ύ

Verzögerte Hypersensibilität

Grupp L	elT(+).: R	E( + ) L-R	L~R ■■ inn	1	Gruppe 2 T( + ).: L R	1,69	E(-) L-R	L-R . . mn	Gruppe3T(-).E(-) L R L-R	1,85	0,05	L-R .	Gruppe4T(-),E( + ) L R L-R	1,86	0,23	L-R	12	U)
	1,57	0,02	R xI0°	1	1,91	1,83	0,22	R xl0°	1,90	1,85	0,10	R xl0°	2,09	1,98	0,20	R xl0C	10	U)
1,59	1,54	0,02	11	1,83	1,80	0	13	!,95	1,92	0,16	3	2,18	1,86	-0,02	0	bo
1,56	1,68	0,19	31	1,91	1,67	0,11	0	2,08	1,78	0,11	5	1,84	1,81	0,12	7	^^ IV
1,87	1,49	0,46	5	1,86	1,69	0,19	6	1,89	1,82	0,09	8	1,93	1,72	0,15	9
1,95	1,67	0,08	0	1,78	1,72	0,09	11	1,91	1,78	0,23	6	1,87	1,61	0,32	20
1,75	1,57	-0,03	3	1,96	1,52	0,24	5	2,01	1,91	0,06	5	1,93	1,88	-0,01	0
1,54	1,54	0,04	15	1,71	1,69	0,19	14	1,97	1,80	0,19	13	1,87	1,87	0,06	3
1,58	1,65	0,25	—	1,82	1,87	0,13	13	1,99	1,82	0,10	3	1,93	—	—	—
1,90	—	—	—	1,83	1,77	-0,04	8	1,92	1,75	0,17	11	—	-	—	-
—	—	—	8	1.77	Durchschnitt	0	0	1,92	Durchschnitt		5	-	Durchschnitt		8
—	Durchschnitt			0	10
7	7

Bemerkungen:

1. T( + ) = Tumor transplantiert;T( —) = kein Tumor transplantiert.

2. E( + ) = mit Eisenin behandelt; E(-) = nicht mit Eisenin behandelt. 3.L= Dicke der linken Pfote (mm); R = Dicke der rechten Pfote (mm).

(2) In vitro Versuch

(a) Sensibilitätstest

Colon 26 wird gewebekultiviert und mit Eisenin in verschiedenen Konzentrationen 3 Tage in Berührung gebracht. Dem Medium wird Tritium-Thymidin, Uridin bzw. Leucin zugesetzt, und ihr Einbau in die Zellen wird untersucht, um den Hemmindex zu bestimmen. Die Ergebnisse der Prüfung des Einflusses von Eisenin auf die DNS-, RNS- und Proteinsynthese sind in Tabelle II angegeben.

Tabelle II Sensibilitätstest

Eisenin-Konzentration (mg/ml)

1,0 0,1 0,01 0,001 0,0001 Vergleich

Zählungen pro min im Fall von Tritium-Thymidin (CPM)

Durchschnitt

Zählungen pro min im Fall von Uridin (CMP)

Durchschnitt

Zählungen pro min im Fall von Leucin (CPrvi)

Durchschnitt

140 430 171 170 163 554 176 167	190 120 203 872 201 151 223 845	207 474 229 569 240 628 246 273	220 010 213816 221 170 213017	231 236 219 336 224 786 233 612	218 622 220 775 245 962 226 495
170 297	198 381	238 823	218 332	229 878	221 964
23	U	8	2	0
27 088 20 903 19 954 22 463	32 774 25 271 24 222 26 786	37 043 33 21 f 31498 34 408	39 415 31675 28 671 33 161	32 836 29 585 24 135 29 958	32 553 31 801 30 304 27 653
21 107	25 426	33 039	31 169	30 793	31 553
33	19	0	0	2
6 826 6 150 6 587	13311 12 566 S 076 7 076	12 285 11020 i2 097 11318	13 620 14 230 13 379 11355	12 952 11 936 ii 80S 10 952	14 674 11 382 '12 690 14 350
6 521	11318	11478	13 743	12 232	13 905
53	19	17	1	12

Bemerkungen:

(1) Der Hemmindex (M.) wird nach folgender Gleichung berechnet Wenn der I.I. 75% überschreitet, wird das Mittel als wirksam bewertet.

