DE2908957A1 - PROCESS FOR THE ENZYMATIC DETERMINATION OF OESTROGENS AND READY-TO-USE COMBINATION FOR PERFORMING THE SAME - Google Patents
PROCESS FOR THE ENZYMATIC DETERMINATION OF OESTROGENS AND READY-TO-USE COMBINATION FOR PERFORMING THE SAMEInfo
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INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA HECHERCHE MEDICALE - OKi]TOM 101 rue de Tolbiac 756^5 !1ARIS CEDEX 13 / FrankreichINSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA HECHERCHE MEDICALE - OKi] TOM 101 rue de Tolbiac 756 ^ 5! 1 ARIS CEDEX 13 / France
Verfahren zur enzyma ti sehen Bestimmung von (JstroS611611 sowie anwendungsfertige Kombination zur Durchführung derselben.Process for the enzymatic determination of (JstroS 611611 as well as a ready-to-use combination for carrying out the same.
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzytnatischen Bestimmung von Östrogenen, insbesondere Östron und Östradiol, sowie eine gebrauchsfertige Kombination zur Durchführun/y dieser Bestimmung.The present invention relates to a method for enzymatic Determination of estrogens, especially estrone and estradiol, as well as a ready-to-use combination for implementation this provision.
Die genaue Kenntnis der Menge von Steroidhormonen, insbesondere der Menge Östron und Östradiol, die im Urin und im Plasma vorhanden sind, hat für den Kliniker, insbesondere für den Gynäkologen, eine wachsende Bedeutung bei der Feststellung einer sicheren Diagnose und bei der Erstellung einer wirksamen Therapie, insbesondere bei Ovarial-Isuffizienz, bei Störungen der i: stro^en-Biosynthese, bei der Überwachung problematischer Schwangerschaften eic, Eine derartige Kenntnis macht es jedoch erforderlich, daß man über Techniken der f'strogen-Bestimmung verfügt, die spezifisch, genau und empfindlich, zuverlässig, reproduzierbar und relativ wenig kostspielig sind und durchgeführt werden können, ohne daß man von dem Techniker, der die Bestimmung durchführt, besondere Fähigkeiten und Geschicklichkeiten fordern muß.Accurate knowledge of the amount of steroid hormones, particularly the amount of estrone and estradiol, that are present in the urine and plasma is of growing importance for the clinician, especially the gynecologist, in determining a safe Diagnosis and the creation of an effective therapy, especially in the case of ovarian isufficiency, in the case of disorders of the i: stro ^ en biosynthesis, in monitoring problematic pregnancies eic, However, such knowledge requires that one has techniques of estrogen determination that are specifically, are accurate and sensitive, reliable, reproducible and relatively inexpensive and can be carried out, without the technician performing the determination must require special skills and abilities.
Im Laufe der letzten Jahre wurden mehrere Methoden zur Mikro— bestimmung von östrogenen vorgeschlagen, die den Forderungen der Kliniker entsprechen sollen. Die bislang am häufigsten verwendeten Methoden der Mikrobestimmung sind:Several methods of micro- Proposed determination of estrogens to meet the demands of clinicians. The most commonly used so far Methods of micro-determination are:
die Mikrobestimmung durch Fluoreszenz, die radioimmunologische Bestimmung.micro-determination by fluorescence, radioimmunological determination.
Die erstere, d.h.die Bestimmung durch Fluoreszenz, bestimmt dieThe former, i.e. determination by fluorescence, determines the
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gesamten Phenole des Harnes,Mstradio1 , östron und östriol und umfaßt vier Stufen: eine Stufe der Hydrolyse der konjugierten Verbindungen; eine Stufe der Extraktion, welche eine kostspielige und langwierige Phase der Bestimmung ist und die Handhabung großer ^engen sehr reiner Lösiangsmittel erfordert; eine Stufe der Entwicklung des Chromophors; und eine Stufe der Ablesung. Auf alle Fälle ist der Wert dieser Bestimmung begrenzt, da sie keine große Spezifität hat und deshalb durch die Mediziner nur mit der äußersten Vorsicht angewendet werden kann.total urinary phenols, M stradio1, oestrone and oestriol and comprises four stages: a stage of hydrolysis of the conjugated compounds; an extraction stage which is an expensive and lengthy phase of determination and requires the use of large, narrow, very pure solvents; a stage in the development of the chromophore; and a level of reading. In any case, the value of this provision is limited, since it does not have great specificity and can therefore only be used by medical professionals with the utmost caution.
Was den zweiten Typ der bislang vorgeschlagenen Bestimmung anbelangt, nämlich die radioimmunologische Bestimmung, ob sie viel genauer als die Bestimmung durch Fluoreszenz.ist und erlaubt die getrennte Bestimmung von Östradiol, östron und östriol im Plasma, jedoch hat sie den Nachteil, daß sie teuer ist und die Verwendung von radioaktiven Isotopen erforderlich macht, wodurch ihre Verwendung auf Laboratorien beschränkt ist, welche eine geeignete, sehr kostspielige Einrichtung besitzen und aufgrund einer speziellen Vereinbarung des Gesundheitsministeriums dazu berechtigt sind.As for the second type of provision proposed so far, namely the radioimmunological determination of whether it is much more accurate than the determination by fluorescence. and allows it the separate determination of estradiol, estrone and estriol im Plasma, however, has the disadvantage that it is expensive and requires the use of radioactive isotopes, thereby their use is limited to laboratories which have suitable, very expensive equipment and due to are entitled to do so under a special agreement of the Ministry of Health.
