DE3133123C2 - Unbeweglich gemachte α-Glukosyltransferase, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Verwendung zur Herstellung von Palatinose - Google Patents
Unbeweglich gemachte α-Glukosyltransferase, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Verwendung zur Herstellung von PalatinoseInfo
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Abstract
Palatinose wird aus Saccharose unter Verwendung einer unbeweglich gemachten α-Glukosyltransferase hergestellt, die gewonnen wird, indem man ganze Zellen von α-Glukosyltransferase enthaltenden Bakterien durch Einschluß der Zellen in ein Calciumalginat-Gel granuliert, Polyäthylenimin in das Granulat eindringen läßt und das Granulat mit Glutaraldehyd-Lösung behandelt. Das unbeweglich gemachte Enzym kann leicht von der Produktlösung für einen wiederholten Einsatz abgetrennt werden und ist daher für eine Palatinoseherstellung mit hoher Produktivität geeignet. Die Effektivität der Palatinoseproduktion wird gesteigert, indem das unbeweglich gemachte Enzym in eine Säule gepackt und eine Saccharoselösung mit hoher Geschwindigkeit durch die Säule geleitet wird.
Description
Die Erfindung betrifft unbeweglich gemachte λ-GIukosyltransferase,
ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie die Verwendung zur Herstellung von Palatinose
(vergleiche hierzu die Patentansprüche 1 bis 3).
Palatinose ist ein reduzierendes Disaccarid, das als natürlicher Bestandteil in Honig und Zuckerrohrsaft
vorkommt. Die Süßkraft von Palatinose ist ungefähr halb so groß wie die von Sacharose.
Die Molekularstruktur von Palatinose ist ο-Ο-λ-D-Glukopyranosyl-D-fructose,
in welcher die Glukose in 1,6-StelIung an Fructose gebunden ist. Palatinose wird
auch als Isomaltulose bezeichnet.
Bei einem Verfahren zur Herstellung von Palatinose wird das Enzym in Form von lebenden oder toten Zellen
von Protaminobacter rubrum einer wäßrigen Lösung von Saccharose zugegeben, um Saccharose in Palatinose
zu überführen, wonach das Enzym aus der Lösung in der in dem deutschen Patent 10 49 800 beschriebenen
Weise entfernt wird, hierbei wird das Enzym durch Zentrifugation abgetrennt.
Beim gegenwärtigen Entwicklungsstand wird λ-GIukosyltransferase,
die Palatinose aus Saccharose bildet, durch Kultivieren einer bestimmten Bakterienart, insbesondere
Protaminobacter rubrum, Serratis plymuthica usw., in Gegenwart von Saccharose hergestellt Da das
Enzym mit den Bakterienzellen verbunden ist, kann eine Zellmasse dieser Bakterien als Enzympräparat verwendet
werden.
Bei der Herstellung von Palatinose aus Saccharose wird üblicherweise eine Zellmasse, die Λ-Glukosyltransferase
enthält, einer wäßrigen Lösung von Saccharose mit einer Konzentration von 20 bis 30% zugegeben, und
die Reaktion wird unter Rühren der Mischung durchgeführt, welche währenddessen auf einer Temperatur von
20 bis 30° C und auf einem pH von etwa 7 gehalten wird. Die Reaktionsdauer hängt von der Menge des Enzyms,
der Reaktionstemperatur usw. ab. Da aber die Restmenge an Saccharose in der Reaktionsmischung üblicherweise
innerhalb von etwa 20 Stunden nach Zugabe der Zellen sehr gering wird, wird dieser Zeitpunkt als Reaktionsende
angesehen. Danach werden die Zellen aus der Reaktionsmischung entfernt, und man erhält eine wäßrige
transparente Lösung von Pabtinose, welche mit HiI-
I in CaI ei !«alginat eingeschlossene
fe von Ionenaustauscherharzen u.dgl. gereinigt und dann unter vermindertem Druck konzentriert wird, um
Palatinose zu kristallisieren.
Bei der obigen Verfahrenr-weise werden die Zellen
aus der Reaktionsmischung üblicherweise durch Zentrifugieren abgetrennt, da aber die Differenz in der spezifischen
Dichte zwischen den Zellen und der Reaktionsmischung klein ist und auch die Zellgröße sehr klein ist, ist
der Wirkungsgrad der Abtrennung sehr schlecht und daher sind für die Durchführung des Verfahrens sehr
große Einrichtungen erforderlich, was bei der industriellen Durchführung des Verfahrens mit erheblichen Problemen
verbunden ist
Erfindungsgemäß wird dieses Problem dadurch ge-
löst daß eine unbeweglich gemachte Λ-Glukosyltransferase
geschaffen wurde und diese für die Herstellung von Palatinose verwendet wird. Zu diesem Zwecke wurde
ein geeignetes Verfahren zum Unbeweglichmachen des Enzyms entwickelt.
Die unbeweglich gemachte Λ-Glukosyltransferase ist
dadurch gekennzeichnet, daß man Bakterienzellen, die Λ-Glukosyltransferase enthalten, durch Einschluß in ein
Calciumalginat-Gel granuliert, das Granulat in eine auf einen pH von 5,0 bis 5,9 eingestellte Polyäthylen-
imin-Lösung taucht, bis die Polyäthyleniminkonzentration
im Gel 0,5 bis 1,5% beträgt, und dann das Granulat mit einer Glutaraldehydlösung behandelt, die die 1,5 bis
fünffache Menge, bezogen auf das im Gel befindliche Polyäthylenimin, an Glutaraldehyd enthält. Das Verfahren
zur Herstellung der unbeweglich gemachten λ-GIukosyltransferase
besteht darin, daß man die obengenannten Maßnahmen in der angegebenen Reihenfolge
durchführt. Dadurch wird eine leicht handhabbare käfigartige Gitterstruktur erhalten, die die Λ-Glukosyl-
transferase mit hoher Aktivität in wirksamer Weise einschließt, für Saccharose und Palatinose aber durchgängig
ist.
