DE2933832C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft Glycoproteine, insbesondere Dihydro
xyboryl/Glycoprotein-Komplexe sowie ein Verfahren und ein
Reagens zum Nachweis, zur Abtrennung oder Ermittlung von
Glycoproteinen unter Verwendung solcher Komplexe.
Glycoproteine sind konjugierte Proteine, bei denen eine der
prosthetischen Gruppe(n) aus einem Kohlenhydratderivat besteht.
Sie kommen weit verbreitet in der Natur vor und erfüllen
die verschiedensten Aufgaben. So kommen beispielsweise
Glycoproteine in Blut und Absonderungen, in Zellmembranen
und in Bindegewebe vor. Glycoproteine können auch
industriell wertvolle Verbindungen sein, so wird beispielsweise
alkalische Phosphatase für Immunotests und zu diagnostischen
Zwecken verwendet.
Von Interesse sind die in Erythrocyten vorkommenden Glycoproteine,
insbesondere die drei mit der Sammelbezeichnung
HbA₁ versehenen Neben-(minor)Glycohämoglobine. Es hat sich
gezeigt, daß die Konzentrationen dieser drei Glycoproteine
bei an Diabetes mellitus leidenden Menschen und Tieren
oder schwangeren bzw. trächtigen Frauen bzw. Tieren erhöht
sind (vgl. L.A. Trivelli und Mitarbeiter in "New England
Journal of Medicine", Band 284, Seite 353 (1971),
König und Cerami in "Proceedings of the National Academy
of Sciences of United States of America", Band 72, Seite
3687 (1975) und König und Mitarbeiter in "Diabetes",
Band 25, Seite 1 (1976)). Der Grund für die Erhöhung der
HbA₁-Konzentration beruht vermutlich auf einer persistierenden
Hyperglykämie, die bei nicht-eingestellten Diabetikern
auftritt. Dies führt zu einer Modifizierung des
Hämoglobins A mit konstanter Geschwindigkeit während der
Lebensdauer des HbA₁ produzierenden roten Blutkörperchens.
Bei dem nicht-eingestellten Diabetiker kann der HbA₁-Spiegel
auf das 3- oder 4-fache erhöht sein. So beträgt beispielsweise
bei einem Gesunden die HbA₁- (glycosiliertes
Hämoglobin-)Konzentration 6 bis 9% des Gesamthämoglobins,
bei Diabetikern kann der HbA₁-Spiegel auf bis zu 20% (des
Gesamthämoglobins) erhöht sein. So stellt die Ermittlung
des HbA₁-Gehalts von Hämoglobin ein höchst geeignetes Mittel
zum Nachweis der Schwere der Glucoseintoleranz bei Diabetikern
dar. Infolge der verzögerten Änderung des HbA₁-Spiegels
spiegelt die HbA₁-Konzentration bei Diabetikern
den mittleren Blutglucosespiegel für den vorhergehenden Monat
und dergleichen wider.
HbA₁c stellt den Hauptbestandteil von HbA₁ (Glycohämoglobin)
dar, es kommt in normalen Erwachsenenerythrocyten in einer
Menge von 4 bis 7% vor. Die Aminosäuresequenz entspricht
dem Hämoglobin A, der einzige Unterschied besteht im Vorhandensein
einer Hexose an der Aminogruppe des endständigen
Valins der β-Kette. Die Bildung der Verbindung erfolgt
auf nicht-enzymatischem Wege. Zunächst bildet sich langsam
zwischen der endständigen Aminogruppe und dem freien Zucker
eine Schiff'sche Base, worauf eine Amadori-Umlagerung erfolgt:
In dem Formelschema bedeuten R' eine Proteinkette und R Wasserstoff
oder PO₃H₂. Die Eigenschaften von HbA₁c und der
anderen HbA₁-Komponenten sind von den Eigenschaften von normalem
Hämoglobin nur geringfügig verschieden.
Verfahren zur Bestimmung der HbA₁-Konzentration in Hämoglobin
sind in der Regel zeitraubend und langwierig und darüber
hinaus gegenüber geringfügigen Schwankungen des pH-Werts und
der Ionenstärke empfindlich. Es besteht folglich ein Bedarf
nach einem raschen und einfach durchzuführenden genauen Test.
Kynoch und Lehmann haben in "The Lancet", 2. Juli 1977, ein
Verfahren zur Bestimmung der HbA₁-Komponente von Hämoglobin
beschrieben. Dieses Verfahren besteht in einer chromatographischen
Trennung der HbA₁-Komponente von den HbA- und HbA₂-Komponenten
mit Hilfe eines handelsüblichen Kationenaustauscherharzes
(einer Maschenweite von 200 bis 400 mesh). Es
wird eine Fließgeschwindigkeit von 150 ml/h empfohlen, so
daß der Test in 2,5 h durchgeführt werden kann. Obwohl andere
Versionen dieses Verfahrens unter Verwendung von Ionen
austauscherharzen raschere Ergebnisse liefern können, erfordern
nichtsdestotrotz sämtliche Verfahren, die von der
Verwendung von Ionenaustauscherharzen abhängig sind, eine
genaue Steuerung des pH-Werts und der Ionenstärke.