Methoden zur enzymatischen Bestimmung von östrogenen sind übrigens in der Literatur beschrieben (M.H\RKONEN, H.ADLERKREUZ, E.V.GROMAN, Journal of Steroid Biochemistry 197^4 Vol. 5, Seiten 717 - 7^5), aber infolge ihrer Schwierigkeit können Sie nicht klinisch verwendet werden. Diese Methoden beschreiben die Bestimmung von östradiol und Östron mit Hilfe von 17 P —''^ Dehydrogenase aus der Placenta, welche mit NADP (Phospho-By the way, methods for the enzymatic determination of estrogens are described in the literature (M.H \ RKONEN, H.ADLERKREUZ, E.V. GROMAN, Journal of Steroid Biochemistry 197 ^ 4 Vol. 5, pp 717 - 7 ^ 5), but because of their difficulty you cannot used clinically. These methods describe the determination of estradiol and estrone using 17 P - '' ^ Dehydrogenase from the placenta, which with NADP (phospho-
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Nikotinamid-Adenin—Dinucleotid, Coenzym der Dehydrogenase) bzv:. NADΠI verbunden ist, wobei das Östradiol von den anderen reaktiven Steroiden, die im Plasma vorhanden sind, durch Chromatographie über einer Aluminiumoxid-Kolonne gereinigt wird. Die enzymatisehe Dismutation zwischen NADP und NADPH %iird gemäß der in der oben genannten Publikation beschriebenen Methode durchgeführt, indem man Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (g6PDH) und Güirfcamas-Dehydrogenase verwendet, wobei man eine Verstärkung von 10.000 erreicht; der enzymatisehe Kreislauf ist erforderlich, um dfss während der Reaktion gebildete NADPH zu messen, weil im n1asma der nicht-schwangeren Frau nur eine sehr geringe Konzentration an 'stradiol vorhanden ist (4-1 nMol/l). Das gebildete 6-!hosphogluconat wird durch Fluorometrie unter Verwendung von 6-^hosphogluconat-Dehydrogenase und NADP bestimmt. Es ist in dieser Publikation angegeben, daß die beschriebene Methode eine Nach— Weisempfindlichkeit von 25 JFMoI Steroid und eine Bestimmungs— genauigkeit von ik';i> gestattet und daß ihre Spezifität vergleichbar ist mit radioimmunologischen Bestimmung. Doch weisen die Autoren der Publikation auf die Schwierigkeit der Methode hin, insbesondere beim enzymatischen Kreislauf, wodurch die Anwendung ihrer Methode bei Routineanalysen im Laboratorium verhindert wird.Nicotinamide adenine dinucleotide, coenzyme of dehydrogenase) or. NADΠI, the estradiol being purified from the other reactive steroids present in the plasma by chromatography over an alumina column. The enzymatic dismutation between NADP and NADPH% is carried out according to the method described in the above publication, using glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6PDH) and Güirfcamas dehydrogenase, a gain of 10,000 being achieved; the enzymatic circuit is necessary in order to measure the NADPH formed during the reaction, because in the n 1as ma of the non-pregnant woman there is only a very low concentration of stradiol (4-1 nmol / l). The 6-phosphogluconate formed is determined by fluorometry using 6-phosphogluconate dehydrogenase and NADP. It is stated in this publication that the method described permits a detection sensitivity of 25 JFMoI steroid and an accuracy of determination of ik ';i> and that its specificity is comparable to radioimmunological determination. However, the authors of the publication point out the difficulty of the method, especially with the enzymatic cycle, which prevents the application of their method in routine analyzes in the laboratory.
Es wurde nun gefunden, daß die Schwierigkeit dieser Methode nicht der einzige Grund ist, um ihre Verwendung für die enzymatisehe Routinebestimmung im Laboratorium zu verhindern.It has now been found that the difficulty of this method is not the only reason for its use for enzymatic purposes To prevent routine determination in the laboratory.
Wie ebenfalls aus den Stand der Technik hervorgeht, ist es be-As can also be seen from the prior art, it is
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kannt, daß 17 ft -Östradiol-Dehydrogenase (das Enzym ist nach der internationalen Klassifikation als E.C.1.1.1.6? bezeichnet) nicht nur eine Dehydrogenase-Wirkung hat (NAD+ —* NADH; NAD+ = Nikotinamid—Adenin-Dinueleotid), sondern auch eine Transhydrogenase-Wirkung hat: in Gegenwart von NADI1H (in geringer Menge) findet eine t bertragung und Bildung von NADH statt (wobei das östrogen in oxidierter oder reduzierter Form an dieser Transhydrierungsreaktion teilnimmt).knows that 17 ft -estradiol dehydrogenase (the enzyme is designated as EC1.1.1.6? according to the international classification) not only has a dehydrogenase effect (NAD + - * NADH; NAD + = nicotinamide-adenine-dinueleotide), but also has a transhydrogenase effect: in the presence of NADI 1 H (in small amounts), a transfer and formation of NADH takes place (whereby the estrogen in oxidized or reduced form takes part in this transhydrogenation reaction).
Der Zyklus der Bildung von NADP .—> NADPH in Gegenwart eines Enzyms wie Glucose-6-P-Dehydrogenase ist ebenfalls bekannt. Es genügt daher, wenn der folgende Zyklus gebildet wird (der im Schema 1 dargestellt ist), unter solchen Konzentrationsbedingungen der Gofaktoren, daß NADH in meßbaren Mengen entsteht, die proportional der Konzentration an östradiol und Östron sind:The cycle of formation of NADP .—> NADPH in the presence of an enzyme such as glucose-6-P-dehydrogenase is also known. It is sufficient therefore, when the following cycle is formed (which is shown in scheme 1), under such conditions of concentration of gofactors, that NADH is produced in measurable amounts that are proportional to the concentration of estradiol and estrone:
NADHNADH
(östron)(estron)
NADPNADP
NADI1HNADI 1 H
Enzym:Enzyme:
Östradioldehydrogenäse Estradiol dehydrogenation
,Glucose-6-Phosphat (G6P), Glucose-6-phosphate (G6P)
GluconolactonGluconolactone
Enzym: Glucose-6P DehydrogenaseEnzyme: glucose-6P dehydrogenase
Diese Methode der enzymatischen Bestimmung der Gesamt-Östrogene östron (E1) + östradiol (Ep) ist zwar viel einfacher als dieThis method of enzymatic determination of the total estrogen oestrone (E 1 ) + oestradiol (Ep) is much simpler than that
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tatsächlich verwendeten Bestimmungsniethoden und theoretisch sehr verlockend; leider ist sie in der Praxis jedoch nicht befriedigend, insbesondere hinsichtlich der Genauigkeit der erhaltenen Resultnte: die Reaktionsgeschwindigkeit, die durch die Kinetik des Auftretens von NADH bestimmt wird, ist nämlich eine Punktion der Konzentration der östrogene E und E .determination rivet testicles actually used and theoretically very much tempting; unfortunately, however, it is not satisfactory in practice, particularly with regard to the accuracy of the ones obtained Result: the reaction rate, which is determined by the kinetics of the occurrence of NADH, is namely a puncture the concentration of estrogens E and E.
