DE2923957A1 - Bezugskontrollreagenz fuer die haematologische mehrfachanalyse und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Description

Patentanwälte

Dlpl.-ing. E. Eder -6 -

Dipl.- Ing. K. Schieschke
»Mönchen 40, Eli8üae;lutraBe34

COULTER ELECTRONICS, INC, Hi a 1eah/Florida

Bezugskontrollreagenz für die hämatologische Mehr fachanalyse und Verfahren zu dessen Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Bezugskontroi 1reagenz und ein Verfahren zu dessen Herstellung nach dem Oberbegriff des Patentanspruches 1 bzw. 15.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein stabiles hämatologisches Bezugskontrollreagenz für die üblichen medizinischen diagnostischen Verfahren zur Analyse und zum Testen einer Blutprobe eines Patienten zur Durchführung der üblichen Bestimmungen bezüglich der Blutprobe. Die Erfindung schafft im einzelnen ein Diagnosetest-Kontrollreagenz mit Zusätzen, die dem Kontrollreagenz die Fähigkeit verleihen, die gewünschten Blutplättchen-Parameter der Blutprobe des Patienten und auch die sieben üblichen Bestimmungen oder Parameter bezüglich der Blutprobe zu überwachen. Die Erfindung schafft mit anderen Worten ein einziges hämatologisches Bezugskontrollreagenz, das anwendbar ist zur Überwachung der Genauigkeit und Fehl er frei heit der üblichen hämatologischen Messungen oder Bestimmungen, d.h. der Zahl der roten Blutkörperchen (RBZ),der Zahl der weißen Blutkörperchen (WBZ), des Hämatokrits (HKT), des Hämoglobins (HGB), des mittleren korpuskularen Hämoglobins (MKH), des mittleren korpuskularen Volumens (MKV) und der mittleren korpuskularen Hämoglobinkonzentration (MKHC), und das auch als Kontrollreagenz verwendbar ist zur überwachung der Fehlerfreiheit und Genauigkeit der Messung und Bestimmung der Blutplättchenparameter, etwa der Blutplättchenzählung, des mittleren Blutplättchenvol umens,der Blutplättchenvolumenfraktion (Thrombozytenwert) und der Blutplättchenverteilungsbreite unter Verwendung

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desselben gesamten Blutprodukts, das für gewöhnlich zur Kontrolle der vorher genannten, üblichen hämatologischen Parame-' ter verwendet wird.

Es ist ein übliches medizinisches diagnostisches Vorgehen, eine Blutprobe eines Patienten zu analysieren und zu testen, um bezüglich der Blutprobe gewisse übliche Bestimmungen zu machen. Dieses Vorgehen ist ein wichtiges diagnostisches Werkzeug für den Arzt. Als Ergebnis des modernen technologischen Fortschritts wurden automatisierte Instrumente entwickelt, die eine Blutprobe eines Patienten aufnehmen und diese automatisch und kontinuierlich verarbeiten zur Lieferung der oben als die sieben üblichen Parameter einer Blutprobe beschriebenen Parameter oder Bestimmungen. Ein Instrument, das eine Blutprobe eines Patienten aufnimmt, und diese automatisch und kontinuierlich verarbeitet zur Lieferung dieser sieben angegebenen üblichen Parameter oder Bestimmungen ist in der US-PS 3 549 994 beschrieben. Diese Patentschrift liefert annehmbare Definitionen dieser Paramler und untersucht die bei der Handhabung der Blutprobe zu lösenden Probleme, wenn diese Probe durch das Fluidsystem der Vorrichtung nach dieser Patentschrift gezogen wird.

Die Inhaberin, die Coulter Electronics, Inc., aus Hialeah/Florida, U.S.A., produziert und verkauft andere Blutkörperchenzähl- und -analysierinstrumente, die weniger ausgeklügelt als die Vorrichtung nach der US-PS 3 549 994 sind, die aber so betrieben werden, daß die Zahl der roten und weißen Blutkörperchen, die Hämoglobinkonzentration und deren zusammengestellte Indizes, wie HKT, MKV, MKH und MKHK, bestimmt werden.

Beim Gebrauch eines derartigen Instruments, auf das gelegentlich unter dem Warenzeichen "COULTER COUNTER" der Firma Coulter Electronics, Inc. Bezug genommen wird, muß ein Mehrzweck-Verdünnungsmittel mit einem Elektrolyt verwendet werden, das die Ausführung der elektronischen Messungen durch das COIiLTER-COUNTER v-i-Instrument ermöglicht. Ein geeignetes Mehrzweck-Verdünnungsmittel für die Blutanalyse durch ein elektronisches Instrument, wie den COULTER-COUNTER®, ist in der US-PS 3 962 125 beschrieben.