Es wurde nun ein Verfahren zur Abtrennung von Glycoproteinen
von sonstigen Proteinen gefunden, das sich besonder gut
zur Verwendung bei Schnelltests der HbA₁-Komponenten von
Hämoglobin eignet. Es hat sich gezeigt, daß man mit Hilfe
des neuen Verfahrens diesen Test sehr rasch durchführen
kann. Darüber hinaus eröffnet die Erfindung einen größeren
Spielraum bezüglich pH-Wert und Ionenstärke, ohne daß die
Genauigkeit und Reproduzierbarkeit beeinträchtigt werden.
Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Abtrennen
von Glycoproteinen aus einer Probe, welches dadurch gekennzeichnet
ist, daß man mit der Probe ein Dihydroxyborylreagens
unter Bedingungen, die eine Komplexbildung zwischen
dem Glycoprotein und der Dihydroxyborylgruppe zulassen, in
Berührung bringt, die komplexgebundene Substanz vom Rest
der Probe trennt und gegebenenfalls die abgetrennte, komplexgebundene
Substanz unter Bedingungen, die eine Rückgewinnung
des Glycoproteins gestatten, reagieren läßt.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Ermittlung
der Glycoproteinmenge in einer Probe, welches dadurch
gekennzeichnet ist, daß man die geschilderte Abtrennung
durchführt und die Menge des abgetrennten oder rückgewonnenen
Glycoproteins bestimmt.
Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung abgetrennten Glycoproteine
bilden mit der Dihydroxyboryleinheit eines unlöslich
gemachten Reagens unter geeigneten Bedingungen Komplexe.
Wenn die Kohlenhydrat-prosthetische Gruppe des Glycoproteins
eine 1,2-Diolfunktion aufweist, bildet sich der
Komplex vermutlich durch doppelte Kondensation wie folgt:
Bei einer solchen Reaktion können jedoch auch andere als
1,2-Gruppen, insbesondere 1,3- und 1,4-Gruppen, teilnehmen.
Folglich dürfte es zur Komplexbildung für das Glycoprotein
nicht erforderlich sein, vic-Dioleinheiten aufweisen zu
müssen.
Das die Dihydroxyboryleinheit oder -gruppe bzw. den Dihydroxyborylliganden
aufweisende Reagens kann aus einer polymeren
Matrix oder einem sonstigen geeigneten festen oder flüssigen
Träger mit einem daran gebundenen oder damit assoziierten,
vorzugsweise kovalent daran gebundenen Phenylboron-, Bor-
oder sonstigen Boronsäureliganden erhalten werden. Die Bindung
des Liganden ist hierbei derart, daß die Dihydroxyboryleinheit
oder -gruppe zur Komplexbildung zur Verfügung steht.
Das Reagens kann in flüssiger Form vorliegen, so daß zur
Trennung des komplexgebundenen Glycoproteins eine Verteilung
durchgeführt werden kann. So erhält man beispielsweise
ein wäßriges zweiphasiges System unter Verwendung von 10%
(w/w) Polyäthylenglycol (vgl. Albertsson und Mitarbeiter
in "J. Steroid Biochem.", Band 4, Seite 537, (1973)). Das
die Dihydroxyboryleinheit oder -gruppe enthaltende Reagens
kann aus dem Liganden in einer der beiden Schichten eines
solchen zweiphasigen Systems bestehen, so daß eine Verteilung
des Glycoproteins bewirkt wird.
Die polymere Matrix kann aus einem natürlich vorkommenden
oder synthetischen Polymeren, insbesondere einem hydrophilen
Material, wie einem Polyacrylamid oder einem Agarose/
Polyacrylamid-Mischpolymerisat, Agarose, oder einem Polymerisat
mit freien Hydroxylgruppen, wie Cellulose, einem Cellulosederivat,
Stärke, Dextran oder einem vernetzten Dextran,
beispielsweise einem unter der Handelsbezeichnung
Sephadex vertriebenen vernetzten Dextran, einem Protein,
wie Wolle, oder Polyvinylalkohol, bestehen. Das polymere
Material kann gegebenenfalls vernetzt oder chemisch modifiziert
sein. Andere verwendbare polymere Materialien sind
die unter den Handelsbezeichnungen Sepharose vertriebene
Agarose, das unter der Handelsbezeichnung Sephacryl vertriebene
Mischpolymerisat aus Dextran und Acrylamid oder
das unter der Handelsbezeichnung Spheron vertriebene vernetzte
Hydroxyäthylmethacrylat, ferner mikroteilchenförmige
kugelige Affinitätsträger (vgl. US-PS 41 43 302), Nylon,
Polyester, wie Polyäthylenterephthalat, Celluloseacetat,
substituierte vernetzte Polystyrole, z. B. chlormethyliertes
Polystyrol, Metalloxide, poröse, mit hydrophilen organischen
Polymerisaten beschichtete keramische Materialien,
Glas oder sonstige geeignete Materialien.
Die Matrix bzw. der Träger kann die Form von Perlen oder
lagenförmigen Gebilden, z. B. Geweben oder sonstigen üblichen
gegossenen oder extrudierten Gebilden, aufweisen. Um
der Matrix eine ausreichende mechanische Festigkeit zu verleihen,
kann sie in einem Gelschlauch, in einer Säule, in
einem flachen Bett oder in einem formbaren Behälter gehalten
oder in Streifen aus beliebigen Materialien einschließlich
von "Peilstäben" (dip-sticks) ausgeformt sein. Das Verfahren
läßt sich unter Verwendung einer Säule oder in sonstiger
Weise kontinuierlich oder chargenweise durchführen.