Aus der DE-OS 29 15 135 ist es zwar bekannt, gegen Glutaraldehyd empfindliche intrazelluläre Enzyme mit
Hilfe von Polyäthylenimin und Glutaraldehyd unbeweglich zu machen, e sehr feinttilig an. In der DE-OS 23 45 186 ist ein ähnl
ches Verfahren beschrieben, bei dem Alginat als Binde verwendet wird. Aus diesen Druckschriften läßt sich
jedoch der spezielle Aufbau des erfindungsgemäßen «- Glukosyltransferase-Granulats mit seinen besonderen
Eigenschaften nicht herleiten.
Gemäß der Erfindung ist eine Einschlußmethode mit Calciumalginat-Gel als erste Stufe vorgesehen. Diese
Methode kann in an sich bekannter Weise sehr einfach durchgeführt werden, indem eine wäßrige Lösung einer
Mischung eines Enzyms und Natriumalginat hergestellt und die Lösung tropfenweise in eine wäßrige Calciumchlorid-Lösung
zugegeben wird, beispielsweise unter Verwendung eines Injektors, um die Mischung zu einem
körnigen Material zu gelatinieren. Obwohl Calciumalginat den Nachteil hat, daß es sich bei pH-Werten über 5,8
allmählich auflöst, besitzt sein Gel eine hohe physikalische Festigkeit und kann daher i.i einfacher Weise sowohl
in Festbettreaktoren als auch in Wirbelbett-Reaktoren eingesetzt werden.
Zellen mit A-Glukosyltransferase-Aktivität werden
durch Inokulieren von Serratia plymuthica NCIB No. 8285 in ein wäßriges Medium, das 5% Saccharose,
3% Maisquellwasser, 0,3% Dinatriumhydrogenphosphat und 0,2% Natriumchlorid enthält und auf einen
Anfangs-pH von 7 eingestellt wurde, und durch aerobes Kultivieren und Sammeln durch Zentrifugalab-
scheidung gewonnen. Die Zellen werden vorzugsweise
in einer wäßrigen 2prozentigen Natriumalginat-Lösung von ungefähr 40 Volumenprozent der kultivisrten Brühe
suspendiert, wonach die Suspension tropfenweise einer wäßrigen 0,1 N Calciumchlorid-Lösung unter Ver-Wendung
eines Injektors zugegeben wird, gefolgt von einem zweistündigen Rühren. Die gebildeten Körnchen
werden durch Filtration abgetrennt und mit Wasser ausreichend gewaschen. Die obigen Verfahrensschritte
werden alle bei Temperaturen unterhalb 25° C durchgeführt, damit die «-Glukosyltransferase nicht inaktiviert
Werden die so erhaltenen Körnchen einer 30%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht) zugegeben
und läßt man die Mischung bei 25°C stehen und mißt ihre Reduktionskraft in Abhängigkeit vom Zeitablauf,
dann kann bestätigt werden, daß die Reduktionskraft allmählich zunimmt Auch bei der weiteren Analyse unter
Anwendung einer Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie
wurde nachgewiesen, daß der Anstieg der Reduktionskraft durch die Bildung von Palatinose
verursacht wird. Dies bedeutet, daß Λ-Glukosyltransferase
durch die Calciumalginat-Gel-Einschlußmethode in beliebigem Maße granuliert werden kann.
Wenn jedoch die Reaktionsmischung, nachdem im wesentlichen alle Saccharose in Palatinose umgewandelt
ist, filtriert wird, um die Granulatkörner zurückzugewinnen, und die Granulatkörner ausreichend mit
Wasser gewaschen und dann erneut einer 30%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht) zugegeben und to
bei 25°C stehengelassen werden, dann vermindert sich die Steigerungsrate der Reduktionskraft im Unterschied
zur ersten Reaktion auf weniger als 1/10 der anfänglichen Rate. Es wird angenommen, daß dies auf
eine Auflösung des Enzyms in die Reaktionsmischung zurückzuführen ist. Dies bedeutet, daß das Enzym auf
Grund irgendwelcher Ursachen in die Lage versetzt
^wird, sich aus den Zellen zu befreien, und auf der ande-Seite
die Maschen des Calciumalginat-Gel-Gitters
,nicht ausreichend fein sind, das Enzym-Protein zurück-
45
50
Es wurde somit gefunden, daß, obwohl eine Granulierung von Λ-Glukosyltransferase mit der Calciumalginat-Gel-Einschlußmethode
möglich ist, die Λ-Glukosyltransferase
doch nicht unbeweglich gemacht werden kann.
