DE2829556A1

DE2829556A1 - Verfahren zur herstellung von fructose und sirups auf der basis von fructose sowie die mittel zu dessen durchfuehrung

Info

Publication number: DE2829556A1
Application number: DE19782829556
Authority: DE
Inventors: Paolo Branduzzi; Nadia Cimini; Ludwig Degen; Roberto Olivieri
Original assignee: SnamProgetti SpA
Current assignee: SnamProgetti SpA
Priority date: 1977-07-05
Filing date: 1978-07-05
Publication date: 1979-01-18
Also published as: BE868766A; YU133978A; IL54894A; DK302278A; AU520074B2; FR2396765B1; DD138330A5; ZA783200B; NO782300L; NL7807295A; IL54894A0; IT1104769B; SE7807551L; JPS5414592A; US4291123A; SU755206A3; DK145679B; CH640002A5; DK145679C; GB1590266A

Description

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Case 1084
12/10/nc

Snamprogetti S.p.A., Mailand/Italien

Verfahren zur Herstellung von Fructose und Sirups auf der Basis von Fructose sowie die Mittel zu dessen Durchführung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fructose uns Sirups, die Fructose und Glucose enthalten, durch Anwendung eines isomerisierenden Enzyms, erhalten aus Mikroorganismen des Stammes Streptomyces sp. und die Mittel, die zur Durchführung dieses Verfahrens erforderlich sind.

Zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose in Fructose fügt man Glucoseisomerase (D-Xylose-ketol-isomerase, 5.3.1.5) zu einer Lösung von Glucose, wie Maissirup, und man steuert die Reaktionsbedingungen derart, daß eine Glucosefraktion in Fructose umgewandelt wird, wobei die Menge an Glucose, die in Fructose umgewandelt wird, eine Funktion einer Gleichgewichtskonstante ist, die bei 60°C den Wert 1 hat.

Es wurden enzymatische Verfahren zur Umwandlung von Glucose in Sirups beschrieben, die Glucose und Fructose enthalten, durch Anwendung von Enzymen, die extrahiert wurden aus einer Anzahl von Species von Mikroorganismen der Stämme Pseudomonas, Lactobacillus, Escherichia, Aerobacter, Bacillus und anderen.

Als ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung wurde nunmehr gefunden, daß auch Streptomyces sp.-Stämme, die bisher nicht beschrieben wurden, dazu geeignet sind, ein isomerisierendes Enzym

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herzustellen, das aktiv für Glucose ist, wenn sie auf einem geeigneten Kulturmedium gezogen werden.

Diese Stämme, die man aus Holzparzellen bzw. Holzhaufen im Botanischen Garten von Pavia, Italien, isolierte, sind mit den Nummern Cl 71/A und Cl 77/22 bezeichnet und hinterlegt bei dem Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, unter den Nummern NRRL 11.120 und NRRL 11.121.

Sie weisen folgende Charakteristika auf:

Cl 71/A	Cl 77/22
grau	grau
(Gy)	(Gy)
reactus flexibilis	reactus flexi
(RF)	(RF) Mlis
vorhanden	vorhanden
(C₊)	(C+)
glatt	glatt
(SM)	(SM)

A. Farbe des reifen und mit
Sporen versehenen Mycels

B. Morphologie der Sporangien

C. Dunkelbraune melanoide
Pigmente

D. Oberfläche der Sporen

E. Assimilation von C-Quellen:
D-Glucose
D-Xylose
D-Arabinose
D-Rhamnose
D-Fructose·

D-Glactose + +

Raffinose - +

D-Mannit - -

i-Inosit + (+)

Salicin + +

Sucrose bzw. Saccharose - -

F· Bildung von Verbindungen mit

antibiotischer Wirksamkeit keine keine

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ORIGINAL INSPECTED

-A-

Cl 71/A

Cl 77/22

G. Farbe des vegetativen Mycels

H. Empfindlichkeit gegenüber Streptomycin

cremefarben
bis hellbraun

empfindlich

cremefarben bis hellbraun

empfindlich

Die Untersuchungen mit Ausnahme von E. wurden an Fe-Co-Asparagin-Agar durchgeführt. Für die Untersuchung der Anwendung der verschiedenen C-Quellen, E., wurde das Basismedium von Pridham und Gottlieb (1948) verwendet.

