DE10005808B4 - Verfahren zur Herstellung von Matrizen-DNA aus veredelter pflanzlicher Nahrung, die sich zur Amplifizierung eines DNA-Bereichs durch das PCR-Verfahren eignet - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Präparation einer Matrizen-DNA aus einem veredelten Pflanzennahrungsmittel, welches einer Proteindenaturierungsbehandlung unterzogen wurde, umfassend die Schritte:
(a) Durchführen einer Entfettungsbehandlung des veredelten Nahrungsmittels;
(b) Extrahieren einer rohen DNA-Fraktion aus dem veredelten Pflanzennahrungsmittel; und (
c) Durchführen einer DNA-Fraktionierungsbehandlung der rohen DNA-Fraktion durch ein Polyethylenglycol-Fällungsverfahren und/oder ein Polyacrylamidgelelektrophoreseverfahren.

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Matrizen-DNA aus einem veredelten Nahrungsmittel, bei dem Samen einer Pflanze, wie die Sojabohne, als Material verwendet werden, wobei sich die Matrizen-DNA zum Nachweisen der Gene der Pflanze und rekombinanten Gene davon durch ein PCR-Verfahren verwenden lässt, sowie ein Verfahren zum Nachweisen der Gene einer Pflanze mit einer solchen Matrizen-DNA zum Nachweisen der Pflanzengene in der veredelten Pflanzennahrung, die von der Pflanze herrührt, durch ein PCR-Verfahren.
• Veredelte Nahrungsmittel, bei denen Samen einer Pflanze als Material verwendet werden, werden während ihres Herstellungsverfahrens einer Hochtemperatur-Behandlung, Hochtemperatur-Mahl-Behandlung, Hochdruck-Behandlung oder einer mechanischen Mahlbehandlung unterworfen, woraufhin eine Fragmentierung der DNA-Moleküle erfolgt. Bei fermentierten Nahrungsmitteln, wie Bohnenpaste und fermentierten Sojabohnen, erfolgt eine weitere Fragmentierung der DNA durch eine aus Mikroorganismen stammende Nuclease.
• Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines DNA-Fragmentes, das so rein ist, dass es sich als Matrize für eine PCR-Amplifizierung aus einem solchen veredelten Pflanzennahrungsmittel verwenden lässt, und die Bereitstellung eines Verfahrens zur Verwendung der Matrizen-DNA zum Nachweisen der Gene einer Pflanze, aus der das veredelte Nahrungsmittel hergestellt ist, durch ein PCR-Verfahren.
• Für die Extraktion von Pflanzen-DNAs, d.h. DNAs aus Sojabohne und anderen Pflanzen, sind bereits grundlegende Techniken entwickelt worden, die sich auch für die Extraktion von DNA aus Nahrungsmitteln verwenden lassen, wie das CTAB-Verfahren (Marray, M.G. und Thompson, W.F.; Rapid Isolation of high molecular weight plant DNA, Nucleic Acids Res. 8 (1980) 4321-4325), das SDS-Phenol-Verfahren (David, R.W., Thomas, M., Cameron, J., St. John, T.P., Scherer, S. und Padgett, R. A.; "Methods in Enzymology" hrsg. von Grossman, L. und Moldav, K. Bd. 65 (1980) S. 404, Academic Press, New York) und das Protease-K-Verfahren (Jofuku, K.D., Goldberg, R.B.; Plant molecular biology – a practical approach, hrsg. von Show, C.H. (1988) S. 37, IRL Press, Oxford-Washington DC).
• Jeppesen und Lis(in: Methods in Enzymdogy, Hrsg. L. Grossmann und K. Moldave Vol. 65 (1980), 305-319 und 347-353) beschreiben die Fraktionierung von DNA-Fragmenten mittels Polyacrylamid-Elektrophorese oder Polyethylenglykol (PEG) – Fällung (Seiten 306, 307 sowie Seite 349, Absatz 2 und 3).
• Haj-Ahmad et al. (BioTechniques 16 (1994), 392-394) offenbart, dass die Isolierung hochmolekularer DNA aus tropischen, verholzten Pflanzen mittels eines modifizierten Polyethylenglykol (PEG) DNA-Extraktionsverfahrens möglich ist (siehe Titel). Die so erhaltene hochmolekulare DNA kann dabei als Matrize für eine PCR-Amplifikation verwendet werden (Seite 394, dritte Spalte, Zeilen 10 bis 13).
• Werden jedoch veredelte Nahrungsmittel, die Pflanzensamen als Material verwenden, hergestellt, wird das Material häufig verschiedenen Veredelungsschritten, wie Hochtemperatur-, Hochdruck-, und mechanischen Mahlbehandlungen oder einem Fermentationsschritt mit Mikroorganismen unterworfen. Werden die vorstehenden Grundtechniken direkt angewendet, ist es darum in vielen Fällen schwierig, eine DNA herzustellen, die hinreichend rein ist, dass sie als Matrizen-DNA bei der PCR-Amplifikation verwendet werden kann.
• Im Fall der Sojabohne, die eine der Materialien für japanische traditionelle Nahrungsmittel auf Pflanzenbasis ist, ermöglichen bspw. die Samen und Bohnensprossen die Extraktion hochreiner DNA, die sich in einem nativen Zustand befindet, lediglich durch Verwendung der vorstehenden grundlegenden Verfahren. Tofu (Bohnenquark) einschließlich Kori-Dofu (gefriergetrockneter Tofu) und Aburaage (gebratene Tofu-Stücke), einschließlich Ganmodoki (gebratener, gefüllter Tofu), usw. können zu Herstellung einer Matrizen-DNA für PCR durch Verwendung der vorstehenden grundlegenden Verfahren ohne Vorbehandlung oder DNA-Reinigungsschritte verwendet werden, da sie bei ihrer Herstellung einer DNA-Fragmentierung unterlagen, obwohl die Ausbeute an Matrizen-DNA niedrig ist.
• Im Falle von Kinako (getrocknetes Bohnenmehl (Hochtemperatur-Mahlen) und gedämpften/gekochten Sojabohnen (gekochte Bohne, Autoklavieren) oder ihren fermentierten Nahrungsmitteln (Natto (fermentierte Sojabohnen), Miso (Bohnenpaste), usw.) und dergleichen, wird die DNA durch die jeweils beteiligte Behandlung in Fragmente gespalten, und folglich war es sehr schwierig, hochreine DNA herzustellen, mit der keine niedermolekulare DNA gemischt ist.
• Die erste Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung hochreiner DNA, die als Matrize für PCR aus veredelten Pflanzennahrungsmitteln, die von Sojabohnen und anderen Pflanzensamen als Material herrühren, verwendet werden kann, wobei die veredelten Nahrungsmittel einer Proteindenaturierungsbehandlung unterworfen worden sind.
• Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Nachweisen eines Pflanzengens durch ein PCR-Verfahren aus einem veredelten Nahrungsmittel, das aus einer Pflanze stammt, wobei die Matrizen-DNA verwendet wird.
• Ein globaler Trend im Bewußtsein des Verbrauchers ist, dass der Verbraucher mittlerweile genau wissen möchte, welche Materialien in einem hochveredelten Nahrungsmittel enthalten sind. Viele der Arbeitsschritte beim Veredelungsverfahren gehen jedoch oft mit einer erheblichen Denaturierung von Proteinen einher, so dass die Identifikation von Pflanzenmaterialien durch die Analyse von Proteinen gemäß herkömmlicher Verfahren nur in wenigen Situationen erfolgreich war.