Es wurde daraufhin in Betracht gezogen, daß bei Einwirkung von als Vernetzungsmittel zum Unbeweglichmachen
von Enzymen weit verwendeten Glutaraldehyd auf das durch das oben beschriebene Verfahren erhaltene
Granulat komplizierte Vernetzungsverbindungen mit den vom Gel eingefangenen Zellen gebildet werden
und auf diese Weise Λ-Glukosyltransferase widerstandsfähig
gegen eine Freisetzung wird. Deshalb wurde eine Glutaraldehyd-Behandlung näher untersucht
Zu je 100 ml von wäßrigen Glutaraldehyd-Lösungen mit Konzentrationen von 0%, 0,025%, 0,05%, 0,1% und
0,5% wurden 30 g des auf oben beschriebene Weise hergestellten Granulats aus in Calciumalginat-Gel eingeschlossenem
Enzym gegeben, und nach einer Behandlung der Mischung bei 25" C während 30 Minuten wurde
das Granulat jeweils durch Filtration abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Dem so erhaitenen Granulat
wurden jeweils 100 g einer 333%igen Saccharose-Lösung
(Gewicht pro Gewicht) zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde bei 25° C während 20 bis 23 Stunden
inkubiert Nach Abschluß der Reaktion wurden die Granulate durch Filtration abgetrennt, ausreichend mit
Wasser gewaschen und erneut zu 100 g einer 33,3%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht) zugegeben,
um eine zweite Reaktion durchzuführen. Auf diese Weise wurde eine Reihe von Reaktionen ausgeführt Zu
Beginn einer jeden Reaktion wurde der pH-Wert auf 6,5 bis 7,0 eingestellt. Er verminderte sich jedoch auf 5,0 bis
5,5 innerhalb von 20 Stunden. Bei jeder Reaktion wurde eine geringe Menge (2 bis 5 g) des Überstandes der
Reaktionsmischung zum Zeitpunkt von zwei Stunden nach Reaktionsbeginn als Probe entnommen, wobei der
Feststoffgehalt durch ein Refraktometer und reduzierender Zucker durch eine Shaffer-Somogyi-Mikromethode
gemessen wurden und dann der Umwandlungsgrad von Saccharose aus diesen Werten bestimmt wurde.
Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Aus diesen Ergebnissen kann entnommen
werden, daß die geeigneteste Konzentration der Glutaraldehyd-Lösung
im Versuch bei 0,1% liegt. Wenn die Konzentration der Lösung 0,025 oder 0,05% beträgt,
dann wird das Enzym unzureichend unbeweglich gemacht und die Aktivität schnell vermindert. Wenn dagegen
die Konzentration 0,5% beträgt, dann wird das Enzym in hohem Maße durch die Behandlung zum Unbeweglichmacher
inaktiviert. Da jedoch der Aktivitätsverlust auch bei Verwendung einer 0,l°/oigen Glutaraldehyd-Lösung,
welche die besten Ergebnisse in dem oben beschriebenen Versuch ergab, noch groß genug ist, wurde
festgestellt, daß ein unbeweglich gemachtes Enzym mit Hilfe der Glutaraldehyd-Methode nicht in der gewünschten
Weise erhalten werden kann.
Versuchsergebnisse der Auswirkung einer Glutaraldehyd-Behandlung von in Calciumalginat-Gel eingeschlossenem
Enzym
Proben
Glutaraldehydkonzentration
Saccharose-Umwandlungsrate (%) in 2 Stunden
einmal zweimal dreimal viermal fünfmal sechsmal siebenmal achtmal
1 | 0 | 62,9 | 8,4 | 0 | — | — | — | — | — |
2 | 0,025 | 49,4 | 52,6 | 30,1 | 16,7 | 6,3 | 3,4 | — | _ |
3 | 0,05 | 43,0 | 49,9 | 38,7 | 2.?0 | 18,2 | 12,6 | 9,2 | 6,6 |
4 | 0,1 | 31,0 | 43,1 | 38,4 | 32,7 | 29,4 | 25,8 | 22,5 | 20,0 |
5 | 0.5 | 7,6 | 15,0 | 14,5 | 16,1 | 10,5 | 10,3 | 9,4 | 7,5 |
Polyäthylenimin hat die Eigenschaft, auf Grund einer Reaktion mit Glutaraldehyd geliert 'zu werden, da das
Gel jedoch eine geringe physikalische Festigkeit besitzt, ist Polyäthylenimin für sich allein ungeeignet für die
Herstellung von unbeweglich gemachtem Enzym. Es wurde jedoch gefunden, daß ein Gel mit hoher Rückhaltefähigkeit
für das Enzym und hoher physikalischer Festigkeit geschaffen wird, wenn Polyäthylenimin mit Glutaraldehyd
behandelt wird, nachdem es in das Calciumalginat-Gel
eingedrungen ist. Auf diese Weise werden die Nachteile der zwei Gelarten gegeneinander aufgehoben
und das der Erfindung zugrunde liegende Probleme gelöst.
Ausführungen und Einzelheiten der Erfindung werden nachfolgend auch unter Bezugnahme auf Vergleichsbeispiele
beschrieben.
Granulate von in Calciumalginat-Gel eingeschlossenem
Enzym wurden auf dieselbe Weise wie oben beschrieben hergestellt, und es wurden jeweils 30 g des
Granulats zur Herstellung von unbeweglich gemachtem Enzym verwendet. Zusätzlich ist es bevorzugt, wenn die
Teilchengröße im Durchmesser im Bereich von 0,5 bis 5 mm, noch besser im Bereich von 1 bis 3 mm liegt.
