DE2835874C3

DE2835874C3 - Verfahren zur Herstellung von mechanisch und chemisch stabilen, porösen Biokatalysatoren mit hoher enzymatischer Aktivität und perlförmiger Biokatalysator

Info

Publication number: DE2835874C3
Application number: DE2835874A
Authority: DE
Inventors: Harald Dipl.-Chem. 3320 Salzgitter Eng; Joachim Prof. Dr. Klein; Klaus Dieter Dipl.-Chem. 3300 Braunschweig Vorlop; Fritz Prof. Dr. Wagner
Original assignee: 3300 BRAUNSCHWEIG
Current assignee: 3300 BRAUNSCHWEIG
Priority date: 1978-08-16
Filing date: 1978-08-16
Publication date: 1981-02-26
Also published as: DE2835874A1; DE2835874B2

Description

Biokatalysatoren sind für die direkte Gewinnung von primären und sekundären Stoffwechselprodukten von zunehmender Bedeutung. Als Beispiele der Praxis, für weiche technologisches Interesse besteht werden genannt:

Gewinnung von Fructose aus Glykose mittels Glukoseisomerase, Herstellung von 6-APS aus Penicillin G mittels Penicillin-Acylase, Herstellung von L-Asparaginsäure aus Ammo-

niumfumarat mittels E. coli,
' Herstellung von L-Äpfelsäure mit Fumarase von

Brevibakterium ammoniagenes-Zellen.
Unter dem Begriff »Biokatalysator« wird in der technischen Mikrobiologie und im »microbial engineering« ein mittels eines makroskopischen Trägers fixiertes biologisches System aus ganzzelligen Mikroorganismen, oder Enzymen verstanden,

In jüngerer Zeit wird dem Einsatz von fixierten Mirkoorganismen als Biokatalysator aus Gründen der Herstellungskosten und der Flexibilität des Verfahrens der Herstellung, besonders auch unter dem Gesichtspunkt von Mehrenzymreaktionen, der Vorzug gegeben. Die Herstellung der Biokatalysatoren erfolgt im wesentlichen durch physikalischen Einschluß des

Mikroorganismus in eine Polymermatrix. Zur Herstellung derartiger Matrices wurden nach unterschiedlichen Verfahrensschemen folgende Stoffe verwendet:

Polyacrylamid / Polymethacrylamid / Collagen / Cellulose-Triazetat / Carboxymethylcellulose / Agar / Copolymerisate aus Maleinsäure und Styrol/Carageen.

Nach dem Stand der Technik weisen die bekannten Verfahren zur Herstellung von Biokatalysatoren mit diesen Stoffen Schwierigkeiten bei ihrer technischen Herstellung auf und es bestehen Nachteile in den Eigenschaften der nach solchen Verfahren erzeugten Biokatalysatoren.

In der Gruppe AIginat-/CMC-/CopoIymerisatoren, die in einfacher Weise durch Gelbildung mit mehrwertigen Kationen hergestellt werden, besteht der besondere Nachteil der Inresistenz gegenüber Phosphatpuffer-Lösungen, in denen eine Vielzahl von Reaktionen in der Praxis durchgeführt werden. Bei Verwendung natürlicher Elektrolyte kann ein mikrobieller Befall und damit verbunden, eine Zerstörung der Matrix eintreten.

Dazu kommt bei diesem Katalysatortyp wegen der nicht sehr hohen mechanischen Belastbarkeit die Einschränkung, daß eine Verwendung im Festbettreaktor kaum möglich ist.

Die Herstellung des Cellulose-triiicetat-Katalysators nach einem Naßspinnprozeß stellt unter Verwendung von stark toxischen Lösungsmitteln wie Toluol oder Methylenchlorid eine Fixierungsmethode dar, die nur für wenige Mikroorganismen in Frage kommt Durch die Faserform ist der einseitige Einsatz des Katalysators in Festbettreaktoren vr,rgege! .n.