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Ein geeignetes Reagenz zur Bestimmung der weißen Blutkörperchen und des Hämoglobins in der Blutprobe durch ein schnell arbeitendes automatisches hämatologisches Instrument, etwa den Coulter-Counter ^» ist in der US-PS 3 874 852 beschrieben. Das in dieser Patentschrift beschriebene Reagenz ist ein lysierendes Reagenz zur Umwandlung von Hämoglobin in ein Chromogen zur Durchführung der gewünschten Bestimmungen.

Die Coulter Electronics, Inc., hat bisher ein hämatologisches Bezugskontrollreagenz für die Genauigkeit der elektronischen Schätzung der Blutkörperchenwerte geliefert, das zusammen mit den o.a. verdünnenden und lysierenden Reagenzien arbeitet. Ein derartiges Bezugskontroilreaqenz wurde von der Coulter Electronics unter deren Warenzeichen 4C^ geliefert und besteht aus einem aus frischem menschlichem Blut bereiteten hämatologisehen Gesamtblut-BezugskontrolIreagenz. Zur Simulierung von weißen Blutkörperchen wurden fixierte rote Blutkörperchen zugesetzt. Dieses Bezugskontrollreagenz hatte sieben bekannte Blutwerte, die während einer gewünschten Zeitdauer stabil waren. Das Bezugskontrollreagenz wurde bereitet zur Verwendung mit dem COULTER COUNTER^- mit zugehörigen Rechnern für den Hämatokrit für mittleres korpuskulares Volumen und mit Hämoglobinominatoren. Bei Verwendung mit dem oben definierten Blutverdünnungsmittel diente es zur Prüfung der Fehlerfreiheit der Verdünnung, der Zahl der roten Blutkörperchen und der MKV-Hämatokrit-Rechnereichung. Nach dem Zusetzen eines lysierenden Reagenz diente das Bezugskontrollreagenz zur Prüfung der Zahl der weißen Blutkörperchen. Auf diese Weise wurde das hämatologische 4C^- Bezugskontroi 1 reagenz im COULTER-COUNTER ^ verwendet zur elektronischen Schätzung der roten und weißen Blutkörperchen, des Hämatokrits, des mittleren korpuskularen Volumens, des Hämoglobins, des mittleren korpuskularen Hämoglobins und der mittleren korpuskularen Hämoglobinkonzentration. Zur Verwendung mit dem COULTER COUNTER ^/standen auch andere hämatologischen Bezugskontrollreagenzien zur Verfügung, die stabilisierte Suspensionen aus menschlichen roten Blutkörperchen enthielten, etwa das Produkt Baker Haern-C vJder J.P. Baker Chemical Corporation oder das Produkt CH-60^der Dade Reagent Company of Hialeah/Florida, U.S.A. Jedoch konnte keines dieser genannten hämatologischen Kontrol1reagenzien zum Testen der Genauigkeit der

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Messungen der Blutplättchenparameter verwendet werden. Folglich mußte zur Durchführung derartiger Bestimmungen eine gesonderte' Kontrolle zur überwachung der Blutplättchenparameter durchgeführt werden. Mit anderen Worten, es mußte eine gesonderte Kontrolle für die Blutplättchenbestimmungen durchgeführt werden, wobei die hämatologischen Kontrollreagenzien zur Durchführung der sieben üblichen Messungen oder Parameterbestimmungen nicht bei Blutplättchenkontrol1 funktionen angewendet werden konnten.

Ferner war die bisherige Blutplättchenzählung unangemessen aufgrund des Mangels an stabilen Blutplättchenkontrollreagenzien mit anderen Blutkomponenten, nämlich roten Blutkörperchen. Somit erzeugte die zunehmende Verfügbarkeit von Instrumenten zur Unterscheidung von Blutplättchen von roten Blutkörperchen und zur automatischen Durchführung von Blutplättchenzählungen einen großen Bedarf an stabilen Kontroll produkten mit Blutplättchen und roten Blutkörperchen.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Bezugskontroi 1reagenz für die hämatologische Mehrfachanalyse und ein Verfahren zu dessen Herstellung, insbesondere unter Vermeidung der oben angegebenen Nachteile des Standes der Technik.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch den Gegenstand des Patentanspruches 1, 8 bzw. 15.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.

Das einzige hämatologische Kontrollreagenz der Erfindung hat die Fähigkeit zur Überwachung der Blutplättchenparameter und auch der sieben üblichen Parameter für hämatologische Messungen. Dieses hämatologische Kontrollreagenz hat den Vorteil, daß es das Erfordernis für ein gesondertes Kontrollmaterial zur überwachung der Blutplättchenparameter beseitigt und eine bedeutungsvollere Bestimmung der Blutplättchenparameter dadurch ergibt, daß die möglicherweise störenden roten Blutkörperchen und deren