• Zur Lösung der vorstehenden Probleme haben die Erfinder ausgiebige Untersuchungen durchgeführt, und daraufhin haben sie entdeckt, dass eine fakultative Vorbehandlung vor den grundlegenden Verfahren zur DNA-Extraktion und die Anwendung bestimmter Reini gungs- und Trennverfahren nach der Extraktion die Herstellung von hochreiner DNA ermöglichen, sogar aus veredelten Pflanzennahrungsmitteln, die einer Proteindenaturierungsbehandlung unterworfen worden sind.
• Wenn DNA, die gegenüber Hitzebehandlung und dergleichen beständig ist, d.h. in der veredelten Nahrung nach der Proteindenaturierungsbehandlung in einem ungespaltenen Zustand bleibt, in einem hochreinen Zustand präpariert werden kann, dann lässt sich die Art des Pflanzenmaterials mit hoher Empfindlichkeit klären, indem das Gen der Pflanze durch ein PCR-Verfahren unter seiner Verwendung nachgewiesen wird. Es besteht schließlich die Möglichkeit, dass eine Beurteilung dahingehend getroffen werden kann, ob die Pflanze als Rohmaterial des veredelten Pflanzennahrungsmittels eine Pflanze ist, die einer Genrekombinationsbehandlung unterworfen worden ist oder nicht. Die vorliegende Erfindung ist auf diesen Befunden erzielt worden.
• Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird daher ein Verfahren zur Präparation einer Matrizen-DNA aus einem veredelten Pflanzennahrungsmittel, welches einer Proteindenaturierungsbehandlung unterzogen wurde, bereitgestellt, umfassend die Schritte:
• (a) Durchführen einer Entfettungsbehandlung des veredelten Nahrungsmittels;
• (b) Extrahieren einer rohen DNA-Fraktion aus dem veredelten Pflanzennahrungsmittel; und
• (c) Durchführen einer DNA-Fraktionierungsbehandlung der rohen DNA-Fraktion durch ein Polyethylenglycol-Fällungsverfahren und/oder ein Polyacrylamidgelelektrophoreseverfahren.
• Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweisen eines Pflanzengens in einem veredelten Pflanzennahrungsmittel, das aus der Pflanze stammt, durch ein PCR-Verfahren bereitgestellt, wobei die durch das Verfahren des ersten erfindungsgemäßen Aspektes erhaltene Matrizen-DNA verwendet wird.
• Gemäß einem dritten Aspekt der Erfindung ist das veredelte Pflanzennahrungsmittel bei dem Verfahren des zweiten erfindungsgemäßen Aspektes ein ölhaltiger Samen.
• 1 ist ein Elektrophorese-Bild, welches die Molekulargewichte der jeweiligen DNAs aus veredelten Sojabohnennahrungsmitteln zeigt, die in Herstellungsbeispiel 1 hergestellt worden sind, wobei Ma und Mb im oberen Teil die Marker angeben. Die Zahlen 1 bis 9 bezeichnen Sojasamen, Sojasprossen, Sojaquark, gebratenes Sojaquarkstück, gedämpfte/gekochte Sojabohnen, getrocknetes Sojamehl, Bohnenpaste, fermentierte Sojabohnenfraktion III bzw. fermentierte Sojabohnen. Die Zahlen auf der rechten und linken Seite stehen jeweils für Molekulargewichte.
• 2 ist ein Elektrophorese-Bild, das die Ergebnisse der PCR zeigt, welche jeweils mit Hilfe der DNAs der veredelten Sojabohnennahrungsmittel durchgeführt wurde, die in Herstellungsbeispiel 1 hergestellt wurden. Dabei steht der Buchstabe M im oberen Teil für einen Marker. Die Zahlen 1 bis 8 bezeichnen Sojasamen, Sojasprossen, Sojaquark, gebratenes Sojaquarkstück, gedämpfte/gekochte Sojabohnen, getrocknetes Sojamehl, Bohnenpaste bzw. fermentierte Sojabohnen. Die Zahlen auf der linken Seite stehen für die Molekulargewichte.
• 3 ist ein Elektrophorese-Bild, das die Ergebnisse von Testbeispiel 3 zeigt, wobei der Buchstabe M im oberen Teil für einen Marker steht. Die Zahlen 1 bis 6 auf der linken Seite zeigen, dass die Ergebnisse der nicht-rekombinanten Gene gemeint sind, und die Zahlen 1 bis 6 auf der rechten Seite zeigen, dass die Ergebnisse der rekombinanten Gene gemeint sind. Die Zahlen 1 bis 6 bezeichnen Sojasamen, Sojasprossen, Sojaquark, gebratenes Sojaquarkstück, gedämpfte/gekochte Sojabohnen bzw. fermentierte Sojabohnen. Die Zahlen auf der linken Seite stehen für die Molekulargewichte.
• Die vorliegende Erfindung wird nachstehend eingehend beschrieben. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer hochreinen Matrizen-DNA aus einem veredelten Nahrungsmittel aus Pflanzensamen, wie Sojabohne, als Material, wobei sich die Matrizen-DNA zur Amplifikation eines DNA-Bereichs durch ein PCR-Verfahren eignet, sowie ein Verfahren zur Verwendung einer solchen Matrizen-DNA beim Nachweis der Pflanzengene im veredelten Pflanzennahrungsmittel durch ein PCR-Verfahren.
• Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein pflanzliches Nahrungsmittel, das einer Proteindenaturierungsbehandlung, wie einer Hochtemperatur-Behandlung, einer Hochtemperatur-Mahlbehandlung, einer Hochdruckbehandlung oder einer Fermentationsbehandlung, unterworfen wurde.
• Die Proteindenaturierungsbehandlung umfasst bspw. eine Hochtemperatur-Mahlbehandlung, eine Behandlung in einem Autoklaven (Hochdruck) oder eine Fermentationsbehandlung, wenn das Rohmaterial Sojabohne ist. Spezifische Beispiele für veredelte Nahrungsmittel, die solchen Behandlungen unterworfen worden sind, umfassen Bohnenquark, gebratene Bohnenquarkstücke, getrocknetes Bohnenmehl usw. als Beispiele, die einer Hochtemperatur-Mahlbehandlung unterworfen worden sind, gedämpfte/gekochte Sojabohnen (Kochbohne) als Beispiel für eine Autoklavenbehandlung, fermentierte Sojabohnen und Bohnenpaste als Beispiele, die neben diesen Behandlungen einer Fermentationsbehandlung unterworfen worden sind.
• Die veredelten Pflanzennahrungsmittel ergeben keine solche hochreine DNA, die sich in einem PCR-Verfahren verwenden lässt, wenn die DNA durch ein übliches Verfahren extrahiert wird. Dies zeigt die Bedeutung der vorliegenden Erfindung.
• Bei der vorstehenden Erläuterung ist ein Beispiel für ein veredeltes Nahrungsmittel angegeben, bei dem Sojabohne als Rohmaterial verwendet wird. Die erfindungsgemäße Aufgabe ist jedoch nicht auf veredelte Sojabohnennahrungsmittel eingeschränkt, sondern sie umfasst auch veredelte Nahrungsmittel, die aus verschiedenen Pflanzen als Rohmaterialien her gestellt werden, wie Kartoffelchips und Popcorn sowie veredelte Nahrungsmittel aus Reis, Weizen usw.
• Wird in der vorliegenden Erfindung ein veredeltes Pflanzennahrungsmittel, bei dem möglicherweise eine genetisch rekombinierte Pflanze teilweise oder vollständig verwendet worden ist, als Objekt ausgewählt, kann der Nachweis des rekombinanten Gens mit der erhaltenen DNA durchgeführt werden.