Phenylboron-, Bor- oder sonstige Boronsäuren, wie Äthanboronsäure,
1-Propanboronsäure oder 3-Methyl-1-butanboronsäure,
lassen sich auf mechanischem, physikalischem oder
chemischem Wege an die polymere Matrix oder einen sonstigen
geeigneten festen oder flüssigen Träger binden. Der
Ligand kann physikalisch durch elektrostatische Kräfte,
z. B. durch Wasserstoff(brücken)bindungen, gehalten werden.
Andererseits und vorzugsweise kann der Ligand mit Hilfe
einer direkten kovalenten Bindung an die Matrix gebunden
sein. Ferner kann er an ein anderes Molekül oder an andere
Moleküle oder Molekülaggregate hohen oder niedrigen Molekulargewichts,
z. B. ganze Zellen, Bruchstücke derselben
oder Organellen oder Viren gebunden und mit dem "Wirt" zusammen
entweder auf mechanischem Wege (einschließlich eines
Einschlusses), physikalischem oder chemischem Wege an die
polymere Matrix gebunden werden. In der Regel ist es
erforderlich, daß die Phenylboron-, Bor- oder sonstige Boronsäure
derart an die Matrix gebunden ist, daß sie während
der folgenden Reaktion(en) unter Freilassung der Boronsäurehydroxylgruppen
nicht abgelöst werden. Erforderlichenfalls
kann die Matrix oder der Dihydroxyborylligand vor dem Kuppeln
der beiden aktiviert werden.
Beispiele für eine Aktivierung der polymeren Matrix vor der
anschließenden Dihydroxyborylligandenkupplung bildet die
Verwendung der in der Literatur beschriebenen folgenden
Substanzen und Techniken. Die Methoden werden gemäß den
funktionellen Gruppen an der Matrix ausgelistet:
1. -OH-Gruppe, z. B. Polysaccharide:
a)Cyanogenhalogenide
b)Triazine
c)Perjodatoxidation
d)p-Benzochinon
e)Bisoxirane
f)Divinylsulfon
g)Epichlorhydrin
h)Chloressigsäure und Halogenacetylhalogenide
i)p-Nitrobenzylchloride.
2. -NH₂-Gruppen, z. B. Polyacrylamide:
a)Aminoäthylierung
b)Desamidierung zu COOH
c)Hydrazid
d)Glutaraldehyd
3. Si-OH-Gruppen, z. B. Glas:
a)Silanisierung
4. COOH-Gruppen, z. B. Carboxymethylcellulose oder 2(b) oben:
a)N-Hydroxysuccinimidester
b)Goldstein-4-Zentrenreaktion
Die betreffenden Methoden sind in zahlreichen Veröffentlichungen
beschrieben.
Eine direkte oder indirekte Kupplung des Dihydroxyborylliganden
an die polymere Matrix erfolgt nach den im folgenden
aufgeführten Reaktionen. Die betreffenden Reaktionen
sind in der Literatur beschrieben und machen von geeigneten
funktionellen Gruppen am Liganden und der Matrix Gebrauch.
a)Cyanogenhalogenide
b)Carbodiimidkondensation
(1) H₂O-löslich
(2) H₂O-unlöslich
c)Bernsteinsäureanhydrid
d)bifunktionelle Reagentien
e)Divinylsulfon
f)Arylhalogenide
g)Alkylhalogenide
h)N-(substituiertes) Hydroxybernsteinsäureimid-Reaktion
i)Isothiocyanat
j)Diazotierung, z. B.
k)Thiolierung
l)Epichlorhydrin
m)Perjodatoxidation
n)gemischte Anhydridbildung
o)reduktive Alkylierung
p)Acylazidbildung.
a
Bei indirekter Kupplung können "Abstandhalter" zwischen dem
Dihydroxyborylliganden und der Matrix oder dem Träger vorliegen.
Hierbei handelt es sich um hydrophile Monomere oder
Polymere (Polyäthylenglycol), hydrophobe Monomere oder Polymere
(Polymethylen- oder Polyäthylenimin) oder aromatische
Brücken oder sonstige Kombinationen.
Ein Dihydroxyborylreagens erhält man auch durch Polymerisieren
eines Boronsäurederivats, z. B. von Dihydroxyboryl
phenylacrylamid.
Der Einsatz des Dihydroxyborylreagens im Rahmen des Verfahrens
gemäß der Erfindung erfolgt durch Darüberleiten oder
Hindurchleiten einer geeigneten, ein Glycoprotein enthaltenden
Probe über bzw. durch das Reagens oder durch Verteilen.
Das Reagens kann beispielsweise eine polymere Matrix
oder einen Träger in Form von Pellets oder Zylindern enthalten
und in dieser Form in eine Säule gepackt werden. In
diesem Falle wird dann eine glycoproteinhaltige geeignete
Lösung durch die Säule laufen gelassen. Andererseits kann
die Probe oder Lösung durch das Reagens mit einer Matrix
in Form einer porösen Folie passieren gelassen werden. Weiterhin
kann die Matrix in Form eines "Peilstabes" oder
als Teilchen in einem porösen Beutel ähnlich einem Teebeutel
vorliegen. Die Komplexbildung des Glycoproteins mit
dem Reagens wird in der Regel durch Erhöhen des pH-Werts
der Lösung verbessert.