Die Herstellung der Collagen-Katalysatoren ist sehr aufwendig. Der Einsatz ist durch die t 'smbranform auf den Spiralreaktor beschränkt Es kann auf den toxischen Schritt der Härtung mit Glutardialdehyd nicht verzichtet werden. Polyacrylamid-Katalysatoren sind als Produkte einer Block-Polymerisation als scharfkantige, unregelmäßige Granulate beschrieben. Bei Einsatz in Rührreaktoren zeigen diese hohen Abrieb, die Beladung mit Mikroorganismen ist begrenzt. Das Letzte bestätigen die folgenden Offenlegungsschriften:

DE-OS 22 52 815:4,8 g E.coli in 120 ml
Katalysator: 4 Vol.-% Beladungsdichte

DE-OS 24 20 102:17 g Zellen in 170 ml
Katalysator: 10 VoI.-% Beladungsdichte

DEOS 24 14 128:12 g Zellen in 120 ml

Katalysator: 10 Vol.-% Bela3tungsdichte
Polymethacrylamid-Katalysatoren können auch in Kugelform gewonnen werden, die gegenüber Polyacrylamid (PAAm) eine deutlich höhere Festigkeit aufweisen. Es bleibt jedoch die niedrige Beladung bis zu maximal 20% ein erheblicher Nachteil.

Carageen-Katalysatoren sind ebenfalls als scharfkantige, unregelmäßige Granulate beschrieben. Diese zeigen bei Einsatz in Festbettreaktoren hohen Abrieb und geringe Stabilität. Dazu wird auf die Ausführungen auf der 4th ENZYME ENGINEERING CONFERENCE in Bad Neuenanr, 25.—30.09. J 977, verwiesen. Es ist Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Her-■> stellung von mechanisch und chemisch stabilen, porösen, vielseitig einsetzbaren Biokatalysatoren mit hoher Beladung an enzymatisch aktiver Biomasse durch Polymereinsrhluß ganzer Zellen oder von Zellfragmenten zu entwickeln.

ίο Eine weitere Aufgabe der Erfindung sind Biokatalysatoren mit hoher Druckfestigkeit und hoher Beladung. Diese können nach dem Verfahren der Erfindung hergestellt werden.
Das Verfahren der Erfindung ist in den Patentan-

Sprüchen definiert Die Unteransprüche stellen bevorzugte Ausgestaltungen dar. Das Verfahren der Erfindung und die Eigenschaften der danach erzeugten Katalysatorenperlen werden durch die folgender Ausführungsbeispiele beschrieben.

Beispiel 1

30 g E-coh Zellen ATCC 11 105 werden in Form der abzentrifugierten, fließfähigen Biofeuchtmasse (BFM) als Komponente (C) in Stufe 1 mit 10 g des Epoxid-

harzes »Epikote Dx-255« (Deujsche Shell AG, Frankfurt) als Harzkomponente (A) vermischt

Dann werden in Stu£r. 2 20 g einer 25%igen wäßrigen Lösung von »Casamide CA 360« (Akso Chemie, Düren) als Polyaminoamid-Härter-Komponente (B) durch

JO Rühren gut verteilt, wodurch die Polykondensation des Epoxidharzes eingeleitet wird.

Dieses System (A)+(B)+ (C) wird nun in Stufe 3 mit 20 ml einer 8gew.-%igen wäßrigen Na-Alginat-Lösung (»Mannucol LD« der Fa. Alpinate Ind., Hamburg) als