Nun ist die 17 ß -f'stradi ol-Dehydrogenase aus Placenta mit zwei Arten von Verunreinigungen behaftet, welche die Genauigkeit der Bestimmung beträchtlich beeinflussen}Now the 17 ß -f'stradiol dehydrogenase from placenta is afflicted with two types of impurities, which considerably influence the accuracy of the determination}
sie enthält Steroide, insbesondere Östradiol, in nicht vernachlässigbaren Mengen, deren Anwesenheit die Resultate in umso größerem Ausmaß verfälscht als es nötig ist, die 17 fi -östradiol-Dehydrogenise in relativ großen Mengen zu verwenden, wodurch in d»s Milieu eine umso größere Menge an Verunreinigungen eingebracht wird;it contains steroids, especially estradiol, in non-negligible amounts, the presence of which falsifies the results to a greater extent as it is necessary to use the 17 fi -estradiol dehydrogenation in relatively large amounts, which results in an even greater amount in the environment of impurities is introduced;
sie enthält als Verunreinigung auch andere nicht—Östradiol—abhängige -Transhydrogena sen, deren Anwesenheit eine weitereit also contains other non-estradiol-dependent contaminants -Transhydrogena sen, whose presence is another
Fehlerquelle darstellt.Represents source of error.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Verfahrens ZiU? enzymatischen Bestimmung der Östrogene E und En, welche den Anforderungen der Praxis besser entspricht als die bislang bekannten Verfahren und insbesondere spezifisch , sehr genau, zuverlässig, wenig kostspielig, relativ einfach , durchführbar ist und im Vergieich zu dem in der Literatur beschriebenen Verfahren zur enzymatischen Bestimmung nicht nur dieThe aim of the present invention is therefore to create a new process ZiU? enzymatic determination of estrogens E and E n, which better meets the requirements of practice than the previously known methods and especially specific, very accurate, reliable, a little expensive, relatively simple, feasible and in V er gy I said in the literature described method for enzymatic determination not only the
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nicht-Östradiol—abhängigen-Transhydrogennsen beseitigt, welche die I7P -östradiol-Dehydrogenase aus Piacentn begleiten, welche zur Reduktion von NAD in NADH eingesetzt wird und auch eine totale Eliminierung des mit der 17 ß -Östradiol-Dehydrogenase aus Placenta eingeschleppten östradiols gewährleistet, so daß die enzymatische Bestimmung unter so genauen und zuverlässigen Bedingungen abläuft, wie sie im Stand der Technik nicht erreicht werden konnten. non-estradiol-dependent-Transhydrogennsen eliminated which the I7P estradiol dehydrogenase accompany from Piacentn, which is used for the reduction of NAD to NADH and a total elimination of the SS with the 17-estradiol dehydrogenase from placenta entrained estradiol ensured, that the enzymatic determination takes place under conditions as precise and reliable as could not be achieved in the prior art.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung der Östrogene E und E0 in biologischen Media » insbesondere in Plasma und Urin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 17 ß -Östradiol-Dehydrogenase aus Placenta verwendet, die von Steroiden und parasitären nicht östrogen—abhängigen Transhydrogenasen befreit ist, und daß man in Gegenwart von NAD oder eines NAD-Analogen, welches durch das Enzym anerkannt wird, von NADP oder eines dessen Analogen, sowie von eines spezifischen Enzyms NADP-Dehydrogenase und eines NADP bildenden Substrat arbeitet«The subject of the present invention is a method for the enzymatic determination of the estrogens E and E 0 in biological media "in particular in plasma and urine, characterized in that one uses a 17 ß -estradiol dehydrogenase from placenta, which is not estrogenic from steroids and parasitic" dependent transhydrogenases is freed, and that one works in the presence of NAD or an NAD analogue, which is recognized by the enzyme, of NADP or one of its analogues, as well as of a specific enzyme NADP dehydrogenase and a substrate forming NADP «
Unter den Bedingungen des erfindungsgetnäßen Verfahrens - im Gegensatz zu den klassischen enzymatischen Bestimmungen - verschwindet die zu bestimmende Substanz, im vorliegenden Falle die Östrogene E.. und E„, nicht; sie ist nicht der limitierende Faktor der Reaktionsgeschwindigkeit und die Menge des gebildeten NADH ist direkt proportional der Östrogen-Konzentration.Under the conditions of the method according to the invention - in contrast In addition to the classic enzymatic determinations - the substance to be determined disappears, in the present case the estrogens E .. and E ", not; it is not the limiting factor in the speed of reaction and the amount of NADH formed is directly proportional to the estrogen concentration.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindunsgemäßen Verfahrens wählt man das spezifische Enzym NADP-Dehydrogenase ausAccording to a preferred embodiment of the process according to the invention select the specific enzyme NADP dehydrogenase
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BAD ORIGINAL ° OPV J ".
./15../15.
der folgenden Gruppe: Tetrahydrofolat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-5-1-13» 1-5-1-15), Isocitrat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-1-^2), Phosphogluconat-Deh}'-drogenase (internationale Klassifikation 1-1-1-kk), Glucose-6-Phosphat-Befrydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-1-1)9), Lactaldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-1-55), Benzaldehyd—Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-7), Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-?-1-9 £" I -2-1 —I 3_J ), L-Aspartat-semi-AJdehyd-Dehydrog-enase (internationale Klassifikation 1-P-1-11), Glyoxy-1at-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1τ2-1-17).of the following group: tetrahydrofolate dehydrogenase (international classification 1-5-1-13 »1-5-1-15), isocitrate dehydrogenase (international classification 1-1-1- ^ 2), phosphogluconate deh} '- drugase (international classification 1-1-1-kk), glucose-6-phosphate-Befrydrogenase (international classification 1-1-1-1) 9), lactaldehyde dehydrogenase (international classification 1-1-1-55), benzaldehyde- Dehydrogenase (international classification 1-2-1-7), glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (international classification 1 -? - 1-9 £ "I -2-1 -I 3_J), L-aspartate-semi-aldehyde dehydrogenase enase (international classification 1-P-1-11), glyoxy-1ate dehydrogenase (international classification 1τ2-1-17).
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, falls das spezifische Enzym MDJ'-Dehydrogenase GöPDll ist, is.t das HlDP bildende Substrat G6P.According to a preferred embodiment of the method according to the invention if the specific enzyme is MDJ'-dehydrogenase GöPDll is, the HIDP-forming substrate is G6P.