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Metabolite , die normalerweise in Blutproben von Patienten beobachtet werden, im Kontrollmaterial der Erfindung vorliegen. Dies ist insbesondere für Blutplättchenzählungen wichtig, die mit manuellen Methoden unter Verwendung der Licht- oder Phasenmikroskopie durchgeführt werden, wo seitens der Labortechniker höchste Geschicklichkeit erforderlich ist, um die Blutplättchen angemessen von den roten Blutkörperchen und anderen Zellenmaterialien zu unterscheiden. Die Erfindung liefert auch eine Einrichtung zur überwachung dieser Messungen unter Verwendung der Handmethode oder von automatisierten oder halbautomatisierten hämatologisehen Instrumenten für hämatologisehe Messungen zusammen mit einer Einrichtung zum Testen der Genauigkeit der Blutplättchenzählung, des mittleren Blutplättchenvolumens, der Blutplättchenvolumenfraktion (Thrombozytwert) und der Blutplättchenverteilung, wobei dem Bezugskontroi 1reagenz der Erfindung das gesamte Blutprodukt zugrundegelegt wird, das für gewöhnlich zur Kontrolle der üblichen sieben hämatologisehen Parameter verwendet wird.

Die Erfindung besteht aus einem stabilen Gesamtblut-Kontrol1 reagenz mit Blutplättchen, bereitet durch Zusetzen von frisch gelieferten menschlichen oder tierischen Blutplättchen, die entweder natürlich entnommen oder durch chemische oder physikalische Fixierung konserviert wurden meinem herkömmlichen, im Handel erhältlichen hämatologisehen Kontrol1reagenz für das gesamte Blut, etwa wie das 4C^, Baker Haem-C® oder Dade CH-60 ~ Solche her komm! ichen, im Handel erhältlichen hämatol ogi schei Kontrol 1 reagenzien flir das gesamte Blut werden gemäß der Erfindung durch Hinzufügen von Natriumchlorid und Harnstoff aufbereitet. Das Natriumchlorid und der Harnstoff können dem Gesamtblut-Kontrollreagenz unmittelbar zugesetzt oder zuerst in Wasser aufgelöst und danach dem Gesamtblut-Kontrollreagenz zugesetzt werden. Die Bestandteile liegen vor und/oder werden in einem solchen Anteil zugesetzt, daß die Werte für WBZ, RBZ, HGB, HKT, MKV, MKH, MKHK, Verteilungsbreite für rote Blutkörperchen, Blutplättchenzahl, mittleres Blutplättchenvolumen, Thrombozytenwert und Blutplättchenvolumenvertei1ungsbreite denen angenähert sind, die normalerweise in mensch/liehen Blutproben auftreten und die durch Anwen-

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dung einer Vielzahl von bekannten, manuellen oder automatischen Instrumentationsverfahren gemessen werden können. Das Suspensions medium kann ein künstliches Medium, menschliches oder tierisches Plasma oder tierische Proteinlösungen umfassen,

Das 4C ^-J -Produkt der Coulter Electronics, Inc. ist ein stabiles Bezugskontrollreagenz, das sich besonders zur Verwendung mit dem COULTER-COUNTER ^ - Instrument eignet, wenn die Normen der Qualitätskontrolle für die Funktion des Instruments aufgestellt werden. Bei Verwendung des 4C ^-' wird ein vorschriftsmäßig geeichtes und funktionierendes Instrument zur Lieferung

jeden gemessenen oder berechneten Parameters innerhalb eines Bereichs von erwarteten Ergebnissen verwendet.

Die Erfindung umfaßt auch das angegebene Verfahren zur Herstellung des stabilen Bezugskontrollreagenz.

Die Erfindung betrifft, kurz zusammengefaßt, ein einziges diagnostisches. Testreagenz zur Verwendung als Bezugskontrollreagenz für die hämatologische Mehrfachanalyse zur überwachung der Genauigkeit und Fehl erfrei heit von Messungen und Bestimmungen der Zählung für die roten Blutkörperchen, die weißen Blutkörperchen und die Blutplättchen, des Hämoglobingehalts, des Hämatokrits, des mittleren Blutkörperchenvolumens, des mittleren BlutplättchenvoTumens, der Verteilungsbreite für die roten Blutkörperchen und die Blutplättchen, des mittleren korpuskularen Hämoglobins, der mittleren korpuskularen Hämoglobinkonzentration und des Thrombozytenwerts. Das Kontrollreagenz enthält auch Zusätze zur Überwachung der Blutplättchenparameter, obgleich in Blutproben beobachtete mögliche störende Wirkungen von roten Blutkörperchen ebenfalls im Kontrollreagenz vorliegen. Das Kontrollreagenz eignet sich zur Verwendung in automatischen oder halbautomatischen hämatologischen Instrumenten und durch Benutzer von manuellen Methoden.

Die Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung des Kontrollreagenz.

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Die Erfindung wird nun im einzelnen beschrieben.

Die Erfindung verwendet eine Kombination von Harnstoff und Natriumchlorid als: (1) ein Stabilisierungsmittel zur Verwendung mit Blutplättchen enthaltenden Gesamtblut-KontrolIreagenzien und (2) einen Hemmstoff für die schädlichen Wirkungen von tierischen und menschlichen Metaboliten der roten Blutkörperchen, von Nebenprodukten und von Chemikalien der roten und weißen Blutkörperchen, auf tierische und menschliche Blutplättchen.

