DE2943580C2 - L-Phenylalanyl-sowie N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-naphthylester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung - Google Patents
L-Phenylalanyl-sowie N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-naphthylester, Verfahren zu deren Herstellung und deren VerwendungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine Phenylalanylvalylargininnaphthylester,
ein Verfahren, zu deren Herstellung und deren Verwendung zur Bestimmung der Aktivität der in
Anspruch 3 genannten Enzyme, wobei die erfindungsgemäßen Verbindungen als Substrat verwendet werden.
Derzeit sind viele Verfahren zur Bestimmung von Enzym-Aktivitäten bekannt Eines dieser Verfahren
besteht darin, daß man einen Alkylester einer Aminosäure als Substrat mit einem Enzym in Kontakt
bringt und die Enzym-Aktivität aufgrund des Hydrolysegrads
des Alkylesters bestimmt Ein Beispiel für diese Arbeitsweisen ist die bekannte Hestrin- Methode.
Hierbei handelt es sich um ein Verfahren bei dem man ein Enzym mk einem Alkylester einer Aminosäure in
Kontakt bringt, nach einer vorgegebenen Zeitspanne die verbleibenden Estergruppen mit Hydroxylamin in
eine Hydroxamsäure überführt, diese unter Farbentwicklung mit Eisen-III-Chlorid reagieren läßt und die
Farbe als Extinktion mißt und scht:eßlich aus der
Extinktion die Fähigkeit des Enzyms zur Hydrolyse des Esters, d. h. die Enzym-Aktivität, bestimmt
Aus Anal. Biochem. 61,1974,200-208 (CA. 82,1975,
12776) ist es bekannt Plasmin mittels a-N-Methyl-a-N-tosyl-L-lysin-/?-naphthylester
als Substrat durch Messung der freigesetzten Menge an jJ-Naphthol zu
bestimmen. Es gibt auch eine Methode, bei der man ein p-Nitroanilid als Substrat einsetzt (vgl. Thromb. Res. I
1972,267 - 278, DE-OS 23 22 116). Bei diesen Methoden
ist jedoch eine beträchtliche Menge an Enzym
CH3
CHCH3
CHCH3
erforderlich, und wenn die Enzymkonzentration gering
ist oder das Enzym eine geringe Aktivität besitzt so hat es sich als schwierig erwiesen, die Enzym-Aktivität zu
bestimmen.
Erfindungsgemäß wurden ausgedehnte Untersuchungen angestellt, um Verbindungen aufzufinden, welche
die drei nachstehenden Bedingungen erfüllen: Sie müssen eine Affinität für ein Enzym besitzen, die
Bestimmung der Enzym-Aktivität muß einfach durchführbar sein und die Empfindlichkeit der Verbindungen
bei der Bestimmung muß gut sein. Überraschend wurden erfindungsgemäß Verbindungen erhalten, welche
im Vergleich zu den üblichen Verbindungen sich hinsichtlich der vorstehenden Erfordernisse als ausgezeichnet
erwiesen haben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Aminosäurederivate bereitzustellen, welche als ausgezeichnetes
Substrat für Trypsin, Plasmin, Kallikrein,
Urokinase, Cl-Eesterase, Thrombin and Faktor Xa brauchbar sind. Der Erfindung liegt auch die Aufgabe
zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen Aminosäurederivate zu schaffen. Ferner liegt der
Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine neue Verwendung zu schaffen zur Bestimmung der Aktivität der
genannten Enzyme unter Anwendung der neuen Aminosäurederivate als Substrat für das Enzym.
Die vorstehende Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch Bereitstellung von L-Phenylalanyl-L-valyl-L-argininnaphtylestern
der allgemeinen Formel I:
R1-NH CO—NH CO-NH
worin Ri für Wasserstoff oder Benzoyl steht
Die Erfindung schafft auch ein Verfahren zur Herstellung der Phenylalanylvalylargininnaphthylester
der allgemeinen Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist daß man jeweils in an sich bekannter Weise
A) ein
der allgemeinen Formel II:
CH3
CHCH3
CHCH3
(Π)
R3NH CONH COOH
in der R3 Benzoyl oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, mit einem I^Argininnaphthylester der allgemeinen
Formel III:
NH
R4-N-^
(ΠΙ)
in der R4 eine Aminoschutzgruppe bedeutet, kondensiert und
B) aus der Verbindung der allgemeinen Formel IV
NH
CH3 NH-/
CH3 NH-/
I MH P
CHCH3 (CH2J3 1Nn K"
COO
COO
in der R3 und R4 die genannten Bedeutungen besitzen, die Aminoschutzgruppe(n) abspaltet.
