DE2838675A1

DE2838675A1 - Testmittel und verfahren zum nachweis von ketonkoerpern

Info

Publication number: DE2838675A1
Application number: DE19782838675
Authority: DE
Inventors: Thomas A Mager; David L Tabb
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1977-11-21
Filing date: 1978-09-05
Publication date: 1979-05-23
Also published as: US4147514A; IN148668B; DE2838675C3; GB2009400A; IT7851732A0; BR7807608A; GB2009400B; FR2392385A1; AU512204B2; DE2838675B2; IT1106142B; CA1115629A; SE7809390L; HU179778B; JPS54109899A; JPS5752541B2; AR216797A1; FR2392385B1; AU3913478A

Description

Die Erfindung betrifft diagnostische Testmittel zum Nachweis von Ketonkörpern. Insbesondere betrifft die Erfindung die qualitative und quantitative Bestimmung von Ketonkörpern in Körperflüssigkeiten, vor allem von Acetoessigsäure im Urin. Darüber hinaus beschreibt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Ketonkörpern.

Wie im folgenden beschrieben, umfassen die Ketonkörper Verbindungen, wie Aceton, Acetoessigsäure und ß-Hydroxybuttersäure

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(obwohl letztere kein Keton darstellt). Die chemische Bezie hung dieser Verbindungen zueinander wird nachfolgend aufgezeigt:

CH₃COCH₂-COOH CH₃-CO-C (Acetoessigsäure) (Aceton)

H⁺ (Reduktion)

CH₃-CHOh-CH₂-COOH

(ß-Hydroxybutters äure)

Aceton stellt ein Zersetzungs- bzw. Abbauprodukt von Acetoessigsäure dar und wird ansonsten wahrscheinlich nicht im menschlichen Organismus produziert, obwohl es stets dann im Urin gefunden wird, wenn die anderen beiden Verbindungen vorliegen.

Acetoessigsäure und ß-Hydroxybuttersäure sind offensichtlich Zwischenprodukte beim Abbau der Fettsäureketten (über Acetoacetyl-Coenzym A) . Im Normalfall werden Fettsäurai zu Kohlendioxid und Wasser oxidiert und es erscheinen im Blut oder im Urin keine Zwischenprodukte in grösserem Ausmass.

Wenn der Körper aufgrund einer metabolischen Störung oder einer ungeeigneten Diät unzureichende Mengen an Kohlehydraten metabolisiert, so führt der gesteigerte Fettsäuremetabolismus zum Auftreten von Ketonkörpern im Blut (Ketonämie) und im Urin (Ketonurie). Klinische Zustände, vor allem bei Diabetes mellitus, erfordern den Nachweis und die Beobachtung der Ketonurie zu deren Behandlung. Aus diesem Grunde wird von Versuchen zu einer vereinfachten Produktion und einer verbesserten Stabilität der

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Natriumnitroprussid-Teste berichtet, welche für diesen Nachweis im grossen Masstab angewendet wurden.

Die Verwendung von löslichen Nitroprussiden zum Nachweis von Ketonkörpern, bekannt als Legal-Test, ist seit langem bekannt. Von Swinehart stammt ein Übersichtsartikel in"coordination Chem. Rev., 2(4), 386-403, Dezember 1967," der Arbeiten zur Reaktion von Natriumnitroprussid mit Aceton und Acetoessigsäure. Diese Arbeit von Swinehart beschreibt den Reaktionsmechanismus von Natriumnitroprussid am Zentrum des Säurewasserstoffs sowie die Reaktion der Nitrosylkomponente von Natriumnitroprussid.

Die US-PS 2 186 902 (Fortune) offenbarte als eine der ersten eine Formulierung, wonach die Nitroprussid-Reaktion in Gegenwart von Ammoniak durchgeführt wird,um besondere Färbungen zu entwickeln.

Die US-PS 2 509 140 (Free) beschrieb später Formulierungen zum Nachweis von Ketonkörpern im Urin, die wasserlösliche Nitroprusside, eine aliphatische Aminosäure (Glycin) und eine alkalische Substanz enthalten. US-PS 2 577 978 (Nicholls) offenbart den Zusatz von Lactose oder ähnlichen Zuckern zu der Zusammensetzung gemäss Free.

US-PS 2 990 253 betrifft eine Testäüsammensetzung, welche in einen saugfähigen Streifen inkorporiert wird, wobei - aufgrund der Instabilität von Nitroprussid im alkalisch-wässrigen Medium das Nitroprussid getrennt gehalten wird. Eine Trennung wird durch ein zweistufiges Herstellungsverfahren des Streifens erreicht, wonach zuerst das Nitroprussid in einem sauren wässrigen Medium auf den Träger aufgebracht.wird, wodurch die Stabilität der Verbindung aufrecht erhalten wird, und nach dem Trocknen der

* (Smeby)

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Träger in eine nicht-wässrige Lösung von organischen Basen, wie verschiedenen Aminen oder Aminoalkoholen, eingetaucht wird, um die erforderliche Alkalinität zu erreichen.

US-PS 3 212 855 (Mast) offenbart ein verbessertes zweistufiges Tauchverfahren, wobei der saugfähige Träger zuerst mit einem alkalischen Puffer und einer Aminosäure und nach dem Trocknen dann mit einem Alkalimetall-nitroprussid, einer Verbindung die einen organischen Film mit saurem pH-Wert bildet,und einem organischen Lösungsmittel imprägniert wird.

ÜS-PS 3 880 590 (Ogawa) beschreibt einen Ketonteststreifen, der durch ein einmaliges Tauchverfahren hergestellt wird. Die Zusammensetzung besteht aus einem Nitroprussidsalz in Kombination mit einem Salz eines Schwermetalls, mit einer spezifischen Dichte von über 5, wie Nickel, Kupfer, Kobalt, Mangan, Chrom und Zink, und eignet sich für Bestimmungen bei saurem pH-Wert. Weitere Metalle, die eine spezifische Dichte von über 5 aufweisen, umfassen Arsen (5,7), Blei (11,34) und Quecksilber (13,6). Substanzen, wie Puffer, die dazu dienen, der Zusammensetzung einen alkalischen pH zu verleihen, sind ausgeschlossen.

Der Einsatz von Ketonnachweisverfahren, bei denen Schwermetalle verwendet werden, stösst jedoch auf Widerstände. Metalle mit hoher Dichte, insbesondere Nickel, Kobalt und Chrom, waren Gegenstand ausgedehnter, staatlich subventionierter Toxizitätsuntersuchungen. Insbesondere wurde von H. E. Christensen (Herausgeber) in "Registry of Toxic Effects of Chemical Substances", U.S. Department of Health, Education and Welfare, Rockvillc, Maryland (1975), über die Toxizität dieser Metalle und vieler ihrer Salze berichtet. In der HEW-Studie wird z.B. für die Verbindung Nickelchlorid eine Lethaldosis (^Dg₀ von 26 mg/kg angegeben, wenn diese Verbindung intraperitoneal in Mäuse injiziert

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wird. Die niedrigste angegebene lethale Dosis (LDLo) von 10 mg/kg wird für die intravenöse Verabreichung an Hunden berichtet. LDLo stellt die niedrigste Dosis einer Substanz dar, die - mit Ausnahme durch Inhalierung - auf irgendeine Art über einen beliebigen Zeitraum verabreicht wurde, und wie berichtet, zum Tode geführt hat. Für Kupfer(II)chlorid wird LD₅₀ mit 140 mg/kg angegeben, wenn dieses oral an Ratten verabreicht wurde. Bei der intraperitonealen Verabreichung an Mäuse werden 7400 Mikrogramm/ kg angegeben. Die Toxizität von Kobalt(II)chlorid wird als LD₅₀ mit 80 mg/kg (oral) und 20 mg/kg (intravenös) bei der Ratte angegeben.

Ausserdem wird in der 1976 vom National Cancer Institute veröffentlichten "Übersicht von Verbindungen, die auf ihre karzinogene Aktivität geprüft wurden" angegeben, dass Kobaltchlorid, Kupfer, Nickel und viele von dessen Salzen,zink und eine Anzahl seiner Salze, Blei und andere Schwermetalle in Tieren Tumore verursachen. C. D. Searle hat in "Chemical Carcinogens" ACS Monograph 193, Washington, American Chemical Society (1976) auf den Seiten 327-329 Nickel als besonders aggressives Karzinogen identifiziert.