Harnstoff allein wurde früher als Stabilisierungsmittel in reinen Suspensionen von menschlichen Blutplättchen verwendet, die als Kontrollmaterial bereitet wurden zur Verwendung in Verbindung mit der Durchführung von Blutplättchenzählungen. Die auf diese Weise bereiteten menschlichen Blutplättchen waren im wesentlichen reine Suspensionen. Restliche rote und weiße Blutkörperchen wurden bei derartigen Kontrol1reagenzien nicht zugelassen. Die Funktion des zugesetzten Harnstoffs in derartigen Kontrol1suspensionen bestand lediglich in der Verhinderung der allmählichen Zersetzung der Blutkörperchen während der nachfolgenden Lagerung während einer einige Monate langen Zeitdauer. Der Gesamteffekt bestand in der Lieferung einer Suspension von Blutplättchen mit verhältnismäßig konstanter (- 20%) Anzahl der Blutplättchen je Volumeneinheit. Wenn Harnstoff nicht zugesetzt werden würde, würde die Anzahl der Teilchen je Volumeneinheit allmählich ansteigen, wenn die Blutplättchen sich für gewöhnlich innerhalb einiger Tage zu zersetzen beginnen.

Bisher wurden rote und weiße Blutkörperchen in BlutplättchenkontrolIreagenzien nicht zugelassen, und zwar vermutlich deshalb, weil diese Blutkörperchen beinahe unmittelbar die Blutplättchen zum Zusammenballen und Zersetzen veranlassen, wodurch die Wirksamkeit des gemischten Kontrollmaterials zerstört wird. Zusätzlich war Harnstoff in hohen Konzentrationen als schädlich für die Stabilität und Unversehrtheit der roten Blutkörperchen bekannt, wodurch seine Verwendung als Konservierungsmittel in rote Blutkörperchen enthaltenden Suspensionen offensichtlich ausgeschlossen war. Als Ergebnis bestanden die bisher bekannten Blut-

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plättchenkontrollreagenzien ledig!ich aus reinen Suspensionen von menschlichen Blutplättchen, bei Anwesenheit von Harnstoff als · Konservierungsmittel, wobei keine roten Blutkörperchen oder andere aus Blut gebildeten Elemente zugelassen wurden, wodurch deren Wirksamkeit als Kontrollmaterialien vermindert wurde.

Bis zum Vorliegen der Erfindung waren keine erfolgreichen Kombinationen von Gesamtblut-Bezugskontrollreagenzien bekannt, die mit zwei-zmolarem Harnstoff konservierte menschliche Blutplättchen enthalten. Tatsächlich lehrt der Stand der Technik, daß bei Zusatz des bei der Erfindung verwendeten zweimolaren Harnstoffs zu menschlichen Blutkörperchen die roten Blutkörperchen zerstört werden (Owen, J.D., "Computer Simulated Urea Reflection Coefficients in Human Red Blood Cells", Bioehem. et Biophys. Ac ta 443, 306-310, 1976; Saunders, A.M., Scott, F. "Hematologic Automation by Use of Continuous Flow Systems", J.Histochem, Cytochem. 22, 707-710, 1974).

Es wurde erfindungsgemäß gefunden, daß Harnstoff in Anwesenheit von Natriumchlorid zur Verhinderung der schädlichen Wirkung von autologen roten und weißen Blutkörperchen auf die in Suspension befindlichen Blutplättchen. Es wird folglich eine stabile Blutplättchensuspension geliefert, die rote Blutkörperchen enthält und der Zusammensetzung von menschlichem Blut nahekommt. Es ist eine einzige stabile Suspension mit Blutplättchen und roten Blutkörperchen vorgesehen, was durch die Anwendung einer Kombination von Harnstoff und Natriumchlorid möglich gemacht ist, die vorher stabilisierten Suspensionen von mensch^ liehen roten Blutkörperchen, etwa Coulter 4C^H Bake Haem-C^ oder Da de CH-60^,zugesetzt wird, die die sonst schädlichen Wirkungen des Harnstoffs leicht tolerieren können. Die Kombination von Harnstoff, Salz und der vorher konservierten Suspension aus roten Blutkörperchen ist ihrerseits eindeutig stabil und liefert ein verträgliches Medium., indem entweder natürliche Blutplättchen oder unter Verwendung von Formaldehyd, Glutaraldehyd, Osmiumsäure oder anderen chemischen Fixierungsmitteln fixierte rote Blutkörperchen in stabiler Form koexistieren können.

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Ein weiterer, abgeleiteter Nutzen der Erfindung besteht daß die Kombination von Harnstoff, Salz und vorher fixierten · Suspensionen aus roten Blutkörperchen eine Umgebung liefern, in der das Zellenvolumen der einzelnen Bl utpl a'ttchen unverändert bleibt. Durch die Anwendung der aus Blutplättchen und Kontrollsuspension von roten Blutkörperchen bestehenden Kombination können nun Laboratorien die Genauigkeit der Blutplättchenzählung sowie der Messung des mittleren Blutplättchenvolumens (MBPV) und der Blutplättchenvolumenverteilung (BPVV) überwachen, so daß wirksame Patientenmessungen routinemäßig durchgeführt

werden können.