Die Ausgangsverbindungen der allgemeinen For- kann hergestellt werden, indem man ein Argininderivat
melll, die zur Herstellung der erfindungsgemäßen Ver- der allgemeinen Formel III' mit einer geeigneten
bindungen der allgemeinen Formel I eingesetzt werden, Schutzgruppe:
können hergestellt werden, indem man eine Verbindung der allgemeinen Formel V: 20 NH
können hergestellt werden, indem man eine Verbindung der allgemeinen Formel V: 20 NH
I NH-R4
(CM2J3 (111 )
(V) R4—HN COOH
worin R4 dieselbe Bedeutung wie zuvor besitzt und
R3HN COOH 30 R4' eine Aminoschutzgruppe darstellt, welche von der
Gruppe R4 verschieden ist, naphthyliert, wobei man
eine Verbindung der allgemeinen Formel III" erhält: worin R3 dieselbe Bedeutung wie zuvor besitzt, mit
einer Verbindung der allgemeinen Formel VI: .NH
35
CH3 CH3 f
( NH K<
(DT')
CH (VI)
40
R4—HN COOR2
H2N COOR5
worin R2, R4 und R4- dieselben Bedeutungen wie zuvor
besitzen und anschließend selektiv nur die Amino-45 schutzgruppe in der α-Position aus der Verbindung III"
worin R5 fur Alkyl steht, zu einem Ester der allgemei- entfernt
nen Formel VII kondensiert: Bei der Herstellung der Verbindung IV löst man die
Verbindung II und das Argininderivat III in einem geeigneten Lösungsmittel auf und gibt zur erhaltenen
50 Lösung ein Aktivierungsmittel, das üblicherweise
Z K3 C H3 eingesetzt wird, beispieslweise Dicydchexylcarbcdiiniid
X / (DCC), Diphenylphosphorylazid (DPPA), ein Alkylchlor-
(VII) carbonat oder dergleichen, und anschließend, erforderli-
Achenfalls, eine Base, beispielsweise Triäthylamin oder
55 dergleichen. Dann rührt man die erhaltene Mischung, rn mw nnrti} wodurch die Verbindung IV hergestellt wird. Zu den
uu Mti CUUK5 eingesetzten Lösungsmitteln gehören übliche Lösungsmittel,
beispielsweise Chloroform, Dichlormethan, Diworin R3 und R5 dieselben Bedeutungen wie zuvor methylformamid, Tetrahydrofuran und dergleichen in
besitzen und anschließend den Ester der allgemeinen 60 dem Umfang, in dem die Ausgangsmaterialien darin
Formel VII hydroylsiert Andernfalls kann man die von löslich sind. Die Reaktionstemperatur kann im Bereich
L. Lubiewska-Nakonicczana, B. Rzeszetarska und E von 0° bis 40° C liegen.
Taschner, Justus LJebigs Ann. Chem, 741, 157 (1970) Nach Beendigung der Reaktion kann man die
offenbarten Verbindungen als Verbindungen der allge- Verbindung IV aus der Reaktionsmischung auf übliche
meinen Formel II verwenden. 65 Weise isolieren. Wenn man DCC als Aktivierungsmittel
Das Argininausgangsderivat der allgemeinen Formel verwendet^wird der ausgefäUte Dicyclohexylhamstoff
III umfaßt auch den NGJ^Dibenzyloxycarbonyl:L-ar- (DCU) durch Filtrieren entfernt und ein geeignetes
ginin-1-naphtylester und ähnliche Verbindungen und Extraktionslösungsmittel, beispielsweise Äthylacetat,
wird zum Filtrat zugegeben. Danach wäscht man den Extrakt mit wäßriger Zitronensäurelösung, wäßriger,
gesättigter Natriumbicarbonatlösung und/oder gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung, trocknet über
wasserfreiem Magnesiumsulfat und verdampft dann unter vermindertem Druck, um das Lösungsmittel zu
entfernen. Hierbei erhält man die Verbindung IV.