CPM (Vergleich) - CPM (Arzneistoff)

^{X 10}°

CPM (Vergleich) (2) Die M essung wird mit einem Scintillationszähler durchgeführt

(b) Cytotoxizhätstest

Balb/^ί -Mäusen wird intraperitoneal 15 mg Eisenin verabreicht Einer Kontrollgruppe wird Stärke gegeben. Die srwendete Zielzelle ist BW 5174 (Thymoma der AKR-Maus). Milzzellen und intraperitoneale Zellen werden in anhaftende bzw. nicht anhaftende Zellen unterteilt und die Cytotoxizität wird in jedem Fall gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt

Tabelle III Cytotoxizitätstest

Eisenin Vcrglcichs-

vcrabreicht gruppe

Milzzellen

Gesamt 24% 23%

Nicht anhaftende Zellen (natürliche Killer) 13% 15%

Anhaftende Zellen (Makrophagen) 10% 10%

Intraperitoneale Zellen

Gesamt 24% -8%

Nicht anhaftende Zellen (natürliche Killer) 32% 2%

Anhaftende Zellen (Makrophagen) 17% -5%

Bemerkungen:

(1) Die prozentuale Cytotoxizität in Tabelle III beruht auf folgender Gleichung:

_ . . _ . . ...., Testzählung - geringste Zählung

Prozentual Cytotoxizität = -z-z—, =;·^ΰι ■ χ 100

¹ Stärkste Zahlung - geringste Zahlung

(2) Die Messungen werden nach dem ⁵¹Cr-Freisetzungsversuch durchgeführt.

(c) Akute Toxizität

9 BaIb/^ -Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g wird Eisenin intraperitoneal gemäß Tabelle IV verabreicht.

Tabelle IV Akute Toxizität

Eisenin-Dosierung Zahl der

6 7/9

3 1/9

Bei der Zusammenfassung der Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Versuche zeigt sich aus den Tabellen I und II im Fall von isologen allogenen Tumoren, wie Colon 26 bei Balb/0-Mäusen ein deutlicher Unterschied zwischen der mit Eisenin behandelten und der nicht behandelten Gruppe. Eine Antitumorwirkung von Eisenin ist deutlich zu erkennen. Die Fig. 3 und 4 zeigen auch im Fall von nackten Mäusen ohne T-Zellen, daß ähnliche Ergebnisse erhalten werden. Eine ähnliche Antituraorwirkung wird auch im Fall von isologen xenogenen Tumoren, wie Sarcoma 180, bei BaIb/^ -Mäusen festgestellt, wie in Fig. 5 zu sehen ist. Andererseits kann aus den Ergebnissen der Prüfung der verzögerten Hypersensibilität BaIb/^-Mäusen gemäß Tabelle I kaum ein Unterschied zwischen den Durchschnittswerten der vier Gruppen von Kombinationen aus Gegenwart und Abwesenheit von Tumortransplantation und Gegenwart und Abwesenheit einer Behandlung mit Eisenin festgestellt werden. Eisenin hat also keine Wirkung auf die Aktivierung einer immunologischen Reaktion, an der T-Zellen teilnehmen. Aus den in Tabelle II enthaltenen Ergebnissen der Sensibilitätsprüfung, bei der der Hemmindex in allen Fällen niedrig ist, was auf fehlende Hemmwirkung durch Eisenin hindeutet, kann erkannt werden, daß Eisenin keine direkte Wirkung auf Tumorzellen hat

Bei den Ergebnissen der in Tabelle III dargestellten Cytotoxizitätsprüfung zeigt sich zwar kein nennenswerter Unterschied im Fall von Milzzellen, jedoch ein deutlicher Unterschied im Fall der interperitonealen Zellen. Dies erlaubt den Schluß, daß der durch Eisenin verursachte Immunitätseffekt hauptsächlich auf die Aktivierung der anhaftenden Zellen und der nicht anhaftenden Zellen in der Peritonealhöhle zurückzuführen ist. Nach der Prüfung der akuten Toxizität liegt der LD_S0-Wert von Eisenin bei etwa 5 g/kg, während die wirksame Dosis aufgrund der vorstehenden Prüfungen vermutlich bei etwa 15 mg pro 20 g liegt, bezogen auf das durqhschnittliehe Körpergewicht der in den Versuchen Balb/gi -Mäuse. Die Dosierung beträgt somit etwa 75 mg/kg und eine solche Dosis kann günstigerweise mehrmals verabreicht werden.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche g

1. Carcinostatisches Mittel mit immunverstärkender carcinostatischer Wirkung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Eisenin, einem Tripeptid mit der Sequenz

L-Pyroglu—L-GIn- L-AIa

in der Pyroglu, GIn und AIa Pyroglutaminsäure, Glutamin bzw. Alanin bedeuten, und pharmazeutisch verträglichen Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffen.

2. Eisenin zur Anwendung bei der Behandlung von Tumoren.