-
Beschreibung
-
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Feststellung induzierter
Signale.
-
Es kann erforderlich sein, induzierte Signale festzustellen, um hieraus
Rückschlüsse auf die Substanz zu ziehen, die die induzierten Signale abgibt.
-
Durch die Erfindung soll nun eine Vorrichtung geschaffen werden, mit
der in sicherer und einfacher Weise diese induzierten Signale gemessen werden können.
-
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß eine Oberfläche
zur Aufnahme einer Probe vorgesehen ist, Einrichtungen zur Erzeugung von Erregungssignalen
und Einrichtungen, mit denen diese Erregungssignale auf die Probe errichtet werden1
Einrichtungen, die diese Oberfläche beeinflussen, um die Erregungssignale, die die
Erregung bewirkt haben, von der Mengenmeßeinrichtung fortzulenken und Einrichtungen
zur Messung der Menge der von der Probe abgegebenen induzierten Signale.
-
Mit besonderem Vorteil wird hierdurch sichergestellt, daß die Erregungssignale
das Meßergebnis nicht verfälschen können.
-
Mit besonderem Vorteil kann die Oberfläche durch ein hochreflektierendes
Substrat gebildet werden, sowie die Erregungssignale Photone aufweisen und die induzierten
Signale Photone aufweisen. Dabei kann insbesondere mit Vorteil das hochreflektierende
Substrat ein metallbeschichtetes Substrat sein, die Einrichtungen zur Erzeugung
der Erregungssignale eine Lichtquelle und Wellenlängenauswahleinrichtungen aufweisen,
die Einrichtung zur Ablenkung des Erregungssignals von der Mengenmeßeinrichtung
das metallbedeckte Substrat
und eine Photonenzelle aufweisen und
die Einrichtungen zur Messung der Menge der induzierten Signale eine Wellenlängenauswahleinrichtung
und ein Photonenzählsystem aufweisen.
-
Mit dieser Vorrichtung soll in vorteilhafter Weise beispielsweise
wie folgt gearbeitet werden.
-
An ein eine metallische Oberflächenschicht aufweisendes Substrat wird
zunächst eine Schicht aus bekannten biologischen Teilchen absorbiert. Dieses aktive
Substrat wird dann in eine Lösung eingetaucht, die eine unbekannte Menge an zweiten
biologischen Teilchen, die die erste Art von Teilchen, die in ungeordneter Verteilung
in der Schicht anwesend sind, binden, enthalten. Auf dieses Substrat wird dann eine
dritte Art biologischer Teilchen, gebunden an ein anregbares Mittel, von dem ein
induziertes Signal erzeugt werden kann, aufgebracht, und dieses Substrat wird dann
in eine Vorrichtung eingebracht, die eine Quelle für induzierte Signale anregende
Teilchen sowie ein Photonenzählsystem zum Messen der Menge an induziertem Signal
aufweist. Das die Metallschicht aufweisende Substrat lenkt die anregenden Teilchen
auf eine Falle, so daß weniger anregende Teilchen auf das Photonenzählsystem gelangen,
während das induzierte Signal auf das Photonenzählsystem gelenkt wird und eine größere
Menge an induziertem Signal gemessen wird.
-
Insbesondere kann mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine immunologische
Untersuchung vorgenommen werden.
-
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, daß das Erregungssignal nach
dem Auftreffen auf das Substrat zur Photonen zelle reflektiert wird.
-
Dabei kann die Wellenlängenauswahlvorrichtung der Einrichtung zur
Messung der induzierten Signale zwei Schmalband-Interferenzfilter mit ähnlicher
Spitzenwellenlänge aufweisen.
-
Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Oberfläche eine leitende Oberfläche
ist, das Erregungssignal Elektronen aufweist, das induzierte Signal Photonen aufweist
und die Oberfläche zum Einfangen der Elektronen positiv aufgeladen ist.