Die Aminoschutzgruppe der Verbindung IV wird auf übliche Weise entfernt Wenn man als Aminoschutzgruppe
Benzyloxycarbonyl einsetzt, wird die Verbindung IV in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst, und
ein Katalysator, beispielsweise Palladium-auf-Aktivkohle
oder dergleichen, wird zur erhaltenen Lösung zugegeben, um die Schutzgruppe reduktiv zu entfernen.
Man kann auch die Verbindung IV zu einer Lösung von Bromwasserstoffsäure in Essigsäure zugeben. Dann
wird die in Form des Hydrobromids ausgefällte Verbindung durch Filtrieren isoliert, wodurch man die
Verbindung I erhält
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I werden verwendet als Substrate zur
Bestimmung der Aktivität von Trypsin, Plasmin, Kallikrein, Urokinase, Cl-Esterase, Thrombin und
Faktor Xa. Wenn man die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I mit einem solchen Enzym in
Kontakt bringt, dient die Verbindung somit als Substrat, und Naphthol wird durch Hydrolyse mit dem Enzym
nach einem vorgegebenen Zeitraum freigesetzt nachdem die Menge an Naphthol bestimmt wird, um die
Enzym-Aktivität zu messen. Die Tatsache, daß man die Enzym-Aktivität sehr leicht bestimmen kann, ist für eine
quantitative Analyse einer Enzympräparation, eine Diagnose durch Messung der Enzymverteilung im Blut,
eine Diagnose durch Messung der Enzymkonzentration in Blut oder Urin, oder dergleichen, von wesentlicher
Bedeutung.
Wenn man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Enzym-Aktivität bestimmt, so bringt man das Enzym
mit einer vorgegebenen Menge der erfindungsgemäßen Verbindung I in einer geeigneten Pufferlösung in
Kontakt Nach einer vorgegebenen Zeitspanne bei vorgegebener Temperatur wird die Menge an freigesetztem
Naphthol gemessen, wodurch die Enzym-Aktivität bestimmt wird. Als Pufferlösung kann man eine
Lösung verwenden, welche den optimalen pH für das Enzym aufweist Man kann die Reaktion unter
geeigneten, konstanten Bedingungen hinsichtlich Temperatur und Zeit durchführen, obgleich es bevorzugt ist,
die bei einer Temperatur von 25 bis 37° C nach 30 Minuten freigesetzte Menge an Naphthol zu messen.
Die Messung der Naphtholmenge kann anhand einer der bekannten Methoden durchgeführt werden, beispielsweise
durch physikochemische Methoden, wie Gaschromatographie oder Dünnschichtchromatographie,
oder durch chemische Methoden, wie durch die Eisen-III-Chloridreaktion, die Diazokupplungsreaktion
oder durch die Methode des Fast-Violet-B-Salzes (FVB).
Bevorzugt im Hinblick auf Einfachheit und Empfindlichkeit der Bestimmung ist jedoch eine Methode, bei der
das FVB zur Reaktionsmischung zugegeben wird, um eine Farbe zu entwickeln und die Extinktion mit Hilfe
eines Photometers bestimmt wird
Die Menge des nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmten Naphtols entspricht der Enzym-Aktivität
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es -möglich, eine Änderung der Enzymkonzentration im
Blut oder im Urin, bedingt durch verschiedene Erkrankungen, ohne weiteres festzustellen.
Die Erfindung ist durch die nachstehenden Beispiele und die Zeichnung näher erläutert. In der Zeichnung
sind die Standardkurven für die Konzentration des Th rombins angegeben.
Herstellung von L-Phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-1-naphthylester-dihydrochlorid
Man löst in 10 ml Ν,Ν-Dimethylformamid (DMF)
796 mg N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-valin
(vgl. L Lubiewska-Nakonieczna, B. Rzeszotarska und E. Taschner, Justus Liebigs Ann. Chem, 741, 157 (1970))
und 1,36 g N^N^Dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-inaphthylester-trifluoracetat
auf und gibt dann 533 mg DCC, 351 mg 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und
0,31 ml Triäthylamin (TEA) zur Lösung unter Eiskühlung zu. Die erhaltene Mischung wird bei derselben
Temperatur 3 Stunden gerührt und dann noch 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Nach beendeter
Reaktion wird der ausgefallene DCU durch Filtrieren entfernt und man gibt Äthylacetat zum Filtrat zu. Die
erhaltene Mischung wird mit 10%iger Zitronensäurelösung, gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter
Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet
und dann unter vermindertem Druck eingedampft, um das Lösungsmittel zu entfernen. Der
Rückstand wird aus Äthylacetat umkristallisiert Man erhält 810 mg (Ausbeute 43%) N-Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-valyl-NG,NG-dibenzyloxycarbonal-L-arginin-1-naphthylester
in Form eines weißen Pulvers mit Schmelzpunkt 174 bis 176° C
IRv^cm-·: 3400,3250,1740,1720,1640.