Da eine Polyäthylenimin-Lösung stark alkalisch ist und Calciumalginat aufzulösen vermag, wird die Lösung
vor ihrer Verwendung zweckmäßigerweise mit Salzsäure auf einen pH von 5,0 bis 5,8 neutralisiert. Die Menge
an Polyäthylenimin-Lösung lag bei 30 g und die Konzentration war doppelt so hoch wie die vorbestimmte
Konzentration der Lösung, die eindringen soll. Es wurden, mit anderen Worten, Polyäthylenimin-Lösungen
mit Konzentrationen von 1%, 2% und 3% verwendet, um sie in das Gel mit Konzentrationen von 0,5%, 1%
bzw. 1,5% eindringen zu lassen. Nach dem Eintauchen des Granulats in die Polyäthylenimin-Lösung für eine
Zeitdauer von 10 Minuten wurde das Granulat durch Saugfiltration gewonnen und, ohne es mit Wasser zu
waschen, zu 100 ml einer Glutaraldehydlösung bestimmter Konzentration gegeben und darin während
30 Minuten behandelt. Danach wurde das Granulat durch Filtration gewonnen, ausreichend mit Wasser gewaschen
und wiederholt für die Reaktion wie in dem oben beschriebenen Experiment eingesetzt wobei die
Änderungen der Saccharose-Umwandlungsrate während zwei Stunden vei folgt wurden. Es wurde bestätigt,
daß entsprechend der Temperaturbedingung ca. 80 bis 90% der umgewandelten Saccharose in Palatinose umgewandelt
worden war.
Die Ergebnisse des obengenannten Versuches über
die Wirkung der Verwendung von Polyäthylenimin sind
in Tabelle 2 aufgeführt. Als ein Vergleichsbeispiel für
den Fall, bei dem ohne Polyäthylenimin gearbeitet wird,
sind die Daten von Beispiel Nr. 5 der Tabelle 1 auch in
Tabelle 2 wiedergegeben. Da sich Polyäthylenimin mit
Glutaraldehyd verband, war eine relativ große Menge
an Glutaraldehyd erforderlich.
Wie sich im Falle von Probe Nr. 10 ergibt, wird ein
ausreichender Unbeweglichkeitseffekt nicht erhalten, wenn 0,1% Glutaraldehyd verwendet werden, und aus
Probe Nr. 9 ergibt sich, daß das Ausmaß der Immobilisierung immer noch nicht genügend ist, wenn Konzentrationen
von 0,2% Glutaraldehyd verwendet werden.
Bei Probe Nr. 7 wurde !% Polyäthylenirnin im Gel
absobiert und das Gel wurde mit 0,5% Glutaraldehyd behandelt. In diesem Falle war die Anfangsaktivität
hoch und stabil. Bei Probe Nr. 8 lag die absobierte Menge an Polyäthylenimin bei 1,5% des Gels, und die Kon-
zentration des Glutaraldehyds lag bei 1%. In diesem Falle war die Anfangsaktivität etwas niedrig aber die
Stabilität sehr groß. Wenn man berücksichtigt, daß die angenommene Höhe der Konzentration von Polyäthylenimin
in dem Gel mit einer beträchtlichen Unge-
nauigkeit behaftet ist, dann können die Bedingungen als optimal angesehen werden, wenn die Konzentration an
Polyäthylenimin, bezogen auf die im Gel vorhandene Menge, im Bereich von 0,5 bis 1,5% liegt und die Konzentration
der Glutaraldehyd-Lösung im Bereich von
0,5 bis 1,0%. Wenn die Konzentration von Polyäthylenimin höher ist als der obengenannte Bereich, dann wird
der Diffusionswiderstand für Saccharose und für das Reaktionsprodukt unerwünscht hoch, und wenn die
Konzentration niedriger liegt als der vorgenannte Be-
rieh, dann wird die Stabilität der Immobilisierung schlecht.
Das quantitative Verhältnis von Polyäthylenimin und Glutaraldehyd ist ebenfalls von Bedeutung, und es wurde
gefunden, daß die Menge an Glutaraldehyd in einem
Bereich liegen muß, der 1,5- bis 5mal so groß ist wie die
Menge an Poiyäthylenimin.
Im Falle der Probe Nr. 7 liegt die Menge an Polyäthylenimin im Gel in einem Bereich von 0,15 bis 0,3 g,
während die Menge an verwendetem Glutaraldehyd
0,5 g beträgt. Im Falle der Probe Nr. 8 lag die PoIyäthylenimin-Menge
bei 0,23 — 0,45 g, wogegen die Menge an Glutaraldehyd 1,0 g betrug.
Versuchsergebnisse über die wirkung der Verwendung von Polyäthylenimin zusammen mit Glutaraldehyd
Proben- Versuchsbedingung
Nr. (A) (B)
Nr. (A) (B)
Saccharose-Umwandlungsrate (%) in 2 Stunden
einmal zweimal dreimal viermal fünfmal
einmal zweimal dreimal viermal fünfmal
rechsmal siebenmal achtmal
5 | 0 | 0,5 | 7,6 | 15,0 | 14,5 | 16,1 | 10,5 | 103 | 9,4 | 7,5 |
6 | 0,5 | 0,5 | 11,0 | 17,7 | 18,1 | 17,3 | 16,6 | 15,4 | 12,3 | 12,0 |
7 | 1,0 | 0,5 | 24,8 | 30,4 | 30,1 | 29,8 | 26,7 | 26,7 | 26,0 | 24,5 |
S | 15 | Ί.0 | 11,4 | 18,3 | 18,0 | 18,1 | 18,3 | 17,6 | 16,3 | 16,4 |
9 | 1,0 | 0,2 | 36,3 | 40,0 | 35,5 | 333 | 28,4 | 24,9 | 22,5 | 20,0 |
10 | 1,0 | 0,1 | 4U | 35,4 | 34,2 | 22,3 | 15,4 | 13,7 | 11,2 | 9,2 |
(A): Die Konzentration von Polyäthylenimin im Gel nach dem Eintauchen des Gels in die Polyäthyleniminlösung.
(B): Die Konzentration der Glutaraldehyd-Lösung.