-
Ausführungsbeispiele der Erfindung sollen in der folgenden Beschreibung
unter Bezugnahme auf die Figuren der Zeichnung erläutert werden. In den Zeichnungen
ist Fig. 1 ein Schnitt durch ein in der Vorrichtung verwendetes Präparat mit einem
Substrat mit einer in der monomolekularen Proteinschicht gebundenen zweiten Art
biologischer Teilchen, Fig. 2 ein Schnitt durch ein Präparat mit an die zweiten
biologischen Teilchen gebundenen dritten biologischen Teilchen, Fig.3A eine Ansicht
einer Ausführungsform der Vorrichtung zur Uberprüfung des fertigen Substrats, ein
Photonenzählsystem befindet sich in einem Abstand von dem Substrat, damit die anregenden
Teilchen von der Metalloberfläche gegen das dunkle Gehäuse reflektiert werden, so
daß alle darauf auftreffenden Photonen absorbiert werden, während zufolge dieser
Reflexion ein verstärktes induziertes Signal vom Substrat zum Photonenzählsystem
laufen kann,
Fig. 3B eine perspektivische Ansicht eines Teiles der
Vorrichtung von Fig. 3A. Hier ist eine Elektronenkanone 31 gezeigt. Das Substrat
30 wird mittels einer Metallbürste 33 positiv aufgeladen und auf konstanter Spannung
gehalten. In Fig. 3B sind nur die Kontaktteile von Bürste 33 und Oberfläche 30 im
Detail gezeigt. Die Rückwand des dunklen Aufnahmekastens 35 weist ein Loch 34 auf,
durch das Licht auf die Metalloberfläche 30' gerichtet werden kann.
-
Fig. 4 ist ein Schnitt durch das Präparat von Fig. 2, der eine vierte
Art biologischer Teilchen an die zweite Art, die wiederum an die erste Art gebunden
ist, gebunden zeigt.
-
Fig. 5 ist ein Schnitt durch das Präparat von Fig. 1, das die dritte
Art biologischer Teilchen an die erste Art gebunden zeigt.
-
Nachdem einige biologische Teilchen von Interesse (2. biologisches
Teilchen) an die erste Schicht aus Protein gebunden sind, hat das Substrat den in
Fig. 1 gezeigten Aufbau aus dem eigentlichen Substrat 10, der Metalloberflächenschicht
11, den ersten biologischen Teilchen 12 und den zweiten biologischen Teilchen 13.
Ein biologisches Teilchen, wahrscheinlich der Antikörper des zweiten biologischen
Teilchens, wird mit einem fluoreszierenden Farbstoff verbunden.
-
Ein Tropfen einer Lösung dieses fluoreszierenden Antikörpers (drittes
biologisches Teilchen) wird auf das Substrat, das bereits das zweite biologische
Teilchen aufweist, wie in Fig. 1 gezeigt, aufgebracht. Dann wird das Substrat vorzugsweise
so lange in einer Feuchtigkeitskammer gehalten, daß der fluoreszierende Antikörper
mit dem zweiten biologischen
Teilchen reagiert. Nach der Reaktion
hat das Substrat den in Fig. 2 gezeigten Aufbau. Die Menge an gebundenem fluoreszierenden
Antikörper 14 ist proportional der Menge an dem auf dem Substrat 30 anwesenden zweiten
biologischen Teilchen. Das Präparat mit dem in Fig. 3 gezeigten Aufbau wird in ein
geschlossenes Gehäuse mit einer Lichtquelle 31, die dem Induzieren einer Fluoreszenzemission
von dem Substrat 30 dient, eingebracht. Das Photon von der Lichtquelle 31 wird nach
Auftreffen auf dem Substrat 30, das eine reflektierende metallische Oberfläche hat,
gegen die Wand des Gehäuses reflektiert und von ihr eingefangen, während das induzierte
Signal von dem Photonenzählsystem 32, das der Messung der Quantität dieser Fluoreszenzemission
dient, angezeigt wird. Da eine konstante Lichtquelle verwendet wird, ist das am
Photonenzählsystem 32 angezeigte Signal proportional der Menge an fluoreszierendem
Antikörper 14 an dem Substrat. Daher ist es bei Anwendung der Vorrichtung gemäß
der Erfindung nicht notwendig, daß die biologischen Teilchen, damit sie bestimmt
werden können, eine Schicht bilden. Die zweiten biologischen Teilchen werden an
die erste oder Proteinschicht gebunden. Da die zweiten biologischen Teilchen keine
Schicht bilden müssen, müssen diese ersten biologischen Teilchen nicht die ganze
Schicht einnehmen. Daher braucht die erste Schicht aus Protein nicht von hoher Reinheit
zu sein. Alles dies sind beträchtliche Vorteile gegenüber den US-Patentschriften
3 926 564 und 4 011 308.