NMR δ ppm (CDCl3+DMSOd6):
0,9 (6H, d), 2,0 (4H, breit), 2,6 (IH, m),
3,l(2H,m),4,0-5,0(lHx3,m), 5,0 (2H,s), 5,2(2H,s), 5,3 (2H,s),
7,2—8,1 (aromatische Protonen).
Man löst 720 mg des obigen Esters in 5 ml DMF und gibt 300 mg 10% Palladium-auf-Aktivkohle (Pd-C) und
0,80 g Chlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung (98 mg HCl/g) zur Lösung. Die erhaltene Mischung wird 3
Stunden gerührt, während man Wasserstoffgas hindurchgibt Danach wird das Pd-C durch Filtrieren
entfernt, Zum Filtrat gibt man 100 ml wasserfreien Diäthyläther und sammelt das auf diese Weise
ausgefällte weiße Pulver, wobei man 440 mg (Ausbeute 93%) L-Phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-1-naphthylester-dihydrochlorid
mit Schmelzpunkt 113 bis 118° C (Zers.) erhält
-1:3650,1750,1650.
Das als Ausgangsmaterial verwendete NG,NG-pibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l
-naphthylester-triflüorace- - tat wird folgendermaßen hergestellt:
Man löst 9,1 g Να-4-Methoxybenzyloxycarbonyl-NGJ>JG-dibenzyioxycarbonyl-L-arginin
(vgL Z. Naturf. 20b, 429 (1965) F. Weygand, E. Nintz) in 30 ml
wasserfreiem Pyridin und gibt 7,9 g Ι,Γ-Dinaphthylsulfit
zu. Die erhaltene Mischung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt Man gibt zur Reaktionsmischung
Äthylacetat zu und wäscht die Mischung mit
230241/306
9 10
lO°/oiger Zitronensäurelösung, gesättigter Natriumbi- zum Rückstand zu und rührt die erhaltene Mischung,
carbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung in wobei man 200 mg (Ausbeute 53%) N-Benzoyl-L-phe-
dieser Reihenfolge, trocknet über wasserfreiem Magne- nylalanyl-L-valyl-L-arginin-1-naphthylester-hydrochlo-
siumsulfat und dampft dann unter vermindertem Druck rid in Form eines weißen Pulvers mit Schmelzpunkt 75
zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit wasserfreiem 5 bis 85° C (Zers.) erhält.
Diäthyläther gewaschen, wobei man 9,0 g (Ausbeute
82%) Nflc-4-Methoxybenzyloxycarbonyl-NG,NG-diben- IRv**cm-':3200,1750,1640.
zyloxycarbonyl-L-arginin-1-naphthylester in Form einer
blaßgelben viskosen öligen Substanz erhält. Das als Ausgangsmaterial eingesetzte N-Benzoyl-L-
i ο phenylalanyl-L-valin wurde wie folgt hergestellt:
IRv^cm-':3400,1760,1720,1690. In 100ml Tetrahydrofuran (THF) werden 13,5g
N-Benzoyl-L-phenylalanin und 8,4 g L-Valinmethyl-
NMR ό ppm (CDCU): ester-hydrochlorid aufgelöst Danach gibt man unter
l,9(4H,m),3,7(3H,s),4,l(2H,m), Eiskühlen 13,8g DPPA und 14,0ml TEA zur Lösung.