Um während des gesamten Verfahrens aseptische Bedingungen
aufrechzuerhalten, hat es sich manchmal als zweckmäßig erwiesen,
dem System eine geringe Menge antimikrobielles Mittel,
z. B. ein Lösungsmittel, ein Antibiotikum oder ein Gift,
zuzusetzen. Ferner können dem Glycoproteingemisch andere
Biochemikalien, z B. KCN bei der Bestimmung von glycosyliertem
Hämoglobin, zugesetzt werden.
Wenn die Matrix bzw. der Träger in Form magnetischer Teilchen
vorliegt, kann die Trennung mit Hilfe eines Magneten
erfolgen.
Nicht-Glycoproteinmaterialien können aus einer Säule unter
Verwendung einer geeigneten Waschlösung, z B. eines Puffers
oder Lösungsmittels, eines sonstigen biochemischen Reagens
oder auf elektrophoretischem Wege eluiert werden. In der
Regel muß hierbei darauf geachtet werden, daß durch diese
Maßnahme das spezifisch gebundene Glycoprotein, das mit
dem Reagens in der Säule oder in dem "Peilstab" reagiert
hat, nicht desorbiert wird.
Eine Rückgewinnung des Glycoproteins erreicht man gegebenenfalls
unter Anwendung üblicher chemischer oder physikalischer
Desorptionsverfahren, beispielsweise durch Darüberleiten
oder Hindurchleiten der eine Desorption verursachenden
Substanz(en) über bzw. durch das Reagens oder durch
Herbeiführen von Änderungen des pH-Werts oder sonstiger
Bedingungen, die vorher die Adsorption erleichtert haben.
Beispiele für geeignete Desorptionsmaßnahmen sind eine
Ligandenkonkurrenz, eine Inhibitorkonkurrenz spezifischer
oder nicht-spezifischer Natur (z. B. Einführen von Sorbit
oder Zuckern oder sonstiger Diole oder Alkohole, die das
gebundene Glycoprotein verdrängen), Änderungen des Lösungsmittels,
des Puffers und/oder des pH-Werts und Änderungen
in der Ligandenkonzentration.
Die Desorption des Komplexes aus polymerer Matrix und Borsäure,
beispielsweise Phenylboronsäure, erfolgt vorzugsweise
derart, daß die Dihydroxyboryleinheit oder -gruppe
nicht von der Matrix entfernt wird, so daß diese wieder
verwendbar ist.
Die Bestimmung des rückgewonnen Glycoproteins kann nach
üblichen biochemischen Verfahren oder durch Berechnen der
prozentualen Menge an insgesamt eingesetztem Protein mit
Hilfe von Adsorptionsmessungen bei bestimmten Wellenlängen
erfolgen. Das Glycoprotein kann in noch komplexgebundenem
Zustand geschätzt werden.
Reaktionsfähige Dihydroxyborylreagentien werden in der Literatur
beschrieben (vgl. beispielsweise C.H. Elliger und
Mitarbeiter in "J. Chromatography", Band 104, Seite 57-61 (1975)).
Beispiele hierfür sind N-(m-Dihydroxyborylphenyl)-carbamyl
methylcellulose, Borsäuregel, {2-(Diäthyl)-[p-(trihydroxyborato)-
benzyl]-ammonio)-äthyl}-Sephadex und sonstige modifizierte
Polymerisate.
Die Erfindung betrifft ferner durch Reagierenlassen eines
vorzugsweise unbeweglich gemachten Dihydroxyborylreagens
der beschriebenen Art mit einem Glycoprotein gebildete
Komplexe.
Wie bereits erwähnt, eignet sich das Verfahren gemäß der
Erfindung in besonders geeigneter Weise zur Trennung glycosylierter
Hämoglobine HbA₁c von den nicht-glycosylierten
Hämoglobinen, wie HbA und HbA₂ . Folglich eignet sich das
Verfahren zur Schnellbestimmung des Gehalts von lysiertem
Humanblut an glycosyliertem Hämoglobin zur Überwachung der
Behandlung von Diabetikern.
Die bei der Durchführung solcher Maßnahmen einzuhaltenden
Stufen lassen sich wie folgt zusammenfassen:
- 1. Binden von glycosyliertem Hämoglobin aus lysiertem Blut an ein unbeweglich gemachtes oder trennbares Dihydroxyborylreagens.
- 2. Abtrennung der nicht-glycosylierten Hämoglobine durch Waschen oder Entfernen des erhaltenen Komplexes, beispielsweise durch Entfernen der "Peilstäbe" oder durch Verteilen.
- 3. Schätzen bzw. Berechnen des glycosylierten Hämoglobins entweder in situ an oder in dem Reagens oder nach Entfernung von dem Reagens.
Das Verfahren kann beispielsweise in einer einfachen Form
zum Testen einer Standardmenge lysierten Bluts durch Einbringen
eines Reagens in Form eines an einen "Peilstab"
gebundenen Dihydroxyborylliganden in das lysierte Blut herangezogen werden.