Die Wirkung der gemeinsamen Verwendung von Polyäthylenimin zusammen mit Glutaraldehyd ist aus
den in Tabelle 2 aufgeführten Daten eindeutig ersichtlich. Zur weiteren Klärung des Effekts wurde die Anzahl
der Einsätze, bis die Aktivität auf die Hälfte vermindert ist, und die Anzahl, bis die Aktivität um 75% vermindert
ist, aus den Daten der Tabellen 1 und 2 sowie aus Vergleichswerten der Produktivität, bis die Aktivität um
75% vermindert ist, wie folgt berechnet:
Es wird angenommen, daß die Reaktion entsprechend der Geschwindigkeitsgleichung (1) einer Reaktion erster
Ordnung abläuft:
K l/rlog(l - x)
wobei
K die Reaktionsgeschwindigkeitskonstante
t die Reaktionszeit
t die Reaktionszeit
χ die Umwandlungsrate von Saccharose bedeuten.
Wenn man davon ausgeht, daß in der Gleichung (1) K in Proportion zu der offensichtlichen Enzymaktivität in
dem Reaktionssystem steht und t konstant ist, dann ist die offensichtliche Enzymaktivität in Proportion zu log
(1 —χ), und daher ist der Anfangswert von — log {\-x) von Probe Nr. 1 als 100 als Standard definiert,
und es wurde dann die spezifische Aktivität einer jeden Probe, bezogen auf jeden Einsatz, berechnet. In der Annahme,
daß die Verminderungsrate der Aktivität eines jeden Enzyms als konstant anzusehen ist, wurde die Aktivität
in ein scmilogarithmisches Diagramm eingetragen, dessen Abszisse die Nummer des Einsatzes und
dessen Ordinate die spezifische Aktivität angaben, wobei nach einer Regression gesucht wurde und die Zahl
der Einsätze, bis die Aktivität 50% der maximalen Aktivität und 25% der maximalen Aktivität betrug, abgeleitet
wurden. Da die maximale Aktivität häufig nach dem zweiten Mal auftrat, ist die Anzahl der Einsätze, bis die
Aktivität 25% der maximalen Aktivität wird, nicht immer das Doppelte der Einsatzzahl, bis die Aktivität 50%
der maximalen Aktivität beträgt. Die Produktivität ergibt sich aus der Summe der Werte der spezifischen
Aktivität für jeden Einsatz. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.
Vergleich der Einsatzzahlen und Produktivität
Proben- | Versuchsbedingung | (B) | Zahl der | 25 | Produk |
Nr. | (A) | 1 | tivität | ||
brauchbaren | 4 | ||||
0 | Einsätze | 5 | 25 | ||
1 | 0 | 0,025 | 50 | 10 | 100 |
2 | 0 | 0,05 | 1 | 13 | 189 |
3 | 0 | 0,1 | 2 | 19 | 222 |
4 | 0 | 0,5 | 3 | 36 | 327 |
5 | 0 | 0,5 | 6 | 70 | 125 |
6 | 0,5 | 0,5 | 8 | 12 | 225 |
7 | 1,0 | 1,0 | 11 | 6 | 746 |
8 | 1,5 | 0,2 | 19 | 749 | |
9 | 1,0 | 0,1 | 36 | 360 | |
10 | 1,0 | Polyäthylenimin (%) | 7 | 197 | |
(A): | Glutaraldehyd (%) | 3 | |||
(B): | bis zu 50% Aktivität | ||||
(50%): | bis zu 25% Aktivität | ||||
(25%): | |||||
Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen deutlich, daß die Unbeweglichkeitsbehandlung unter den oben beschriebenen
Optimalbedingungen die Produktivität ganz erheblich verbessert.
Bei einer weiteren Anwendungsform des erfindungsgemäßen Produkts zur Herstellung von Palatinose wird
in einem Recycling-System eine Saccharose-Lösung aus einem Vorratstank mit Hilfe einer Pumpe einer Säule
zugeführt, welche mit nach der obengenannten Methode unbeweglich gemachter ar-Glukosyltransferase bepackt
ist. Die Reaktionsmischung wird vom Auslaß der Säule in den Vorratstank zurückgeführt, und der pH-Wert
im Vorratstank und der pH-Wert der Recycling-Lösung in den Rohrleitungen werden eingestellt.
im nachfolgenden werden die Eigenschaften der unbeweglich gemachten Λ-Glukosyltransferase, wie sie
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wird, beschrieben.
Wie oben erwähnt, löst sich Calciumalginat in einer Lösung nur mit einem pH-Wert oberhalb 5,8 allmählich auf und daher soll die Reaktion bei einem pH-Wert unterhalb 5,8 durchgeführt werden. Wenn der pH-Wert der Reaktionsmischung beispielsweise auf 7,0 neutralisiert wird, dann vermindert sich der pH-Wert schnell und wird stabilisiert, wenn er unter 5,8 kommt.
Wie oben erwähnt, löst sich Calciumalginat in einer Lösung nur mit einem pH-Wert oberhalb 5,8 allmählich auf und daher soll die Reaktion bei einem pH-Wert unterhalb 5,8 durchgeführt werden. Wenn der pH-Wert der Reaktionsmischung beispielsweise auf 7,0 neutralisiert wird, dann vermindert sich der pH-Wert schnell und wird stabilisiert, wenn er unter 5,8 kommt.
In der Zeichnung zeigt ein Diagramm die pH-Charakteristik der Enzymaktivität, die unter Verwendung einer
30%igen Saccharose (Gewicht pro Gewicht) gemessen wurde, gelöst in einer 0,02 M Essigsäure/Calciumacetatpuffer-Lösung.