-
Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß das bei Durchführung des Verfahrens
gemäß der Erfindung aufgefangene Signal nicht von der Größe des biologischen Teilchens
abhängt.
-
Mit der Vorrichtung können beispielsweise sowohl große biologische
Teilchen (vergleichbar den in der US-PS 3 853 467 genannten) als auch kleine biologische
Teilchen (vergleichbar den in der US-PS 3 926 564 genannten) bestimmt werden.
-
Auch kleinere Teilchen, wie Steroidhormon und Polypeptide, können
bestimmt werden. Der gebundene fluoreszierende Farbstoff kann (a) ein Fluorescein-derivat,
üblicherweise Fluorescein-isocyanat (FIC) oder -isothiocyanat (FITC), (B) ein Rhodamin-derivat,
üblicherweise Rhodamin-isocyanat oder -isothiocyanat, Lissamin-rhodamin-B 200-sulfonylchlorid
(RB200XC) oder (C) 1-Dimethylaminonaphtalin-5-sulfonylchlorid (DANSC) sein. Diese
Farbstoffe sind im Handel erhältlich (beispielsweise von der Baltimore Biological
Lab), und auch einige Antikörper mit daran gebundenem fluoreszierendem Farbstoff
sind im Handel erhältlich. Für verschiedene Farbstoffe werden zweckmäßig verschiedene
Lichtquellen und verschiedene Photonenbestimmungsvorrichtungen verwendet. Die am
stärksten intensivierte Lichtquelle ist der Laser. Es können aber auch Bogenlampen
mit einer Wellenlängenselektiereinrichtung oder Wolframlampen mit einer Wellenlängenselektiereinrichtung
zum Auswählen einer günstigen Wellenlänge verwendet werden. Die stark reflektierende
Oberfläche des Substrats lenkt die anregenden Photonen von dem Photonenzählsystem
32 ab, so daß das induzierte Signal nicht von anregenden Photonen gestört wird.
Je stärker die Vermischung von induziertem Signal und anregenden Photonen ist, desto
größer ist die Störung. Je höher das Verhältnis Signal zu Störung ist, desto zuverlässiger
sind die Testergebnisse. Unabhängig davon, was für eine Lichtquelle verwendet wird,
ist für die Photonenbestimmungsvorrichtungeine Wellenlängenselektiereinrichtung
erforderlich, um die Fluoreszenzemissionen
weiter zu selektieren,
da sie mit einer geringen Menge an anregenden Photonen gemischt sein kann, obwohl
wegen der Verwendung der Reflektiereinrichtung das Verhältnis Signal zu Störung
sehr groß ist. Die Wellenlängenselektiereinrichtung kann ein Monochromator oder
ein Filter sein.
-
Das anregende Signal muß kein Photon sein. Es kann ein Neutronensignal
sein, und das induzierte Signal kann Strahlung (bekannt als Neutronenaktivierungsanalyse)
oder andere Strahlung sein.
-
Es können Elektronen oder andere geladene Teilchen sein, und das induzierte
Signal kann die charakteristische Röntgenstrahlung sein, wenn das dritte biologische
Teilchen mit spezifischen Elementen etikettiert ist. Beispielsweise kann eine Metalletikettierung
durch Ferritin, das im Handel erhältlich ist, erfolgen, und das wirtschaftlichste
geladene Teilchen kann ein Elektron sein. In diesem Fall wird die Metalloberfläche
positiv aufgeladen und mit einer konstanten Spannung verbunden, wie in Fig. 3B gezeigt.
Diese Metalloberfläche dient dann als die Elektronenfalle. Ein entsprechendes Photonenzählsystem
kann verwendet werden, um das induzierte Signal von dem Eisenelement zu bestimmen.