Nach einer weiteren Ausfiihrungsf orm des erfindungsgemäßen Verfahrens findet die Bestimmung in einem Milieu statt, das aus einem Puffer mit einem pH-Vert in der Nähe von 7,k besteht, wobei die Ionenstärke gleich oder geringer ist als die eines 0,1-molaren Puffers.According to a further embodiment of the method according to the invention, the determination takes place in a medium which consists of a buffer with a pH value in the vicinity of 7. k , the ionic strength being equal to or less than that of a 0.1 molar buffer .
Nach einer weiteren bevorzugten Ausfiihrungsf orm des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält der Puffer außerdem 0,5 Promille bis ifo Protein ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen.According to a further preferred embodiment of the method according to the invention, the buffer also contains 0.5 per mil to ifo protein without any significant affinity for estrogens.
Nach einer speziellen Ausfiihrungsf orm dieser Variante ist das dem Milieu zugesetzte Protein Serum-Albumin, insbesondere Rinder- _ ■ 909839/0735According to a special embodiment of this variant, the protein added to the milieu is serum albumin, especially cattle albumin. _ ■ 909839/0735
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Serum-Albumin.Serum albumin.
Erfindunsgemäß wird die Bestimmung in Gegenwart von FAD oder einem seiner ^nalogen durchgeführt, wie Acetyl-NAD oder Thio-NAD.According to the invention, the determination in the presence of FAD or carried out one of its analogs, such as acetyl-NAD or thio-NAD.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindun^sgemäßen Verfahrens sind das NAD und das NADP-bildende Substrat im Überschuß vorhanden.According to a further preferred embodiment of the process according to the invention, the NAD and the NADP-forming substrate are present in excess.
Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindunsgemäßen Verfnh-According to a further embodiment of the process according to the invention
-3 -k rens ist die Menge NAD im Reaktionsmilieu 10 -bis 10 -molar, diejenige des NADP 10~ - bis 10 -molar und das Konzentrationsverhältnis NAD zu NADP etwa 10 .-3- k rens, the amount of NAD in the reaction medium is 10 to 10 mol, that of NADP is 10 to 10 mol and the concentration ratio of NAD to NADP is about 10.
Es wurde gefunden, daß die absoluten und relativen Mengenverhältnisse des in das Milieu eingeführten NAD bzw.NADP beträchtlich zur Genauigkeit der Bestimmung beitragen, indem die Menge des vorhandenen NadP nicht die oben angegebenen Mengenverhältnisse überschreiten darf, da sonst die Aktivität des Enzyms 17/3 fistradiol-Dehydrogenase behindert und deshalb die Resultate verfälscht werden.It has been found that the absolute and relative proportions of the NAD or NADP introduced into the medium contribute considerably to the accuracy of the determination in that the amount of NadP present must not exceed the proportions given above, otherwise the activity of the enzyme 17/3 f istradiol dehydrogenase is hindered and the results are therefore falsified.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Eliminierung der parasitärenAccording to a further preferred embodiment of the invention Procedure will eliminate the parasitic
nicht-östrogen-abhängigen-Transhydrogenasen-Enzymen durch Erhitzen der Lösung von 17^-östradiol-Dehydrogenase, welche ein Polyol enthält, bewirkt, und zwar 1oo bis 15o Minuten auf eine Temperaturnon-estrogen-dependent transhydrogenase enzymes by heating the solution of 17 ^ -estradiol dehydrogenase, which is a polyol contains, causes, namely 100 to 150 minutes at one temperature
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von 60 bis 7o 0C in Gegenwart von 4o bis 60 % dieses Polyols, sowie durch Chromatographie auf DEAE - Cellulose.from 60 to 7o 0 C in the presence of 4o to 60% of this polyol, and purified by chromatography on DEAE - cellulose.
Nach einer speziellen Ausführungsform dieser Variante besteht das Polyol aus Glycerin.According to a special embodiment of this variant there is the polyol made from glycerine.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält die das Polyol enthaltende Lösung von 17/5'Östradiol-Dehydrogenase außerdem eine geringe Menge Diäthylstilbestrol (1o~ M).According to a further preferred embodiment, the solution containing the polyol contains 17/5 'oestradiol dehydrogenase also a small amount of diethylstilbestrol (10 ~ M).
Nach einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Entfernung der Steroide aus der 17$*Östradiol-Dehydrogenase durch Waschen des Enzyms, das vorher auf BEAE-Cellulose oder etwas ähnlichem adsorbiert wurde, mit einem Phosphatpuffer bewirkt, dessen pH-Wert in der Nähe von etwa 7-»2 liegt und der etwa 15 bis 25 % eines polaren Lösungsmittels enthält.According to a further embodiment of the method according to the invention, the steroids are removed from the 17 $ * estradiol dehydrogenase by washing the enzyme, which was previously adsorbed on BEAE cellulose or something similar, with a phosphate buffer, the pH of which is close to about 7- »2 and which contains about 15 to 25 % of a polar solvent.
Nach einer besonderen Ausführungsform dieser Variante enthält der Phospiiatpuffer etwa 2o % Ithanol.According to a special embodiment of this variant, the phosphate buffer contains about 20 % ethanol.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgeinäßen Verfahrens wird das Reaktionsgemisch, welches die ReaktionskoiEponenten und die zu bestimmenden Substanzen enthält, vor dem Ablesen der optischen Dichte 2 bis 12 Stunden, vorzugsweise 3 bis 9 Stunden, bei einer Temperatur von 2o bis 4o 0C, vorzugsweise 25 bis 38 0C inkubiert.According to a further preferred embodiment of the erfindungsgeinäßen process, the reaction mixture containing the ReaktionskoiEponenten and the substances to be determined is, prior to reading the optical density of 2 to 12 hours, preferably 3 to 9 hours, at a temperature of from 2o to 4o 0 C, preferably 25 to 38 0 C incubated.
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"Das Treibrad" zu der gesamten Dosierung besteht nämlich in den Umwandlungen von E^ und E2 und dann von E2 in E^ (wie weiter oben im Schema 1 angegeben). Diese Umwandlungen führen in jedem Cyclus zur Bildung einer stöchiometischen Menge NADH. Diese Umwandlungen verlaufen während der Inkubationszeit. So entsteht am Ende von χ Cyclen, welche einer bestimmten Inkubationsdauer entsprechen, eine Menge NADH, die dem x-fachen der stöchiometrischen Menge des Substrats (E^ und/oder E2), im Milieu entspricht, welche Menge NADH dann gut feststellbar, ist."The driving wheel" for the total dosage consists namely in the conversions of E ^ and E 2 and then from E 2 to E ^ (as indicated above in Scheme 1). These conversions lead to the formation of a stoichiometric amount of NADH in each cycle. These conversions take place during the incubation period. Thus, at the end of χ cycles, which correspond to a certain incubation period, an amount of NADH is created that corresponds to x times the stoichiometric amount of the substrate (E ^ and / or E 2 ) in the environment, which amount of NADH can then be easily determined .