Zusammenfassend .kann ausgeführt werden, dass bestimmte Aminosäuren und Schwermetallsalze verwendet wurden, in dem Versuch, die Reaktion von Acetoessigsäure mit Natriumnitroprussid zu verbessern. Aufgrund dieser Versuche konnten Verbesserungen erreicht werden, jedoch sind diese in gewisser Weise beschränkt, da die Verwendung vieler dieser Substanzen von beachtlichen gesundheitlichen Gefahren begleitet wird.

Ausserdem gilt als allgemein akzeptierte Tatsache, dass die Anwendung des Natriumnitroprussid-Testes bei alkalischem pH (im Gegensatz zu saurem pH) ein "zweistufiges" Tauchverfahren

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bei der Teststreifenherstellung erfordert, das ökonomisch einen beachtlichen Faktor darstellt.

Darüber hinaus bestehen noch ernsthafte Probleme aufgrund der Instabilität, insbesondere bei alkalischem pH-Wert, der wässrigen Nitroprussid-Lösungen, sowie aufgrund der langsamen und nur massig ansprechenden Reaktivität und der Instabilität der chromophoren Spezien. Der schnelle Farbabbau der erhaltenen chromophoren Spezien verringert die Aussagekraft nach verhältnismässig kurzen Zeitspannen und verlangt daher eine unmittelbar durchgeführte Auswertung durch geübtes Personal.

Es ist daher das Hauptziel der vorliegenden Erfindung, einen verbesserten Test zum Nachweis von Ketonkörpern der Art zur Verfügung zu stellen, bei der lösliches Nitroprussid verwendet wird.

Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, Ketontestmittel, wie eine entsprechende Zusammensetzung und einen Nachweisanzeiger zur Verfügung zu stellen, wobei Substanzen verwendet werden, die keine signifikanten gesundheitlichen Gefahren mit sich bringen.

Darüber hinaus ist es Ziel der Erfindung, Ketontestmittel vom Nitroprussid-Typ zur Verfügung zu stellen, wobei die Stabilität des Nitroprussids sowohl bei saurem als auch bei alkalischem pH aufrechterhalten wird.

Weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine Herstellungsmethode für Ketontestanzeiger mit einem einzigen Tauchvorgang zu schaffen, wobei die genannten Testanzeiger bei alkalischem pH-Wert verwendet werden sollen.

Ziel der Erfindung ist es ausserdem, ein Ketontestmittel,

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einschliesslich einer Zusammensetzung und eines Anzeigers, zur Verfügung zu stellen, welches die Ionisierung der Ketonkörper erleichtert und dadurch eine verkürzte Reaktionszeit möglich macht.

Durch die Erfindung wird ein Ketontest geschaffen, der in wirksamer Weise die Stabilität des sich ergebenden chromophoren Komplexes aufrecht erhält.

Weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer Ketontestzusammensetzüng, welche die oben genannten Vortei3.e aufweist und die hinsichtlich ihrer Herstellungskosten wesentlich reduziert ist.

Ziel der Erfindung ist es ausserdem, eine Ketontestzusammensetzung und einen Anzeiger zur Verfügung zu stellen, wobei die oben genannten Vorteile durch Anwesenheit eines anorganischen Salzes von Magnesium oder Kalzium gewährleistet sind.

Darüber hinaus stellt die Erfindung eine Ketontestzusammensetzung und einen Anzeiger zur Verfügung, mit deren Hilfe eine weitere Stabilisierung des erhaltenen chromophoren Komplexes infolge einer synergistischen Kombination der oben genannten Metallsalze mit einem primären Amin erreicht wird.

Weitere Ziele der Erfindung lassen sich der folgenden Beschreibung entnehmen.

Gemäss der Erfindung wird ein Testmittel zum Nachweis von Ketonkörpern in Körperflüssigkeiten zur Verfügung gestellt. Insbesondere wird eine Zusammensetzung.vom Nitroprussid-Typ geschaffen, die dadurch gekennzeichnet"ist, dass mindestens ein anorganisches Salz eines Metalles aus der Gruppe Magnesium und Kalzium

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zugegeben wird. Gegebenenfalls kann mindestens ein primäres Amin in Kombination damit zugegeben werden. Die Zusammensetzungen werden in einen Träger inkorporiert, wie z.B. einer absorbierenden Matrix oder einer Tablette, um einen Testanzeiger zu schaffen. Das Nitroprussid wird in Lösung bei alkalischem pH durch das Metallsalz stabilisiert, wodurch eine Herstellungsmethode mit einem einzigen Tauchvorgang möglich wird; die Ionisierung der Ketonkörper wird durch das Metallsalz katalysiert, wodurch sich eine verkürzte Reaktionszeit ergibt; ausserdem wird der erhaltene chromophore Komplex durch das Metallsalζ stabilsiert, wodurch der Zeitraum der Farbbeständigkeit zur Parbauswertung verlängert wird. Darüber hinaus wird der chromophore Komplex durch das primäre Amin stabilisiert.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung ein lösliches Nitroprussid in Kombination mit mindestens einem anorganischen Salz, wie CaCl₂ und insbesondere MgSCK. Andere geeignete Salze umfassen z.B. MgCl₃₇ MgBr-, Mg(ClO₄)₂"6H₂O Mg(NO₃)₂-"2H₂O, Mg(NO₂J₂-3H₂O, CaSO₄, Ca(BrO₃) ₂-H₃O, Ca(ClO₃) ₂, Ca(ClO)₂ ^und Ca(HSO₃)2· Der Zusammensetzung können ein oder mehre Metallsalz(e) zugefügt werden, wobei die Kombination von MgSO₄ und CaCl₂ besonders bevorzugt ist.

Bevorzugte Nitroprusside stellen die löslichen. Nitroprussidsalze dar. Diese umfassen Alkalimetallsalze von Nitroprussid, wie Natrium- oder Kaliumnitroprussid.

Es wurde festgestellt, dass die/Anwesenheit dieser Metallsalze eine Reihe von überraschenden Effekten ergibt. Zu diesen Effekten gehören die Stabilisierung löslicher Nitroprusside in wässriger Lösung bei alkalischem pH, die erleichterte Ionisierung von Ketonkörpern und die Stabilisierung der erhaltenen chromophoren Spezien. Darüber hinaus wird ein Einstufen-Verfahren unter

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Verwendung von Herstellungslösungen mit alkalischem pH zur Herstellung von Nachweisanzeigern, die bei alkalischem pH verwendet werden sollen, geschaffen.

Es wird angenommen, dass diese bisher nicht bekannten Eigenschaften und Vorteile sich aufgrund des in Diagramm A aufgezeigten Mechanismus ergeben, obwohl dies nicht unbedingt eine Theorie darstellt, auf welche die Erfindung basiert werden muss.

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DIAGRAMM A

CN j

NC

I I Fe

CN

NC-

—CN

Il ο Mg 0

NC-

—CN Fe

NC—j CN

CN

NC

•CN

Fe

NC-

-CN

CH \

H₂C

-O=C

/^H2 -O=C

NC-

■CN

Fe

NC-

-CN

CN

H₃C

NC-

CN

NC-

■ CN

NC-—CN O N

-C—0"

,C Mg C

CH₃

-0

-CN

NC——CN CN

* Die Abbildungen entsprechen der Nomenklatur und den Abbildungen von Cotton und Wilkinson
in "Advanced Inorganic Chemistry", John Wiley & Sons (1962)

DO CO OO CJ)

Darüber hinaus ergeben sich weitere vorteilhafte Eigenschaften, die den bisher zur Verfügung stehenden Tests überlegen sind. Unter diesen Eigenschaften sind zu nennen, die verstärkte Stabilität bei erhöhter Hitzeeinwirkung sowie bei verstärkter Feuchtigkeitseinwirkung, eine reduzierte Differenzierungszeit, eine Empfindlichkeit gegenüber Ketonkörperkonzentrationen, die unter den. Konzentrationen liegt, die bisher nachweisbar waren, ein intensiverer Farbtest und beachtliche ökonomische Vorteile bei den Kostenaufwendungen der verwendeten Materialien. Vergleichende Kostenangaben sind dem Chemical Marketing Reporter, 19, September 1977,zu entnehmen. Sämtliche der anderen vorteilhaften Eigenschaften werden durch die nachstehenden Beispiele bestätigt.