-
Die zu messende Menge an induziertem Signal kann durch Ändern der
Menge an erregendem Signal manipuliert werden. Gemäß der Erfindung werden die anregenden
Teilchen von dem Signalbestimmungssystem fortgelenkt, so daß das Signal verstärkt
wird, ohne daß die Störung beträchtlich erhöht wird. In der Vorrichtung gemäß der
Erfindung ergibt ein mit einer Metallschicht überzogenes Substrat ohne biologische
Teilchen sehr wenige Störungsgeräuschzählungen. Das ist eine Verbesserung gegenüber
den bekannten Vorrichtungen, die eine Emanation eines Signals von einer Quelle von
konstantem Wert, der von
der spezifischen Aktivität abhängt, verwenden.
Auch wird die Emanation mit der Zeit geringer, manchmal bei sehr kurzer Halbwertszeit,
und es ist daher schwieriger, damit zu arbeiten. Die Verwendung eines induzierten
Signals ist ein beträchtlicher Vorteil gegenüber der US-PS 4 011 308.
-
Bei Verwendung eines induzierten Signals kann der natrliche Hintergrund
gemessen werden, indem man das anregende Signal dafür abschaltet, d. h. die Abscheidung
eines biologischen Teilchens zur Bildung eines speziellen Musters, wie es gemäß
US-PS 4 011 308 erforderlich ist, ist nicht notwendig. Die Zählung außerhalb des
Musters ist das, was unter dem natürlichen Hintergrund zu verstehen ist.
-
Durch die Verwendung der Vorrichtung wird es möglich, eine Spurenmenge
an dem dritten biologischen Teilchen auf der Metalloberfläche zu bestimmen, d. h.,
es hat sich gezeigt, daß das dritte biologische Teilchen, um bestimmt zu werden,
keine Schicht bilden muß. Auch das zweite biologische Teilchen oder das erste biologische
Teilchen müssen keine Schicht bilden. Als die erste Schicht wurden teilweise gereinigte
erste biologische Teilchen (beispielsweise nach Fällung mit Ammoniumsulfat) verwendet.
Die geringe Menge an zweiten biologischen Teilchen ragen ebenso wie die dritten
biologischen Teilchen aus der Metalloberfläche heraus. Das ist gegenüber der Verwendung
von Schichten ein Vorteil, weil die Teilchen von Interesse in die Lösung hineinragen
und dadurch die spezifische Reaktion erleichtern und die nicht spezifische Bindung
verringern. Sowohl die Zeit zur Durchführung eines solchen Tests als auch die Menge
an nicht spezifischer Bindung wird stark verringert. Weitere Vorteile des Verfahrens
gemäß der Erfindung gegenüber den Verfahren der US-Patentschriften 4 011 308 und
3 926 564,
bei denen die ersten, die zweiten oder die dritten biologischen
Teilchen Schichten bilden, damit sie bestimmt werden können (Giaever Slides), sind:
1) Es ist nur eine sehr geringe Menge an ersten biologischen und zweiten biologischen
Teilchen (etwa 1/1000 der von Giaever verwendeten) erforderlich, um einen Test durchzuführen.
Die ersten biologischen Teilchen müssen nur teilweise gereinigt sein und können
daher leichter erhalten werden und sind billiger.
-
2) Einfluß der Gleichgewichtskonstante: Wenn die ersten biologischen
Teilchen eine Schicht bilden, ist eine Bindung mit dem Metall erforderlich, damit
diese Teilchen nicht in Lösung gehen, und um dies zu erreichen, ist eine große Menge
an ersten biologischen Teilchen erforderlich. Wenn auch die zweiten biologischen
Teilchen eine Schicht bilden, ist es die Bindung zwischen dem ersten und dem zweiten
biologischen Teilchen, die verhindert, daß das zweite biologische Teilchen in Lösung
geht. Für die Bildung einer Schicht aus dem zweiten biologischen Teilchen gibt es
jedoch eine Mindestkonzentration an dem zweiten biologischen Teilchen in der Lösung,
unter der dieses zweite biologische Teilchen keine Schicht bilden kann. Dadurch
wird die Genauigkeit des Testergebnisses stark vermindert. Bei dem Verfahren gemäß
der Erfindung gibt es keine Schicht aus den zweitenbiologischen Teilchen. Auch die
Menge an ersten biologischen Teilchen in der Proteinschicht kann mit dem Grad der
Reinigung oder des Zusatzes verschiedener Mengen an inertem Protein wie BSA variieren.