In der Figur bedeutet die durchgezogene Linie (A) das unbeweglich gemachte Enzym und die
gestrichelte Linie (B) ein freigesetztes Zellenzym. Der aktive pH-Bereich ist im Vergleich zum freigesetzten
Zellenzym in Richtung auf die saure Seite verschoben, es ist jedoch eindeutig, daß der pH-Wert während der
Reaktion vorzugsweise innerhalb eines Bereichs, der die Stabilität des Gels nicht vermindert, so hoch wie möglich
gehalten wird. Deshalb wird der pH-Wert der Reaktionsmischung in der Regel 5,0 bis 5,8, vorzugsweise auf
etwa 5,5, gehalten.
Im nachfolgenden wird der Einfluß der Temperatur erläutert. Das erfindungsgemäße unbeweglich gemachte
Enzym wurde in eine 30%ige Saccharose (Gewicht pro Gewicht), welche in einer 0,02 M Essigsäure/Calciumacetat-Pufferlösung
bei pH 5,5 aufgelöst war, eingetaucht und 30 Minuten lang bei einer definierten Temperatur gehalten, wonach das unbewegliche Enzym
durch Filtration abgetrennt und mit Wasser ausreichend gewaschen wurde. Danach wurde das unbewegliche Enzym
mit einer Saccharose-Lösung der selben Zusammensetzung wie oben während zwei Stunden bei 3CrC
gehalten, wonach seine verbliebene Aktivität gemessen wurde. Eine Verminderung der Aktivität findet bei 30°
noch nicht statt, jedoch bereits bei Temperaturen zwisehen
30 und 35° C. Deshalb wird die Umwandlung von Saccharose in Palatinose wie im Falle der Verwendung
des freigesetzten Zellenzyms zweckmäßigerweise bei Temperaturen unterhalb 300C durchgeführt
Für die Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms kann ein Reaktionsgefäß mit einem Rührer verwendet
werden, zur Verhinderung einer Zerstörung bzw. eines Abriebs des Granulats ist es jedoch günstiger, eine mit
dem Granulat bepackte Säule, vorzugsweise eine Säule vom Festbett-Typ zu verwenden. Der Druckverlust in
der Säule ist sehr gering, und es kann eine recht hohe lineare Geschwindigkeit angewendet werden.
Wenn die Verweildauer in der Säule verlängert ist, dann vermindert eine pH-Verringerung die offensichtli-
ehe Aktivität des Enzyms, weshalb ein Recycling-System
mit einer verkürzten Verweildauer bevorzugt angewendet wird und der pH-Wert im Recycling-System
außerhalb der Säule auf ca. 5,5 eingestellt wird. Ein solches Vorgehen wird als besonders geeignete Maßnahme
im Zusammenhang mit der Verwendung des Enzyms nach der Erfindung erachtet. Auch wird zweckmäßiger
fc"; weise im Vergleich zu der Menge der zu behandelnden
Lösung eine große Menge an unbeweglichen Enzympartikeln bzw. Granulatkörnern in eine Säule gepackt.
Wird die zu behandelnde Lösung einmal durch die Säule geleitet, dann kann der größere Teil der Saccharose in
Palatinose umgewandelt werden. Wenn mehr als 98% der Saccharose in die Folgeprodukte umgewandelt sind,
dann wird die Reaktion abgebrochen. Eine transparente Flüssigkeit kann durch ein einfaches Filter bzw. Sieb
erhalten und direkt in die nachfolgende Stufe weitergeführt werden. Es bestehen also keinerlei Probleme wie
im Falle der Verwendung von freigesetzem zellulärem Enzym.
Außerdem wird es durch die Erfindung ermöglicht, daß die anfängliche Saccharose-Konzentration in der
Reaktionsmischung im Vergleilch zur Verwendung herkömmlicher freigesetzter Zellen innerhalb eines von der
Löslichkeit der Palatinose als Reaktionsprodukt zügelassenen Bereichs erhöht werden kann. Da Palatinose in
der etwa l,5fachen Gewichtsmenge Wasser bei 30°C aufgelöst wird, kann die anfängliche Saccharose-Konzentration
bei ungefähr 40% (Gewicht pro Gewicht) liegen.
Die Kosten für die Konzentrierung der Flüssigkeit in einer Kristallisationsstufe können auf diese Weise erheblich
gesenkt werden.
Wenn ferner eine höhere Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms als diejenige, die in den obigen Beispielen
erläutert ist, erhalten werden soll, dann kann die im Calciumalginat-Gel eingeschlossene Enzymmenge
erhöht werden, was leicht erreicht werden kann.
Weitere Ausführungsformen und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden detaillierten
Beschreibung in Verbindung mit den Ansprüchen.
In ein 301 Fermeni>rgefäß werden 151 eines Kulturmediums
mit einem pH 7 gegeben, das 5% Saccharose, 3% Maisquellwasser, 0,3% Dinatriumhydrogensulfat
und 0,2% Natriumchlorid enthält Nach Sterilisieren und nach Inokulieren von Serratia plymuthica NCIB
Nr. 8285 wird die Fermentation bei einer einer Tempiratur von 28° C während 16 Stunden mit einem Belüitungsgrad
von 7,5 i/min und einer Rührgesehwindigkcii von 400 U. p. M. durchgeführt, um ein Kulturmaterial
mit einer hohen Aktivität an «-Glukosyltransferase zu erhalten. Dieses wurde durch Zentrifugalabscheidung
abgetrennt und man erhielt 2,5 1 einer das Enzym enthaltenden Zellaufschlämmung.