Die gemäss der Erfindung verwendeten Metallsalze sind im wesentlichen nicht-toxisch und nicht-karzinogen. Zum Beispiel beträgt die niederste lethaie Dosis nach Christensen {entsprechend der im voranstellenden zitierten Veröffentlichung) für Magnesiumsulfat (Synonym: Epsom-Salze) 75O mg/kg bei intravenöser Injektion in Hunde. Die intraperitonealen und subkutanen LDLo-Werte betragen beim Hund mehr als das Doppelte dieser Menge. ^LD5q~ Werte sind für diese Verbindung überhaupt nicht aufgeführt. Lediglich für Magnesiumchlorid wird eine LD₅₀-DoSiS mit 2800 mg/kg bei oraler Verabreichung an Ratten angegeben. Für Kalziumchlorid beträgt bei Ratten LDc₀ 100 mg/kg (oral) , LDLo 500 mg/kg (intraperitoneal) und 161 mg/kg (intravenös). Diese Daten befinden sich im starken Gegensatz zu denen anderer Metallsalze, wie z.B. der im Vorangehenden besprochenen Metallsalze.

Gemäss einer*bevorzugten Ausführung umfasst die Zusammensetzung mindestens ein primäres Amin. Ein Typ eines primären Amins, der besonders geeignet ist, wird durch die Aminosäuren dargestellt. Andere bevorzugte Amine gehören der Gruppe Ethylendiamin, Picolylamin, m-Aminophenol und Semicarbazid an. Geeignet sind auch

* anderen

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Amine aus der Gruppe Aminomethansulfonsäure, SuIfanilinsäure, Cysteinsäure, Cyclohexylamin und Pyridoxamin. Vorteilhaft ist auch die Verwendung von Kombinationen dieser primären Amine, z.B. von. Aminomethansulfonsäure und Pyridoxamin.

Es wurde festgestellt, dass sich durch die Zugabe dieser primären Amine unerwartet vorteilhafte Eigenschaften ergeben. Unter anderem hat sich gezeigt, dass Schiffsche Basen, die zwischen den Ketonkörpern und einem primären Amin gebildet werden, in synergistischer Kombination mit Metallsalzen gemäss der Erfindung wirken, indem sie mit vergleichsweise niedrigen Mengen an Bestandteilen einen besonders empfindlichen Ketonnachweis ergeben.

Eine optimale Farbentwicklung wird dann erhalten, wenn die protonierten und freien Formen des aktiven Amins in äquimolaren Konzentrationen vorliegen. Daher wird bevorzugt ein primäres Amin ausgewählt, dessen pKa gleich dem pH ist, bei dem der Test durchgeführt werden soll. Die erhaltene blaue Färbung und die chromophoren Spezien, die diese Färbung ergeben, bilden einen Gegensatz zur Entwicklung der Rotfärbung, die durch Zugabe der Natriumprussid- und Metallsalz-Zusammensetzung zu einem Ketonkörper in Abwesenheit einer Stickstoffquelle erhalten wird.

Ausser der Katalysierung der Reaktion von löslichem Nitroprussid mit Ketonkörpern durch Zugabe anorganischer Magnesiumoder Kalziumsalze wird nun in vorteilhafter Weise der promnastische Effekt dieser Metallsalze auf Aldehyd- und Ketonkomponenten auf dem Gebiet der Nitroprussid-Teste angewandt, indem die Metallsalze mit primären Aminen unter Bildung eines Metallkomplexes, wie er in dem nachfolgenden Diagramm B gezeigt wird, kombiniert werden, wobei zwei benachbarte KoordinationsZentren des Metalls durch das Carbonyl und das primäre Amin eingenommen

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bzw. besetzt werden. Diese Nachbarschaft der zwei reaktiven Spezien, die in einer starren Konfiguration um ein Metallion angeordnet sind, führt dann dazu, dass das Metallion als ein Elektronenreservoir fungiert, was deren Reaktion zur Bildung einer Schiff'sehen Base unter Eliminierung von H₃O erleichtert.

Diagramm B

/^CH2^CH2\ N NH₂

c=c

Es wird angenommen, dass die Bildung einer Schiff'sehen Base zwischen einer Aminosäure, einem aminosäureanalog oder bestimmten anderen primären Aminen und Acetoessigsäure oder Acetoacetat den promnastischen Effekt mit einem Metallsalz in einem sehr starren, jedoch sehr wirksamen Bi-Tridentat-Komplex erfährt, wie in Diagramm C angegeben.

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Diagramm C

Darüber hinaus werden Testanzeiger dnxh Inkorporierung der Zusammensetzungen gemäss der Erfindung zur Verfügung gestellt, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieser Reagenztestanzeiger mit Hilfe eines einzigen Eintauchschrittes, wobei das Verfahren darin besteht, dass ein Träger, wie eine Matrix oder eine Tablette, mit einem Nitroprussid in Kombination mit einem anorganischen Magnesium- oder Kalziumsalz oder dem Metallsalz und einem primären Airiin in Kontakt gebracht wird. Wenn dieser Kontakt durch Imprägnierung mit einer Lösung gemäss der erfindungsgemässen Zusammensetzung erfolgt, so wird der auf diese Weise behandelte Träger getrocknet. Lösungsmittel, die für die Herstellung von Lösungen für die Einmal-Eintauch-Methode verwendet werden, können Wasser, physiologische Lösungen, organische Lösungsmittel oder deren Gemische darstellen.

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3V

Die Lösung selbst oder eine Tablette, welche die erfindungsgemässe Zusammensetzung enthält, kann zum Nachweis von Ketonkörpern verwendet werden, indem diese zu der Probe an Körperflüssigkeit, wie Urin, Plasma oder Serum, zugegeben wird. Dadurch wird die Bildur.g eines chromophoren Komplexes mit der resultierenden Farbänderung bewirkt. Die Zusammensetzung wird jedoch vorzugsweise in·Form einer festen Präparation, im Gegensatz zur Lösung selbst, verwendet.

Feste Präparationen, wie sie nachfolgend beschrieben werden, werden vorzugsweise in eine Trägermatrix vom Format eines Streifens inkorporiert. Der Testanzeiger bzw. der Teststreifen wird in vorteilhafter Weise verwendet, indem dieser in eine Testprobe für kurze Zeit eingetaucht wird oder indem auf andere Weise die Testprobe in die Trägermatrix eindringen kann, wobei sich in Anwesenheit von Ketonkörpern eine nachweisbare Farbänderung ergibt. Der Testanzeiger kann auf die gleiche Weise verwendet werden, wenn Plasmaproben, Serumproben oder Proben anderer KÖrperflüssigkeiten zu prüfen sind. Der erfindungsgemässe Testanzeiger kann gegebenenfalls auf ein längliches Trägerelement aufgebracht werden.» . . '

Der Testanzeiger gemäss der Erfindung ist sensitiv gegenüber Ketonkörpern, insbesondere gegen Acetessigsäure und Acetoacetat im Urin. Da eine charakteristische Farbreaktion in Abhängigkeit von der Konzentration der nachzuweisenden Ketonkörper stattfindet, ist es möglich, die genannten Ketonkörper semi-guantitativ nachzuweisen.

Unter Verwendung der Testzusammensetzung und des Anzeigers gemäss der Erfindung ist es nunmehr möglich, Acetoessigsäure im Urin in Mengen von hinunter bis mindestens 1 mg/dl nachzuweisen.

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Obwohl in der nachfolgenden Beschreibung der Klarheit willen spezifische Ausdrücke verwendet werden, sollen sich diese jedoch nur auf besondere Ausführungen gemäss der Erfindung beziehen, die als Beispiele zur Erläuterung^ ausgewählt wurden, ohne den Umfang der Erfindung zu beschränken.

Die im Handel üblichen Standardprodukte für lösliche Nitroprusside, wie Natriumnitroprussid, lassen sich gut verwenden. Ebenso sind die gemäss der Erfindung verwendeten Metallsalze und primären Amine leicht erhältliche handelsübliche Präparationen. Anorganische Magnesium- und Kalziumsalze werden im Bereich von etwa 0,5 molaren (M) bis etwa 2,0 M Lösungen verwendet. Wenn primäre Amine, wie Äthylendiamin, Picolylamin, m-Aminophenol, Semicarbazid, Aminomethansulfonsäure, SuIfanilinsäure, Cysteinsäure, Cyclohexylamin und Pyridoxamin mit dem Metallsalz kombiniert werden, so lie^ gen sie ün.Konzentrationsbereich von etwa 1,0 bis etwa 1,5 Gew.% vor. Die kombinierten Materialien können der Nitroprussid-Lösung zusammen oder in Sequenz zugegeben werden. Ebenso können mehr als ein Kalzium- oder Magnesiummetallsalz oder primäres Amin gleichzeitig verwendet werden.

Es können übliche Puffer, wie Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan /TRIS/# Piperazin-N,N'-bis-(2-äthansulfonsäure) /PIPES?, N-Tris-(hydroxymethyl)-methyl-2-aminoäthansulfonsäure verwendet werden.