Die beste Auflösung ist sehr viel empfindlicher, und ihre Grenzen hängen von der
Menge an dritten biologischen Teilchen, die noch genau gemessen werden kann, ab.
-
Die in Fig. 3A gezeigte Vorrichtung, die im folgenden besprochen wird,
ist der Schlüssel für die Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung. Das wesentlichste
Merkmal
der in Fig. 3A gezeigten Vorrichtung ist das metallische
Substrat. Im Weg des anregenden Photons, das von der Lichtquelle 32 ausgeht und
an der Wand des dunklen Gehäuses endet, darf sich nichts befinden als die stark
reflektierende metallische Oberfläche und die biologischen Teilchen darauf. Wenn
der Einfallswinkel gleich dem Reflexionswinkel ist und das Signalbestimmungssystem
senkrecht zu dem Substrat und in einigem Abstand davon angeordnet ist, wird das
anregende Teilchen nicht auf das Bestimmungssystem zu gestreut. Auch kann die Form
des Gehäuses so gewählt werden, daß sein Einfangvermögen erhöht wird, so daß fast
alle anregenden Teilchen, die gegen die entsprechend ausgebildete Falle reflektiert
werden, dort abgebremst werden und nicht zu dem Signalzählsystem gelangen. Das induzierte
Signal, das von dem dritten biologischen Teilchen ausgeht, nachdem das anregende
Teilchen absorbiert ist, kann in jeder Richtung ausstrahlen, und ein Teil davon,
der von der Sammelöffnung des Photonenzählsystems abhängt, gelangt zu dem Photonenzählsystem.
Wegen der stark reflektierenden metallischen Oberfläche werden auch diejenigen induzierten
Photonen, die direkt in eine Richtung entgegengesetzt von dem Photonenzählsystem
abgestrahlt werden, zurückreflektiert und treten in das Photonenzählsystem ein.
-
Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ist speziell für ein stark reflektierendes
Substrat ausgebildet, und es ist nicht wesentlich, daß es ein mit einem Metallüberzug
versehenes Substrat ist. Jedoch ist ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat
eines der zweckmäßigsten.
-
Aber auch beispielsweise ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat,
das noch eine dünne Schicht aus einem Gel aufweist, ist ein gutes Substrat. Auch
ist es nicht
von entscheidender Bedeutung, daß die daran gebundenen
Moleküle Proteinmoleküle sind. Vielmehr kann die Vorrichtung auch für andere Moleküle
oder dünne Gewebeschnitte und andere Dinge, die durch Trocknen, chemische Umsetzung,
Adhäsion, Bindung oder andere Maßnahmen zur Bindung an ein solches stark reflektierendes
Substrat gebracht sind, verwendet werden.
-
In der Vorrichtung gemäß der Erfindung kann auch für eine trockene
Probe, wie im vorliegenden Fall, eine Lichtquelle sehr hoher Intensität verwendet
werden. Die stark reflektierende Metalloberfläche bewirkt, daß es zu einer nur sehr
geringfügigen Photonenabsorption (die in Wärme umgewandelt wird) kommt, so daß auch
die Wahrscheinlichkeit eines Ausbleichens oder einer Beschädigung der Probe sehr
gering ist. Daher kann sogar ein Laser als Lichtquelle verwendet werden. Dies sind
beträchtliche Vorteile gegenüber den US-Patentschriften 4 056 724 und 4 036 946.