Auf dem "Peilstab" bildet sich der glycosylierte Hämoglobinkomplex
und wird nach beendeter Aufnahme aus dem lysierten
Blut entfernt. Der nun rotgefärbte "Peilstab" wird
nach dem Waschen mit einem Puffer mit einer vorgeeichten
Standardfarbkarte verglichen, wobei man den prozentualen
Gehalt des lysierten Bluts an glycosyliertem Hämoglobin
angeben kann.
Gegebenenfalls können die glycosylierten Hämoglobine nach
einem der geschilderten Gewinnungsverfahren, beispielsweise
durch konkurrierende Inhibierung unter Verwendung
eines Zuckers, wie d-Glucose, von dem Reagens freigesetzt
werden. Danach kann die prozentuale Menge an rückgewonnenem
glycosyliertem Hämoglobin, beispielsweise durch Absorptionsmessung
bei einer Wellenlänge von 413 nm, geschätzt
oder bestimmt werden.
Ein geeignetes Reagens zur Bestimmung des Gehalts einer Blutprobe
an glycosyliertem Hämoglobin enthält folgende Bestandteile:
(1) einen Reaktionspartner für das in der lysierten
Probe enthaltene glycosylierte Hämoglobin mit einer an
einen Träger gebundenen Dihydroxyborylgruppe und (2) einen
Puffer, der den pH-Wert der lysierten Blutprobe in einem
Bereich von 7,5 bis 9 zu halten vermag.
Vorzugsweise besitzt der Puffer in Lösung eine Ionenstärke
von 0,1 bis 0,5.
Bevorzugte Reagentien enthalten ferner als dritten Bestandteil
ein Lysiermittel für die Blutprobe, beispielsweise
eine Lösung mit 0,1% Saponin, und vorzugsweise enthält das
Lysiermittel zusätzlich noch Kaliumcyanid zur leichteren
kolorimetrischen Bestimmung von Hämoglobin und/oder glycosyliertem
Hämoglobin.
Zur Desorption des glycosylierten Hämoglobins von dem Reagens
zur quantitativen Isolierung bzw. Bestimmung und/oder
zur Wiederverwendung des Reagens kann man als Eluiermittel
einen Puffer eines pH-Werts von unter 7,5, einen Puffer
eines pH-Werts von 7,5 bis 9 mit Borsäure oder eine Alkyl-
oder Arylboronsäure in einer Menge von 0,05 bis 1 M
oder vorzugsweise mit 0,05 bis 1, in der Regel 0,5 m Diolzucker,
z. B. Glucose, Sorbit oder Ribose, verwenden.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.
a) Dieses Beispiel veranschaulicht die Bestimmung von glycosylierten
Hämoglobinen in lysiertem Humanblut.
In einem Abzug wird nach dem im folgenden geschilderten Verfahren
Phenylboronsäure an ein Polysaccharid, beispielsweise
an Agarose in Perlenform (Sepharose 4B) gebunden.
20 ml (etwa 20 g Nettogewicht) Sepharose werden gewaschen
und auf eine Temperatur von 4°C gekühlt, worauf 20 ml eines
kalten 2m-Bicarbonat/Carbonat-Puffers eines pH-Werts von
11 zugegeben werden. Danach wird das Gemisch schwach gerührt.
Danach wird das Sepharosegemisch langsam mit einer
gekühlten Lösung von 2 g Cyanogenbromid in 4 ml N-Methylpyrrolidon
versetzt. Das Gemisch wird nach Zugabe der letzten
Menge der Cyanogenbromidlösung 8 min lang gerührt,
worauf die erhaltene Aufschlämmung filtriert und rasch
mit eiskaltem 8% (v/v) Aceton und eiskaltem 0,1m-Bicarbonatpuffer
eines pH-Werts von 9 gewaschen wird. Nach Entfernung
des überschüssigen Puffers von der gewaschenen Aufschlämmung
wird diese in eine Lösung von 1 g m-Aminophenylboronsäure
in 20 ml 0,1m-Bicarbonatpuffer eines pH-Werts
von 9 eingetragen und darin 18 h lang bei einer Temperatur
von 0° bis 4°C inkubiert. Danach wird die nicht-gebundene
Phenylboronsäure weggewaschen. Die polymere Matrix wird in
eine 1 ml fassende Chromatographiersäule gefüllt und darin
so lange mit Natriumphosphatpuffer eines pH-Werts von 7
gewaschen, bis der gesamte nicht-umgesetzte Phenylboronsäureligand
entfernt ist. Dies wird durch Überwachen der
Waschlösung mit UV-Licht ermittelt.
b) Einem gesunden Individuum werden in Äthylendiamin
tetraessigsäure in einer geeigneten Flasche 5 ml Blut entnommen,
worauf das Blut schwach mit der Äthylendiamintetraessigsäure
gemischt wird. 0,5 ml des hierbei erhaltenen
anitkoagulierten Bluts werden in ein konisches 10 ml fassendes
Zentrifugierröhrchen gefüllt und mit isotonischer
Kochsalzlösung auf 10 ml aufgefüllt. Danach wird das Ganze
5 min lang bei 3000 Upm zentrifugiert. Die überstehende
Flüssigkeit wird verworfen. Das aus roten Blutkörperchen
bestehende Pellet wird mit Hilfe von 0,8 ml einer Lysierlösung
mit 0,1% Saponin und 0,5% KCN lysiert. Nach einminütigem
Stehenlassen bei Raumtemperatur wird das lysierte
Blut mit Natriumphosphatpuffer eines pH-Werts von 7 mit
0,65 g KCN pro 1 l Puffer auf 10 ml aufgefüllt und 5 min
bei 3000 Upm zentrifugiert. Hierauf wird die überstehende
Flüssigkeit abgetrennt. 2 ml derselben werden über die in
der geschilderten Weise hergestellte Phenylboronsäuresäule
mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 60 ml/h laufen gelassen.