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Proben den biologischen Media, welche die zu bestimmenden östrogene E1 und E2 enthalten, vor dem Bestimmungsverfahren einem Vorbereitungs-, Extraktions- und/oder Reinigungsverfahren unterworfen.According to a preferred embodiment of the method according to the invention, the samples of the biological media which contain the estrogens E 1 and E 2 to be determined are subjected to a preparation, extraction and / or purification process before the determination process.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform dieser Variante werden,According to a preferred embodiment of this variant,
falls das die zu bestimmenden östrogene enthaltende biologische Milieu aus Plasma besteht, ist diesen vorher einen an sich bekannten Extraktionsverfahren mit zum Beispiel Äther unterworfen, worauf man mehrmals mit den geeigneten Lösungsmitteln wäscht, abdampft und den letzten Abdampfrückstand in einem Gemisch aus einem polaren Lösungsmittel und einem Puffer dessen Ionenstärke praktisch gleich derjenigen eines o,1 M-Puffers is·^ löst, und der eine geringe Menge eines Proteins ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen sowie 15 bis 25 % If the biological medium containing the estrogens to be determined consists of plasma, this is previously subjected to a known extraction process with, for example, ether, after which it is washed several times with the appropriate solvents, evaporated and the last evaporation residue in a mixture of a polar solvent and a Buffer the ionic strength of which is practically the same as that of a 0.1 M buffer and which dissolves a small amount of a protein with no significant affinity for estrogens and 15 to 25 %
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eines Polyols enthält.of a polyol.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform dieser Variante wird , falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende biologische Milieu aus Urin besteht, diese vorher einem Vorbereitungsverfahren mit Hilfe eines die konjugierten Verbindungen hydroIysierenden Enzyms, wie zum Beispiel „ β -Glucuronidase" Pasteur, unterworfen.According to a further preferred embodiment of this variant, if the biological medium containing the estrogens to be determined consists of urine, this is previously subjected to a preparatory process with the aid of an enzyme which hydrolyzes the conjugated compounds, such as "β- glucuronidase" Pasteur.
Me Erfindung betrifft ferner eine gebrauchsfertige Bestimmungskombination (Bestimmungs-Kit), welche insbesondere für die Bestimmung der Östrogene E^, und Ep in Urin brauchbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie im wesentlichen folgende vorher bestimmte und lyophilisierte Bestandteile enthält:The invention also relates to a ready-to-use determination combination (determination kit), which is used in particular for determining the estrogens E ^, and Ep in urine are useful, thereby characterized in that it essentially contains the following previously determined and lyophilized ingredients:
- das Enzym 17 β ^Östradiol-Dehydrogenase, welches von Steroiden und parasitären nicht östrogen-abhängigen OJranshydrogenasen befreit sowie in einem geeigneten Polyol konserviert ist, insbesondere Glycerin;the enzyme 17 β ^ estradiol dehydrogenase, which is freed from steroids and parasitic non-estrogen-dependent OJranshydrogenasen and is preserved in a suitable polyol, in particular glycerol;
- einen inneren Standard (der einen bekannten Überschuß an Östrogenen enthält);an internal standard (containing a known excess of estrogens);
- eine Kontrolle (blanc);- a control (blanc);
- ein Enzym für die Hydrolyse der im Urin enthaltenen konjugierten Verbindungen, wie ,, P> -GlucuronidaseM Pasteur , das vorher in Funktion zur Menge der zu behandelnden Urinprobe bestimmt wurde:- an enzyme for the hydrolysis of the conjugated compounds contained in the urine, such as ,, P> -glucuronidase M Pasteur, which was previously determined as a function of the amount of the urine sample to be treated:
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NAD : 1o"2 - 1o ~4 ΜNAD: 1o " 2 - 1o ~ 4 Μ
Glucose-6-PDH : ο,1 IE/ml der zu bestimmenden ProbeGlucose-6-PDH: ο, 1 IU / ml of the sample to be determined
NADP : 1o~6 - 1o~8MNADP: 1o ~ 6 - 1o ~ 8 sts
Glucose-6-P : 1o~2 - Ίο ΜGlucose-6-P: 1o ~ 2 - Ίο Μ
Puffer SBA (Rinder-Serum Albumin) : o,5 Promille bis 1 Puffer Tris-HCL o,o5 M, pH etwa 7,5 ·Buffer SBA (bovine serum albumin): 0.5 per thousand to 1 Buffer Tris-HCL 0.05 M, pH about 7.5
Erfindungsgemäß besteht die Kontrolle (blanc) aus einem Gemisch von Puffer Tris-HCL + 15 bis 25 % Polyol + o,5 Promille bis 1 % SBA (Puffer A) und etwa o,5 ml Puffer A + 2 χ 1o"r M NAD, 2 χ 1o~6M NADP, 2 χ 1o""5 M Glucose-6-Phosphat, 0,2 I.E. Glucose-ö-Phosphat-Dehydrogenase/ml (Puffer B).According to the invention, the control (blanc) consists of a mixture of buffer Tris-HCL + 15 to 25 % polyol + 0.5 to 1 % SBA (buffer A) and about 0.5 ml of buffer A + 2 10 "r M NAD , 2 1o ~ 6 M NADP, 2 χ 1o "" 5 M glucose-6-phosphate, 0.2 IU glucose-δ-phosphate dehydrogenase / ml (buffer B).
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht der innere Standard aus einem Gemisch des obigen Puffers B und des Puffers A, der 16oo Picogramm östradiol/ml und o,o2 I.E. 17/?-östradiol-Dehydrogenase enthält.According to a preferred embodiment of the invention, the internal standard consists of a mixture of the above buffers B and of buffer A, which contains 16oo picograms of estradiol / ml and 0.02 I.U. 17 /? - contains estradiol dehydrogenase.
Außer den oben genannten Aufuhrungsformen betrifft die Erfindung auch andere Ausführungsformen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen.In addition to the above-mentioned forms of listing, the invention relates to also other embodiments that emerge from the following description emerge.
In den folgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert, ohne daß sie hierauf beschränkt werden soll.The process according to the invention is explained in more detail in the following examples, without being restricted thereto target.