4,8(lH,m),5,l(2Hx2,s),5,2(2H,s), 15 Die erhaltene Mischung wird bei Raumtemperatur 24
6,7—8,0(aromatischeProtonen). Stunden gerührt Die Reaktionsmischung wird dann
unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft
Zu 8,0 g des obigen Esters gibt man 15 ml und der Rückstand wird in Äthylacetat aufgelöst Man
Trifluoressigsäure und rührt die erhaltene Mischung 30 wäscht die Lösung mit 10%iger Zitronensäurelösung,
Minuten unter Eiskühlung. Nach der Reaktion dampft 20 gesättigter Natriumbicarbonatlösung und gesättigter
man die Reaktionsmischung unter vermindertem Druck Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge, trocknet
ein, um die Trifluoressigsäure zu entfernen. Dann gibt über wasserfreiem Magnesiumsulfat und dampft dann
man wasserfreien Diäthyläther zum Rückstand zu, um unter vermindertem Druck' zur Trockne ein. Den
diesen aufzulösen. Anschließend läßt man die erhaltene Rückstand kristallisiert man aus Äthylacetat/n-Hexan
Lösung stehen. Die auf diese Weise ausgefallenen 25 um. Hierbei erhält man 73 g (Ausbeute 38%) N-Ben-
farblosen nadeiförmigen Kristalle werden gesammelt zoyl-L-phenylalanyl-L-valinmethylester in Form eines
Man erhält 4,5 g (Ausbeute 61%) NG,NG-Dibenzyloxy- weißen Pulvers mit Schmelzpunkt 160bis 163°C.
carbonyl-L-arginin-l-naphthylester-trifluoracetat mit
Schmelzpunkt 149 bis 151°C. IRvm.icm-'^OO, 1730,1630.
IRÄm-':3400,1760,1720,1665. Man |öst 5,7 g des obigen Esters in 100 ml Methanol
und gibt dann zur Lösung 24 ml einer IN NaOH-Lö-
NMR <5 ppm (CDCl3+DMSO-de): sung. Die erhaltene Lösung wird 2 Stunden bei
2,1 (4H, m), 40 (2H m) 4,5 (IH ml Raumtemperatur gerührt Man konzentriert die Reak-
5,1(2Hs) 5,2(2H si, ' 35 ti°nsnuscnunS unter vermindertem Druck und gibt
71 KniärrJi^tiLt D ♦ \ destilliertes Wasser und Äthylacetat zum Rückstand.
7,1 -^aromatische Protonen). Die ^^ Mischung ^ dann geschüttdt Man
Beispiel 2 trennt die wäßrige Schicht ab und macht mit 10%iger
Herstellung von N-Benzoyl-L-phenylalanyl- Chlorwasserstoff säure schwach sauer. Die auf diese
L-valyl-L-arginin-1-naphthylester-hydrochlorid 40 Weise ausgefaUte ο ige Substanz mit mit Athylacetat
r ' extrahiert Man wascht den Extrakt mit Wasser,
Man löst 368 mg N-Benzoyl-L-phenyl-L-alanylvalin trocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und
und 682 mg NG.NG-Dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l- dampft dann unter vermindertem Druck ein, um das
naphthylester-trifluoracetat in 15 ml DMF und gibt Lösungsmittel zu entfernen. Man kristallisiert den
dann 268 mg DCC, 135 mg HOBt und 0,14 ml TEA zur 45 Rückstand aus Äthylacetat/n-Hexan um. Hierbei erhält
erhaltenen Lösung unter Eiskühlung zu. Die erhaltene man 3,0 g (Ausbeute 54%) N-Benzoyl-L-phenylalanyl-
Mischung wird bei derselben Temperatur 3 Stunden L-valin mit Schmelzpunkt 191° C.
gerührt und dann bei Raumtemperatur weitere 24
Stunden gerührt Die auf diese Weise ausgefallenen IRv^cm-':3350,1710,1630.
Kristalle werden durch Filtrieren gesammelt und aus 50
Chloroform umkristallisiert Hierbei erhält man 600 mg B e i s ρ i e 1 3
(Ausbeute 63%) des N-Benzoyi-L-phenyialanyl-L- w _, ., · . _ ~-_ ,.