Ein Blutplättchen enthaltendes GesamtblutkontrolIreagenz nach der Erfindung wurde bereitet durch Mischen von herkömmlichen, im Handel erhältlichen Gesamtblut-Kontrol1 produkten, etwa Coulter 4C ^, Baker Haem-C®oder Dade CH-6O^, mit frisch gesammelten oder chemisch konservierten menschlichen oder tierischen Blutplättchen und einem Gemisch von Harnstoff und Natrium-Chlorid. Nach dem Stabilisieren während einiger Tage hatte die Suspension stabile Werte für die hämatol ogisehen Parameter WBZ, RBZ, HGB, MKV, HKT, MKH, MKHK, die Verteilungsbreite der roten Blutkörperchen, die Blutplättchenzahl, das mittlere Blutplättchenvolumen, den Thrombozytenwert und die Verteilungsbreite für das Blutplättchenvolumen. Die schädlichen Wirkungen der roten und weißen Blutkörperchen in den als Substrat verwendeten Gesamtblut-Kontrollreagenzien wurde durch den Zusatz von Natriumchlorid und Harnstoff verhindert. Das Material konnte während einiger Monate als stabiles Kontrollreagenz verwendet werden.

Es folgt nun eine Beschreibung des Verfahrens zur Herstellung des Kontrollreagenz.

Der erste Schritt bei einer Art der Bereitung eines BlutplättchenkontrolIreagenz für das Gesamtblut nach der Erfindung besteht in der Lieferung eines Volumens an in herkömmlicher Weise hergestelltem hämatologischem Bezugskontrollmaterial für dasGesamtblut, etwa Coulter 4C^, Baker Haem-C^oder Dade CH-60 oder in der Lieferung irgendeines anderen handelsüblich hergestellten oder sonst geeigneten hämatol ogisehen Kontrollmaterials

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für das Gesamtblut einschließlich behandelten roten Blutkörperchen in einem künstlichen Medium. Danach werden menschliche oder tierische Blutplättchen durch Venenpunktierung oder ein anderes Blutentnahmeverfahren des menschlichen oder tierischen Spenders geliefert. Die menschlichen oder tierischen Blutplättchen können dann in beliebiger Weise verwendet werden, und zwar entweder frisch oder nach dem an den Blutplättchen einige der chemischen oder physikalischen Fixierungsverfahren angewendet wurden.

Der nächste Schritt besteht im Bereiten einer Lösung von Harnstoff und Natriumchlorid in Wasser oder einem anderen Lösungsmittel zur nachfolgenden Mischung mit dem Gesamtblut-KontrolIreagenz und den Blutplättchen. In der Lösung werden Harnstoff und Natriumchlorid im folgenden Verhältnis im allgemeinen auf looo ml des Mediums, z.B. Wasser, zugesetzt:

Harnstoff 120 g
Natriumchlorid 9 g

Der in 1 1 Medium verwendete Harnstoff variiert zwischen 100 und 140 g, während das Natriumchlorid zwischen 8 und 10 g variiert. Der Harnstoff und das Natriumchlorid wurden entweder miteinander gemischt, und dann der Kontrol!suspension zugesetzt, oder wurden in etwa 1 1 Medium, z.B. Wasser, gelöst. Die resultierende Lösung wurde in diesem Augenblick in noch zu erläuternden Mengen dem Kontrollmatertal zugesetzt. Es kann ein Salzäquivalent zu Natriumchlorid verwendet werden.

Der letzte Schritt besteht lediglich in einer gemeinsamen Mischung des kommerziell oder industriell bereiteten hämatologischen Gesamtblut-Bezugskontrollreagenz, der unbehandelten, nicht stabilisierten oder vorher stabilisierten Blutplättchensuspension und der Lösung von Harnstoff und Natriumchlorid. Nach einem etwa 30 Minuten langen Mischen und einem etwa 48 Stunden langen Stabi-

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1isierentlassen der Blutkörperchensuspension war, wie festgestellt, das Kontrollmaterial stabil für vollständige hämatologische Parameter. Es wird eine selektrive Suspension von roten Blutkörperchen und Blutplättchen hergestellt. Das Suspensionsmedium kann künstlich sein, aus menschlichem oder tierischem Plasma oder aus menschlichen oder tierischen Proteinlösungen bestehen.

Die folgenden Beispiele zeigen, wie zur Erzeugung des Gesamtblut-KontrolIreagenz der Erfindung Suspensionen von behandelten roten Blutkörperchen, Blutplättchen und Lösungen von Natriumchlorid und Harnstoff, wie beschrieben, miteinander gemischt werden können.