Die so erhaltene Zellaufschlämmung bzw. -suspension wurde mit 2,5 1 einer wäßrigen Lösung von 4%
Natriumalginat gut durchgemischt, und die Mischung wurde in einen zylindrischen Extruder gegeben, der mit
einer Form mit einer Vielzahl von Poren mit einem Durchmesser von 0,6 mm am Kopfende ausgerüstet ist.
Die Mischung wurde nach unten durch die Form durch Anlegen eines Drucks extrudiert. Unterhalb des Extruders
befand sich ein 201-Gefäß, das 101 einer wäßrigen 0,15 M Calciumchlorid-Lösung enthielt Unter Rühren
dieser Lösung mit einem Rührer wurden der Lösung die aus der Form fallenden Flüssigkeitstropfen der Mischung
zugegeben. Die Extrusion war nach 10 Minuten beendet Die Calciumchlorid-Lösung wurde 2 Stunden
lang gerührt, um die physikalischen Eigenschaften der gebildeten Körnchen in der Lösung zu festigen. Danach
wurde das erhaltene Granulat durch Filtration gewonnen und mit Wasser gewaschen. Das Gewicht des erhaltenen
Granulats betrug 5 kg.
Nach Verdünnen von 270 g 30%igem Polyäthylenimin mit ca. 3 1 Wasser wurde die dabei erhaltene Lösung
mit verdünnter Salzsäure auf einen pH von 5,5 eingestellt und danach die Gesamtmenge der Flüssigkeit
auf 4 kg eingestellt. Die gesamte Menge des oben beschriebenen Granulats wurde der Lösung zugegeben,
und nach langsamem Rühren wurde das Granulat durch Filtration wiedergewonnen. Durch Feststoffanalyse der
zurückbleibenden Lösung wurde berechnet, daß ca. 20 g Polyäthylenimin in die Granulatkörnchen eingedrungen
war. Dementsprechend wurden 101 einer 0,5%igen GIutaraldehydlösung,
die 50 g Glutaraldehyd enthielt, hergestellt, was dem 2,5fachen der berechneten Menge entspricht.
Das Polyäthylenimin enthaltende Granulat wurde der Lösung zugegeben und nach schwachem Rühren
während 30 Minuten wurde das Granulat durch Filtration wiedergewonnen und mit Wasser ausreichend gewaschen.
Die obigen Verfahrensschritte wurden durchweg bei einer Temperatur von ca. 25° C durchgeführt.
Die Menge an auf diese Weise erhaltener unbeweglich gemachter Glukosyltransferase betrug 3,3 kg. Das
Enzym wurde in eine 5 1-Säule gepackt.
In 9 kg Wasser wurden 6 kg feingranulierter Zucker aufgelöst, wonach die Temperatur der Lösung auf 25°C
eingestellt wurde. Die Lösung wurde durch die Säule umgewälzt, indem die Lösung der Säule mit einer Geschwindigkeit
von 50 1 pro Stunde mit Hilfe einer Pumpe zugeführt und die Lösung vom unteren Auslaß der
Säule in das ursprüngliche Gefäß rückgeführt wurde. Da der pH-Wert der Lösung während des Recyclings
allmählich verringert wurde, wurde er mit einer wäßrigen Natriumhydroxid-Lösung unter Verwendung eines
automatischen pH-Reglers auf etwa 5,5 eingestellt. Nach einer Umwälzdauer von 21 Stunden waren mehr
als 98% der Saccharose unter Bildung von Palatinose umgesetzt
Die Zuckerlösung wurde entnommen, und es wurde eine zweite Reaktion unter Verwendung einer frischen
Zuckerlösung begonnen. Die Menge an Saccharose- Lösung war bis zur dritten Reaktion die gleiche, wonach
jedoch die Menge an Zuckerlösung entsprechend der Verminderung der Aktivität allmählich verkleinert wurde.
Es dauerte 25 Tage, bis die pro Tag zu behandelnde Menge an Saccharose auf die Hälfte verminderi war.
Während dieser Zeitdauer betrug die Gesamtmenge an behandelter Saccharose 110 kg. Bei Fortführung des
Versuches dauerte es 48 Tage, bis die Aktivität 1 /4 der ursprünglichen Aktivität betrugt, und die behandelte
Saccharose-Menge lag bei 160 kg.
Es wurde eine 6%ige Natriumalginat-Lösung hergestellt,
und 1,25 1 der Lösung wurden mit 2,5 1 einer wie in Beispiel 1 hergestellten Zellaufschlämmung vermischt.
Dann wurde die Mischung, wie in Beispiel 1 beschrieben, tropfenweise durch einen Extruder in 8 1 einer
0,15 M Calciumchlorid-Lösung eingebracht, wobei 3 kg Granulat erhalten wurden.
Nach Einstellen des pH-Wertes von 31 einer
2,5°/o!gen Polyäthylenimin-Lösung auf 5,5 wurde das Granulat während 10 Minuten in diese Lösung getaucht,
wobei 30 g Polyäthylenimin in die Granulatkörner eindrangen. Das Granulat wurde daraufhin während 30
Minuten mit 91 einer l°/oigen Glutaraldehyd-Lösung
behandelt, die 90 g Glutaraldehyd enthielt, was der dreifachen
Menge an Polyäthyienimin entspricht Das Granulat wurde dann durch Filtration wiedergewonnen und
mit Wasser gewaschen, wobei 2,5 kg unbeweglich gemachte
Λ-Glukosyltransferase erhalten wurden.