• Das erfindungsgemäße Verfahren ist die Extraktion und die Präparation von DNA aus veredelten pflanzlichen Nahrungsmitteln, die wie vorstehend beschrieben Protein-Denaturierungsbehandlungen unterworfen worden sind. Dabei erfolgt eine Entfettungsbehandlung des Nahrungsmittels als Vorbehandlung und anschließend die Auswahl eines geeigneten Verfahrens aus den vorstehend beschriebenen grundlegenden Extraktionsverfahren. Insbesondere Pflanzensamen, die als solche fein pulverisiert sind, oder diejenigen, die mit Öl oder dergleichen bedeckt sind, müssen einer Entfettungsbehandlung unterworfen werden.
• Sogar wenn ein Pflanzengewebe, wie Samen, einer Hochdruck-Dämpf-/Kochbehandlung unterworfen wird, wird der Teil der DNA-Region, der um einen Histonkern gewunden ist, geschützt, und bleibt daher ohne Bruchstellen. Die DNA-Kette zwischen den Nucleosomen wird dagegen auf eine Größe von mehreren zehn Basen fragmentiert. Im Fall der fermentierten Sojabohnen und Bohnenpaste wird die DNA in den Nucleosomeneinheiten durch eine Protease und Nuclease, die von Fermentationsmikroben abstammen, weiter abgebaut. Ist eine solche niedermolekulare DNA zugegen, wird das PCR-Verfahren dadurch gehemmt.
• Insbesondere im Fall von fermentierten Sojabohnen erfolgt neben dem enzymatischen Abbau der DNA-Fragmente eine Kontamination der DNA-Präparation mit einer großen Menge Polysaccharid (Fructan}, das durch Bacillus subtilis (nattoproduzierende Bakterien) erzeugt wird, wodurch die PCR-Amplifikation beträchtlich gehemmt wird. Im Fall von Stärkesamen, wie Mais, erzeugt ein partieller Abbau der Stärke aufgrund der intrazellulären Amylase während des Dämpf-/Koch-Verfahrens Oligosaccharide, die das PCR-Verfahren ebenfalls hemmen.
• Bei der vorliegenden Erfindung kann die Entfettungsbehandlung des veredelten Pflanzennahrungsmittels die niedermolekulare DNA entfernen, die Probleme bei der PCR verursacht, so dass eine Verringerung der Reinheit der in einer späteren Behandlung zu präparierenden DNA verhindert wird, und hinreichend reine DNA, die zur PCR-Amplifikation bereitgestellt werden soll, erhalten werden kann.
• Pflanzennahrungsmittel, die keiner Proteindenaturierungsbehandlung unterworfen werden, wie Sojabohnensamen und Bonnensprossen; benötigen keine Entfettungsbehandlung. Die Entfettungsbehandlung kann gemäß einem bekannten Verfahren durchgeführt werden, bspw. dem Soxhlet-Verfahren, unter Verwendung von Diethylether oder dergleichen als Lösungsmittel, einer Entfettungsbehandlung unter Verwendung eines Ethers und dergleichen.
• Die Bedingungen der Entfettungsbehandlung können bestimmt werden, indem bspw. die Art des veredelten Nahrungsmittels angemessen in Betracht gezogen wird. Die Temperatur der Etherschicht wird bspw. auf 65°C eingestellt, und die Extraktion erfolgt 14 Std. lang.
• Wird DNA aus veredelten Nahrungsmitteln unter Verwendung von Samen mit Pflanzenölgehalt, wie Sojabohnen, bspw. "Kinako" (getrocknetes Bohnenmehl), das durch Umwandeln des Samens selbst zu feinem Pulver durch ein Hochtemperatur-Mahlverfahren erhalten wird, und aus veredelten Pflanzennahrungsmitteln, die mit Öl bedeckt sind, bspw. Popcorn, extrahiert, ist die Entfettungsbehandlung eine essentielle Vorbehandlung.
• Bei der vorliegenden Erfindung ermöglicht neben der Entfettungsbehandlung als Vorbehandlung, die Gefriertrocknungs-, Hochdruckbehandlung, wie Autoklavieren usw. eines veredelten Nahrungsmittels als Rohmaterial, dass die Präparation der Ziel-DNA effizient durchgeführt wird.
• Die Bedingungen der Gefriertrocknungs- und Hochdruck-Behandlung sind nicht besonders eingeschränkt, und sie können unter gewöhnlichen Bedingungen durchgeführt werden.
• Bei Nahrungsmitteln, deren DNA durch eine Protease und/oder eine Nuclease, die von Fermentations-Mikroorganismen abstammen, zersetzt worden ist, wie fermentierten Sojabohnen und Bohnenpaste, insbesondere fermentierten Sojabohnen, besteht die Möglichkeit, dass die Kontamination der DNA mit einer großen Menge Polysaccharid (Fructan), hergestellt durch Bacillus subtilis (nattoproduzierende Bakterien) die PCR hemmt, so dass vorzugsweise eine Autoklaven-Behandlung zu ihrer Sterilisation und anschließend eine Gefriertrocknungsbehandlung und eine Entfettungsbehandlung durchgeführt werden.
• Nachfolgend wird die DNA-Extraktion aus veredelten Pflanzennahrungsmitteln erläutert.
• Das Extraktionsverfahren umfasst fundamentale DNA-Extraktionsverfahren, wie das vorstehend beschriebene CTAB-Verfahren, SDS-Phenol-Verfahren und das Protease-K-Verfahren. Ein gewünschtes Verfahren lässt sich aus diesen Extraktionsverfahren auswählen und als Extraktionsbedingungen können die in der vorstehenden Literatur beschriebenen verwendet werden.
• Es gibt keine speziellen Bedingungen für diese Extraktionsverfahren, jedoch erfolgt die Phenolbehandlung bei jedem Verfahren häufiger als in der vorstehenden Literatur beschrieben worden ist, um denaturiertes Protein zu beseitigen.
• Bei den der Proteindenaturierungsbehandlung unterworfenen veredelten Pflanzennahrungsmitteln, welche die erfindungsgemäßen Gegenstände sind, kann die durch das vorstehende Extraktionsverfahren erhaltene DNA-Fraktion als solche gelegentlich nicht in einem PCR-Verfahren eingesetzt werden, da sie einen PCR-Inhibitor enthält.
• Bei der Bohnenpaste wird bspw. die DNA durch eine Nuclease, die von Mikroorganismen stammt, die bei dem Fermentationsverfahren eingesetzt werden, in kleinere Moleküle gespalten, (d.h. das Molekulargewicht der DNA wird verringert), und auf dieser Stufe verbleibt die niedermolekulare DNA und verursacht eine Hemmung des PCR-Verfahrens.
• Im Falle der gedämpften/gekochten Sojabohnen erfolgt, da diese einer Hochtemperatur- und Hochdruckbehandlung unterworfen werden, eine DNA-Fragmentierung, so dass die niedermolekularen DNAs entfernt werden müssen.
• Getrocknetes Sojamehl wird hergestellt, indem es zur Desaktivierung von Lectin, Trypsin-Inhibitor usw., die im Sojasamen enthalten sind, und zur gleichzeitigen Verleihung von Duft geröstet und anschließend durch eine mechanische Mahlbehandlung feinpulverisiert wird.
• Beim Durchlaufen dieser Behandlungen werden die Doppelstränge der im getrockneten Sojamehl enthaltenen DNA in kleine Moleküle von der Größe einer Nucleosomeneinheit gespalten, und die DNA, die die Nucleosomen miteinander verknüpft, wird auf eine Größe von mehreren zehn Basenpaaren fragmentiert. Daneben werden während des Feinpulverisierungsverfahrens Proben dann mit Öl beschichtet, wenn die Nucleinsäuren und Proteine in Zellfragmente eingehüllt sind, und daher wird bei Verwendung der Proben als solche in der PCR die Wirkung der Pufferlösung nicht erreicht. Aus diesem Grund müssen die sehr niedermolekularen DNAs und die Ölkomponenten entfernt werden.