1. Eine Lösung mit 25 g Harnstoff und 1,8 g Natriumchlorid

in 200 ml destilliertem Wasser wird 1000 ml einer behandelte ten Gesamtblut-Suspension, etwa Coulter 4C^v-' zugesetzt.

Eine Lösung mit 2,4g Harnstoff und 0,18 g Natriumchlorid in 20 ml Wasser wird 100 ml Suspension von menschlichen Blutplättchen zugesetzt.

Jede resultierende Suspension wird einige Minuten lange gemischt wonach die behandelte Suspension aus roten Blutkörperchen und die Blutplättchensuspension, von denen beide Harnstoff enthalten, etwa 30 Minuten lange gründlich gemischt und dann etwa 48 Stunden lang stabilisieren gelassen^zur Erzeugung des BlutkontrolIreagenz der Erfindung. wird

2. 20,0 g Harnstoff und 1,5 g Natriumchlorid werden unmittelbar 1000ml einer behandelten Gesamtblutsuspension, etwa Coulter 4C ^ zugesetzt. 100 ml einer Suspension von menschlichen Blutplättchen werden dann unmittelbar der Harnstoff und Natriumchlorid enthaltenden behandelten Gesamtblutkontrol1-Suspension zugesetzt. Die Suspension wird etwa 30 Minuten lang gemischt und 48 Stunden stabilisieren gelassen zur Erzeugung des Bezugskontrollreagenz der Erfindung. Aus dieser Ausfüh-

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rungsform'ist ersichtlich, daß eine Auflösung des Harnstoffs und des Natriumchlorids vor dem Mischen mit der behandelten. Gesamtblut-Suspension nicht erforderlich ist.

3. Eine Lösung mit 26,6 g Harnstoff und 1,98 g Natriumchlorid in 220 ml destilliertem Wasser wird unmittelbar 1000 ml einer behandelten Gesamtblut-Kontrol1 suspension, etwa Coulter

4C zugesetzt. Dann werden 100 ml einer Suspension aus menschlichen Blutplättchen zugesetzt. Die resultierende Suspension wird etwa 30 Minuten lang gemischt und 48 Stunden Tang stabilisieren gelassen zur Erzeugung des Bezugskontrollreagenz der Erfindung.

Beim Bezugskontrollreagenz der Erfindung liegt Harnstoff in einem Verhältnis von etwa 16,7 bis etwa 23,3 g in etwa 1 1 des Bezugskontrollreagenz der Erfindung vor.

Beim Bezugskontrollreagenz der Erfindung wird Natriumchlorid im Verhältnis zur Harnstoffkonzentration zugesetzt, d.h. 1,33 bis 1,67 g Natriumchlorid je Liter des die obenangegebenen 16,7 bis 23,3 g Harnstoff enthaltenden Bezugskontrollreagenz.

Es ist ersichtlich, daß diese Gesamtmenge an Natriumchlorid zusätzlich ist zum restlichen Salzgehalt der behandelten Gesamtblutsuspension oder Blutplättchensuspension, der diese Gesamtmenge zugesetzt wird. Es ist ferner ersichtlich, daß ein bedeutender Faktor der Erfindung die Beziehung zwischen dem Harnstoff und dem zugesetzten Natriumchlorid und nicht der gesamte Salzgehalt des Bezugskontrollreagenz ist.

Diese Beziehung zwischen dem Harnstoff und dem zugesetzten Natriumchlorid ermöglicht die Herstellung eines stabilen Bezugskontrollreagenz, das wenigstens rote Blutkörperchen und Blutplättchen enthält.

Das Folgende wird im Hinblick auf die Wirkung und Bedeutung des zugesetzten Natriumchlorids angegeben. Die meisten bei der Erfindung verwendeten Äusgangsmaterialien, stabilisierte Blutkontrol 1-

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reagenzien und Blutplättchensuspensionen, enthalten vorher zugesetztes Natriumchlorid. Die Erfindung beschreibt den Zusatz' eines Gemischs von Harnstoff und Natriumchlorid zu diesen Materialien in der Weise, daß diese koexistieren können. Der Zweck des zugesetzten Natriumchlorids besteht in der Aufrechterhaltung des osmotischen und ionischen Gleichgewichts bei einem Zusatz von Harnstoff.