J5 Lösung (D) gut vermischt und danach in Stufe 4 in eine 2gew.-%ige CaCh-Lösung als Fällungsbad aus einer Kapillare mit dem Durchmesser 0,4 mm durch Anlegen von Überdruck eingedüst. Dabei bilden sich perlförmige Teilchen mit einem Durchmesser von 3 bis 4 mm. Nach zwanzigminütigem Rühren werden die Teilchen als nunmehr stabile Partikel aus der CaCl:-Lösung entfernt und gewaschen. An diesen Prozeß schließt sich in Stufe 5 eine schonende Trocknung durch Überleiten von Luft bei 28⁰C über einen Zeitraum von 24 Stunden an. Dabei > Schrumpfen die Perlen auf etwa Vs ihres ursprünglichen Durchmessers. Die trockenen, bezüglich der Komponenten (A) und (B) ausgehärteten Perlen werden in Stufe 6 für 40 Minuten in einer 0,1 molaren Phosphat-Pufferlösung unter Rühren gewaschen, wobei das Alginat als Polyelektrolytkomponente (D) aus den Kugeln herausgelöst wird und die Perlen auf einen Durchmesser von 3 mm rückquellen. Der so erhaltene poröse Biokatalysator weist eine hohe Beladung an Zellmasse, vereint mit einer guten mechanischen Stabilität auf, was durch die folgenden Daten belegt wird:

	Katalysator-Typ	Beladung	Beladung	Relative	Absolute
		K. CoIi		Aktivität*)	Aktivität
		g BFM pro g	Vol.- %	%	μ Kat/I
		fertiger			Katalysator
		Katalysator
ί	unregelmäßige Partikel
1	aus Blockkondensation
	0 100 μηι	1.24	70	40	80
'ί	0 3—4 mm	1.24	70	Π	16.4

5 \|·'οπ sei/ung	28	35 874	Relative Aktivität*)	6	Absolute Aktivität Katalysator
Katalysator-Typ	Beladung E-CoIi g BFM pro fertiger Katalysator	Beladung g Vol.-%	28	38
Kugel-Perlen nach dem Verfahren der Erfindung 0 3 mm .	1.13	67

*) Aktivität der fixierten C CoIi Zellen, bezogen auf die Aktivität der gleichen Zellmenge in freier Suspension.

Bei einer relativen Aktivität von 28% (fixierte Zellen pro gleicher Zahl freier Zellen) liegt die absolute Aktivität (Penicillin G-Acylase, 37° C, pH = 7,8) bei 38 μ Kat/1 Katalysator.

Die Druckfestigkeit nach dem Verfahren der Erfindung beträgt 651 p/Perlc.

Beispiel 2

35 g Preßhefe als Komponente (C) werden in Stufe 1 in 10 g des Epoxid-Harzes »Epikote Dx-255« (Deutsche Shell AG, Frankfurt) als Harzkomponente (A) eingerührt.

Darin werden in Stufe 2 20 g einer 25gew.-°/oigen wäßrigen Lösung von »Casamide CA 360« (Akzo Chemie, Düren) als Polyaminoamid-Härter Komponente (B) durch Rühren gut verteilt, wodurch die Polykondensation des Epoxidharzes eingeleitet wird.

Dieses System (A)+(B) + (C) wird nun in Stufe 3 mit 35 ml einer 8gew.-%igen Na-Alginat-Lösung (»Mannu-Col-LD« der Fa. Alginate Ind, Hamburg) als Lösung (D) gut vermischt und in Stufe 4 in eine lgew.-°/oige CaCb-Lösung als Komponente (E) aus einer Kapillare mit dem Durchmesser von 0,4 mm durch Anlegen von Überdruck eingedost. Dabei bilden sich perlförmige Teilchen mit einem Durchmesser von drei bis vier Millimeter.

Im übrigen wird nach Beispiel 1 verfahren.

Die Biokatalysatorperlen haben schließlich einen Durchmesser von 3 mm. Die Beladung beträgt 1,18 g Biofeuchtmasse pro g Biokatalysator; die absolute Aktivität, gemessen am Abbau von Glucose zu Äthanol beträgt 0,18 gGlucose/ml Katalysator - h.

Die Druckfestigkeit nach dem Verfahren der Erfindung beträgt 650 p/Perle Biokatalysator.

Die »Belastungsmessung« an Katalysatorperlen des ßiokatalysators gemäß der Erfindung gibt den Ausdruck der »Druckfestigkeit« in der Dimension »p/Perle« als eine an die Geometrie der einzelnen Perle gebundene Größe. Da diese Katalysatorperlen praktisch die gleiche Form aufweisen, ergibt sich somit «ine definierte Maßzahl für die »Druckfestigkeit«.