• Wenn das als Rohmaterial verwendete Pflanzennahrungsmittel fermentierte Sojabohnen ist, ist es zudem aufgrund der Kontamination mit DNA und Polysaccharid aus B. subtilis (nattoproduzierende Bakterien) wie oben beschrieben in einem hochviskosen Zustand, und die DNA von B. subtilis (nattoproduzierende Bakterien) und die in kleinere Moleküle gespaltene DNA liegen als Gemisch vor, so dass die PCR-Amplifikation erheblich gehemmt wird.
• Folglich wird die DNA, die durch das vorstehende Verfahren extrahiert wird, erfindungsgemäß einer Behandlung durch ein Polyethylenglycol-Fällungsverfahren und/oder einer DNA-Fraktionierungsbehandlung durch ein Polyacrylamid-Gelektrophoreseverfahren unterworfen, so dass DNA mit höherer Reinheit hergestellt wird.
• Die Behandlung durch ein Polyethylenglycol-Fällungsverfahren umfasst eine Reihe von Arbeitsschritten, wie die Zugabe von Polyethylenglycol, gelöst in einem geeigneten Lösungsmittel zu einer DNA-Extraktlösung durch ein herkömmliches Verfahren und Stehenlassen, Durchführung einer Fest-Flüssig-Trennung bspw. durch Zentrifugation, Waschen der abgetrennten Niederschläge, Trocknen, Entfernen des Lösungsmittels usw. Diese Behandlung ergibt gereinigte DNA.
• Die Behandlung mit Polyacrylamidgel kann auf herkömmliche Weise erfolgen. Wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt, wird Rohextrakt-DNA auf ein 2 mm dickes 6,5%iges Polyacrylamidgel aufgetragen und bei 100 V elektrophoretisch aufgetrennt, 10 min lang mit 0,001%igem Ethidiumbromid gefärbt, und dann wird das Gel im Zielbereich unter UV (320 nm) ausgeschnitten und die DNA aus dem Gel extrahiert.
• Durch diese Behandlung können nur DNAs mit kleinen Molekülen (in der Größenordnung von etwa 200 Basenpaaren) verbleiben.
• Die Extraktionsbehandlung, die ein Polyethylenglycol-Fällungsverfahren verwendet, und/oder eine DNA-Fraktionierungsbehandlung durch ein Polyacrylamidgelelektrophoreseverfahren, sind aus den vorstehend genannten Gründen Arbeitsschritte, die dann empfohlen werden, wenn das Ziel Pflanzennahrungsmittel sind, die übrig gebliebene kleinere DNA-Moleküle enthalten, wie Bohnenpaste, gedämpfte/gekochte Sojabohne, getrocknetes Sojamehl und fermentierte Sojabohnen. Insbesondere wenn ein Nahrungsmittel, das in äußerst kleine Moleküle gespaltene DNA und viele Ölkomponenten enthält, wie getrocknetes Sojamehl, als Rohmaterial verwendet wird, ist eine Fraktionierung durch diese Verfahren notwendig. Bei gedämpfter/gekochter Sojabohne müssen niedermolekulare DNAs durch Einsatz eines Polyethylenglycol-Fällungsverfahrens und anschließende Extraktion und Reinigung unter Verwendung eines Polyacrylamidgelelektrophoreseverfahrens entfernt werden.
• Ist das als Rohmaterial verwendete pflanzliche Nahrungsmittel fermentierte Sojabohnen (Natto), wird wünschenswerterweise eine DNA-Fraktionierungsbehandlung durch ein Polyacrylamidgelelektrophoreseverfahren zur leichten und gesicherten Entfernung von Inhibitoren durchgeführt. Wird lediglich die Polyethylenglycolfällung durchgeführt, kann die PCR-Amplifikation gelegentlich erheblich aufgrund des Auftretens eines Hochviskositätszustandes, der durch die von B. subtilis (nattoproduzierende Bakterien) und aufgrund der gemischt vorliegenden DNA von B. subtilis (nattoproduzierende Bakterien) und der niedermolekularen DNA davon, verursacht wird, inhibiert werden.
• In diesem Fall kann bspw. eine semipräparative Gelelektrophorese mit Acrylamid verwendet werden. Dieses Verfahren lässt sich auf fermentierte Sojabohnen und andere veredelte Nahrungsmittel anwenden.
• Vor der DNA-Fraktionierungsbehandlung unter Verwendung eines Polyacrylamidgelelektrophoreseverfahrens kann natürlich der Arbeitsschritt einer Extraktionsbehandlung durch ein Polyethylenglycol-Fällungsverfahren durchgeführt werden.
• Wie in den nachfolgenden Beispielen gezeigt, ermöglicht die Durchführung der DNA-Fraktionierung aus dem Polyacrylamidgel, wenn das Rohmaterial fermentierte Sojabohnen sind, dass die Ziel-DNA erhalten wird, indem Fragmente von 300 bp oder weniger ausgewählt werden und diese gereinigt werden.
• Bei anderen Rohmaterialien als fermentierte Sojabohnen können die Inhibitoren leicht und sicher entfernt werden, indem die Behandlung durchgeführt wird.
• Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Gel nach der vorstehend beschriebenen Behandlung durch ein Polyethylenglycolfällungsverfahren und/oder eine DNA-Fraktionierungsbehandlung durch ein Polyacrylamidgelelektrophoreseverfahren weiter einem Maxam-Gilbert-Verfahren (Maxam, A.M. und Gilbert, W.; A new method for sequencing DNA, Proc. Natl. Acad. Sci 74 (1977) S. 560) oder einem Elektroelutionsverfahren, um eine DNA-Fraktion der Zielgröße aus dem Acrylamidgel zu extrahieren, unterworfen, wodurch die DNA weiter gereinigt wird.
• Für Extraktionsbedingungen wird das Gel bspw. 10 min in 0,001% Ethidiumbromid getaucht, und das Gel des Zielbereichs wird unter UV (320 nm) ausgeschnitten, und wenn danach das Maxam-Gilbert-Verfahren erfolgt, wird es unter den in der vorstehenden Literatur beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Im Fall des Elektroelutionsverfahrens werden dagegen das ausgeschnittene Gel und TE-Pufferlösung in einem Dialyseschlauch untergebracht und es wird 1 Std. lang ein Strom bei 100 V angelegt, und die DNA, die in die Pufferlösung im Schlauch eluiert worden ist, wird gewonnen.
• Ist das Rohmaterial fermentierte Sojabohnen (Natto), wird wünschenswerterweise diese Extraktionsbehandlung durchgeführt. Durch Einsatz dieser Behandlung wird ein Großteil der sehr niedermolekularen DNA und von Fructan entfernt, und DNA, die zur Verwendung als Matrize bei der PCR hinreichend rein ist, lässt sich gewinnen.
• Ob die DNA, die durch die Extraktions- und Reinigungsbehandlung wie vorstehend beschrieben, hergestellt wird, tatsächlich als Matrize für das PCR-Verfahren verwendet werden kann, lässt sich bestimmen, indem Tests durchgeführt werden, bei denen die DNA tatsächlich als Matrize für ein PCR-Verfahren verwendet wird.