Das unbeweglich gemachte Enzym wurde in eine Säule gepackt und wie in Beispiel 1 verwendet In diesem
Falle betrug die in einem Tag behandelte Saccharose-Menge 5 kg zu Beginn der Behandlung, und nach 25
Tagen hatte die Säule noch eine Arbeitskapazität von 3 kg pro Tag. Die während 25 Tagen behandelte Saccharose-Menge
betrug 95 kg, und es dauerte ca. 50 Tage, bis die Aktivität bei 1/4 der Anfangsaktivität lag. Die
Menge an behandelter Saccharose betrug 185 kg.
Serratia plymuthica NClB Nr. 8285 wurde unter Verwendung
eines Kulturmediums, das 5% Saccharose, 3% Maisquellwasser, 0,5% Hefeextrakt, 0,3% Dinatriumhydrogenphosphat
und 0,2% Natriumchlorid enthielt, während 20 Stunden bei einem Anfangs-pH von 7,0,
einer Temperatur von 280C, einer Belüftungsrate von
1/4 Vol/Vol χ min und einer Rührgeschwindigkeit von
300 U. p. M. kultiviert, wobei 15 1 Kulturmaterial erhalten
wurden. Das kultivierte Material wurde einer Zentrifugalabtrennung unterworfen, um 3 1 Zellaufschlämmung
zu bilden, welche mit 1,5 1 einer 4%igen Natriumalginat-Lösung gut vermischt wurden. Die Mischung
wurde wie in Beispiel 1 zur Bildung eines Granulats in eine Calcii'mchlorid-Lösung eingetropft, und das erhaltene
Granulat mit Wasser gewaschen. Nach Eindringen von Polyäthylenimin in die Granulatkörner wurde das
Granulat mit einer Glutaraldehyd-Lösung behandelt, um 2,6 kg fixierte Λ-Glukosyltransferase zu bilden, welche
in eine 51 Säule gepackt wurden.
Eine Lösung von Saccharose, aufgelöst in einer 0,01 M Essigsäure/Calciumacetat-Lösung, wurde in einer
Konzentration von 30% (Gewicht pro Gewicht) bei
einer Temperatur von 25° C und einer Fließgeschwindigkeit
von 2,5 1 pro Stunde durch die Säule geleitet Der Anteil an Saccharose im Ausfluß wurde zu 0,5% bestimmt,
was zeigt, daß der größte Teil der Saccharose in der Säule in Palatinose umgewandelt worden war. Wurde
die Säule 30 Tage lang unter denselben Bedingungen wie oben eingesetzt, dann lag der Saccharosegehalt im
Ausfluß im Bereich von 0,5 bis 1,5%. Die innerhalb von 30 Tagen behandelte Saccharose-Menge lag bei 540 kg.
100 g der unbeweglich gemachten Λ-Glukosyltransferase, die wie in Beispiel 3 erhalten wurde, wurden in eine
200 ml Säule gepackt Durch diese Säule wurden 21 einer 30%igen Saccharose-Lösung (Gewicht pro Gewicht)
mit einer Geschwindigkeit von 500 ml pro Stunde hindurchgeleitet und wie in Beispiel 1 umgewälzt Ein
automatischer pH-Regler wurde mit dem Gefäß für die Saccharose-Lösung verbunden und der pH-Wert auf
5,5 ±0,1 unter Anwendung einer gesättigten Calciumhydroxid-Lösung eingestellt Die Temperatur des Reaktionssystems
wurde auf 25° C gehalten. Da die Konzentration an Saccharose ι der Reaktionsmischung nach
20 Stunden unter 0,5% lag, wurde die Saccharose-Lösung erneuert und die Reaktion von neuem begonnen.
Auf diese Weise wurde die Reaktion 20mal durchgeführt, ohne daß eine merkliche Änderung in bezug auf
die Enzymaktivität der Säule beobachtet wurde.
Ohne Verwendung der in Beispiel 4 genannten Säule wurden 100 g des unbeweglich gemachten Enzyms wie
in Beispiel 4 zu 2 I einer Saccharose-Lösung gegeben. Nach einer Reaktionsdauer von 20 Stunden unter Rühren
und Einstellen des pH-Wertes auf 5,5 und unter Einhaltung einer Temperatur von 25°C lag die Saccharose-Konzentration
bei 0,3%. Das Enzym wurde durch Filtration wiedergewonnen und für die nachfolgende
Reaktion eingesetzt. Nach 20maligem Einsetzen des Enzyms wurde keine merkliche Veränderung der Enzymaktivität
beobachtet.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (3)
- Patentansprüche:1 Unbeweglich gemachtep-Glukosyltransferase, dadurch erhältlich, daß man Bakterienzellen, die x-Glukosyltransferase enthalten, durch Einschluß in ein Calciumalginat-Gel granuliert, das Granulat in eine auf einen pH von 5,0 bis 5,9 eingestellte PoIyäthylenimin-Lösung taucht, bis die Polyäthylenimin-Konzentration im Gel 0,5 bis 1,5% beträgt, und dann das Granulat mit einer Glutaraldehyd-Lösung behandelt, die die 1,5- bis fünffache Menge, bezogen auf das im Gel befindliche Polyäthylenimin, an GIutaraldehyd enthält
- 2. Verfahren zur Herstellung der Λ-Glukosyltransferase gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die im Anspruch 1 genannten Maßnahmen in der angegebenen Reihenfolge durchführt
- 3. Verwendung der unbeweglich gemachten x-Glukosyltransferase gemäß Anspruch 1 zur Herstellung von Palatinose aus Saccharose.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP55113982A JPS5836959B2 (ja) | 1980-08-21 | 1980-08-21 | 固定化α−グルコシルトランスフエラ−ゼによるパラチノ−スの製造法 |
Publications (2)
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