Die Methode zur Bestimmung der »Druckfestigkeit« gemäß der Erfindung ist folgende:

Der mechanische Teil der Testanordnung besteht aus «inem fest eingespannten Probetisch, einem darüber •ngeordneten Stempel, der starr mit einem Kraftaufnehmer (Fa. Hottinger Baldwin Meßtechnik, Darmstadt; Kraftaufnehmer U l/l kpond) verbunden ist und einer Antriebseinheit aus Motor und Getriebe.

Das Signal des Kraftaufnehmers wird in einem Meßverstftrker Typ KWS 3072 (Fa. HBM, Darmstadt) verstärkt und auf einen Schreiber gegeben.

Zur Messung itx Belastungsfähigkeit von Katalysa-

torkugeln, wird jeweils eine Kugel auf den Probentisch gelegt Von oben drückt dann der Stempel mit einer Vorschubgeschwindigkeit von 1,45 mm/min auf das Katalysatorkorn.

>o Die auf die Kugel wirkende Kraft wird über Stempel. Kraftaufnehmer und Verstä:<er direkt als Meßgröße durch den Schreiber in einem Xraft-Zeit-Diagramm aufgezeichnet.

Aus diesem Diagramm lassen sich reproduzierbare > > Aussagen über die Bnichfestigkeit dadurch machen, daß »ich der Bruchvorgang durch eine yahnartige Diskontinuität im Kraft-Zeit-Diagramm eindeutig markieren läßt.

Die Fehlergrenze der Kraftmessung selbst liegt unter 1%. bei der Vermessung mehrerer Perlen einer Herstellungscharge ergeben sich naturgemäß größere Schwankungen, die jedoch ± 5% nicht überschreiten.

Durch dieses Meßverfahren wird gleichzeitig die Druckfestigkeit in der Dimension »P/Perle« als eine an J5 die Geometrie der jeweiligen Perle gebundene Größe definiert.

Diese Meßmethode bestimmt die Kraft nur in einer Krafteinheit und zwar in »pond/Perle«. Unter »P/Perle« ist diese Definition zu verstehen.
4(i Die Krafteinheit »pond« kann in die SI-Krafteinheit »Newton« wie folgt umgerechnet werden:
1000 pond = 9306 Newton « 10 Newton.

Nach dem Verfahren der Erfindung wird der stoffliche Aufbau der Polymermatrix eines Biokataly-4j sators durch Polykondensation einer mehrfunktionellen. wasseremulgierbaren Epoxi-Praepolymer-Komponente (A) mit einer mehrfunktionellen Härtungskomponente (B) wie Polyaminoamid. vollzogen. Der technische Vorteil dieses allgemeinen Reaktionstyps so liegt darin, daß der Polymeraufbau bei geeigneter Auswahl der Reaktionskomponenten bei Raumtemperatur ohne Bildung vcn Nebenprodukten abläuft. Das nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte PoIyrnemetzwerk weist eine hohe mechanische und chemisehe Stabilität auf. Die Behandlung mit Salzlösung sowie extreme pH-Werte im sauren und alkalischen Bereich führen zu keiner Beeinflussung der materiellen Netzwerkeigenschaften. Die nach dem Verfahren der Erfindung verwendeten Epoxi-Praepolymeren in «ο wäßrigem Medium unter Ausschluß schädlicher Lösungsmittel führen zu praktisch untoxischen Biokatalysatorperlen.

Das direkte Einbringen der feuchten Biomasse (C) in die viskose Epoxiharz-Komponente (A) führt zur Umhüllung der Zellen mit der Komponente (A), wobei das untoxische harz zusätzlich die Funktion eines Schutzkolloides während der Fixierung übernimmt.
Die besondere Eignung der Epoxide zum Einschluß

ganzer Zellen oder von Zellfragmenten ergibt sich bereits bei der einfachen Blockkondensation von (A)+(C) mit (B). Durch den hohen Anteil an Biomasse (C) im Verhältnis zur eingesetzten Menge an Harz- und Härtungs-Komponente, (A)+(C), wird, wie Untersu- > chungen mit dem Rasterelektronenmikroskop bestätigen, erreicht, daß ein durch Blockpolymerisation synthetisiertes Epoxi-Polymernetzwerk Porosität aufweist.

