DE2840680A1 - Verfahren zum messen von lipoproteidcholesterinen - Google Patents

Verfahren zum messen von lipoproteidcholesterinen

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DE2840680A1 DE19782840680 DE2840680A DE2840680A1 DE 2840680 A1 DE2840680 A1 DE 2840680A1 DE 19782840680 DE19782840680 DE 19782840680 DE 2840680 A DE2840680 A DE 2840680A DE 2840680 A1 DE2840680 A1 DE 2840680A1
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Description

Anmelder: HELENA LABORATORIES CORPORATION
Verfahren zum Messen von
Lipoprotexdchü!esterinen
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein klinisches
Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Lipoproteidcholesterinfraktionen, insbesondere Lipoprotei cholesterin mit hoher Dichte (HDL), in Serum, Plasma und anderen Körperflüssigkeiten.
Blutserumcholesterin wird seit mehr als dreißig Jahren mit Coronararterienerkrankungen in Verbindung gebracht. Medizinische Fachleute glauben seit langem, daß Personen mit
erhöhtem Serumcholesterinspiegel wahrscheinlicher an Herzmuskelinfarkten (Herzanfällen) erkranken als Personen mit niedrigeren Cholesterinspiegeln. Die Wechselbeziehung
zwischen Cholesterinspiegeln und Coronararterienerkrankung
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ist jedoch nicht widerspruchsfrei, und daher sind diu vorliegenden diagnostischen Versuche über Cholesterin nur als Anleitung und nicht als verläßlicher Indikator für die Wahrscheinlichkeit von Herzmuskelinfarkt oder vorzeitiger Coronararterienerkrankung zu betrachten.
Die kurz zurückliegende Arbeit des National Heart, Lung and Blood Institute of Bethesda, Maryland, und des Framinyham Heart Institute of Framingham, Massachusetts, zeigt, daß eine Cholesterinfraktion, Lipoprotein mit hoher Dichte, wLiklich ein "Anzeiger für ein Risiko einer Herzkranzgefäß-Erkrankung" ist. Diese Entdeckung sollte unser Verständnis der Rolle von Cholesterin in Coronararterienerkrankungen verbessern. Weiter könnte auch eine Wechselbeziehung zwischen dem verbleibenden Lipoproteidcholesterin und dem Risiko einer Herzgefäßerkrankung gefunden werden. Daher ist ein einfacher, schneller und verläßlicher Test über die Konzentrationen von Lipoproteidcholesterinfraktionen in Körperflüssigkeiten notwendig.
Die seitherigen klinischen Versuche zur Bestimmung der Konzentration von Lipoproteidcholesterin mit hoher Dichte (HDL) in der Körperflüssigkeit erfordert ein Ausfällen der anderen Cholesterinfraktionen (Lipoproteide mit niedriger und mit sehr niedriger Dichte) und eine Bestimmung der Cholesterinkonzentration im Überstand. Kurz gesagt, der empfohlene Versuch umfaßt die Zugabe einer Heparinlösung zu der Fluidprobe und das Mischen, die Zugabe von Manganchlorid und Mischen, Abkühlen und Abziehen des Überstandes. Es wird angenommen, daß das gesamte verbleibende Cholesterin im überstand Lipoproteidcholesterin mit hoher Dichte ist. Das Cholesterin wird mit Isopropanol extrahiert, und der Extrakt wird auf Cholesterin und Trigylcerid in Spektrophotometern oder Dauerfluß-Analysatoren geprüft.
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Es ist of fensichtlieh, daß dieses Verfahren ei η i <je Nachteile hat. Das Verfahren ist langsam und daher teuer. Da Ausfällung verwendet wird, ist die Verläßlichkeit des Versuches zweifelhaft. Schließlich wird die Annahme, daß alles nach dem Ausfällen verbleibendes Cholesterin Lipoproteid mit hoher Dichte ist, ernsthaft in Frage gestellt. Das Problem in Zusammenhang mit dieser Annahme ist das Fehlen einer Spezifiziiät der normalerweise verwendeten Cationen, insbesondere Ca , Mg und Mn , in der LipoproteiJ /Heparin-Wechselwirkung. Ferner wurde gefunden, daß Unterklassen von Lipoproteid en mit hoher Dichte in Gegenwart von Mangancationen ausgefällt werden können. Daher ist das Ausfällverfahren nicht so verläßlich wie angenommen.
Das Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Lipoproteincholesterinfraktionen nach der vorliegenden Erfindung schaltet diese Probleme aus und ergibt einen einfachen und verläßlichen klinischen Vorgang.