Es ist zu beachten, daß eine Unabhängigkeit der Blutkörperchenzahl (Blutplättchen, rote und weiße Blutkörperchen) und der Blutkörpercheneigenschaften (mittleres Blutkörperchenvolumen, Blutkörperchenmorphologie) von der chemischen Zusammensetzung des Bezugskontrollreagenz der Erfindung besteht. Die chemische Zusammensetzung des Bezugskontrollreagenz der Erfindung, bestehend aus vorher stabilisierten roten Blutkörperchen und fixierten roten Blutkörperchen, Blutplättchen und zugesetztem Harnstoff und Natriumchlorid ist unabhängig von der gewünsch ten Blutkörperchenzählung und den Blutkörpercheneigenschaften. Zum Beispiel ermöglicht die Erfindung den Zusatz von etwa 100 ml einer Suspension mit entweder sehr vielen oder sehr wenigen Blutplättchen zu etwa 1000 ml eines vorhandenen Bezugskontroi 1-reagenz, etwa Coulter 4C^, mit einem hohen oder niedrigen zahlenmäßigen Anteil roter Blutkörperchen im Zahlenwert der weißen Blutkörperchen, im hohen oder niedrigen Wertniveau des mittleren Korpuskular Volumens, so daß das resultierende ungefähre Volumen von 1100 ml Blutkörperchensuspension je nach den gewünschten Niveaus verhältnismäßig wenige oder viele Blutplättchen sowie rote und weiße Blutkörperchen hat.

Wie beim Stand der Technik und der vorliegenden Beschreibung verwendet, sind die auf Blutkörperchen angewendeten Ausdrücke "stabilisiert" und "behandelt" synonym und stehen im Gegensatz zum Ausdruck "fixierte Blutkörperchen". Beide im vorliegenden beschriebenen anfänglichen Ausgangsmaterialien (das vorher beschriebene stabilisierte Blutkörperchenkontrollreagenz und die Blutplättchen) können entweder aus stabilisierten oder behandelten Blutkörperchen (chemisch fixierten Blutkörperchen oder natürlichen unbehandelten Blutkörperchen) bestehen.

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(R)

Zum Beispiel besteht das Coulter 4C^v-^/aus stabilisierten (behandelten) roten Blutkörperchen und chemisch fixierten roten Blutkörperchen.

Stabilisierte (behandelte) Blutkörperchen bestehen aus menschlichen oder nicht menschlichen Blutkörperchen, denen zur Verlängerung der Lebensdauer verschiedene Konservierungsmittel zugesetzt wurden.

Chemisch fixierte Blutkörperchen bestehen aus menschlichen oder nicht menschlichen Blutkörperchen, die chemisch gehärtet, d.h. gegerbt wurden, und zwar für gewöhnlich durch Chemikalien, wie Glutaraldehyd, Formaldehyd, Osmiumsäure und Uranylacetat.

Stabilisierte Blutkörperchen sind bei Anwesenheit von Tensiden oder bei geringer Osmolalität anfällig gegen Hämolyse und Zerreißen, während chemisch fixierte Blutkörperchen bei derartigen Umgebungen ihre Morphologie beibehalten.

Wie erläutert, eignet sich das hämatologische Bezugskontrollreagenz nach der Erfindung auch zur Durchführung von manuellen Bestimmungen. Dem Fachmann sind die manuellen Methoden bekannt, die für die derartige Kontrollreagenzien verwendenden manuellen Bestimmungen von RBZ, WBZ, HGB und HKT angewendet werden, Eine detaillierte Erläuterung dieser manuellen Methoden kann entfallen. Es genügt die Angabe, daß das Bezugskontrollreagenz der Erfindung, wie hier beschrieben, bei instrumentellen und manuellen Methoden anwendbar ist.

Patentanwälte

Dipl.-ing. E. Eder Dipl.-Ing. K. ScÄieschke 8 Mflndien 40, Elis4Wift3traBe34

Claims (1)

1. Dipl.-ing. E. Eder Dipl.-Ing. K. Schieschke B Mflnchen 40, Eligaoeiriotraße 34

   COULTER ELECTRONICS, INC.

   Hialeah/Florida
   U.S.A.

   Bezugskontrollreagenz für die hämatologische Mehrfachanalyse und Verfahren zu dessen Herstellung

   Patentansprüche

   Bezugskontrollreagenz für die hämatologische Mehrfachanalyse, gekennzeichnet durch eine Suspension von roten Blutkörperchen und Blutplättehen in einem Harnstoff enthaltenden, salzhaltigen Medium, wobei der Harnstoff wenigstens in einer Konzentration vorliegt, die normalerweise für die Stabilität und Unversehrtheit der roten Blutkörperchen schädlich ist, wobei die Harnstoffkonzentration keine schädlichen Wirkungen hat, so daß die Parameter für die roten Blutkörperchen und die Blutplättchen im allgemeinen stabil sind und den in Säugetierblutproben vorliegenden nahekommen, wobei das Bezugskontrollreagenz zum Testen der Fehlerfreiheit und Genauigkeit der herkömmliehen Parameter für die roten Blutkörperchen und die Blutplättchen angewendet wird.

   2. Bezugskontrollreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium künstlich ist.

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   ORlGfNAt INSPECTED

   3. Bezugskontrollreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium menschliches oder tierisches Blutplasma ist.

   4. Bezugskontrollreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium eine menschliche oder tierische Proteinlösung ist.

   5. Bezugskontrollreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutplättchen menschlichen oder tierischen Ursprungs sind.

   6. Bezugskontrollreagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Harnstoff im Verhältnis von etwa 16,7 bis 23,3 g auf etwa 1 1 des Bezugskontrollreagenz vorliegt.