Die mit der Blockpolymerisation unter Wasseraustritt einhergehende Schrumpfung des Träger- in materials der nach dem Verfahren der Erfindung verwendeten Stoffe (A) und (B) führt zu hohen Beladungen an Biomasse (C) mit hoher enzymatischer Aktivität. Es wird jedoch bei dieser Arbeitsweise mit der für technische Prozesse notwendigen Körnung ,-, von etwa 3 bis 4 mm nur eine geringe enzymatische Aktivität von etwa 'Λ der ursprünglichen Aktivität erreicht. Dieses Ergebnis ist auf eine Diffusionshernrnun⁰ zurückzuführen Durch d*^p hnhp Rplarfuncr mit Biomasse (C) können die Substratmoleküle nicht ;n alle Zellen erreichen.

Diese Feststellung wird durch die folgende Untersuchung bestätigt. Wenn ein die Zellen enthaltender Epoxiblock in einer Polymermühle in scharfkantige, unregelmäßig geformte Katalysatorpartikel y, von 50 bis 100 Mikron zerkleinert wird, so zeigen diese Partikel eine hohe enzymatische Aktivität. Dies spricht für eine relativ milde Fixierungsart. Es wird auch das REM-Ergebnis bezüglich der Porosität des Materials dadurch bestätigt. κι

(REM = Raster-Elektronenmikroskop).

Mit zunehmender Größe der Körnung derartiger, gemahlener Katalysatorpartikel ist jedoch eine Abnahme der Aktivität verbunden. Derartige Produkte sind also für den Einsatz in der Technik nicht geeignet. j-,

Dagegen besitzen die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Katalysatorperlen auch in der technisch notwendigen Korngröße eine hohe enzymatische Aktivität.

Die lange Zeit bis etwa 30 h zur Trocknung Vorzugsweise bei Raumtemperatur und zur Aushärtung der Katalysatorperlen nach dem Verfahren der Erfindung, die auch ais iange »Topfzeit« der Ausgangsstoffe bezeichnet wird, bietet den Vorteil der bei technischen Fixierungsverfahren erwünschten Zeitreserven. Nach- 4-, teilig sind bei der Arbeitsweise nach dem Stand der Technik jedoch der große Aufwand an Vermahlungsenergie. Dazu kommt ein erheblicher Abrieb der unregelmäßig getrockneten, spröden Partikel, sowie die Reaktionshemmung durch Diffusionslimitierung. Diese Nachteile werden durch das Verfahren der Erfindung und durch die Katalysatorperlen gemäß der Erfindung vermieden. Nach dem Verfahren der Erfindung wird durch die Kombination der Polykondensation (A)+(B) mit der ionotropen Gelbildung (D)+(C) ein periförmiger, poröser Biokatalysator erzeugt, der gegenüber den Biokataiysatoren nach dem Stand der Technik eine hohe mechanische und chemische Stabilität, sowie eine hohe Beladung an enzymatischer Biomasse aufweist, die auch im technisch wichtigen Kornbereich von etwa 2 bis eo 5 mm eine hohe enzymatische Aktivität besitzt und durch seine periförmige Formgebung und seine Festigkeit in den bekannten Reaktorsystemen einsetzbar ist