• Zur Durchführung dieser Tests haben die Erfinder auf der Basis der Gensequenz von β-Actin der Sojabohne aus einer Datenbank 5 Primer hergestellt, d.h. Act5', Act5'-2, Act5'-3, Act3' und Act3'-2. Die jeweiligen Basensequenzen der Primer sind in den SEQ.-ID.-Nr. 1 bis 5 des Sequenzprotokolls aufgeführt. Unter Verwendung dieser Primer wurde tatsächlich eine PCR, in der die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte DNA eingesetzt wurde, durchgeführt, und als Ergebnis zeigte das Polyacrylamid-Gelelektrophoresebild wie in späteren Beispielen gezeigt jeweils ein einzelnes PCR-Produkt (2). Dieses Produkt wurde in den pTA-Vektor (hergestellt von Invitrogen) subkloniert, um die Basensequenz zu bestimmen, wobei sich ergab, dass diese mit der β-Actin-Sequenz identisch war.
• Dieses Ergebnis zeigt, dass die erfindungsgemäß hergestellte DNA sich als Matrizen-DNA für eine PCR-Reaktion eignet.
• Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Bewertung eines rekombinanten Gens, das sich in Pflanzennahrung befindet, verwendet werden.
• Nachstehend wird das Verfahren zum Nachweis rekombinanter Gene erläutert, wobei als Beispiel eine von Agrobacterium abstammende 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase [EPSPS] (Padgett, S. R. et al.; Development, identification and characterization of a glyphosate-tolerant soybean live, Crop. Sci., (1995) 1451-1461) verwendet wurde, die der Hauptteil eines Herbizidresistenzgens in einer herbizidresistenten Sojarekombi nante, einem typischen Beispiel für rekombinante Pflanzen, die praktische Verwendung gefunden haben, ist.
• Zuerst werden zur Klonierung des in einer rekombinanten Sojabohne befindlichen rekombinanten Gens Primer für den 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus bzw. den NOS-(Nopalinsynthetase)-Terminator hergestellt. Dann erfolgt ein PCR-Verfahren mit einer aus rekombinanter Sojabohne gewonnenen DNA als Matrize und deren Primer. Das Produkt wird in pTA-Vektor (hergestellt von Invitrogen) subkloniert und sequenziert.
• Auf der Basis der Nucleinsäuresequenz des klonierten rekombinanten Gens wird ein Primer zum Nachweis von Sojabohnensamen konstruiert.
• Die Erfinder haben aus den klonierten rekombinanten Genen 4 Primer hergestellt, die der vorstehenden EPSPS, Hauptteil des Herbizidresistenzgens, entsprechen, d.h. EPSPS5'-1, EPSPS5'-2, EPSPS3'-1 und EPSPS3'-2. Die Basensequenzen dieser Primer sind wie in SEQ.-ID.-Nr. 6 bis 9 im Sequenzprotokoll gezeigt.
• Unter Verwendung der vorstehenden Primer EPSPS5'-1 und EPSPS3'-1 als Primer zum Nachweis rekombinanter Gene und mit Act5' und Act3', den Primern für Sojabohne-β-Actin, als Primer zur Bewertung, ob die PCR-Amplifikation selbst gut verläuft, wird ein gewöhnliches PCR-Verfahren (Einzelschritt) unter Verwendung einer DNA, die aus rekombinanten Sojasamen durch das erfindungsgemäße Verfahren präpariert worden ist, als Matrize, durchgeführt. In diesem Fall ist der Nachweis möglich, wenn der Anteil der Sojabohnenrekombinante 0,1% (1/1000) beträgt.
• Die PCR kann unter den Bedingungen von 1 Zyklus bei 96°C-48 sec, 66°C-48 sec und 72°C-1 min, dann 32 Zyklen bei 94°C-48 sec, 66°C-48 sec und 72°C-1 min und dann 72°C-8 min durchgeführt werden.
• Die Durchführung einer Zweischritt-PCR unter Verwendung einer Primer-Kombination EPSPS5'-1 und EPSPS3'-1 und einer Kombination von EPSPS5'-2 und EPSPS3'-2 (die PCR-Bedingungen sind für jeden Schritt die gleichen wie beim vorstehenden Einschritt-Verfahren) ermöglicht den Nachweis rekombinanter Gene bei einer hohen Empfindlichkeit von 0,0001% (1/1 000 000). Diese Ergebnisse sind eingehend im späteren Testbeispiel 2 gezeigt.
• Die Bewertung von rekombinanten Genen in veredelten Nahrungsmitteln aus Sojabohnensamen usw. als Rohmaterial kann folgendermaßen durchgeführt werden.
• Bei dieser Bewertung können die von den Erfindern hergestellten Primer NOS5'-1 und NOS3'-1 zwischen der 3'-Stelle des EPSPS-Gens und dem Gen für den NOS-(Nopalinsynthetase)-Terminator, das sich stromabwärts davon befindet, verwendet werden. Die Basensequenzen der Primer sind in SEQ.-ID.-Nr. 10 bzw. 11 im Sequenzprotokoll aufgeführt.
• Die Durchführung der PCR mit durch das erfindungsgemäße Verfahren extrahierter DNA als Matrize und NOS5'-1 und NOS3'-1 als Primer ermöglicht den Nachweis rekombinanter Gene in veredelten Nahrungsmitteln, die Sojabohne als Rohmaterial nutzen.
• Als PCR-Bedingungen sind übliche Bedingungen, bspw. 1 Zyklus bei 96°C-48 sec, 66°C-48 sec und 72°C-1 min, dann 40 Zyklen bei 94°C-48 sec, 66°C-48 sec und 72°C-1 min und dann 72°C-8 min wirksam.
• Der Grund zur Verwendung der vorstehenden Primer ist, dass sich insbesondere wenn rekombinante Gene aus fermentierten Sojabohnen nachgewiesen werden, das PCR-Produkt, von dem man annimmt, dass es auf dem EPSPS-Gen beruht, das aus B. subtilis (nattoproduzierende Bakterien) stammt, durch die vorstehenden Primer und Primern an anderen Stellen nachweisen lässt.
• Die Verwendung der durch das erfindungsgemäße Verfahren aus Pflanzennahrungsmitteln präparierten DNA als Matrize ermöglicht die Bewertung, ob rekombinante Gene zugegen sind oder nicht.
• Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird bei der Extraktion von DNA aus Pflanzennahrungsmitteln, die einer Proteindenaturierungsbehandlung unterworfen worden sind, die Entfettung bei Bedarf als Vorbehandlung durchgeführt, und weiterhin werden eine Behandlung durch ein Polyethylenglycolfällungsverfahren und/oder eine DNA-Fraktionierungsbehandlung durch ein Polyacrylamidgelelektrophoreseverfahren und anschließende DNA-Extraktion durch das Maxam-Gilbert-Verfahren oder einem Elektroelutionsverfahren in Kombination durchgeführt, was die Extraktion und Präparation hochwertiger DNA ermöglicht, so dass ein geeigneter Primer für die Verwendung in einem PCR-Verfahren aus der DNA konstruiert werden kann.
• Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich ebenfalls auf getrocknetes Sojamehl, das einer Hochtemperatur- und einer mechanischen Mahlbehandlung unterworfen worden ist, gedämpfte/gekochte Sojabohnen, die einer Hochdruckbehandlung unterworfen worden sind, und Bohnenpaste und fermentierte Sojabohnen, die jeweils Fermentationsschritten unterworfen worden sind, anwenden. Insbesondere das Verfahren zur Extraktion und Präparation hochreiner DNA aus fermentierten Sojabohnen wurde noch nicht vorgestellt und ist erstmalig durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt worden.
• Durch Auswahl von Nahrungsmitteln, die von rekombinanten Feldfrüchten abstammen, als Gegenstand, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren den Nachweis rekombinanter Gene aus der erhaltenen hochreinen DNA.