Das Eluat wird in 25 ml fassenden volumetrischen
Kolben gesammelt, worauf die Säule so lange mit Natriumphosphatpuffer
gewaschen wird, bis in der Waschflüssigkeit
kein Hämoglobin mehr nachgewiesen werden kann. Die
Desorption der Säule erfolgt mit Hilfe des 0,5m-d-Glucose
enthaltenden Natriumphosphatpuffers. Das erhaltene Desorbat
wird in 10-ml-volumetrische Kolben gesammelt. Zur Wiederverwendung
wird die Säule in Natriumphosphatpuffer eines
pH-Werts von 7 auf den Gleichgewichtszustand eingestellt.
Die Adsorption A bei einer Wellenlänge von 413 nm (für
Hämoglobin spezifisch) wird für beide Lösungen ermittelt,
worauf folgende Berechnungen durchgeführt werden:
Ergebnisse:
Desorbat (10 ml)0,018
Eluat (25 ml)0,092
Dieses Beispiel veranschaulicht, daß die Phenylboronsäuresäule
in dem Beispiel 1 beschriebenen System für glycosyliertes
Hämoglobin spezifisch ist.
Von einem anderen gesunden Individuum gesammeltes Blut wird
in genau der im Beispiel 1 geschilderten Weise behandelt,
worauf der prozentuale Gehalt an glycosyliertem Hämoglobin
bestimmt wird.
Blut desselben Individuums wird ferner nach dem von P.A.M.
Kynoch und H. Lehmann in "The Lancet", 2. Juli 1977, Seite 16,
beschriebenen Verfahren unter Verwendung des Austauscherharzes
Amberlite Resin cg50 Type II (200 mesh) anstelle
des Bio-rex-70-Kationenaustauscherharzes auf seinen Gehalt
an glycosyliertem Hämoglobin hin untersucht.
Ergebnisse:
Phenylboronsäure-Verfahren des Beispiels 15,34% glycosyliertes Hämoglobin
Verfahren nach Kynoch und Lehmann5,45% glycosyliertes Hämoglobin
Dieses Beispiel veranschaulicht die Spezifität der unbeweglich
gemachten Phenylboronsäure für glycosyliertes Hämoglobin
unter Verwendung vorher gereinigter Zubereitungen.
Blut eines gesunden Individuums wird nach dem von Kynoch
und Lehmann aaO beschriebenen Verfahren auf seinen Gehalt
an glycosyliertem Hämoglobin untersucht. Bei diesem Verfahren
wird Hämoglobin in zwei unterschiedliche Fraktionen,
nämlich (1) Hb glycosyliert und (2) Hb A + A₂, getrennt.
Beide Fraktionen werden nach diesem Verfahren dargestellt
und in dem im Beispiel 1 beschriebenen Natriumphosphatpuffer
eines pH-Werts von 7 gesammelt. Jede Fraktion wird
entsprechend Beispiel 1 über die Phenylboronsäuresäule
laufen gelassen. Die prozentuale Rückgewinnung an beiden
Bestandteilen beträgt:
Hb A + A₂ (nicht-glycosyliert) 0,457%
Hb A glycosyliert44,79%
Eine 100%ige Rückgewinnung des glycosylierten Hb A wird
nicht erreicht, was zeigt, daß die Säule gesättigt ist.
Die Bindung von nicht-glycosyliertem Hämoglobin ist vernachlässigbar.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Retention eines Glycoproteins
in Form eines spezifischen Schwangerschaftsproteins
1(sp₁) auf einer Phenylboronsäure/Sepharose-Säule.
(a) 1 g CNBr-aktiviertes Agarosegel in Perlenform wird
15 min lang auf einem Glasfilter mit 10-3m-HCl-Lösung (200 ml)
gequollen und gewaschen. Ferner werden etwa 10 mg Meta
aminophenylboronsäure in 0,1m-NaHCO₃-Pufferlösung mit 0,5m-NaCl
(5 ml) gelöst, worauf die erhaltene Lösung mit dem Gel
in einem Teströhrchen gemischt wird. Die erhaltene Mischung
wird 2 h lang bei einer Temperatur von 4°C Ende-über-Ende
rotieren gelassen (man kann auch andere schwache Rührmaßnahmen
anwenden, Magnetrührer sollten jedoch nur mit größter
Sorgfalt zum Einsatz gelangen, um ein Brechen der Gelperlen
zu vermeiden). Nicht-gebundenes Material wird mit dem Kupplungspuffer
weggewaschen, etwa noch vorhandene aktive Gruppen
werden während 1 bis 2 h mit 1M-Äthanolamin bei einem
pH-Wert von 8 reagieren gelassen. Es werden drei Waschzyklen
durchgeführt, jeder Zyklus besteht im Waschen bei einem
pH-Wert von 4 mit Hilfe eines 0,1m-Acetatpuffers mit 1m-NaCl
und in einem Waschen bei einem pH-Wert von 8 mittels
eines 0,1m-Boratpuffers mit 1m-NaCl.