   7. Bezugskontrollreagenz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Natriumchlorid im Verhältnis von 1,33 bis 1,67 g auf etwa 1 1 des Bezugskontrollreagenz zugesetzt ist.

   8. Bezugskontrollreagenz für die hämatologische Mehrfachanalyse,

   gekennzeichnet durch eine einzige Suspension von roten Blutkörperchen und Blutplättchen, wobei die Suspension Harnstoff und Natriumchlorid in einem ausgewählten Suspensionsmediurc enthält, das die Anwendung des Kontrollreagenz zur überwachung der Fehlerfreiheit und Genauigkeit der Messungen oder der Bestimmungen der üblichen hämatologischen Parameter und der Blutplättchenparameter einer Blutprobe ermöglicht, wobei der Harnstoff wenigstens in einer Konzentration vorliegt die normalerweise für die Stabilität und Unversehrtheit der roten Blutkörperchen schädlich ist, wobei die Harnstoffkonzentration keine stfädliche Wirkungen hat, so daß die Parameter für die roten Blutkörperchen und die Blutplättchen im allgemeinen stabil sind und den in Säugetierblutproben vorliegenden nahekommen, wobei das Bezugskontrollreagenz zum Testen der Fehlerfreiheit und Genauigkeit der herkömmlichen Parameter für die roten Blutkörperchen und Blutplättchen angewendet wird.

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   9. Bezugskontrollreagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium künstlich ist.

   10. Bezugskontrollreagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium menschliches oder tierisches Blutplasma ist.

   11. Bezugskontrollreagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium eine menschliche oder tierische Proteinlösung ist.

   12. Bezugskontrollreagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Blutplättchen menschlichen oder tierischen Ursprungs sind.

   13. Bezugskontrollreagenz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Harnstoff im Verhältnis von etwa 16,7 bis 23,3 g auf etwa 1 1 des Bezugskontrollreagenz vorliegt.

   14. Bezugskontrollreagenz nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß Natriumchlorid im Verhältnis von 1,33 bis 1,67 g auf etwa 1 1 des Bezugskontrollreagenz zugesetzt ist.

   15. Verfahren zur Herstellung eines einzigen hämatologischen

   Bezugskontrollreagenz zur überwachung der Genauigkeit der Messungen von üblichen hämatologischen Parametern und von Blutplättchenparametern, gekennzeichnet durch

   A) Bereiten einer stabilisierten Suspension von menschlichen oder tierischen Blutplättchen,

   B) Beschaffen eines herkömmlichen hämatologischen Bezugskontroll reagenz für das gesamte Blut einschließlich roter Blutkörperchen in einem Suspensionsmediun,

   C) Mischen der stabilisierten Blutplättchensuspension und des Bezugskontrollreagenz mit einem Gemisch von Harnstoff und Natriumchlorid oder einem ähnlichen Salz, das so gewählt ist, daß es mit den hämatologischen Bestandteilen des Gemischs während einer vorgewählten Zeitdauer verträglich ist, und

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   D) Stabilisieren lassen der resultierenden Suspension während etwa 48 Stunden,

   |«r-wobei der Harnstoff wenigstens in einer Konzentration vorliegt, die normalerweise für die Stabilität und Unversehrtheit der roten Blutkörperchen schädlich ist, wobei die Harnstoffkonzentration keire schädlichen Wirkungen hat, so daß die Parameter für die roten Blutkörperchen und die Blutplättchen im allgemeinen stabil sind und den in Säugetierblutproben vorliegenden nahekommen.

   1G. Verfahrer: nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Harnstoff und das Chloi idsftlz miteinander vermischt und zt; Beginn dem Bezugskontrollreagenz des Abschnitts B) zugesetzt werden.

   17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Harnstoff und das Chloridsalz in einem angemessenen Volumen von Wasser gelöst und dann dem Bezugskontroi 1reagenz des Abschnitts B) zugesetzt werden.

   18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß ein Suspensionr.medium verwendet wird, das künstlich oder von natürlicher biologischer Art ist.

   19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Harnstoff und das Chloridsalz in einem angemessenen Volumen von Wasser gelöst und dann dem Bezugskontroi 1reagenz des Abschnitts. B) zugesetzt werden, wonach die Blutplättchensuspension des Abschnitts A) zugesetzt wird.

   20. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Harnstoff und das Chloridsalz dem BezugskontroiIreagenz des Abschnitts B) bzw. der Blutplättchensuspension der- Abschnitts. A) zugesetzt wird, und däß die resultierenden Suspensionen gemischt werden.

   909881/0716

   21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Harnstoff und das Chloridsalz vor dem Zusetzen zum Bezugskontroilreagenz des Abschnitts B) und zur Blutplättchensuspension des Abschnitts A) löslich gemacht werden.

   DfpF.-lng. JL Eder
   DipL-Ing. K.J&hieschke

   9098SU0716 - ■ . ' --6