• In Bezug auf die Empfindlichkeit des Nachweises rekombinanter Gene ist eine herkömmliche Empfindlichkeit von 0,1% rekombinanter Sojabohnen-Beimischung sichergestellt. Überdies vergrößert eine 2-Stufen-PCR die Empfindlichkeit um den Faktor 1000.
• Werden als Rohmaterial fermentierte Sojabohnen verwendet, ermöglichen wie vorstehend beschrieben nach den Arbeitsgängen der DNA-Extraktion, der Fraktionierung der DNA aus Polyacrylamidgel und Extraktion der DNA durch das Maxam-Gilbert-Verfahren oder Elektroelutionsverfahren anschließend dazu die Präparation von DNA, die sich zur PCR-Amplifikation verwenden lässt, so dass das erfindungsgemäße Verfahren eine signifikante praktische Bedeutung hat.
• Zudem besteht eine Eigenschaft der Erfindung darin, dass auch eine Kombination von Primern, die keine nicht-spezifische Bande induziert, konstruiert werden kann, was eine signifikante Auswirkung hat.
• Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren zur Extraktion von DNA, deren Reinheit zur Verwendung als Matrizen-DNA in einem PCR-Verfahren ausreicht, aus veredelten Nahrungsmitteln, die ölhaltige Samen als Material verwenden, fertiggestellt. Dieses Verfahren eignet sich auch zur Herstellung einer Matrizen-DNA, die es ermöglicht, ein PCR-Verfahren für veredelte Nahrungsmittel durchzuführen, die andere essbare Pflanzenteile als Samen verwenden, wie Kartoffelchips.
• Das erfindungsgemäße Verfahren kann überdies zur Herstellung einer Matrizen-DNA verwendet werden, die sich in einem PCR-Verfahren für Nahrungsmittel einsetzen lässt, die aus Tieren stammen, wie Zuchtvieh, wobei die Nahrungsmittel durch Hochtemperatur- und Hochdruckbehandlung veredelt worden sind.
• Die vorliegende Erfindung wird nachstehend eingehend anhand von Beispielen beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
• Herstellungsbeispiel 1
• Herstellung von Bohnensprossen, gedämpften/gekochten Sojabohnen, Sojaquark, gebratenen Sojaquarkstücken und fermentierten Sojabohnen (Natto) als Proben Unter Verwendung von lediglich rekombinanten Sojasamen oder eines Gemischs, das 10% nicht-rekombinante Sojasamen enthielt, wurden Bohnensprossen, gedämpfte/gekochte Sojabohnen, Sojaquark, gebratene Sojaquarkstücke und fermentierte Sojabohnen durch die nachstehenden Verfahren hergestellt.
• Bohnensprossen
• In einem großen nichtrostenden Bottich wurden 3 mit Wasser befeuchtete Gazetücher aufeinander ausgelegt. Sojasamen wurden auf der feuchten Gaze ausgesät, mit Aluminiumfolie vor Lichteinfall geschützt und 7 Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur gezüchtet, wobei das Wasser täglich ausgetauscht wurde. Die entstandenen Keime wurden gesammelt, so dass Proben erhalten wurden.
• Gedämpfte/gekochte Sojabohnen
• Sojasamen ließ man über Nacht bei Raumtemperatur Wasser absorbieren, und sie wurden dann einer Autoklaven-Behandlung unterworfen (121°C, 60 min), so dass gedämpfte/gekochte Sojabohnen erhalten wurden.
• Sojaquark und gebratene Sojaquarkstücke
• Sojasamen ließ man über Nacht bei niedriger Temperatur (etwa 18°C) Wasser absorbieren, und sie wurden dann in einem Mixer zerkleinert und unter Zugabe von Wasser weiter gemahlen. Nach dem Erhitzen auf etwa 95°C wurde dies durch einen Trichter, in dem sich ein gebleichtes Baumwolltuch befand, filtriert, so dass Tonyu (Sojamilch) erhalten wurde. Der auf dem gebleichten Baumwolltuch verbliebene Kuchen wurde zur Gewinnung einer weiteren Portion Sojamilch gepresst.
• Die Sojamilchportionen wurden vereinigt und in fließendem Wasser unter Rühren gekühlt. Anschließend wurde ein Koagulans hinzugefügt und das Gemisch erhitzt, so dass es koagulierte, und erneut in fließendem Wasser gekühlt, um Sojaquark herzustellen.
• Gebratene Sojaquarkstücke wurden hergestellt, indem der so hergestellte Sojaquark geschnitten und die Stücke anschließend in einem Speiseöl gebraten wurden.
• Fermentierte Sojabohnen
• Sojasamen ließ man einen Tag lang bei Raumtemperatur Wasser absorbieren, und sie wurden dann einer Autoklavenbehandlung (121°C, 60 min) unterworfen, um sie zu dämpfen/kochen. Auf die gedämpten/gekochten Sojabohnen wurde Bacillus subtilis (nattoproduzierende Bakterien) gesprüht, und man ließ sie etwa 1 Tag bei 4°C fermentieren, so dass fermentierte Sojabohnen erhalten wurden.
• Getrocknetes Sojamehl und Bohnenpaste.
• Es wurden jeweils kommerzielle Produkte verwendet.
• Die konzentrationsangaben "mM" und "μM" beziehen sich auf mMol/l bzw. μMol/l.
• Beispiel 1
• DNA-Extraktion (durch das SDS-Phenol-Verfahren) aus Sojasamen, Sojasprossen, gedämpften/gekochten Sojabohnen, Sojaquark, gebratenen Sojaquarkstücken, getrocknetem Sojamehl und Bohnenpaste
• Für Sojasamen, getrocknetes Sojamehl und Bohnenpaste wurden als Proben kommerzielle Produkte verwendet. Für Sojasprossen, gedämpfte/gekochte Sojabohnen, Sojaquark und gebratene Sojaquarkstücke wurden die in Herstellungsbeispiel 1 oben erhaltenen Proben verwendet.
• Jede Probe (ausgenommen die Sojasamen und Sojasprossen) wurde in flüssigem Stickstoff gefroren und dann in einem Gefriertrockner getrocknet. Anschließend wurde die Probe in einem Mörser zur Herstellung eines feinen Pulvers gemahlen. Diese Probe wurde bei 65°C in einem Soxhlet-Extraktor mit Diethylether entfettet. Die DNA-Extraktion wurde mit der entfetteten Probe durchgeführt.
• Die entfettete Probe (20 g) wurde nach Zugabe von 25 ml Extraktions-Pufferlösung (100 mM Tris-HCl-Pufferlösung, pH-Wert 8,8, die 50 mM EDTA, 500 mM Natriumchlorid und 10 mM β-Mercaptoethanol enthielt) homogenisiert, und 2,5 ml 10% SDS wurden zum Homogenat gegeben und 15 min bei 65°C inkubiert.
• Dann wurde Kaliumacetat in einer Endkonzentration von 1 M dazu gegeben, und das Gemisch wurde 30 min auf Eis stehen gelassen. Danach wurde das Gemisch unter den Bedingungen 10000 × g, 10 min und 4°C zentrifugiert, so dass ein Überstand erhalten wurde. Der Überstand wurde mit Phenol, das mit einer äquivalenten Menge TE (10 mM Tris-HCl-Pufferlösung, pH-Wert 8,0, die 1 mM EDTA, pH-Wert 8,0 enthielt) gesättigt war, versetzt, gemischt und dann unter den gleichen Bedingungen wie oben zentrifugiert, so dass eine Wasserschicht erhalten wurde. Der Extraktionsschritt mit Phenol wurde dreimal wiederholt.
• Anschließend wurden ähnliche Arbeitsschritte durchgeführt, wobei Phenol durch Diethylether ersetzt wurde, und das in der Wasserschicht gelöste Phenol mit Ether extrahiert wurde.