Cholesterin kommt im Blutserum in zwei Formen vor, nämlich als freies Cholesterin und Cholesterinester. Beide Formen sind zusammen mit anderen Lipiden (z.B. Triglyceride, Phospholipide etc.) zur Bildung von Lipoproteiden an Serumproteine gebunden. Diese Lipoproteide kommen in verschiedenen Dichten vor, wie dies anfänglich durch Ultrazentrifugierung bestimmt wurde. Die Dichtefraktionen sind im allgemeinen Lipoproteidcholesterin mit hoher Dichte (HDL), Lipoproteidcholesterin mit sehr niedriger Dichte (VLDL) und Lipoproteidcholesterin mit niedriger Dichte (LDL). Es wird festgehalten, daß weitere Fraktionen einschließlich Unterklassen von HDL-Cholesterin festgestellt wurden, die oben genannten sind jedoch die Hauptfraktionen.
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Obwohl gewisse Proteine durch EIeL Li ophorese-Vei f dhrt.ii getrennt wurden, waren solche Verfahren bei der Tiennuny von kleineren Molekülen wie Cholesterin nicht erfolgreich. Das Verfahren nach der Erfindung nützt den Vorteil der Tatsache, daß beide Cholesterinformen an Serumproteine gebunden sind, was eine Trennung durch Elektrophoreseverfahren ermöglicht.
Nach der vorliegenden Erfindung wird also ein Vt rfahren zur Bestimmung der Konzentration von Lipoprotei^cholesterin mit hoher Dichte in der Körperflüssigkeit geschaffen, das gekennzeichnet ist durch
a) Aufbringen einer Probe der Körperflüssigkeit auf ein festes Elektrophorese-Trägermedium,
b) Anlegen eines Gleichstromes über dem Elektrophorese-Trägermedium, bis die Lipoprotei ucholesterinfraktion mit hoher Dichte von jeglichem,verbleibendem Lipoproteid der Probe getrennt ist,
c) Aufbringen eines für Lipoproteideholesterine mit hoher Dichte empfänglichen Entwicklungssubstrates auf das getrennte, der Elektrophorese unterworfene Lipoproteidcholesterin mit hoher Dichte und
d) quantitative Bestimmung der Konzentration des in der Körperflüssigkeit vorhandenen Lipoproteidcholesterins mit hoher Dichte aus der entwickelten, der Elektropherese unterworfenen Probe.
Durch diese Erfindung ist es möglich, die Konzentrationen von Lipoproteidcholesterin mit hoher Dichte, sehr niedriger und mit niedriger Dichte zu bestimmen. Dies ist eine bevorzugte Ausfuhrungsform der Erfindung, und die nachstehende Beschrei-
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buny betrifft diesen Aspekt der Erfindung. Das Verfahren ist wie folgt:
Zuerst wird eine kleine Probe der zu untersuchenden Körperflüssigkeit auf ein festes Elektrophorese-Trägermedium, vorzugsweise Zelluloseacetat, aufgebracht. Das Trägermedium hat im allgemeinen die Form eines Streifens. Dann wird ein Gleichstrom über dem Trägermedium während einer vorbestimmten Zeit angelegt, um die Lipoproteiächolesterine mit hoher, sehr niedriger und niedriger Dichte im Medium zu trennen. Danach wird ein für geringe Konzentrationen von Cholesterin empfängliches Entwicklungssubstrat auf die der Elektrophorese unterworfenen Lipoproteiocholesterine aufgebracht, das die getrennten Lipoproteidcholesterine auf dem Trägermedium entwickelt; die Cholesterine erscheinen in rotbrauner Farbe. Schließlich werden die Konzentrationen jedes Lipoproteidcholesterins durch irgendeines der verschiedenen Verfahren, wie direkte Dichtemessung oder durch Eluieren jeder Fraktion und Messen der Konzentration jedes Lipoproteids im Eluat, quantitativ bestimmt.
Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung ermöglicht also im wesentlichen gleichzeitig die Messung von Lipoproteincholesterinen mit hoher Dichte, mit niedriger Dichte und mit sehr niedriger Dichte. Das Verfahren ist schneller und billiger als die seitherigen klinischen Verfahren, da das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung das Ausfällen ausschaltet. Schließlich kann das Verfahren nach der Erfindung leichter nachgearbeitet v/erden, da die Bestimmung der Lipoproteid cholesterin-Konzentrationen direkt aus der gesamten Probe erfolgt. Weitere Vorteile und verdienstvolle Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich besser aus der folgenden detailierten Beschiäbung.