Eine bevorzugte Ausfuhrungsform besteht in der Beimengung eines Polyelektroryten (DX wie Na-Alginat zur Epoxi-Härter-Biomasse (A)+(B)+(Q durch periodisches Eindüser, in ein Fällungsbad (E) aus wäßriger CaClrLösung, wodurch die unmittelbare ionische Vernetzung des Alginats an der Tropfenoberfläche und damit die Bildung des perlförmigen Katalysators ermöglicht wird. Dabei beginnt sich gleichzeitig die Polykondensation des Harz-Härter-Systems (A)+(B) innerhalb der Ca-Alginathülle zu vollziehen. Nach wenigen Minuten sind die Tropfen soweit zu Perler verfestigt, daß diese abgetrennt und gewaschen werden können und der schonenden Trocknung durch Überleiten von Luft und der Aushärtung unterworfen werden können. Nach Beendigung des Trocknungsvorganges von etwa 20 h bei Raumtemperatur wird das in den Katalysatorperlen gleichmäßig verteilte Alginat mittels Phosphatpuffer-Lösung herausgewaschen Es werden durch diese Maßnahme durchgehende Kapillarwege gebildet und es entsteht der poröse, perl· förmige Biokatalysator aus Epoxid (A)+ (B) und dei Biomasse (C).

Die durch den Einschluß des Alginats in Stufe 3 unc rliirrh das Herauslösen in Stufe 6 zusätzlich gewonnene Porosität, optisch erkennbar an den REM-Äufnahmen ist an einem Quellen der Katalysatorperlen beim Herauswaschen des Alginats um 30% gegenüber der getrocknetes Alginat enthaltenden Perlen festzustellen.

Dieser erhebliche Vorteil der Katalysatorperlen gemäß der Erfindung ergibt sich auch aus der wesentlich höheren enzymatischen Aktivität gegenübet Kaialysatorperlen nach dem Stand der Technik im gleichen Korngrößenbereich.

Dieser technische Vorteil des Aktivitätsverhaltens des Epoxi-Biokatalysators gemäß der Erfindung im Vergleich der nach dem Stand der Technik erzeugten Katalysatoren mit Penicillin G-Acylase-Aktivität mittels fixierten E. coli zeigt die folgende Tabelle.

Durch die Strukturveränderung des Epoxinetzwerkes, hervorgerufen durch die Polykondensation von (A)+(B) in einer Polyelektrolytmatrix (D)+(E), ist das makroskopische Stoffverhalten der Trägermatrix von einem spröden Verhalten bei den Blockkondensations-Pärtikeln zu einem elastischen Verhalten bei den Katalysatorperlen gemäß der Erfindung übergegangen Dieser technische Vorteil ist für den universellen Einsatz der Katalysatorperlen gemäß der Erfindung

Die folgende Tabelle zeigt die technische Überlegenheit der Katalysatorperlen gemäß der Erfindung gegenüber solchen nach dem Stand der Technik in bezug auf die Druckfestigkeit, ausgedrückt in p/Perle.

Trägersystem

1) bis 4) siehe Fußnote

Druckfestigkeit pond/Perle

Polyacrylamid 1) kleiner 10 Polymethacrylamid 2) 30 bis 80 Copoly-Maleinsäure-Styrol 3) 200 bis 400 Epoxj-Biock^ größer 1000 Epoxi-Perlen gemäß der Erfindung 650 bis 895

1) P. Schal ε, Dissertation Techa Universität Braunschweif 1977.

2) wie I).

3) U. Hackel, Dissertation Techa Universität Braunschweif 1976.

4) Nicht veröffentlichte Untersuchung mit Epoxiblocl nach dem Stand der Technik.

Ein Abrieb der Katalysatorperlen gemäß dei Erfindung ist unter extremen Bedingungen im batch weisen Rührkesselbetrieb nicht feststellbar.

In der folgenden Tabelle wird vergleichsweise die Druckfestigkeit in p/Perle nach der gleichen Meßmethode von handelsüblichen Ionenaustauscher-Harzen angegeben.

Produkt »LEWATIT«, Handelsprodukt der Bayer AG, Leverkusen.
Material: Styrol-Divinylbenzol (DVB).

Dtr »DVB«-Gehalt gibt den Vernetzungsgrad an.

Typenbezeichnung

DVB

Makroporös:

Lewatit SPC 108/H 8
Lewatit SP112 12

Gelförmig:

Lewatit SC 104/H 4

Dieser Vergleich bestätigt die hohe Druckfestigkeit der Katalysatorperlen gemäß der Erfindung.