• Die Wasserschicht nach der Extraktion mit Ether wurde mit 0,6 Volumen Isopropylalkohol versetzt, und das Gemisch ließ man 20 min bei Raumtemperatur stehen. Anschließend wurde es unter den Bedingungen 10000 × g, 10 min und 4°C zentrifugiert, so dass Niederschläge erhalten wurden. Die Niederschläge wurden mit 70% (Vol./Vol) Ethanol gewaschen, getrocknet und von Ethanol befreit und dann in 5 ml TE gelöst.
• Zur Lösung wurde RNase A in einer Endkonzentration von 0,05 mg/ml gegeben, und das Gemisch wurde 1 Std. bei 37°C inkubiert, um die RNA in der Probe abzubauen. Danach wurden ähnlich wie oben die Extraktionsschritte mit Phenol und die Extraktionsschritte mit Ether durchgeführt.
• Im Fall der Sojasamen, Sojasprossen, Sojaquark und gebratenen Sojaquarkstücke, wurden Proben der so erhaltenen DNA-Fraktionen in der PCR verwendet.
• Für die Proben der gedämpften/gekochten Sojabohnen, des getrockneten Sojamehls und der Bohnenpaste wurde zu der durch das vorstehende Verfahren erhaltenen Wasserschicht 20%iges (Gew./Vol.) Polyethylenglycol-6000 (PEG-6000), gelöst in einer 0,6fachen Menge einer 2,5 M Natriumchloridlösung, gegeben, und das Gemisch wurde mindestens 1 Std. lang auf Eis stehen gelassen. Anschließend wurde das Gemisch unter den Bedingungen 10000 × g, 10 min und 4°C zentrifugiert, um Niederschläge zu erhalten.
• Die Niederschläge wurden mit 70%igem (Vol./Vol.) Ethanol gewaschen, getrocknet und von Ethanol befreit und dann in 1 ml sterilem Wasser gelöst, so dass eine DNA-Lösung erhalten wurde. Für die gedämpften/gekochten Sojabohnen wurde ebenfalls die Fraktionierung der DNA-Länge durch Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt.
• Beispiel 2
• Extraktion von DNA aus fermentierten Sojabohnen
• Zur Sterilisation von B. subtilis (nattoproduzierende Bakterien) erfolgte eine Hitzesterilisationsbehandlung unter den Bedingungen 121°C und 60 min. Anschließend wurde versucht, die DNA gemäß dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 1 zu extrahieren.
• Die erhaltene DNA-Lösung war jedoch hochviskos, und zudem waren Polysaccharide und dergleichen, sezerniert von B. subtilis (nattoproduzierende Bakterien) in großen Mengen enthalten, so dass keine für die PCR-Reaktion geeignete DNA erhalten werden konnte.
• Daher wurde versucht, die Polysaccharide usw. aus der vorstehenden DNA-Lösung mittels Polyacrylamidgelelektrophoreseverfahren zu entfernen.
• Als Ergebnis der Durchführung des Polyacrylamidgelelektrophoreseverfahrens wurden eine aus B. subtilis (nattoproduzierende Bakterien) stammende hochmolekulare DNA und aus Sojabohne stammende vermutlich abgebaute niedermolekulare DNAs – wenn auch nur in geringen Mengen – beobachtet (vgl. Spur 9 in 1). Die Fraktionierung der DNA-Länge erfolgte daher mittels Polyacrylamidgel. Die Fraktionierung der DNA aus fermentierten Sojabohnen wurde durchgeführt, indem die Probe in drei Fraktionen unterteilt wurde, und zwar von 600 bp oder mehr (fermentierte Sojabohne I), von 300 bp bis 600 bp (fermentierte Sojabohne II) und 300 bp oder weniger (fermentierte Sojabohne III).
• Dies bedeutet, dass ein 450 μg-Äquivalent der Proben-DNA, die erhalten wurde, indem die Polyethylenglycolfällung auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt wurde, auf ein 2 mm dickes 6,5%iges Polyacrylamidgel aufgetragen wurde und die Elektrophorese bei 100 V durchgeführt wurde. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Ethidiumbromid gefärbt und dann in drei Fraktionen unterteilt, und zwar von 600 bp oder mehr (fermentierte Sojabohne I), von 300 bp bis 600 bp (fermentierte Sojabohne II) und 300 bp oder weniger (fermentierte Sojabohne III), die aus dem Polyacrylamidgel ausgeschnitten wurden.
• Zur Gewinnung der DNA aus den ausgeschnittenen Gelen wurde die Extraktion der DNA auf der Basis des Maxam-Gilbert-Verfahrens durchgeführt. D.h. die ausgeschnittenen Gele wurden mit einem sterilen Glasstab zerkleinert, bis eine Paste erhalten wurde. Dann wurden 0,2 ml Extraktions-Pufferlösung (0,5 M Ammoniumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 2,5 mM EDTA, 0,1% SDS) hinzu gefügt und etwa 30 sec mit einem Vortexmischer intensiv gemischt. Das Gemisch wurde anschließend unter den Bedingungen 15000 × g, 10 min und 4°C zentrifugiert, so dass ein Überstand erhalten wurde. Dieser Extraktionsschritt wurde zweimal wiederholt, um die DNA aus dem Gel zu extrahieren.
• Nach Beendigung des Extraktionsschrittes wurden die Extrakte vereinigt, und die Extraktion mit Ether erfolgte nach der Extraktion mit Phenol auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1. Zur Wasserschicht nach der Extraktion wurden 2 Volumina Ethanol gegeben, und das Gemisch wurde 30 min bei –20°C gekühlt, gefolgt von Zentrifugation unter den Bedingungen 15000 × g, 15 min und 4°C, so dass Niederschläge erhalten wurden.
• Nach dem Waschen mit 70%igem (Vol./Vol.) Ethanol wurden die Niederschläge getrocknet und dann in 30 ml sterilem Wasser gelöst, so dass gereinigte DNA erhalten wurde. Als alternatives Verfahren können die auf die Phenolextraktion folgenden Arbeitsschritte nach der Durchführung des vorstehenden Elektroelutionsverfahrens usw. anstelle des Maxam-Gilbert-Verfahrens durchgeführt werden.
• Die aus der Fraktion von 300 bp oder weniger (fermentierte Sojabohne III) extrahierte DNA wurde einem Elektrophoresetest unterworfen, und eine schwache Bande wurde beobachtet (vgl. Spur 8 in 1).
• Testbeispiel 1
• Es wurde untersucht, ob eine PCR möglich ist, in der sich DNAs, extrahiert aus Sojasamen, Sojasprossen, gedämpften/gekochten Sojabohnen, Sojaquark, gebratenen Sojaquarkstücken, getrocknetem Sojamehl und Bohnenpaste als Matrize verwenden lassen.
• Die PCR erfolgte mittels Soja-β-Actin-Primern (Act5'-2 (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 2 im Sequenzprotokoll) und Act3' (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 4 im Sequenzprotokoll); 0,05 μM) unter den Bedingungen 1 Zyklus 96°C-48 sec, 66°C-48 sec und 72°C-1 min, dann 32 Zyklen 94°C-48 sec., 66°C-48 sec und 72°C-1 min, und dann 72°C-8 min.
• Als Ergebnis wurden wie in 2 gezeigt für alle DNA-Proben Banden bestätigt.