Die Nitroprussid-Lösung wird auf einen pH im Bereich von etwa 7,0 bis etwa 9,2 gehalten. Gemäss" der Erfindung ist die Stabilisierung von Nitrqprussid in einem im allgemeinen alkalischen pH-Bereich, in welchem das Nitroprussid eine verbesserte Reaktivität aufweist, gewährleistet.

Die Bezeichnung Trägermatrix kann sich auf saugfähige und

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nicht-saugfähige Matrizes beziehen, die in Wasser oder physiologischen Flüssigkeiten unlöslich sind und die ihre strukturelle Integrität in den genannten Flüssigkeiten beibehalten. Geeignete, saugfähige Matrizes umfassen Papier, Zellulose, Holz, synthetische Harzvliese, Glasfasern, Webstoffe oder Faservliese und dergleichen. Nicht-saugfähige Matrizes umfassen organoplastische Materialien, wie Polystyrol, Polypropylen und dergleichen. Wird eine saugfähige Matrix verwendet, so ist es vorteilhaft, diese durch geeignete Mittel, wie z.B.ein doppelseitiges Klebeband an ein unlösliches Trägerelement zu fixieren, wie z.B.an eine.n organo-plastischen Streifen. Dies erleichtert die Verwendung derselben.

Alternativ können die Zusammensetzungen gemäss der Erfindung" in einen Träger eingebaut werden, der in Form einer gepressten oder gegossenen (molded) Tablette vorliegt und der übliches Trägermaterial enthält.

Die Differenzierung von 0 bis 80 mg/dl bezieht sich auf die Zeit, die erforderlich ist, um eine Farbbildung zu erreichen, die ausreicht, visuell die Testanzeiger, die Ketonkonzentrationen von 0 mg/dl, 20 mg/dl, 40 mg/dl und 80 mg/dl ausgesetzt worden sind, zu unterscheiden.

Nach einer bevorzugte Ausführungsform werden die Testanzeiger gemäss der Erfindung durch Inkorporieren, wie z.B. durch Imprägnierung einer Trägermatrix mit der erfindungsgemässen Zusammensetzung, hergestellt. Neben der Imprägnierung können die Anzeiger gemäss der Erfindung auch mittels anderer geeigneter Methoden, wie Bedrucken oder Aufsprühen der Zusammensetzung auf das Substrat oder die Matrix, hergestellt werden.

Das Verfahren zur Anwendung dieser Anzeiger sieht vor, eine

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flüssige Probe in Kontakt mit dem Anzeiger oder dem Testmittel zu bringen und dann die sich ergebende Farbänderung des Anzeigers oder der Probe zu beobachten.

Gemäss der Erfindung werden Testmittel zur Verfügung gestellt, die ein Nitroprussid in Kombination mit mindestens einem anorganischen Salz aus der Gruppe Magnesium und Kalzium oder das Metallsalz und ein primäres Amin umfassen. Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung und sollen keine Einschränkung der Erfindung darstellen.

Beispiel I

Dieses Experiment zeigt die stabilisierende Wirkung von Mg ' auf Nitroprussid-Lösungen.

MgSO^'7H₂O (analysenrein) wird in verschiedenen Mengen in 2 M wässrigen Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-^TRIS/- Puffer gelöst, so dass Konzentrationen bis zu 1 M (Molar) und 2 M erhalten werden. Daraufhin gibt man 2,5 g Na₂/lNO)Fe(CN) ₅_7 zu 50 ml dieser Pufferlösung. Der pH-Wert wird in aliquoten Teilen dieser Lösung durch tropfenweise Zugabe von 0,1 M NaOH eingestellt. Auf diese Weise werden die Imprägnierungslösungen gemäss Tabelle 1 erhalten.

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Tabelle 1

pH	2 M Mg⁺⁺	1 M Mg⁺⁺
9,2 9,0 8,6 8,3 8,0	Mg 2(9,2) Mg 2(9,O) Mg 2(8,6) Mg 2(8,3) Mg 2(8,0)	Mg 1(9,2) Mg 1(9,0) Mg 1(8,6) Mg 1(8,3) Mg 1(8,0)

Whatman-3MM-Filterpapier (Whatman Inc., Clifton, N.J. 07014) in Streifen von 2,5 cm χ 1O cm wird bis zur Sättigung mit den jeweiligen Lösungen, wie sie in Tabelle 1 angegeben sind, imprägniert, dann bei51,7°C (125°F) getrocknet und zu Quadraten von 0,5 χ 0,5 cm geschnitten, welche Anzeiger gemäss der Erfindung-darstellen. Die auf diese Weise hergestellten Nachweisanzeiger werden mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebandes auf plastische Trägerelemente von der Grosse 0,5 cm χ 8,O cm geheftet.

Anzeiger, die frisch hergestellt worden waren bzw. 3 und 21 Stunden alt waren, wurden durch momentanes Eintauchen in Urinlösungen mit 0, 20, 40 und 80 mg/dl Acetoessigsäurekonzentration und in eine wässrige Ketonlösung (Stammketon) mit 2 g/dl getestet. Die Ergebnisse, die nach der angegebenen-Ablese- bzw. Auswertezeit (in Sekunden) erhalten wurden, werden in Tabelle wiedergegeben.

4. durch Imprägnieren mit Lösungen .

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Tabelle 2

Frische Lösungen	Testanzeiger	0 bis 80 mg/dl Differenzierung\sek. (Bemerkungen)	Stammkel-.on (Bemer kungen)
Mg 2(9,2)	5 (ausgezeichnet purpurfarben)	momentan (tief purpurfarben)
Mg 2(9,0)	1O (ausgezeichnet)	momentan (tief purpurfarben)
Mg 2(8,6)	1O (gut - rosa/ rosefarben)	moment an (purpur- farben)
Mg 2(8,3)	10-20 (gut-ausge zeichnet)	momentan (purpur farben)
Mg 2(8,0)	20-35 (gut-ausge zeichnet)	moment an (purpur- farben)
Mg 1(9,0)	15-25 (gut-ausge zeichnet)	momentan (purpur farben)
Mg 1 (8,6)	20—35 (gut-ausge zeichnet)	momentan (purpur farben)
Mg 1(8,3)	25-40 (mittel)	momentan (purpur farben)
Mg 1(8,0)	35-40 (mittel)	momentan (purpur farben)
•	3 Stunden alte Lösung
Testanzeiger	0 bis 80 mg/dl Differenzierung sek. (Bemerkungen)	Vergleich mit fri schen Lösungen bei 20 & 80 mg/dl
Mg 2(9,2)	10 (ausgezeichnet)	kein wesentlicher Unterschied
Mg 2(9,0)	10-15 (gut)	kein wesentlicher Unterschied

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Fortsetzung Tabelle 2

Mg 2(8,6) Mg 2(8,3) Mg 2(8,0) Mg 1(9,2) Mg 1(9,0) Mg 1(8,6) Mg 1(8,3) Mg 1(8,0)	10-20 (gut-ausge zeichnet) 20-25 (gut) 15-20 (gut) 15-20 (gut) 15-20 (gut-ausge zeichnet) 20-35 (gut-ausge zeichnet) 25-40 (mittel) 35-40 (mittel)	kein wesentlicher Unterschied kein wesentlicher Unterschied kein wesentlicher Unterschied kein wesentlicher Unterschied kein wesentlicher Unterschied kein wesentlicher Unterschied kein wesentlicher Unterschied kein wesentlicher Unterschied	Testanzeiger	0 bis 80 mg/dl Differenzierung sek. (Bemerkungen)	Vergleich mit fri schen Lösungen bei 20 & 80 mg/dl
21 Stunden alte Lösung	Mg 2(9,2) Mg 2(9,0) Mg 2(8,6) Mg 2(8,3)	5-10 (sehr gut) 10 (sehr gut) 10-15 (sehr gut) 15-20 (sehr gut)	kein wesentlicher Unterschied möglicherweise eine schwächere Reaktion bei 20 mg/dl nach 21 h kein wesentlicher Unterschied kein wesentlicher Unterschied

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Fortsetzung Tabelle 2

Mg 2(8,0)	20 (sehr gut)	möglicherweise eine schwächere Reaktion bei 80 mg/dl nach ^V21 h
Mg 1(9,2)	15 (gut)	möglicherweise sind 21 h Proben gleich- massiger entwickelt
Mg 1(9,0)	10-15 (gut)	kein wesentlicher Unterschied
Mg 1(8,6)	15-20 (gut)	kein wesentlicher Unterschied
Mg 1(8,3)	20-25 (gut)	kein wesentlicher Unterschied
Mg 1(8,0)	30 (gut)	kein wesentlicher Unterschied

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Die bei diesem Experiment erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass j

die sonst instabilen Nitroprussid-Lösungen durch Zugabe von i

Magnesiumsalzen über einen längeren Zeitraum hin stabil sind. I

Die Lösungen, selbst wenn sie über längere Zeiten aufbewahrt ;

wurden, ergaben Anzeiger, mit denen man Keton leicht nachwei- ! sen konnte und die zwischen unterschiedlichen Ketonkonzentrationen differenzierten.