Die enzymatisch^ Langzeit-Stabilität eines Biokatalysators ist eine wichtige Voraussetzung für den technischen Einsatz unter wirtschaftlichen Bedingungen.

Ein nach dem Verfahren der Erfindung hergestellter, perlförmiger Biokatalysator mit in Epoxid-Perlen fixierten E coli-Zellen, der bei 9" C in 0,9%iger NaCl-Lösung gelagert ist, besitzt nach 120 Tagen noch etwa 21°fr der ursprünglichen Aktivität. Unter gleichen Bedingungen gelagerte freie Zellen sind bereits nach 3—4 Tagen unbrauchbar.

Ein reaktionskinetischer Langzeittest wurde in einem Wirbelbettraktor mit Rührkesselcharakteristik durchgeführt Dazu wurden frisch hergestellte Katalysatorperlen nach dem Verfahren der Erfindung verwendet. Es wird eine Serie von sich wiederholenden »Batch-reaction-runs« durchgeführt. 1 1 einer 0,5%igen Penicillin G-Lösung wird kontinuierlich zirkulierend durch den die Katalysatorperlen, welche als enzymatisch aktive Substanz E. coli-Zellen enthielten, enthaltenden Wirbelbettreaktor gepumpt. Temperatur 37°C; pH-Wert = 7,8. Die Reaktionslösung wird alle 24 Stunden vollständig gegen frische 0,5%ige Penicillin-G- Lösung ausgetauscht.

in Die enzymatische Aktivität des Biokatalysators bleibt

Druckfestigkeit innerhalb von 30 Tagen praktisch konstant.

p/Perle Der vergleichsweise mit einem Polyacrylamid-Bio-

katalysator mit fixierten E. coli-Zellen durchgeführte Langzeittest hat eine Halbwertszeit von 17 Tagen bei ι ·; 4O⁰C. Dazu wird auf »Continous Production of 6-Aminopenicillinanic Acid from Penicillin by Immobilized Microbial Cells«, Sato, Tosa, Chibata, in European J. Appl. Microbiol., 2, 153 160 (1976) verwiesen.

i-»n, ubsuiiuvi VIi t-iigiiiaviiai ι τ. 11 uts uHjr^atatysanjt a

in gemäß der Erfindung entsprechen der Aufgabenstellung mit hoher mechanischer und chemischer Stabilität und Porosität, sowie mit hoher enzymatischer Aktivität bei hoher Zellbeladung.
Die Perlform des Biokatalysators gemäß der Er-

2i findung gestattet mit sehr guter Raum-Zeit-Ausbeute und Langzeit-Stabilität den universellen Einsatz in den verschiedensten Reaktortypen. Es wird dadurch die Überlegenheit des Biokatalysators gemäß der Erfindung gegenüber solchen nach dem Stand der Technik

in nachgewiesen.

Dazu kommt aber auch noch die gegenüber den Verfahren nach dem Stand der Technik einfacher durchzuführende Herstellung nach dem Verfahren der Erfindung, wodurch sich eine vorteilhafte Wirtschaft-

lichkeit ergibt. Diese liegt aber auch in der Verwendung kostengünstiger Ausgangsstoffe.