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23089572308957
A - Bas EnzymA - Bas enzyme
Die 17ß Östradiol-Hydrogenase aus menschlicher Plazenta wird durch Chromatographie über DEAE-Cellulose und durch Affinitätschromatographie nach der von J.C.NICOLAS, M. PONS, B. DESCOMPS lind A.CSASTES de PADLET, Febs Letters YoI. 23 n° 2. Juni 1972, S 175-179, beschriebenen Methode gereinigt. Die auf diese V/eise erhaltene Enzymlösung wird 2 Stunden auf 65 0C in Gegenwart von 5o % Glycerin (und 1o~ M Diäthylstilbestrol) erhitzt, um alle parasitären anderen Enzyme zu zerstören. Anschließend entfernt man die Steroide durch Waschen des Enzyms, welches vorher auf DEAE-Cellulose adsorbiert wurde, mit 3oo ml Phosphat-Puffer (o,o3 M, pH=7,2), der 2o fo Äthanol enthält.The 17β estradiol hydrogenase from human placenta is determined by chromatography over DEAE cellulose and by affinity chromatography according to the method described by JCNICOLAS, M. PONS, B. DESCOMPS and A.CSASTES de PADLET, Febs Letters YoI. 23 n ° June 2, 1972, pp 175-179. The enzyme solution / ice thus obtained V is heated for 2 hours at 65 0 C in the presence of 5o% glycerol (and 1o ~ M diethylstilbestrol) to destroy all parasitic other enzymes. Is then removed by washing containing the steroids of the enzyme, which was previously adsorbed on DEAE-cellulose, with 3oo ml phosphate buffer (o.o3 M, pH = 7.2) 2o fo ethanol.
B - Extraktion und Reinigung der östrogene des Plasmas B - Extraction and purification of the estrogens of the plasma
Man versetzt 3»5 ml Plasma mit 1oo aiI Natriumpyrophosphat-Puffer (o,1 M, pH 9.). Ber pH-Wert der Plasmaprobe beträgt dann 8,9»100 aiI sodium pyrophosphate buffer are added to 3 »5 ml of plasma (0.1 M, pH 9.). The pH value of the plasma sample is then 8.9 »
Anschließend extrahiert man zwei Mal mit 3 ml Äther und der angereicherte Extrakt wird dann unter Stickstoff eingedampftThen it is extracted twice with 3 ml of ether and the enriched extract is then evaporated under nitrogen
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und auf 2 ml konzentriert, dann zwei Mal mit 1 ml Natriumcarbonat ( 1 Promille ) gewaschen. Dann wird der Äther zur Trocknung abgedampft und der Trockenrückstand in 1 ml 2 M-Natronlauge aufgenommen. Die wässrige Phase wird dann zwei Mal mit 2 ml Benzol/Heptan (2:1 V/V) gewaschen, dann mit 2oo All 1o M H^P(X neutralisiert und zwei Mal mit 3 ml Äther extrahiert. Nach dem Abdampfen wird der Rückstand mit "looyul Äthanol und 25o/ul Puffer-Tris-HCl (o,1 M, pH 7,4·) aufgenommen, der 1 Promill Rinder-Serumalbumin und 2o % Glycerin enthält.and concentrated to 2 ml, then washed twice with 1 ml of sodium carbonate (1 per thousand). The ether is then evaporated to dryness and the dry residue is taken up in 1 ml of 2 M sodium hydroxide solution. The aqueous phase is then washed twice with 2 ml of benzene / heptane (2: 1 V / V), then neutralized with 2oo All 10 MH ^ P (X and extracted twice with 3 ml of ether. After evaporation, the residue is washed with "looyul ethanol and 25o / ul buffer-Tris-HCl (0.1 M, pH 7.4), which contains 1 per mill bovine serum albumin and 20 % glycerol.
Die Östrogenbestimmung wird mit loo^ul dieses Extrakts durchgeführt. The estrogen determination is carried out with 100 μl of this extract.
C - Bestimmung der Östrogene C - Determination of estrogens
Das Reaktionsmilieu besteht aus 1 ml Puffer-Tris-HCl (o,o5 M, pH 7i4)> der 5 Promill Serumalbumin, 5·1ο ^ M Glucose-6-P, 5.1o"4M NAD, 5.1o~7M NADP, o,1 IE Glucose-6-P Dehydrogenase und o,o3 IE 17^ Östradiol-Dehydrogenase enthält. Die Östrogen Konzentration des Extrakts beträgt o,o2 bis 2 pMol.The reaction medium consists of 1 ml of buffer Tris-HCl (0.05 M, pH 714)> 5 per thousand serum albumin, 5 · 1o ^ M glucose-6-P, 5.1o " 4 M NAD, 5.1o ~ 7 M NADP , o, 1 IU glucose-6-P dehydrogenase and o, o3 IU 17 ^ oestradiol dehydrogenase The estrogen concentration of the extract is o, o2 to 2 pmol.
Die Inkubationsdauer beträgt 6 bis 16 Stunden bei 25 °C.The incubation period is 6 to 16 hours at 25 ° C.
Die Reaktionsgeschwindigkeit wird bei 34-0 mm mit Hilfe eines ZEISS-Spectrophotometers MD 1 oder eines Colorimeters LKB gemessen. Die Absorption der verschiedene Östrogen-Konzentra-The reaction rate is at 34-0 mm with the help of a ZEISS spectrophotometer MD 1 or a colorimeter LKB. The absorption of the various estrogen concentrations
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tionen enthaltenden Lösungen bei 34-O mm wird am Ende der Inkubationsdauer ' gelesen.solutions containing ions at 34-O mm will be at the end of the incubation period ' had read.
D - Resultate D - results
Die optische Dichte bei 34-O mm wird nach 6 bis 16 Stunden Reaktionsdauer bestimmt. Die beigefügte Abbildung zeigt die Kurve I für den Standard, erhalten mit Östradiolmengen zwischen o,o2o und 2 Picomol, das heißt, 5 bis 5oo pg nach 6 Stunden Reaktionsdauer; die Kurve II gibt die optische Dichte wider, die man bei den gleichen Mengen Östradiol nach 16 Stunden Inkubation erhält.The optical density at 34-0 mm becomes after 6 to 16 hours Reaction time determined. The attached figure shows curve I for the standard obtained with estradiol levels between o, o2o and 2 picomoles, that is, 5 to 500 pg after 6 Hours of reaction time; curve II shows the optical density that is obtained with the same amounts of estradiol after 16 hours Incubation is maintained.