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Das Verfahren zur Bestimmung der Konzentrationen von Lipoproteidcholesterinen nach der Erfindung ist im wesent.lichen eine elektrophoretische Bestimmung. So wird eine geringe Probe der zu untersuchenden Körperflüssigkeit zuerst auf ein festes Elektrophorese-Trägermedium, vorzugsweise Zelluloseacetat, aufgebracht. Ein geeignetes Zelluloseacetat-Trägermedium ist in Streiferform von Helena Laboratories Corporation, Texas, USA, unter dem Markennamen "Titan III" erhältlich. Es wird festgestellt, daß auch andere Trägermedien, beispielsweise Zellulosenitrat, Agar Atjarose ,Papieracrylaitiidgel, Zellulosenitrat, Silicagel oder Stärke, verwendet werden können. Die Flüssigkeitsprobe wird auf das Trägermedium vorzugsweise in gerader Linie aufgebracht, was ein genaues Ablesen nach der Elektrophorese ermöglicht. Eine geeignete Vorrichtung zum Aufbringen der Flüssigkeitsprobe auf das Trägermedium ist in der US-PS 4 006 705 beschrieben.
Danach wird ein Gleichstrom über dem Medium angelegt, der die Trennung der Lipoproteidcholesterinfraktionen hervorruft. Die Bewegung der Lipoproteidcholesterine durch ein Medium, wie Zelluloseacetat, hängt vom Medium ab, von der Intensität des elektrischen Feldes, der Zeit und der Art des beladenen Partikels. Im Hinblick auf die Tatsache, daß diese Variablen bei jeder Lipoproteidcholesterinfraktion konstant sind, werden die Fraktionen durch Anlegen des elektrischen Feldes getrennt. Es wurde festgestellt, daß optimale Trennungen von Lipoproteidcholesterinen bei ca. einhundertachtzig (180) Volt (Gleichstrom) während ca. Minuten erfolgen. Es wurde ferner gefunden, daß der Grad für die Trennung HDL-, VLDL- und LDL-Cholesterin ist; dies ist der hier verwendete Grad.
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Nach der Elektrophorese wiiiu ein für geringe Cholesterinkonzentrationen empfängliches Entwicklungssubstrat auf den der Elektrophorese unterworfenen Lipoprotei«.!^holesterin-Streifen aufgebracht. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist das Entwicklungssubstrat ein Cholesterinoxidase-Esterasesubstrat, wie es bei Worthington Biochemical Corporation, Freehold, New Jersey, erhältlich ist. Die dort erhältliche Cholesterinoxidase-esterase wird zum enzymatischen Messen von Cholesterin verwendet. Beim erfindungsgemäßen Verfahren' werden die der Elektrophorese unterworfenen Lipoproteidcholesterine während ca. 15 Minuten bei 37 C mit der Cholesterinoxidase-esterase inkiibiert. Das Entwicklungssubstrat kann auf die der Elektrophorese unterworfenen Cholesterine auf verschiedene Weise aufgebracht werden, u.a. durch einfaches Tränken oder Eintauchen der Trägermedien in das Reagens oder vorzugsweise dadurch, daß das Trägermedium auf ein anderes Trägermedium geschichtet wird, das mit dem Reagens imprägniert wurde. Beispielsweise kann ein wie oben beschriebener Streifen aus Zelluloseacetat in ein Cholesterinoxidaseesterasereagens getaucht oder damit imprägniert werden. Es wird dann eine Schicht aus einem mit dem Reagens imprägnierten Zelluloseacetatstreifen und dem der Elektrophorese unterworfenen Medium hergestellt, die wie oben beschrieben inkubiert wird.
Wenn das. Entwicklungssubstrat ein Cholesterinoxidase-esterasereagens ist, sind die Lipoproteidcholesterine rotbraun gefärbt und können auf dem Trägermedium leicht erkannt werden. Weiterhin wurden die Lipoproteidfraktionen wie beschrieben während der Elektrophorese getrennt, was eine quantitative Bestimmung der Konzentration von Lipoproteidcholesterinen mit hoher Dichte, sehr niedriger und niedriger Dichte erlaubt.
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Die quantitative Bestimmung kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden. Beim einfachsten Verfahren werden die Trägermedkin durch ein geeignetes Instrument zum Messen der Absorption, beispielsweise einen Dichtemesser, abgetastet. Bei einer anderen Ausführungsform kennen die einzelnen Fraktionen e.luiert und die Absorption mit einem Spektrophotometer gemessen werden. Wie Fachleute verstehen werden, können andere quantitative Verfahren ebenfalls angewandt werden. Beispielsweise kann das Cholesterinoxidase-esterasereagens mit einem Fluoreszein oder einem radioaktiven Isotop, beispielsweise Jod 125, versehen werden. Wenn Fluoreszein verwendet wird, kann die Konzentration jeder Fraktion durch eine Fluoreszenz-Dichtemessung oder Spektrophotometrie bestimmt werden. Wenn ein radioaktives Isotop verwendet wird, werden die Konzentrationen durch Messen der Radioaktivität jeder Probe unter Verwendung eines Radioisotop-Scanners bestimmt. Wenn ein dünnes Blatt oder ein dünner Streifen Zelluloseacetat für das Elektrophorese-Trägermedium verwendet wird, können die einzelnen Lipoproteil fraktionen mit Scheren herausgeschnitten werden. Dann wird jede Fraktion aufgelöst, und die Fluoreszenz oder Radioaktivität jeder Probe wird gemessen. Dies schafft eine sehr genaue Bestimmung.