380
710

so

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von mechanisch und chemisch stabilen, porösen Biokatalysatoren mit hoher enzymatischer Aktivität durch Polymereinschluß von ganzen Zellen oder Zellfragmenten in Form von Katalysatorperlen mit einer Druckfestigkeit (P/Perle) von durchschnittlich Ober 500 bis etwa 1000. dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 1 eine feuchte, enzymatisch aktive Biomasse (C) mit einer Harzkomponente (A) aus einer praktisch reinen, mehrfunktioneUen Epoxi-Präpolymer-Komponente im Gewichtsverhältnis (A) zu (C) wie 0,5:1 bis 5:1, vermischt wird, danach in Stufe 2 eine wäßrige Lösung einer mehrfunktioneUen Härtungskomponente (B) mit der Masse aus Stufe 1 im Gewichtsverhältnis (B) zu (M)₁ wobei (M)=(A+ B), wie 02 :1 bis 0.8 :1, vermischt und durch Rühren zur Einleitung der Polykondensation praktisch homogen verteilt wird und danach dieses System in Stufe 3 mit einer wäßrigen Lösung eines Polyelektrolyten (D) im Gewichtsverhältnis 1 :0,6 bis 1 :2,3 vermischt v, ird und danach in Stufe 4 die Mischung aus Stufe 3 in eine im Oberschuß vorgelegte wäßrige Lösung eines niedermolekularen Elektrolyten mit mehrwertigen Ionen (E) eingedüst wird unter Entstehung perlförmiger Teilchen eines bestimmten Kornbereiches von 1 bis etwa 5 mm und diese unter Rühren in etwa 5 bis 50 min zu äußerlich verfestigten Teilchen gehärtet und einem Waschprozeß unterzogen werden und danach in Stufe 5 durch Kontakt mit Luft einer Temperatur bis zu 8O⁰C bis etwa 30 h schonend getrocknet und ausgehärtet werden und danach in Stufe b die Polyelektrolyte aus den perlförmigen Teilchen durch einen Waschprozeß mit einer zu (E) konkurrierenden, ionischen Lösung einer Konzentration von 0.05 bis 5 M/l herausgelöst und im feuchten Zustand abgetrennt und ausgeführt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Har/komponente (A) ein in Wasser emulgierbares. niedrig viskoses Epoxiharz eingesetzt wird.

3. Verfahren nach den Ansprüchen I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Harzkomponente (A) eine modifizierte Bisphenol A/Epichlorhydrin-Epox !Verbindung eingesetzt wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen I bis 3. dadurch gekennzeichnet, daß als Harzkomponente (A) ein am Anmeldetag unter der Bezeichnung Epikote DX-255 erhältliches Epoxiharz mit den folgenden Daten eingesetzt wird:
Epoxiäquivalentgewicht (EEW) 182 bis 212: spezi fisches Gewicht 1.05 bei 20° C.

5. Verfahren nach den Ansprüchen I bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Härtungskomponente (B) ein vnkoses Polyaminoamid in etwa 20- bis 50gewichtsprozentiger wäßriger Lösung eingesetzt wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Härtungskomponente (B) ein am Anmeldetag unter der Bezeichnung Casamide C A 360 erhältliches viskoses Polyaminoamid mit den folgenden Daten eingesetzt wird:
Aminwert: 130 bis 160 mg KOH/g;

Viskosität: 300 bis 500 Poise bei 25°C;

Festkörpergehah: 50 ± 1 %.

7. Verfahren nach den Ansprüchen I bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Polyelektrolyt-Lösung (D) ein natürlicher Polyelektrolyt oder ein chemisch modifiziertes natürliches Polymer eingesetzt wird

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Polyelektrolyt-Lösung (D) das Polysaccharid Na-Alginat in einer Konzentration von 5 bis 10 Gewichtsprozent eingesetzt wird.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als niedermolekularer Elektrolyt (E) ein Salz mit einem zum Polyelektrolyten (D) entgegengesetzt geladenen, mehrwertigen Ion eingesetzt wird.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als nieder .lolekularer Elektrolyt (E) bei Verwendung von anionischen Polyelektrolyten (D) in Mischung (A) eine 0.05 bis 1 molare CaCIr Lösung eingesetzt wird.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischung (A) + (C) aus Stufe 1 periodisch in die Misrhung (B) eingedüst wird.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zu der Harzkomponente (A), der Härtungskomponente (B), der Biomasse (C) der Polyelektrolyt (D) zugemischt und die Mischung durch periodisches Eindosen in die wäßrige Lösung des niedermolekularen Elektrolyten aus wäßriger CaCI₂-Lösung eingebracht wird.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Porosität der Katalysatorperlen durch Änderung des Konzentrationsverhältnisses (D):(A) + (B)+(C) in Stufe 3 eingestellt wird.

14. Katalysatorperlen, erhältlich nach den Ansprüchen 1 bis 13.