Die Eichkurve ist in einem sehr großen Bereich linear: Auf alle Fälle deckt sie im breiten Bereich die physiologischen Konzentrationen, einschließlich des nicht-geschlechtsreifen Kindes und des Mannes. Normalerweise ist bei den Bestimmungen durch die fluorometischen Methoden, die derzeit im Stand der Technik durchgeführt werden, die Empfindlichkeit limitiert durch die Größe der Grundfluorescence, welche durch den biologischen Extrakt beigetragen wird. Nach der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode ist es wegen der großen "Verstärkung nicht nötig, die Ablesungen durch Fluorescenz oder in einem sehr hohen Empfindlichkeitsbereich durchzuführen. Aus diesem Grunde ist die durch den biologischen Extrakt beigetragene Absorption vernachlässigbar, gegenüber den AbsorptionenThe calibration curve is linear over a very large range: In any case, it covers the physiological range over a wide range Concentrations, including the immature Child and man. Usually, the determinations are made by the fluorometric methods that are currently in use be carried out in the prior art, the sensitivity is limited by the size of the basic fluorescence, which is contributed by the biological extract. According to the determination method according to the invention, it is because of the large "amplification is not necessary, the readings by fluorescence or in a very high sensitivity range. This is why it is contributed by the biological extract Absorption negligible compared to the absorptions
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der Produkte der enzymatischen Reaktion.the products of the enzymatic reaction.
A - Vorbereitung derUrinproben A - Preparation of urine samples
Die Entnahme wird mit vor dem Aufstehen entnommenen Urin durchgeführt. Man stellt 1 ml Urin auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7 ein, indem man 5o al (o,1 M ) Citratpuffer, zusetzt. Diese Lösung wird mit .einem Tropfen „ß-Glucuronidase"-Pasteur Jo Minuten bei 37 °C behandelt. Die Röhrchen werden dann abgekühlt und mit 1 ml Äthanol versetzt, die Mischung etwa 3o Minuten auf 24 0C gehalten und dann bei 4ooo g zentrifugiert. Das Überstehende wird zur Hälfte mit Puffer-Tris-HCl (pH 7,4), 1 Promill Rinder-Serumalbumin, 2o % Glycerin verdünnt. Die Dosierung wird mit 1oo ul dieses Extrakts durchgeführt.The collection is carried out with urine taken before standing up. 1 ml urine is adjusted to a pH of 6.5 to 7 by adding 50 μl (0.1 M) citrate buffer. This solution is treated with .einem drop "ß-glucuronidase" -Pasteur Jo minutes at 37 ° C. The tubes are then cooled and treated with 1 ml of ethanol, the mixture was held for about 3o minutes at 24 0 C and then centrifuged at 4ooo g Half of the supernatant is diluted with buffer Tris-HCl (pH 7.4), 1 per mill bovine serum albumin, 20 % glycerol, and the dosage is carried out with 100 μl of this extract.
B - Bestimmung B - provision
Man verwendet die folgenden Puffer: Puffer A : Tris HCl o,1 M, pH 7,4, 2o % Glycerin, 1 Promill SBA; Puffer B : Puffer A + 2.1o""5M NAD, 2.1o""6M NADP, 2.1o"5M Glucose-6-Phosphat, o,2 Einheiten pro ml Glucose-The following buffers are used: Buffer A: Tris HCl 0.1 M, pH 7.4, 20 % glycerol, 1 per mill SBA; Buffer B: Buffer A + 2.1o "" 5 M NAD, 2.1o "" 6 M NADP, 2.1o " 5 M glucose-6-phosphate, 0.2 units per ml glucose
6-Phosphat-Dehydrogenase; 909839/07356-phosphate dehydrogenase; 909839/0735
A -A -
Puffer C i Puffer A + 16oo pg östradiol pro ml.Buffer C i buffer A + 160 pg estradiol per ml.
Für 3ede Probe verwendet man 3 Röhrchen, welche I00 juI der Urinverdünnung und die folgende Menge Reaktionskomponenten enthalten:For each sample, 3 tubes are used, which are 100 ml Urine dilution and the following amount of reaction components contain:
Röhrchen 1 ϊ Kontrolle = o,5 ml Puffer A + o,5 ml Puffer B Röhrchen 2 ϊ Bestimmung = o,5 ml Puffer A + o,5 ml Puffer BTube 1 ϊ control = 0.5 ml buffer A + 0.5 ml buffer B Tube 2 ϊ determination = 0.5 ml buffer A + 0.5 ml buffer B
+ o,o25 IE /3-Östradiol-Dehydrogenase Röhrchen J : Überschuß = o,5 ml Puffer B + 0,5 ml Puffer C+ o, o25 IU / 3-estradiol dehydrogenase Tube J: excess = 0.5 ml buffer B + 0.5 ml buffer C.
+o,25 IE i? 4-Östradiol-Dehydrogenase.+ o, 25 IE i? 4-estradiol dehydrogenase.
Die Röhrchen werden 4· bis 16 Stunden bei $7 °C inkubiert. Die optische Dichte wird bei 34-Ο mm nach dieser Inkubationsdauer bestimmt. The tubes are incubated for 4 to 16 hours at 7 ° C. The optical density is determined at 34-Ο mm after this incubation period.
C - Berechnung der Östrogen-Konzentrationen C - calculation of estrogen concentrations
Die Eonsentration der in den Proben enthaltenen Östrogene wird im Vergleich zu dem Absorptionswert des Überschusses mit Hilfe der folgenden Formel berechnetThe concentration of the estrogens contained in the samples is calculated in comparison with the excess absorption value using the following formula
(jControllröhrchens C xier/l = Absorption des Bestimmungsröhrchens - Absorption des J( j control tube C xier / l = absorption of the determination tube - absorption of the J
Absorption des Überschußröhrchens - Absorption des BestimmungsröhrchensAbsorption of the excess tube - absorption of the Determination tube
multipliziert mit 800multiplied by 800
X .X
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C : Östrogen-Konzentration im Urin oder Plasma (jug/Liter) 800 : entspricht dem Östradiol Überschuss in dem Röhrchen X : Volumen des entnommenen biologischen Milieus in Mikroliter. Im vorliegenden Beispiel ist es loooyul im Falle des Plasmas und 25 /öl im Falle von Urin.C: Estrogen concentration in urine or plasma (jug / liter) 800: corresponds to the estradiol excess in the tube X: Volume of the biological medium removed in microliters. In the present example it is loooyul in the case of plasma and 25 / oil in the case of urine.