(b) Die Säule wird durch Waschen mit einem Phosphatpuffer
eines pH-Werts von 7 in den Gleichgewichtszustand
gebracht, worauf ene Reaktion mit einer Plasmaprotein,
insbesondere sp₁ (spezifisches Schwangerschaftsprotein 1)
enthaltenden Lösung ablaufen gelassen wird.
Das gesamte sp₁ wird zurückgehalten (wie die Polyacrylamidgel
elektrophorese und eine Radialimmunodiffusion zeigen)
und mit Sorbit (20 mM in 0,1m-Phosphatpuffer: 14 ml) eluiert.
sp₁ eingesetzt:60 mg
sp₁ eluiert:60 mg.
Dieses Beispiel veranschaulicht die Trennung der alkalischen
Glycoproteinphosphatase von Kälbereingeweidemucosa.
Eine gemäß Beispiel 4(a) hergestellte Säule wird mit einem
Phosphatpuffer (oder HEPES) eines pH-Werts von 8 bis 8,4
gewaschen.
Eine Proteine aus Kälbereingeweidemucosa, insbesondere alkalische
Phosphatase (etwa 100 IE Enzym) enthaltende Lösung
und 1m-NaCl werden auf die Säule aufgegeben. Die gesamte
alkalische Phosphatase wird in der Säule festgehalten.
Nach dem Waschen zur Entfernung von nicht-gebundenem
Protein wird das Enzym mit Hilfe von Sorbit (20 mM) eines
pH-Werts von 8 bis 8,4 (HEPES-Puffer) entfernt. Etwa 90
bis 100% der enzymatischen Aktivität lassen sich wiedergewinnen.
Durch Waschen von 10 ml Agarosegelperlen (Sepharose 6B) mit
destilliertem Wasser auf einer Glasfritte und Entfernen
des in den Zwischenräumen befindlichen Wassers durch Vakuumfiltration
wird ein Reaktionspartner vorbereitet. Das
Gel wird in 6 ml einer 1m-Natriumhydroxidlösung mit 2 mg/ml
Natriumborhydrid und 5 ml 1,4-Butandioldiglycidyläther suspendiert,
worauf die Reaktionsteilnehmer unter schwachem
Rühren bei Raumtemperatur über Nacht reagieren gelassen
werden. Danach wird das Gel gründlich mit destilliertem
Wasser bei einer Temperatur von 5°C gewaschen. Die Umsetzung
läßt sich wie folgt darstellen:
Das aktivierte Produkt wird danach einige Monate lang in
der Kälte gelagert, ohne daß sich die Zahl der Oxirangruppen
merklich vermindert. Bei kürzerer Reaktionsdauer oder
einer niedrigeren Konzentration an dem Bisepoxid bilden
sich weniger Oxirangruppen.
Andere zur Aktivierung ebenso gut verwendbare Alkandiol
diglycidyläther sind 1,3-Propandioldiglycidyläther, 1,5-
Pentandioldiglycidyläther, 1,6-Hexandioldiglycidyläther,
2,5-Hexandioldiglycidyläther und andere Alkandioldiglycidyläther
oder aliphatische Diepoxide mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen.
Die Kupplung des aktivierten Produkts mit einer Dihydroxyboryleinheit
oder einem Dihydroxyborylliganden erfolgt
durch Vermischen des Produkts mit einem alkalischen Medium
(0,2m-Natriumcarbonat eines pH-Werts von 11 bis 12) mit
50 bis 500 mg m-Aminophenylboronsäure. Höhere Konzentrationen
an dem Liganden in dem Reagens erreicht man durch 24-stündiges
Verrühren bei einer Temperatur von 40°C. Danach
wird das Gel mit reichlich destilliertem Wasser gewaschen
und bei einer Temperatur von 4°C gelagert. Das Reagens besitzt
folgende Formel:
Das erhaltene Reagens ist besser als andere, da es aufgrund
seiner Herstellung keine anderen geladenen Gruppen enthält.
Solche anderen geladenen Gruppen können in dem Mittel zu
unerwünschten Ionenaustauscheigenschaften führen. Aus
einer Analyse der Waschflüssigkeit läßt sich abschätzen,
daß an das Agarosegel etwa 20 mg/ml Phenylboronsäure gebunden
sind.
Anstelle der m-Aminophenylboronsäure können auch andere aminosubstituierte
Alkyl- oder Arylboronsäuren zum Einsatz gelangen.
Eine gemäß Beispiel 1 entnommene und behandelte Blutprobe
(bei der Behandlung wird allerdings die Lysierlösung mit
dem Phosphatpuffer vereinigt) enthält im Überstehenden bei
einem pH-Wert von 6,7 schätzungsweise 10 bis 12% Hämoglobin.
0,5 ml der Blutprobe werden über eine Säule mit 2 ml des
in der geschilderten Weise hergestellten Reagens mit einer
Geschwindigkeit von 20 ml/h laufen gelassen, worauf die
Säule mit 0,1m-Phosphatpuffer eluiert wird.
Es werden mehrere Säulen hergestellt, die jeweils 2 ml des
in der geschilderten Weise hergestellten Reagens enthalten.
Über die verschiedenen Säulen wird jeweils mit einer Geschwindigkeit
von 20 ml/h 0,5 ml der Blutprobe fließen gelassen.