valyl-NO^-dibenzyloxycarbonyl-L-arginin-l-naphthyl- Messung der Aktivität von Thrombin
estersmitSchmelzpunktieabisiee-C * M_ unter Anwendung von
r N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-
IRv™cm-':3300,1745,1720,1630. * 1-naphthylester-hydrochlorid als Subsfrat
Zu 1,7 ml 50 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gibt
Man suspendiert 0,5 g des obigen Esters in 10 ml man 0,1 ml einer wäßrigen Thrombin-Lösung in
DMF und gibt dann 200 mg 10% Pd-C und 1,0 g unterschiedlichen Konzentrationen (0,025, 0,05, 0,075
Chlorwasserstoffsäure-Dioxanlösung (110 mg HCl/g) 60 und 0,1 internationale Einheiten von Thrombin in 0,1 ml)
zu. Die erhaltene Mischung wird bei Raumtemperatur 2 und 0,2 ml N-Benzoyi-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-
Stunden gerührt, während man Wasserstoffgas durch- l-naphthylester-hydrochloridlösung (1,5 mM) zu und
leitet Die Reaktionsmischung wird filtriert, um das Pd-C inkubiert die erhaltene Mischung 30 Minuten bei 25" Q
zu entfernen, und 40 ml wasserfreier Diäthyläther Man kühlt die Mischung in Eiswasser ab und gibt 0,1 ml
werden zum Filtrat zugesetzt Die erhaltene Mischung 65 1% FVB zu. Die erhaltene Mischung läßt man 10
wird 24 Stunden lang in Eiswasser stehengelassen. Die Minuten bei 0° C stehen und gibt dann noch 1 ml Eisessig
überstehende Flüssigkeit wird durch Dekantieren zu. Die auf diese Weise entwickelte Farbe wird als
entfernt, dann gibt man 40 ml wasserfreien Diäthyläther Extinktion (505 nm) mit Hilfe eines Spektrophotome-
ters gemessen. Hierdurch wird die Menge an freigesetztem Naphthol, das durch Hydrolyse mit dem Enzym
entstanden ist, bestimmt. Als Kontrolle verwendet man dieselbe Pufferlösung wie zuvor, die jedoch kein
Thrombin enthält. Die Menge an freigesetztem Naphthol entspricht der Enzym-Aktivität.
Die gleiche Arbeitsweise wurde auch unter Anwendung von L-Phe-L-Val-L-Arg-l-naphtylester-2HCl als
Substrat durchgeführt
D'e Ergebnisse der Extinktionsmessungen bei jeder
Thrombinkonzentration nach der vorstehenden Methode sind in der Zeichnung angegeben.
unter Verwendung von N^-Tosyl-L-argininmethyl
ester-hydrochlorid als Substrat
Zu 0,1 ml einer wässerigen Thrombin-Lösung in unterschiedlichen Konzentrationen (0,025, 0,05, 0,075
und 0,1 internationale Einheiten von Thrombin in 0,1 ml) gibt man 03 ml NÄ-Tosyl-L-argininmethylester-hydrochloridlösung (10 Mikromol/0,4 ml 5% DMSO) und
0,6 ml Phosphatpufferlöfung (pH 7,4) und inkubiert die erhaltene Mischung 30 Minuten bei 37° C. Danach gibt
man 1,5 ml einer Hydroxylaminlösung (Mischung gleicher Mengen an 2 M NH^H-Hydrochlorid und
3,5 M NaOH) zu. Man läßt die erhaltene Mischung 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Dann gibt man
1 ml 18°/oige Trichloressigsäurelösung, 1 ml 4 N Chlorwasserstoffsäure und 1 ml 10%ige Eisen-III-Choridlösung zu. Die erhaltene Mischung wird gründlich gerührt
und dann 10 Minuten bei 3000 Upm zentrifugiert Die auf diese Weise entwickelte Farbe der überstehenden
Flüssigkeit wird als Extinktion (530 nm) mit Hilfe eines Spektrophotometers gemessen. Der erhaltene Wert
entspricht der Menge an Substrat, das durch das Thrombin nicht hydrolysiert wurde. Somit entspricht die
Enzym-Aktivität dem Unterschied zwischen dem ohne
Verwendung des Enzyms erhaltenen Wert (Kontrolle)
und dem nach der Enzyrnreaktion erhaltenen Wert.
unter Verwendung von N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-p-nitroanilid-hydrochlorid.
Zu 2,15 ml 0,1 μΜ tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) gibt
ίο man 0,1 ml einer wässerigen Thrombin-Lösung in unterschiedlichen Konzentrationen (0,025, 0,05, 0,075
und 0,1 internationale Einheiten von Thrombin in 0,1 ml) und 0,25 ml N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-p-nitroanilid-hydrochloridlösung als 1 millimolare
wässerige Lösung zu und inkubiert die erhaltene Mischung 30 Minuten bei 37°C. Zur Mischung gibt man
03 ml Eisessig und mißt die entwickelte Farbe als Extinktion (405 nm) mit Hilfe eines Spektrophotometers.