Der Fachmann wird verstellen, daß zahlreiche Abänderungen des Verfahrens zur Bestimmung der Konzentration von Lipoproteil cholesterinen nach der Erfindung möglich sind. Die Einzelheiten des elektrophoretischen Verfahrens werden vom Fachmann verstanden. Beispielsweise zeigt die US-PS 4 005 ein Verfahren und eine Vorrichtung zur graphischen Dichteanzeige, die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann.
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Claims (12)

PATENTANWÄLTE D i ρ I.-C h e m. Dr. Ruff Dipl.-Ing. J. Βθϊθγ RUFK und BEiEiR STUTTGART Neckaistraöe 50 D-7OOO Stuttgart 1 Tel.: CO711) 227051* Telex Ο7-23412 erub d 18. September 1978 /Bo A 17 518 Anmelder: HELENA LABORATORIES CORPORATION Verfahren zum Messen von Lipoproteidcholesterinen Ansprüche
1.»Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Lipoproteid- ^—' cholesterin in Körperflüssigkeiten, gekennzeichnet durch
a) Aufbringen einer Probe der Körperflüssigkeit auf ein festes Elektrophorese-Trägermedium,
b) Anlegen eines Gleichstromes über dem Elekurophorese-Trägermedium, bis die Lipoproteidcholesterxnfraktion mit hoher Dichte von jeglichem verbleibendem Lipoproteid der Probe getrennt ist,
c) Aufbringe eines für Lipoproteidcholesterine mit hoher Dichte empfänjLichen Entwicklungssubstrates auf das getrennte, der Elektrophorese unterworfene Lipoproteid-
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ORIGINAL INSPECTED
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cholesterin mit hoher Dichte und
d) quantitative Bestimmung der Konzentration des in der Körperflüssigkeit vorhandenen Lipoproteidcholesterins mit hoher Dichte aus der entwickelten, der Elektrophorese unterworfenen Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Entwicklungssubstrat Cholesterinoxidase-Esterasesubstrat verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Cholesterinoxidaseesterase auf das Trägermedium aufgebracht wird, indem das Medium in eine Flüssigkeitsprobe des Cholesterinoxidase-Esterasereagens getaucht wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Cholesterinoxidaseesterasesubstrat auf das Trägermedium aufgebracht wird, indem ein unbehandelter Streifen des Trägermediums mit flüssigem Cholesterinoxidase-Esterasereagens imprägniert wird und der imprägnierte Streifen in Schichtform auf die der Elektrophorese unterworfenen Lipoproteidcholesterine aufgelegt und das aufeinandergeschichtete Medium während einer vorbestimmtem Zeitdauer inkubiert wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägermedium Zelluloseacetat verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gleichstrom von ca. einhundertachtzig (180) Volt während ca. 20 Minuten an das Trägermedium angelegt wird.
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7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die quantitative Bestimmung mit einem Densitometer durchgeführt wird, indem die Absorption jedes Lipoproteidcholesterins nach dem Aufbringen des Entwicklungssubstrates gemessen wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die quantitative Bestimmung durchgeführt wird, indem die der Elektrophorese unterworfene Fraktion eluiert und dann die Konzentration der Fraktion quantitativ bestimmt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Fraktion unter Verwendung eines Spektrophotometers bestimmt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Cholesterinoxidase-Esterasereagens mit Fluoreszein versehen wird, wobei die Konzentration der Fraktion durch Messen der Fluoreszenz quantitativ bestimmt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Cholesterinoxidase-Esterase mit einem radioaktiven Isotop versehen wird, wobei die Konzentration der Fraktion durch Messen der Radioaktivität der Fraktion mit einem Radioisotopzähler quantitativ bestimmt wird.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Gleichstrom in der Flüssigkeit vorhandene Lipoproteidcholesterine mit hoher Dichte, sehr niedriger und niedriger Dichte trennt und bei dem die Konzentiation jedes Lipoproteids quantitativ bestimmt wird.
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