Danach wird jede Säule bei unterschiedlichen pH-Werten
mit einem 0,1m-Phosphatpuffer eluiert, um die prozentuale
Menge an gebundenem Hämoglobin zu bestimmen. Die
Bestimmung erfolgt durch Absorptionsmessungen bei 413 nm
bzw. 540 nm. Hierbei werden folgende Ergebnisse erhalten:
Ferner wird der Einfluß einer höheren Salzkonzentration des
Puffers ermittelt, indem Puffer zum Einsatz gelangen, die
zusätzlich 0,5m-KCl enthalten.
Den Ergebnissen ist zu entnehmen, daß das Reagens über einen
breiten Bereich von Ionenstärken (sowohl in An- als auch in
Abwesenheit von zusätzlichem Salz) einen sehr zuverlässigen
Test bei pH-Werten zwischen etwa 8 und 9 ermöglicht. Bei
einer Ionenstärke von 0,1m ist die Bindung bei pH-Werten
zwischen etwa 7,5 und 9 konstant. Selbst bei relativ hohen
Hämoglobinkonzentrationen in der auf diese Säulen aufgegebenen
Probe ist keine Sättigung der Säulen feststellbar.
Der Auftrag von weniger als etwa 2 mg Hämoglobin pro
Säule liefert jedoch ungünstige Ergebnisse. Eine Änderung
der Fließgeschwindigkeit von 5 bis 30 ml/h und der Temperatur
von 4° bis 23°C beeinflußt die prozentuale Bindung
nicht.
Die im vorliegenden Falle hergestellten Säulen binden auch
Glucose. Diese kann somit als konkurrierender Ligand in
einem geeigneten Puffer zur Desorption des glycosylierten
Hämoglobins verwendet werden. Ferner können die Säulen
auch mit einem 0,1m-Phosphatpuffer eines pH-Werts von 8,5
mit 0,1m-Borsäure desorbiert werden.
Claims (7)
1. Verfahren zum Trennen von Glycoproteinen von in einem
Gemisch mit diesen vorliegenden nicht-glycosylierten Proteinen,
dadurch gekennzeichnet, daß man das betreffende Gemisch
mit einem Reagens mit an einem Träger gebundener
Dihydroxyborylgruppe zur Bildung eines Glycoprotein/Dihydroxyboryl-
Komplexes in Berührung bringt und danach den Komplex
von dem Gemisch trennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Reagens mit an den Träger kovalent gebundener
Dihydroxyborylgruppe verwendet.
3. Verfahren zum Nachweis von glycosyliertem Hämoglobin
in Blut, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Blutprobe lysiert, aus der lysierten Probe Zellbruchstücke abtrennt,
die lysierte Probe mit einem selektiven Reagens mit an
einen Träger kovalent gebundener Dihydroxyborylgruppe zur
Bildung eines Komplexes der Dihydroxyborylgruppe mit dem
glycosylierten Hämoglobin in der Probe in Berührung bringt,
den gebildeten Komplex aus der Probe abtrennt und die Menge
an glycosyliertem Hämoglobin in dem Komplex bestimmt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Menge des glycosylierten Hämoglobins kolorimetrisch
bestimmt.
5. Reagens zur Bestimmung des Gehaltes einer Blutprobe
an glycosyliertem Hämoglobin, dadurch gekennzeichnet, daß
es (1) aus einem Reaktionspartner für das glycosylierte
Hämoglobin mit einer an einen Träger gebundenen Dihydroxyborylgruppe
und (2) einem zur Einstellung des pH-Werts
der Blutprobe auf einen Wert von etwa 7,5 bis 9 fähigen
Puffer besteht.
6. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß es als weiteren Bestandteil ein Mittel zum Lysieren
der Blutprobe enthält.
7. Reagens nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß es als Reaktionspartner für das glycosylierte Hämoglobin
Agarose in feinteiliger Form mit daran kovalent gebundener
Dihydroxyborylgruppe enthält.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19792933832 DE2933832A1 (de) | 1979-08-21 | 1979-08-21 | Verfahren zur trennung von glycoproteinen von mit ihnen gemischten, nichtglycosylierten proteinen, verfahren zur bestimmung von glycosyliertem haemoglobin in blut und dabei verwendete reagentien. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19792933832 DE2933832A1 (de) | 1979-08-21 | 1979-08-21 | Verfahren zur trennung von glycoproteinen von mit ihnen gemischten, nichtglycosylierten proteinen, verfahren zur bestimmung von glycosyliertem haemoglobin in blut und dabei verwendete reagentien. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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DE2933832A1 DE2933832A1 (de) | 1981-03-26 |
DE2933832C2 true DE2933832C2 (de) | 1988-07-07 |
Family
ID=6078954
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Country Status (1)
Country | Link |
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DE (1) | DE2933832A1 (de) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4409335A (en) * | 1982-05-28 | 1983-10-11 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method for eliminating glucose dependent Schiff base effect from hemoglobin A1 assay |
EP0446285A4 (en) * | 1988-12-05 | 1993-03-10 | Primus Corporation | Method for determination of glycated proteinaceous species |
-
1979
- 1979-08-21 DE DE19792933832 patent/DE2933832A1/de active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2933832A1 (de) | 1981-03-26 |
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