-
Es gibt verschiedene Wege zur Bindung der ersten biologischen Teilchen
an das Substrat. Für ein mit einem Metallüberzug versehenes Substrat kann die erste
Stufe in einem Eintauchen bestehen, und auch für die Bindung der zweiten biologischen
Teilchen an die ersten biologischen Teilchen und für die Bindung der dritten biologischen
Teilchen an die zweiten biologischen Teilchen (die ersten biologischen Teilchen
in Fig. 5) kann in gleicher Weise vorgegangen werden. Um den Test zu beschleunigen,
kann die Probe auf dem Substrat getrocknet werden. Um die nichtspezifische Bindung
zu senken, kann ein Eintrocknen der Lösung dadurch verhindert werden, daß man das
Substrat in einer Feuchtigkeitskammer hält. Die Vorrichtung und das Verfahren gemäß
der Erfindung können jedoch in vielfacher Weise modifiziert
werden.
Beispielsweise kann die Probe in ein kleines Rohr eingebracht werden, um den Kontakt
mit dem Substrat auf ein kleines Gebiet zu begrenzen; oder das Volumen der Lösung
der Probe kann dadurch vergrößert werden, daß ein Becher verwendet wird. In jedem
Fall ist es wesentlich, daß das fertige Substrat gewaschen wird. Da die Metalloberfläche
die erste biologischen Teilchen bindet, die ersten biologischen Teilchen die zweiten
biologischen Teilchen binden usw., wird durch Waschen die nichtspezifische Bindung,
nicht jedoch die durch die spezifische Reaktion erfolgte Bindung gelöst. Bei Substraten
aus Glas, Plastik oder vielen anderen Materialien, erfolgt dagegen keine Bindung
zwischen ersten biologischen Teilchen und Substrat, und durch Waschen kann daher
die durch die spezifische Reaktion erfolgte Bindung gelöst werden, während andererseits
bei Unterlassung des Waschens die durch nichtspezifische Reaktion erfolgte Bindung
an das Substrat erhalten bleibt und daher eine quantitative Messung unmöglich wird.
-
Außerdem sind solche Substrate nicht stark reflektierend und ergeben
daher in der Vorrichtung gemäß der Erfindung keine gute Auflösung.
-
Um die quantitative Bestimmung bei einem Test zu verbessern und die
Umsetzung klar erkennbar zu machen, werden zweckmäßig in einer Serie von Tests Substrate
mit gleicher Fläche und gleicher Menge an Lösung der Probe verwendet.
-
Die Absorptions- und Emissionsspektren der meisten fluoreszierenden
Verbindungen, die zur Einfärbung von Protein verwendet werden, sind von Hansen PA
(1964) (Publikation der University of Maryland, College Park, Maryland) zusammengestellt.
-
Die Peakwellenlänge des zu verwendenden Filters oder Monochromators
wird zweckmäßig unter Verwendung dieser Angaben ausgewählt. Es wurde jedoch gefunden,
daß die Verwendung eines im Handel erhältlichen (Oriel Corporation) Engbandinterferenzfilters
mit einer Transmission außerhalb eines Durchlässigkeitsbereiches von 0,01 % nicht
genügt, um eine Spurenmenge an dritten biologischen Teilchen auf dem Substrat zu
bestimmen, weil das Störgeräusch des Instruments (zur Ablesung einer blanken Metalloberfläche)
noch hoch ist.
-
Bei Verwendung von zwei solchen Engbandfiltern als Gruppe als Filter
sowohl für das anregende als auch für das induzierte Signal wird die Auflösung sehr
gut und das Störgeräusch des Instruments nicht wahrnehmbar.
-
Nach Hansen sind sowohl die Absorptions- als auch die Emissionsbande
sehr breit und werden noch breiter, wenn eine Bindung an eine Metalloberfläche gemäß
der Erfindung erfolgt ist. Die genaue Peakwellenlänge dieser Engbandinterferenzfilter
ist nicht wesentlich. Es wurde jedoch gefunden, daß die Verwendung von zwei Filtern
als Gruppe besser geeignet ist, um die gleiche Peakwellenlänge und Bandbreite zu
haben.
-
Wenn als Lichtquelle ein Laser verwendet wird, muß kein Filter für
das anregende Signal verwendet werden. Monochromatoren eignen sich ausgezeichnet
zur Wahl des anregenden Signals, insbesondere wenn Lichtquellen hoher Intensität
verwendet werden.