• Bei Durchführung einer 2-Stufen-PCR (erste PCR: Primer Act5'-2 (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 2 im Sequenzprotokoll), Act3' (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 4 im Sequenzprotokoll); 0,05 μM, die PCR-Bedingungen waren die gleichen wie oben, zweite PCR: Primer Act5'-3 (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 3 im Sequenzprotokoll), Act3'-2 (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 5 im Sequenzprotokoll); 0,05 μM, die PCR-Bedingungen waren die gleichen wie oben), wurden Banden für sämtliche DNA-Proben bestätigt. Bei fermentierten Sojabohnen war das PCR-Verfahren nur mit der DNA möglich, die aus der Fraktion von 300 bp oder weniger (fermentiertes Soja III) erhalten wurde.
• Hieraus wurde gefunden, dass das PCR-Verfahren unter Verwendung der durch eine Reihe von Arbeitsschritten in Herstellungsbeispiel 1 aus gedämpften/gekochten Sojabohnen, fermentierten Sojabohnen, getrocknetem Sojamehl und Bohnenpaste extrahierten DNA möglich ist, wie im Falle der DNA, die aus den Rohmaterialien extrahiert wurde, die keiner Proteindenaturierungsbehandlung unterworfen wurden, wie Sojasamen und Sojasprossen.
• Es ist insbesondere sehr interessant, dass DNA, die sich zum Nachweis in einem PCR-Verfahren einsetzen lässt, aus getrocknetem Sojamehl, das einer Hochtemperaturbehandlung und einer mechanischen Mahlbehandlung unterworfen worden ist, und aus fermentierten Sojabohnen, Bohnenpaste usw., die einem Fermentationsverfahren unterworfen worden sind, präparieren lässt.
• Testbeispiel 2
• Nachweis rekombinanter Gene
• Unter Verwendung von 100 ng DNA, extrahiert aus genetisch rekombinierten Sojabohnensamen, wurde die Nachweisgrenze eines PCR-Verfahrens untersucht.
• Die Primer für die 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthase (EPSPS) (EPSPS5'-1 (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 6 im Sequenzprotokoll), EPSPS3'-1 (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 8 im Sequenzprotokoll); 0,1 μM) wurden hergestellt.
• Als Primer für das -β-Actingen der Sojabohne, das zur Untersuchung verwendet wurde, ob die PCR-Reaktion glatt verläuft, wurde ein Primerpaar (Act5' (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 1 im Sequenzprotokoll), Act3' (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 4 im Sequenzprotokoll); 0,05 μM) verwendet.
• Unter Verwendung dieser 4 Primerarten und der aus den rekombinanten Sojabohnensamen extrahierten und in Testbeispiel 1 präparierten DNA als Matrize, wurde eine PCR zum Nachweis rekombinanter Gene durchgeführt.
• Die PCR-Bedingungen waren die gleichen wie in Testbeispiel 1 (1 Zyklus 96°C-48 sec, 66°C-48 sec. und 72°C-1 min, dann 32 Zyklen 94°C-48 sec, 66°C-48 sec und 72°C-1 min und dann 72°C-8 min.
• Demzufolge war der Nachweis sogar mit der Probe möglich, deren Anteil an rekombinanten Sojabohnen 0,1% (1/1000) betrug.
• Überdies wurde eine 2-Stufen-PCR (erste PCR: Primer EPSPS5'-1 (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 6 im Sequenzprotokoll), EPSPS3'-1 (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 8 im Sequenzprotokoll); 0,1 μM, die PCR-Bedingungen waren die gleichen wie vorstehend, zweite PCR: Primer EPSPS5'-2 (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 7 im Sequenzprotokoll), EPSPS3'-2 (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 9 im Sequenzprotokoll); 0,1 μM, die PCR-Bedingungen waren die gleichen wie vorstehend) durchgeführt.
• Demzufolge war der Nachweis sogar mit der Probe möglich, deren Anteil an rekombinanten Sojabohnen 0,0001% (1/1 000 000) betrug, und es wurde gezeigt, dass der Nachweis mit hoher Empfindlichkeit möglich war.
• Aus den Ergebnissen geht hervor, dass sich das erfindungsgemäße DNA-Extraktionsverfahren und die DNA, die sich durch dieses Verfahren herstellen lässt, zum Nachweisen rekombinanter Gene mit einem PCR-Verfahren sehr eignen.
• Testbeispiel 3
• Anschließend wurde mit der aus Sojasprossen, gedämpften/gekochten Sojabohnen, Sojaquark, gebratenen Sojaquarkstücken und fermentierten Sojabohnen – die sämtlich aus rekombinanten Sojabohnen hergestellt worden waren – extrahierten und präparierten DNA rekombinante Gene nachgewiesen. Für das getrocknete Sojamehl und die Bohnenpaste wurden kommerzielle Produkte verwendet, und somit existierte weder eine negative noch eine positive Kontrolle, so dass der Nachweis der rekombinanten Gene nicht durchgeführt wurde.
• Als Primer wurden NOSS'-1 (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 10 im Sequenzprotokoll) und NOS3'-1 (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 11 im Sequenzprotokoll) zwischen der 3'-Stelle des EPSPS-Gens und dem Gen für den NOS-(Nopalinsynthetase)-Terminator, der sich stromabwärts davon befindet, konstruiert.
• Unter Verwendung von jeweils 0,1 μM Primer und der DNA, die aus den vorstehenden Nahrungsmitteln extrahiert worden war, als Matrize, wurde ein PCR-Verfahren durchgeführt. Die PCR-Bedingungen waren 1 Zyklus 96°C-48 sec, 66°C-48 sec und 72°C-1 min, dann 50 Zyklen 94°C-48 sec, 66°C-48 sec und 72°C-1 min und dann 72°C-8 min.
• Als Primer für das β-Actingen der Sojabohne, das zur Bewertung, ob das PCR-Verfahren glatt verläuft, verwendet wurde, wurde ein Primerpaar (Act5' (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 1 im Sequenzprotokoll), Act3' (vgl. SEQ.-ID.-Nr. 4 im Sequenzprotokoll); 0,05 μM) verwendet.
• Demzufolge konnten die rekombinanten Gene, wie auf der rechten Seite in 3 gezeigt, mit der DNA, die durch das erfindungsgemäße Verfahren aus gedämpften/gekochten Sojabohnen, Sojaquark, gebratenen Sojaquarkstücken und fermentierten Sojabohnen – die alle aus rekombinanten Sojabohnen als Rohmaterial hergestellt worden waren – extrahiert und präpariert worden war, in einer Menge nachgewiesen werden, die derjenigen Menge entsprach, die im Fall der rekombinanten Sojasamen und rekombinanten Sojasprossen erhalten wurde.
• Von diesen wurde insbesondere der Nachweis der rekombinanten Gene aus fermentierten Sojabohnen noch nicht beschrieben.
• Sequenzprotokoll

  
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Claims (3)

1. Verfahren zur Präparation einer Matrizen-DNA aus einem veredelten Pflanzennahrungsmittel, welches einer Proteindenaturierungsbehandlung unterzogen wurde, umfassend die Schritte: (a) Durchführen einer Entfettungsbehandlung des veredelten Nahrungsmittels; (b) Extrahieren einer rohen DNA-Fraktion aus dem veredelten Pflanzennahrungsmittel; und ( c) Durchführen einer DNA-Fraktionierungsbehandlung der rohen DNA-Fraktion durch ein Polyethylenglycol-Fällungsverfahren und/oder ein Polyacrylamidgelelektrophoreseverfahren.
2. Verfahren zum Nachweisen eines Pflanzengens in einem veredelten Pflanzennahrungsmittel, das aus einer Pflanze abstammt, durch ein PCR-Verfahren, wobei die durch das Verfahren nach Anspruch 1 erhaltene Matrizen-DNA verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das veredelte Pflanzennahrungsmittel ein ölhaltiger Samen ist.