Die Ergebnisse der Messungen im Beispiel 3, im Vergleichsbeispiel 1 und im Vergleichsbeispiel 2 sind in
der Zeichnung dargestellt Es ist zu ersehen, daß die Methode gemäß Beispiel 3 (N-Benzoyl-Verbindung)
eine Bestimmungsempfindlichkeit aufweist, die ungefähr 30mal größer als die des Vergleichsbeispiels 2 und
ungefähr 5mal größer als die des Vergleichsbeispiels 1 ist.
In der Zeichnung betrifft die Kurve A eine Standardkurve, die im Beispiel 3 erhalten wurde, Kurve
B betrifft eine im Vergleichsbeispiel 1 erhaltene Standardkurve, und Kurve Cbetrifft eine im Vergleichsbeispiel 2 erhaltene Kurve. Die Zahlen in Klammern auf
der Abszisse geben die Enzymkonzentrationen für die Kurve B an. Die Kurve D betrifft das L-Phe-L-VaI-L-Arg-1 -naphthylester-HCl (analog Beispiel 3 hergestellt).
Tabelle I zeigt die relative Empfindlichkeit bei Messung der Aktivität einiger der Enzyme nach den Methoden
des Beispiels 3 und des Vergleichsbeispiels 2.
Enzym
Substrat
alanyl-L-valyl-L-argi-
nin-1-naphthylester
alanyl-L-valyl-L-argi-
nin-p-nitroanilid
Messung der Reaktionsgeschwindigkeit des bekannten iX-N-Methyl-«-N-tosyl-L-lvsin-^-naphthylesters
(CA. 82,1975,12776), der als Verbindung 1 bezeichnet
wird, und des erfindungsgemäßen Benzoyl-Phe-Val-Arg-1-Naphthylesters (Verbindung 2) bei der Bestimmung von drei verschiedenen Enzymen. Wie Tabelle II
zeigt, sind die mit der erfindungsgemäßen Verbindung 2 erhaltenen Reaktionsgeschwindigkeiten wesentlich höher als die der bekannten Verbindung 1.
Tabelle Π | Thrombin | 10"3 | Kallikrein | Plasmin |
Verbindung (1) Mx | 10"3 | 1,1XlO"4 | UXiO"2 | |
Verbindung (2) 9,5 x |
μ
μ μ |
2,4XlO"2 | 2,3XlO"2 | |
Einheiten: Thrombin
Kallikrein Plasmin |
mol/min/IU
mol/min/KU mol/min/CU |
bei 25°C
bei 250C bei 25°C |
||
Mit den erfindungsgemäßen Verbindungen werden also überraschenderweise wesentlich höhere Reaktionsgeschwindigkeiten
erhalten, wodurch sich auch sehr kleine Enzym-Aktivitäten zuverlässig und leicht bestimmen
lassen.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (3)
1 "■■ 2
Patentansprüche:
1. IvPhenylalanyl- sowie N-Benzoyl-L·phenylalanyl-L·va!yl-L·aΓginin-naphthylester der allgemeinen Formel I:
1. IvPhenylalanyl- sowie N-Benzoyl-L·phenylalanyl-L·va!yl-L·aΓginin-naphthylester der allgemeinen Formel I:
R1-NH CONH CONH COO
woi in
R1 für Wasserstoff oder Benzoyl steht.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an
sich bekannter Weise
A) ein L·Phenylalanyl-L·valinderivat der allgemeinen Formel II:
A) ein L·Phenylalanyl-L·valinderivat der allgemeinen Formel II:
CH3
CH2 CHCH3 (Π)
Λ Λ
R3NH CONH COOH
in der R3 Benzoyl oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, mit einem I^Argininnaphthylester der allgemeinen
Formel III:
(ΠΙ)
in der R4 eine Aminoschutzgruppe bedeutet, kondensiert und
B) aus der Verbindung der allgemeinen Formel IV
NH /. CH3
CHCH3 (CHj)3 "n R( (IV)
R3-NH CONH CONH COO
jg; in der R3 und R4 die genannten Bedeutungen besitzen, die Aminoschutzgruppe(n) abspaltet.
3. Verwendung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 als Substrat zur Bestimmung der Aktivität von Trypsin,
Plasmin, Kallikrein, Urokinase, Cl-Esterase, Thrombin und Faktor Xa.
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