Beispiel II

In diesem Experiment wurde pharmazeutisch reines (U.S.P.) Magnesiumsulfat-heptahydrat (Epsom-Salze) anstelle von analysenreinem Magnesiumsulfat verwendet. Die Tatsache, dass pharmazeutisch reines Magnesiumsulfat ohne weiteres im Handel erhältlich ist, zeigt, dass die erfindungsgemäss verwendeten Salze im allgemeinen als nicht-schädlich angesehen werden.

Epsom-Salze bzw. Bittersalze (Walgreen Co., Dist., Deerfield, 111.) wurden anstelle von analysenreinem MgSO-·7H₂O in der folgenden Formulierung verwendet und eine entsprechende Lösung hergestellt:

Bittersalze 49,5 g

Na₂^TNO)Fe(CN)₅_7·2H₂O 5,0 g destilliertes Wasser bis auf 100,0 ml

Die auf diese Weise hergestellte v/ässrige Losung (100 ml) wurde dann mit 1 N NaOH auf pH 9,2 eingestellt.

Diese klare rote Lösung wurde dann zur Imprägnierung in einem einzigen Tauchvorgang von 9 cm χ 18 cm Eaton-Dikeman 204 (ESD)

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Papier (Eaton-Dikeman, Mount Holly Springs, Pa. 17065) verwendet. Das Papier wurde mit der Lösung bis zur Sättigung imprägniert, 10 Minuten lang bei 50 bis 60 C getrocknet und zu Abschnitten von 1 cm χ 1 cm geschnitten, welche erfindungsgemässe Anzeiger darstellen. Die getrockneten imprägnierten Papierabschnitte wurden dann mit einem doppelseitigen Klebeband kaschiert und mit diesem auf ein organo-plastiscl.es Trägerele-.ment geheftet.

Die auf diese Weise hergestellten Anzeiger wurden dann durch momentanes Eintauchen derselben in Urinlösungen mit bekannter Ketonkörperkonzentration getestet. Farbentwicklungen in den erwarteten Farbtönen von braun-gelb (negativ) bis zu verschie-denen Rot-Tönen (positiv) differenzierten zwischen 0, 1, 10, 20, 40 und 80 mg/dl Acetoessigsäure ebenso schnell wie die analysenreine Formulierung (d.h. in 5 bis 10 Sekunden).Die Ergebnisse zeigen, dass die Stabilisierung von Nitroprussid und die Katalyse der Reaktion gleich der ist, wie sie bei Verwendung von-analysenreinem MgSO- erhalten wird.

Beispiel III

Es wurde ein Vergleich unter Verwendung des Anzeigers mit den Metallen der Gruppe Ha und HIa durchgeführt, die als Katalysatoren der Reaktion Na₂/TNO)Fe(CN)₅_7 mit Acetoessigsäure bei einem pH von 7,6 dienen.

Impragnierungslösungen für den Anzeiger wurden durch Auflösen von erfindungsgemässen Zusammensetzungen hergestellt, wobei letztere 2,5 g Na₂^TNO)Fe(CN)₅_7 in Kombination mit den in Tabelle 3 angegebenen Formulierungen in jeweils 50 ml wässrigem TRIS-Puffer enthielten.

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Tabelle 3

Verbindungen	I	II	III .	IV	V
MgSO.*7H₉O CaCl₂ AlCl₃ BaSO₄ NaBF₄	24,3 g
	11,1 g
		13,4 g	23,0 g	.
				11,0 g

Der pH von III konnte nicht auf 7,6 eingestellt werden, da Aluminiumhydroxid ausfiel. BaSO₄ von IV bildete eine unlösliche Emulsion.

Streifen-von 2,5 cm χ 10 cm grossen Whatman-Papieren wurden bis zur Sättigung mit den oben angegebenen Lösungen imprägniert, bei 51,7°C (125°F) getrocknet und zu Abschnitten von 0,5 cm χ 0,5 cm zu den erfindungsgemässen Anzeigern geschnitten. Die auf diese Weise hergestellten Abschnitte wurden mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebandes auf plastische Trägerelemente von der Grosse 0,5 cm χ 8 cm geklebt.

Diese Anzeiger wurden durch momentanes Eintauchen in Stammketon und in ürinlösungen mit 0, 20, 40 und 80 mg/dl Konzentrationen an Acetoessigsäure getestet, wobei die in den Tabelle 4 und 5 angegeben Ergebnisse erhalten wurden.

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Tabelle 4

	Stammketon	III	*	IV	V
	I II	nicht mög lich den pH einzu stellen"	keine (Emul sion)	schwaches Rose (lang sam)
Kontrolle (kein Metall)	momentan momentan violett rot
schwaches Rose (5 min)

Tabelle 5

Verbindungen	0-80 mg/dl Differenzierung
I II	sehr gut (10 bis 15 Sekunden) violette Farbe sehr gut (30 Sekunden) ziegelrote Farbe

Wie aus Tabelle 4 zu ersehen ist, ergeben unter den Verbindungen I bis V lediglich I (MgSO₄) und II (CaCl₂) geeignete Testanzeiger. Tabelle 5 zeigt, dass die mit den Verbindungen I und II hergestellten Anzeiger gut zwischen klinisch signifikanten Ketonkonzentrationen unterscheiden können.

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Beispiel IV

Die Zusairanensetzungen und Anzeiger gemäss der Erfindung (C unten) wurden mit denen verglichen, die "Schwermetallsalze" verwenden, wie dies in Beispiel I der US-PS 3 880 590 (Ogawa) beschrieben ist. Da die Beschreibung hinsichtlich der verwendeten exakten Formulierung unklar ist, wurde diese nach zwei möglichen Interpretationen (A und B unten) hergestellt.

(A) In dieser Präparation wurden 30 ml 0,3 M TRIS, welche 5 g NiCl₂'6H-O pro 1 enthalten, mit 9 ml der folgenden Lösung gemischt:

Dimethylformamid 5g.

Na₂^TNO)Fe (CN)₅_7-2H₂O 40 g

(d.h. 95 g wässriges Natriumnitroprussid)

destilliertes Wasser bis auf 100 ml

Dieses Geraisch stellte eine grau-blaue Emulsion dar, welche bei der Herstellung von Anzeigern gemäss dem Verfahren im vorstehend genannten Beispiel II einen Anzeiger ergab, der eine starke Schleierbildung aufwies und der beim Testen nur schlecht reagierte.

(B) In der alternativen Präparation wurden 30 ml 0,3 M TRIS, die 5 g NiCl₂-6H₃O pro 1 enthielten, mit 9 ml der folgenden Lösung vermischt:

Dimethylformamid 95 g

Na₂^TNO)Fe(CN)₅_7*2H₂O 5 g destilliertes Wasser bis auf 100 ml

Diese Formulierung ergab eine minzgrüne durchscheinende Lösung,

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die zur Herstellung von Anzeigern verwendet wurde. Diese Anzeiger wurden genau wie in Beispiel IV (A) angegeben hergestellt, mit der Ausnahme, dass das Papier bei Raumtemperatur im Dunkeln getrocknet .wurde.

(C) Erfindungsgemässe Testanzeiger wurden genau wie im oben genannten Beispiel II angegeben hergestellt, mit der Ausnahme, dass analysenreines MgSO₄*7H₂O anstelle von pharmazeutisch reinem verwendet wurde.

Um einen fairen Vergleich zu gestatten, würde die Präparation (B), welche die bessere der zwei möglichen Präparationen (A) und (B) darstellt, bei den Vergleichsversuchen mit den erfindungsgemässen Anzeigern verwendet. Jeder der auf diese Weise hergestellten Anzeiger wurde durch momentanes Eintauchen in Urinproben mit 0, 1 , 10, 20, 40 und 80 mg/dl Acetoessigsäure getestet.