Die spezifische Bestimmung von Östradiol kann durchgeführt werden unter der Voraussetzung, daß man vorher das Östron des Milieus mit Hydrazin reagieren läßt.The specific determination of estradiol can be carried out provided that the estrone has been obtained beforehand of the milieu reacts with hydrazine.
Zu diesem Zweck läßt man 0,5 ml des biologischen Milieus (Plasma oder Urin mit Glucuronidase hydrolisiert) mit I00 nl einer wässrigen Hydrazinlösung (5 M, mit HCl auf pH 7 bis gebracht) 3o Minuten bei 37 °C reagieren. Das östradiol wird nach der vorher in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Methode bestimmt.For this purpose, 0.5 ml of the biological medium (plasma or urine hydrolyzed with glucuronidase) is left with 100 nl an aqueous hydrazine solution (5 M, with HCl to pH 7 to brought) react 30 minutes at 37 ° C. The estradiol is determined according to the method previously described in Examples 1 and 2.
Aus der vorgehenden Beschreibung resultiert, das unabhängig von den Ausführungsarten ein Verfahren zua? enzymatischen Bestimmung von Östrogenen E1 und E2 erhalten wird, welches im Vergleich zu den bislang bekannten Bestimmungsmethoden wesentliche Vorteile besitzt, von denen einige schon vorherFrom the preceding description it follows that a method can be used regardless of the types of execution. enzymatic determination of estrogens E 1 and E 2 is obtained, which has significant advantages compared to the previously known methods of determination, some of which have already been achieved
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erwähnt wurden, insbesondere:mentioned, in particular:
- das Verfahren ist sehr wenig kostspielig hinsichtlich der Seaktionskomponenten und Materialien, wobei man nur ein Photometer im nahen U.V. benötigt.- the process is very inexpensive in terms of components and materials, using only one Photometer in the near U.V. needed.
- Man braucht keine Radioisotopen- You don't need radioisotopes
- Das Verfahren ist leicht automatisierbar und direkt bei im Handel erhältlichen automatischen Systemen verwendbar (EECHNICON oder LKB)- The process can be easily automated and is carried out directly at im Commercially available automatic systems can be used (EECHNICON or LKB)
- Von Vorteil ist ferner die große Stabilität der Reaktions-- Another advantage is the great stability of the reaction
CjUa non) komponenten und Enzyme (condition sine^^einer Kommerzialisierung in großem Umfang-.CjUa non) components and enzymes (condition sine ^^ a commercialization on a large scale-.
- Bas Verfahren kann in einem sehr breiten biologischen Bereich angewandt werden- Bas procedure can be used in a very broad biological range can be applied
- Es gibt keine parasitäre Reaktion- There is no parasitic reaction
- Das Verfahren hat eine sehr hohe Spezifität- The method has a very high specificity
- Es werden keine Enzyme zerstört- No enzymes are destroyed
- Das Verfahren ist einfach, zuverlässig und völlig reproduzierbar und sehr empfindlich- The process is simple, reliable and completely reproducible and very sensitive
- Man kann das Verfahren bei einer großen Anzahl biologischer Milieus anwenden- The method can be used in a large number of biological environments
- Man kann das Verfahren bei biologischen Milieus, wie zum Beispiel Urin, anwenden, ohne vorher die Östrogene extrahieren su müssen oder in dem man relativ einfache und schnelle Extraktions-oder Reinigungsmethoden anwendet.- The method can be used in biological environments, such as urine, without first extracting the estrogens su must or in which one is relatively simple and uses rapid extraction or purification methods.
Wie aus dem obigen ersichtlich wird, ist die Erfindung nichtAs can be seen from the above, the invention is not
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auf die ausführlich beschriebenen Ausführungsformen beschränkt; sie umfasst vielmehr alle Varianten, die dem Fachmann aufgrund der Beschreibung einfallen, ohne vom Rahmen der Erfindung abzureichen.limited to the embodiments described in detail; Rather, it encompasses all variants that occur to the person skilled in the art on the basis of the description, without departing from the scope of FIG Invention to submit.
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Claims (1)
dadurch gekennzeichnet,Method according to claim 1,
characterized,
dadurch gekennzeichnet,13 method according to claim 1,
characterized,
dadurch gekennzeichnet,
daß der Phosphatpuffer etwa 20$ Äthanol enthalt.14 method according to claim 13,
characterized,
that the phosphate buffer contains about 20 $ ethanol.
und die zu bestimmende Substanz* enthält, vor dem Ablesen der optischen Dichte 2 bis 12 Stunden, vorzugsweise 3 bis 9 Stunden, bei einer Temperatur von 20 bis 400G, vorzugsweise bei 25 bis 380C inkubiert wird.en
and which contains substance to be determined * is incubated to 38 0 C at 25 prior to reading the optical density of 2 to 12 hours, preferably 3 to 9 hours, at a temperature of 20 to 40 0 G, preferably.
dadurch gekennzeichnet,17. The method according to claim 16,
characterized,
dadurch gekennzeichnet,18. The method according to claim 16,
characterized,
dadurch gekennzeichnet, 19 · Ready-to- use combination for determining the estrogenic Έ * and E 2 in urine by performing the method according to claims 1 to 18,
characterized,
eine Kontrolle (blanc),the enzyme 17 ß -estradiol dehydrogenase, which is freed from steroids and parasitic / non-estrogen-dependent transhydrogenases and preserved in a suitable polyol, in particular glycerol, an internal standard (which contains a known excess of estrogens),
a control (blanc),
NAD: 10~2 - 1O~4 M,an enzyme for the hydrolysis of the conjugated compounds contained in the urine (such as "^ -glucuronidase" Pasteur), which was previously determined by puncture to the amount of the urine sample to be treated,
NAD: 10 ~ 2 - 1O ~ 4 M,
Glucose-6-P: 10~2 - 10~4 M,Glucose-6-PDH: 0.1 ΙΕ / ml of the sample to be determined, KADP: 10 ~ 6 - 10 ~ 8 M,
Glucose-6-P: 10 ~ 2-10 ~ 4 M,
dadurch gekennzeichnet,
daß die Kontrolle (blanc) aus einem Gemisch von Puffer Tris-20. Combination according to claim 19,
characterized,
that the control (blanc) from a mixture of buffer Tris-
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