Der Nickelchlorid-Testanzeiger (B) differenzierte 0, 10, 20, und 80 mg/dl Acetoessigsäure in 30 Sekunden. Der Farbbereich umfasste weisslich (negativ) bis schwach lavendelfarben bei 80 mg/dl. Ketonkonzentrationen von· unter 10 mg/dl, aber über 1 mg/dl,konnten nachgewiesen werden. Der erfindungsgemässe Anzeiger differenzierte zwischen 0, 1, 10, 20, 40 und 80 mg/dl Acetoessigsäure in 5 bis 10 Sekunden, wobei Ketonkonzentrationen von 1 mg/dl nachgewiesen wurden. Der Farbbereich umfasste gelb-braun (negativ) bis tief rot bei 80 mg/dl.

Damit konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe der erfindungsgemässen Anzeiger niedrigere Ketonkonzentrationen nachgewiesen und differenziert werden können, als dies mit Hilfe der bekannten Anzeiger der Fall ist. Ausserdem erfolgt der entsprechende Nachweis schneller.

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Beispiel V

Dieses Experiment stellt einen Vergleichsversuch der Auswirkung von Hitzebelastungen auf die Leistung der Anzeiger dar, wobei diese wie im voranstehenden Beispiel IV getestet wurden.

Die zu testenden Anzeiger wurden genau wie in den voranstehenden Beispielen IV (B) und IV (C) beschrieben, hergestellt. Die als Kontrollen verwendeten Anzeiger wurden während des Experimentes auf Raumtemperatur gehalten. Die übrigen Anzeiger wurden einer trockenen Wärme von entweder 60 C oder 70 C in einem Standard-Laborofen über verschiedene Zeiträume, wie unten angegeben, ausgesetzt.

Nach 3 Tagen zeigte der Anzeiger (C) gemäss der Erfindung bei 60 C keinen Unterschied zur Kontrolle, wohingegen der Anzeiger (B) mit NiCl₂- ein schwaches Nachlassen der Farbintensität aufwies .

Nach 7 Tagen zeigte der erfindungsgemässe Anzeiger bei 60°C noch immer keinen Unterschied zur Kontrolle, wohingegen der Anzeiger mit NiCl- eine deutliche 15 bis 20 Sekunden lange Verzögerungszeit der Farbentwicklung im Vergleich zur Kontrolle aufwies .

Nach 3 Tagen wies der Anzeiger (C), welcher die MgSO.-Formulierung.eathielt, bei 70 C noch immer keinen Unterschied zur Kontrolle auf, wohingegen der Anzeiger (B) mit der NiCl,,-Formulierung eine 30 Sekunden lange Verzögerungszeit zeigte. Darüber hinaus verringerte sich bei Anzeiger (B) die Farbintensität sämtlicher Färbungen um mindestens einen ganzen Farbblock. Dies bedeutet, dass z.B. die Anzeiger, die mit 80, 40, 20 mg/dl

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getestet wurden, jeweils Färbungen ihrer Kontrollen entsprechend 40, 20, 10 mg/dl zeigten.

Damit zeigt das Experiment, dass die erfindungsgemässen Anzeiger wesentlich hitzebeständiger sind als die bekannten Anzeiger. Vom Fachmann wird die Prüfung auf Hitzebeständigkeit im allgemeinen als ein Hinweis für die Lagerbeständigkeit des Produktes angesehen.

Beispiel VI

In diesem Experiment wurden Vergleichsversuche hinsichtlich der Wirkung erhöhter Feuchtigkeit auf verschiedene Anzeiger, die genau wie in den Beispielen IV (B) und IV (C) angegeben,hergestellt wurden, durchgeführt.Die Kontrollanzeiger wurden während des Experimentes bei Raumfeuchtigkeit gehalten. Die übrigen Anzeiger wurden Feuchtigkeitsbelastungen von 87 % relativer Feuchte bei 28 C über verschiedene Zeiträume ausgesetzt.

Nach der Einwirkung der Feuchtigkeit wurden die Anzeiger durch momentanes Eintauchen in Stammketon und in Urinlösungen mit 0, 20, 40 und 80 mg/dl Acetoessigsäurekonzentrationen getestet. Die nach der jeweiligen Einwirkungszeit erhaltenen Ergebnisse sind nachfolgend angegeben.

Nach 1 Stunde zeigte der gemäss der Erfindung hergestellte Anzeiger (C) absolut keine Abweichung von der Kontrolle, während der Anzeiger (B) , welcher NiCl₂ enthielt,den Verlust eines halben Farbblockes bei jeder Konzentration an Acetoessigsäure im Vergleich zur Kontrolle aufwies.

Nach 3 Stunden zeigte sich bei Anzeiger (C) noch immer keine

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Abweichung von der Kontrolle. Der Anzeiger (B) mit NiCl₂ jedoch wies den Verlust eines ganzen Farbblockes für jede der genannten Konzentrationen auf.

Damit zeigt der Versuch, dass die gemäss der Erfindung hergestellten Anzeiger unter Feuchtigkeitsbelastung den bisher bekannten bei weitem überlegen sind. Dies deutet wiederum auf eine gute Lagerbeständigkeit hin.

Beispiel VII

Das folgende Experiment zeigt den katalysierenden Einfluss eines anorganischen Magnesiumsalzes auf die Na_2i/(NO)Fe(CN) ₅_/-Reaktion bei höherem pH.

Eine Imprägnierungslösung für Anzeiger wurde aus einer wässrigen 2 M. TRIS-Lösung durch Auflösen einer erfindungsgemässen Zusammensetzung aus 2 48 g/l MgSO₄*7H₂O und 2,5 g/l Na₂^TNO)Fe(CN)₅_7 hergestellt. Aliquote Teile der oben genannten Lösung wurden auf die pH Werte 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 und 9,2 mit Hilfe von 1 N NaOH oder 1 N HCl hergestellt.

Streifen von 2,5 cm χ 10 cm grossem Whatman-Papier wurden jeweils mit den oben genannten Lösungen bis zur Sättigung imprägniert, bei 51,7⁰C (125 F) getrocknet und zu Abschnitten von 0,5 cm χ 0,5 cm geschnitten, welche die erfindungsgemässen Anzeiger bildeten. Die auf diese Weise hergestellten Abschnitte wurden mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebandes auf plastische Trägerelemente von der Grosse 0,5 cm x^ 8 cm aufgeklebt.

Diese Anzeiger wurden durch momentanes Eintauchen in ein Stammketon

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wie im vorangehenden angegeben, und in Urinlösungen, mit 0, 20, 40 und 80 mg/dl Acetoessigsaurekonzentrationen getestet, wobei die in Tabelle 6 aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden.

Tabelle 6

PH	0-80 mg/dl Differenζ ierung	bei	60	sek	Stammketon
5,0	. keine	bei	60	sek	langsam (rosa-pfirsichfarben)
6,0	schwach	bei bei	15 45	sek sek	schnell (rose-farben)
7,0	mittel gut	bei	15	sek	schneller (rosa)
8,0	gut	bei	15	sek	momentan (violett)
9,0	gut	bei	15	sek	momentan (violett)
9,2	gut	momentan (violett)

Im Gegensatz zu früher bei sauren pH-Werten durchgeführten Versuchen zeigen die obigen Ergebnisse bei Verwendung eines anorganischen Magnesiumsalz-Katalysators eine schnellere und intensivere Farbentwicklung bei Zunahme des pH-Wertes bis zu stark alkalischen Werten.

Beispiel VIII

Das folgende Beispiel zeigt die synergistische Wirkung von Bittersalzen (Epsom-Salzen) und Aminomethansulfonsäure beim Nachweis von Ketonen.

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Tabelle 7

Bestandteile	A BC D
Bittersalze Na₂/TNO)Fe(CN)₅_7·2H₂O Aminomethansulfonsäure	49,5 g 49,5 g 5,0 g 5,0 g 5,0 g 5,0 g 1/5 g 1,5 g

Zusammensetzungen, die jeweils gemäss den in Tabelle 7 angegebenen Formulierungen hergestellt wurden, wurden in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst und der pH mit 0,1 M NaOH auf 7,3 eingestellt. Es wird darauf hingewiesen, dass der pH-Wert von 7,3 sowohl leicht alkalisch ist, als auch sehr nah dem pKa des ausgewählten Amins (pKa = 6,5) liegt.

Bogen von E&D-Papier wurden jeweils mit den oben angegebenen Lösungen bis zur Sättigung imprägniert, 10 Minuten lang bei 50 bis 60 C getrocknet und zu Testanzeigern von der Grosse 1 cm χ 1 cm geschnitten. Diese Abschnitte wurden dann mit einem doppelseitigen Klebeband kaschiert und auf ein Trägerelement aus Plastik geklebt.

Einige Minuten nachdem die Anzeiger in Acetoessigsäure-haltigen Urin eingetaucht worden waren, zeigte der Anzeiger, welcher die Komponente (A) enthielt, keine Farbentwicklung. Der Anzeiger mit den Komponenten (B) zeigte eine schwache und der Anzeiger mit den Komponenten (C) zeigte lediglich eine leichte Differenzierung von 0 bis 80 mg/dl Acetoessigsäure (leichte ziegelrote Färbung) in 30 Sekunden. Im Gegensatz dazu wies der Anzeiger mit den Komponenten (D) eine vollständige Differenzierung zwischen

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O, 20, 40 und 80 mg/dl Acetoessigsäure in 30 Sekunden auf. Die Differenzierung von 0 und 10 mg/dl erschien nach 50 bis 60 Sekunden. Wie erwartet, zeigte Nitroferricyanid allein, dessen pH-Wert auf 7,3 eingestellt worden war ^entsprechend (AJ.7 keine Farbentwicklung, da der klassische optimale pH-Wert im stark alkalischen liegt. Während sich bei pH 7,3 mit Bittersalzen (B) und Aminomethansulfonsaure (C) jeweils ein leichter katalytischer Effekt zeigt, tritt lediglich bei gemeinsamer Verwendung von Epsom-Salz und Aminomethansulfonsaure eine starke Verstärkung der Farbentwicklung auf.

Das Experiment zeigt auf einfache und deutliche Weise den Synergismus zwischen Epsom-Salz und primärem Amin.

Beispiel IX

Die Versuche des vorliegenden Beispiels zeigen den stabilisierenden Effekt bei der Kombination eines erfindüngsgemässen Metallsalzes .mit einem primären Amin.

Anzeiger wurden unter Verwendung von Whatman-Papier von der Grosse 2,5 cm χ 10 cm durch Imprägnieren derselben bis zur Sättigung mit einer Lösung der folgenden Formulierung hergestellt:

TRIS (2,0 molar) 50,0 ml "\

MgSO₄ 10,0 g

NH₂CH₂SO₃H (AMSA) 18,5 g (pH 7,236)

Na₂/TNO)Fe(CN)₅_7 1,0 g

Die Papiere wurden 15 Minuten lang bei 52°C getrocknet und in Quadrate von 0,5 χ 0,5 cm zu den erf indüngsgemässen Anzeigern geschnitten. · .

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Wenn die Anzeiger mit einen Tropfen des Stammketons getestet wurden, so bildete sich augenblicklich eine helle Purpurfarbe. Es ist darauf hinzuweisen,, dass ein wirksamer Nachweis auch dann erfolgt, wenn die Reagenzlösungen viel niedriger, wie in Beispiel VII angegeben, liegen.

Die restliche Imprägnierungslösung dieses Beispiels wurde bei Raumluft über Nacht stehen gelassen. Mit dieser Lösung wurden dann Anzeiger hergestellt und getestet. Die Differenzierung von 0 bis 80 mg/dl wurde in 10 bis 13 Sekunden beobachtet mit einer optimalen Entwicklung der Blaufärbung nach 30 Sekunden. Dies zeigt, dass die Imprägnierungslösung während dieser Zeit stabil blieb.

Das vorstehende Experiment zeigt damit, dass Nitroprussid bei Verwendung der erfindungsgemässen Metallsalze in Kombination mit einem primären Amin bei alkalischem pH stabilisiert wird.

Daraufhin" wurden 10 g MgSO."7H-0 zu ungefähr 90 % der vorstehend bereiteten Imprägnierungslösung dieses Beispiels gegeben. Nachweisanzeiger wurden wie oben angegeben hergestellt, jedoch unter Verwendung dieser veränderten Lösung. Bei der Prüfung zeigte sich, dass die Anzeiger eine anfängliche Farbentwicklung aufwiesen, die unterscheibar schneller erfolgte und eine Differenzierung von 0 bis 80 mg/dl erlaubten, die mit der gleichen Geschwindigkeit erfolgte, wie bei den vorher bereiteten Anzeigern, wobei die Imprägnierungslösung keinen erhöhten Gehalt an Mg enthielt.

Somit zeigt sich eine proportionale Abhängigkeit, die charakteristisch für die Katalyse ist, zwischen der Menge an vorliegendem Magnesiumsalz und der Geschwindigkeit der Farbentwicklung.

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Beispiel X

Lösungen zur Herstellung von erfindungsgemassen Anzeigern
können für noch längere Zeit stabilisiert, werden, indem die
nachfolgende Formulierung verwendet wird, welche das oberflächenaktive Mittel Steol CA-460 (Stepan Chemical Co., Nothfield, 111. 60094) umfasst:

1 M wässriges TRIS 50,0 ml H₂NCH₂SO₃H 1,17 g

Steol CA-460 0,5 g

MgSO₄'7H₂O 15,0 g J 3,0 g

(pH 7,6)

Wenn Anzeiger mit einer Lösung dieser Formulierung imprägniert und wie in Beispiel IX hergestellt wurden, so zeigte sich beim Test mit-Stammketon eine schnelle Reaktion (Rot-Rose-Färbung) und eine 0 bis 80 mg/dl-Differenzierung trat in 20 bis 30 Sekunden auf, wobei 0 mg/dl und 80 mg/dl nach 5 Sekunden unterschieden werden konnten.

Die oben angegebene Formulierung wurde durch Zugabe von 6 g
MgSO₄'7H₂O zu dieser Lösung geändert (der pH beträgt 7,75),
und Anzeiger wie vorher angegeben hergestellt. Diese Lösung mit dem erhöhten MgSO₄·7H₂O-Gehalt wurde nach 1 Woche zur Herstellung von Anzeigern auf die oben angegebene Weise verwendet. Beim Test ergaben diese Anzeiger mit demStammketon augenblicklich
eine Rosefärbung und die 0 bis 80 mg/dl-Differenzierung trat in 15 Sekunden oder darunter auf. Die Lösungen waren unter Raumbedingungen gelagert worden.

Die oben angegebenen Ergebnisse zeigen im Vergleich zu den

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vorhergehenden Beispielen eine weitere Stabilisierung, die durch Zugabe von oberflächenaktiven Materialien erhalten wird.

Beispiel XI

Das folgende Experiment wurde ausgeführt, um die Wirkung von

Kombinationen zu bestimmen.

Kombinationen von Mg und verschiedenen anderen primären Aminen

Lösungen wurden gemäss den in Tabelle 8 angegebenen Formulierungen hergestellt, wobei die wässrige 2 M TRIS-Lösung 20 g/l Steol CA-460 und 120,4 g/l MgSO₄·7H₂O (TRIS-Lösung) enthält und jeweils mit verschiedenen primären Aminen kombiniert wird. Mit diesen Lösungen wurde dann jeweils Whatman-Papier imprägniert, um Anzeiger wie in Beispiel IX herzustellen.

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Tabelle 8	Formulierungen	.pH 7,6 (hoch)	pH 6,0 (niedrig)
	TRIS-Lösung 50,0 ml Histadin 2,1 g Na₂Z"(NO)Fe(CN) ₅_7 2,5 g	M1H*	M1N
TRIS-Lösung 50,0 ml Glycin 0,75g Na₂ZTNO)Fe(CN)_5-/ 2,5 g	M2H	M2N
TRIS-Lösung 50,0 ml AMSA 1,11 g Na₂ZlNO)Fe(CN)₅_7 2,5 g	M3H '	M3N
TRIS-Lösung 50,0 ml Cysteinsäure 1 ,87g Na₂ZTNO)Fe(CN)₅_7 2,5 g	M4H	M4N
TRIS-Lösung 50,0 ml Picolylamin 1,08 g Na₂ZlNO)Fe(CN)_5-/ 2,5 g	M5H	M5N

* Die Buchstaben bzw. Zahlen geben an: Verwendetes Metallion (M = Magnesium), Nr. der Formulierung (1 bis 5) und pH-Wert (H = hoch; N = niedrig).

Die Anzeiger wurden durch momentanes Eintauchen in Stammketon und in Urinlösungen mit 0, 20, 40 und 80 mg/dl Keton getestet, wobei die in Tabelle 9 aufgezeigten Ergebnisse erhalten wurden.

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Tabelle 9

Nr.	O bis 80 mg/dl Differenzierung Sekunden (Bemerkungen)	Stammketon (Bemerkungen)
. M1H	15 (gut)	momentan (violett)
M1N	90 (schwach)	langsam (mittleres Rosa)
M2H	15-20 (gut)	.momentan (violett)
M2N	90-120 (schwach)	langsam (rosa-blau)
M3H	15-20 (gut)	momentant (violett)
M3N	90-120 (schwach)	langsam . (rosa-blau)
M4H	20 (gut)	momentant (violett)
M4N	^: 60 (mittel)	massig
M5H	30 (mittel)	massig (violett)
M5N	60 (mittel)	langsam (rosa)

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass eine grosse Anzahl von primären Aminen und zwar sowohl aromatische als auch aliphatische Amine in Kombination mit Magnesiumsalzen gemäss der Erfindung wirksam sind. Ebenfalls zeigt sich deutlich, dass die Erhöhung des pH-Wertes ein wesentlicher Faktor ist.

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Beispiel XII

Das folgende Beispiel zeigt den kombinierten Effekt von Ca und primären Aminen. " ;

Es wurden Lösungen entsprechend den in Tabelle 10 gegebenen Formulierungen hergestellt, wobei die wässrige 2 M TRIS-Lösung 20 g/l Steol CA-460 und 111 g/l CaCl₂ (TRIS-Lösung) enthielt und jeweils mit den verschiedenen primären Aminen kombiniert würde.

Tabelle 10

Formulierungen	pH 7,6 (hoch)	pH 6,0 (niedrig)
TRIS-Lösung 50_f0 ml Histidin-HC1.H₂O 2,1 g Na₂Z^-(NO)Fe (CN) 5_7 2,5 g TRIS-Lösung 50,0 ml Glycin 0,75 g Na₂ZTNO)Fe(CN)₅_7 2,5 g TRIS-Lösung 50,0 ml AMSA 1,11 g Na₂ZTNO)Fe(CN)₅_7 2,55 g TRIS-Lösung 50,0 ml Cy s te ins äur e 1,8 7 g Na₂ZTNO)Fe(CN)_5-/ , 2,5 g TRIS-Lösung . 50,0 ml Picolylamin 1,08g Na₂ZTNO)Fe(CN) ₅J . 2,5 g	C1H C2H C3H C4H C5H	C1N C2N C3N C4N C5N

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2,5 cm χ 10 cm grosse Streifen von Whatman-Papier wurden jeweils mit den oben genannten Lösungen imprägniert, bei 51,7 C (125°F) getrocknet und zu 0,5 cm χ 0,5 cm grossen Anzeigern gem^ss der Erfindung geschnitten. Die auf. diese Weise hergestellten Abschnitte wurden mit Hilfe eines doppelseitigen Klebebandes auf Trägerelemente aus Plastik von der Grosse 0,5 cm χ 8,0 cm geklebt.

Diese Anzeiger wurden durch momentanes Eintauchen in Stammketon und in Urin-Lösungen mit 0, 20, 40 und 80 mg/dl Keton getestet, -wobei die in Tabelle 11 aufgeführten Ergebnisse erhalten wurden.

Tabelle

0 bis 80 mg/dl Differenzierung Sekunden (Bemerkungen)

Stammketon (Bemerkungen)

C1H C1N C2H C2N C3H

C3N C4H C4N C5H C5N

30-60 (gut-ausgezeichnet) 60 (schwach blau) 45-90 (gut-ausgezeichnet) 90 (schwach) 60-90 (gut)

120 (schwach) 60-90 (schwach-mittel) 60-120 (schwach-mittel) 30-60 (mittel-gut) 60 (schwach)

momentan
(rose-violett)

langsam
(violett)

momentant (rose-violett)

langsam
(violett-rosa)

momentan
rose-blau) langsam (rosa) momentan (rosa) langsam (rosa-violett) momentan (rosa) langsam (rosa-violett;

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Wie die Ergebnisse zeigen, kann eine grosse Anzahl von primären Aminen ebenso mit Kalziumsalzen wirksam kombiniert werden. Auch hier zeigt sich, dass der pH-Wert ein wesentlicher Faktor ist.

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Claims

MILES LABORATORIES, INC., SLKHART, INDIANA / USA Testmittel und Verfahren zum Nachweis von Ketonkörpern- PATENTANSPRÜCHE

1. Testmittel zum Nachweis von Ketonen bei alkalischem pH- ~—' Wert, dadurch gekennzeichnet , dass es ein Nitroprussidin Kombination mit mindestens einem anorganischen Metallsalz aus der Gruppe Magnesium und Kalzium umfasst.

2. Testmittel gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Metallsalz MgSO, oder CaCl^ darstellt.

3. Testmittel gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass eine Kombination von Metallsalzen vorliegt.

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ORIGINAL INSPECTED

4. Testmittel gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass diese Kombination MgSO. und CaCl₀ umfasst.

5. Testmittel gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Nitroprussid Natriumnitroprussxd darstellt.

6. Anzeiger zum Ketonnachweis, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Trägermatrix umfasst, welche das Testmittel gemäss Anspruch 1 dadrin inkorporiert enthält.

7. Anzeiger gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägermatrix saugfähig ist.

8. Anzeiger zum Nachweis von Keton, dadurch gekennzeichnet , dass er eine Tablette umfasst, welche darin inkorporiert das Testmittel gemäss Anspruch 1 enthält."

9. Anzeiger zum Nachweis von Keton, dadurch gekennzeichnet , dass er eine Trägermatrix umfasst, welche in diesem eine Zusammensetzung inkorporiert enthält, die Natriumnitroprussid und MgSO₄ umfasst.

10. Verfahren zur Herstellung eines Anzeigers zum Ketonnachweis, dadurch gekennzeichnet, dass eine Trägermatrix mit dem Testmittel gemäss Anspruch 1 inkorporiert wird.

11. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeich net, dass die genannte Inkorporierung ein Imprägnieren mit einer Lösung .des genannten Testmittels und anschliessendem Trocknen darstellt»

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12. Verfahren zum Nachweis von Keton in einer flüssigen Probe, dadurch gekennzeichnet , dass die genannte Probe mit dem Testmittel gemäss Anspruch 1 in Kontakt gebracht vird und die gegebenenfalls erhaltene Färbung ausgewertet wird.

13. Verfahren zum Nachweis von Keton in einer flüssigen Probe, dadurch gekennzeichnet , dass die genannte Probe mit dem Anzeiger gemäss Anspruch 6 in Kontakt gebracht wird und die gegebenenfalls erfolgte Färbung ausgewertet wird.

14. Testmittel zum Nachweis von Ketonen bei alkalischem pH, dadurch gekennzeichnet , dass es ein Nitroprussid, mindestens ein anorganisches Metallsalz aus der Gruppe Magnesium und Kalzium und mindestens ein primäres Amin umfasst.

15. Testmittel gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein Metallsalz aus der Gruppe MgSO^ und CaCl₂ umfasst.

16. Testmittel gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Metallsalz MgSO, darstellt.

17. Testmittel gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Metallsalz die Kombination MgSO. und CaCl₂ umfasst.

18. Testmittel gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass ein primäres Amin verwendet wird, dessen pKa ungefähr gleich dem pH ist, bei dem das Testniittel verwendet werden soll.

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19. Testmittel gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , dass das primäre Amin Aminomethansulfonsäure, SuIfanilinsäure, Cyclohexamin, Pyridoxamin, Äthylendiamin, Picolylamin, m-Aminophenol, Semicarbazid oder Cysteinsäure darstellt.

20. Testmittel gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , dass das primäre Amin Aminomethansulfonsäure darstellt.

21. Testmittel· gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Nitroprussid Natriumnitroprussid ist.

22. Anzeiger zum Nachweis von Keton, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Trägermatrix umfasst, die darin inkorporiert das Testmittel gemäss Anspruch 13 enthält.

23. Verfahren zur Herstellung eines Ketontestanzeigers, dadurch gekennzeichnet , dass eine Trägermatrix mit dem Testmittel gemäss Anspruch 13 inkorporiert wird.

24. Verfahren zum Nachweis von Keton in einer flüssigen Probe, dadurch gekennzeichnet , dass die genannte Probe mit dem Testmittel gemäss Anspruch 14 in Kontakt gebracht und die sich gegebenenfalls entwickelnde Farbe ausgewertet wird.

25. Verfahren zum Nachweis von Keton in einer flüssigen Probe, dadurch gekennzeichnet , dass die genannte Probe mit dem Anzeiger gemäss Anspruch 22 in Kontakt gebracht und eine sich gegebeneenfalls bildende Farbe ausgewertet bzw. beobachtet wird.

909821/0455