Nach Bergeys Manual of Determinative Bacteriology, 8th Edition (1974), gehören die Streptomyces sp.-Stämme Cl 71/a und Cl 77/22 den grauen Serien an und unterscheiden sich durch zwei oder mehrere Charakteristika vom biochemischen Standpunkt her von den 25 Species, die in die betreffenden Serien aufgenommen wurden.

Die Kulturen der Mikroorganismen, die im Rahmen der vorliegenden E_rfindung liegen, können unter aeroben Bedingungen nach jeder üblichen Methode gezogen werden, wie Oberflächenkulturen, oder vorzugsweise in Tauchkultur, unter Anwendung gerührter Fermentiergefäße. Ein Kulturmedium, das entweder fest oder flüssig sein kann, enthält eine assimilierbare Quelle für C, eine Stickstoffquelle, sowie Mineralsalze und Spurenelemente.

Als Kohlenstoffquellen können verwendet werden Malzextrakt, Glucose, Maltose, Saccharose und andere Zucker, Glycerin, Maisquellflüssigkeit, Aminosäuren, Peptide und andere. Als Stickstoffquelle können organische oder anorganische Stickstoffverbindungen verwendet werden, wie Hefeextrakt, Peptone, Tryptone, Fleischextrakt, Aminosäuren, Caseihydrolysate, Soyabohnenmehl, Salze von NCC und NH.. Für ein zufriedenstellendes. Wachstum sind andere Spurenelemente erforderlich, wie Magnesium, Kobalt, Phosphor, Schwefel und wachstums-stimulierende Faktoren.

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Ein hervorstechender Vorteil der erfindungsgemäßen Streptomyces-Stämme ist die Tatsache, daß sie in der Lage sind, Xylane zu hydrolysieren.

Xylose, die gewöhnlich als Inductor für die Enzymaktivität verwendet wird, ist sehr geeignet und es stellt einen Vorteil dar, daß man die Möglichkeit besitzt, an ihrer Stelle Xylane zu verwenden, die weit verbreitet natürlich auftreten (Weizenstroh: 15 - 20 %, Bagasse 30 %, Coniferenholz 7 - 12 %, breitblättrige immergrüne Gewächse 20 - 25 %, Ölsamen-Hüllen 25 - 30 %). Xylose kann auch erhalten werden durch saure Hydrolyse von Xylanen. Bedauerlicherweise werden unerwünschte oder toxische Produkte während der sauren Hydrolyse gebildet, wie Furfural, Hydroximethylfurfural und Lävulinsäure.

Ein geeignetes Kulturmedium weist beispielsweise folgende Zusammensetzung auf:

Hefeextrakt 5 - 20 g/l
Glucose 10 g/l

Spuren von KHpPO.,
MgSO₄

NH₄Cl oder NaNO₃ 1 g/l

Man bringt die Lösung auf den pH-Wert 7 mit Soda oder Phosphatpuffer. Der pH-Wert-Bereich, der für die Kultur geeignet ist, liegt bei 5-9, wobei der Bereich von 6,8 - 7,3 bevorzugt ist, und die Temperatur liegt bei 20 - 40°C, bei einem bevorzugten Bereich von 29 - 31°C.

Es hat sich als vorteilhaft gezeigt, die Wachstumsphase von der I_nduktionsphase abzutrennen. In der Praxis werden Induktoren, Xylose oder Xylane nach der Wachstumsphase der Mikroorganismen zugesetzt.

Wenn im Kulturmedium Glucose als Köhlenstoffquelle verwendet wurde, ist es zweckmäßig, die Biomasse durch Zentrifugieren zu gewinnen,

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sie von dem Kulturmedium abzutrennen und diese Masse in das Induktionsmedium zu überführen, das 0,5 % - 2 % Xylose zusammen mit Co und Mg ⁺ Ionen enthält.

Die Extraktion der Glucose-Isomerase von dem Mycel erfolgt nach Methoden, die in der Enzymologie üblich sind.

Hierzu werden die Zellen desintegriert mit speziell ausgerüsteten Vorrichtungen, wie die "French Pressure Cell", der "Manton Gaulin Homogenisator", Rototionsdesintegratoren und andere, oder mit Hilfe der Anwendung von Ultraschall. Das Enzym kann in gleicher Weise gut aus acetonischen Pulvern oder aus gefriergetrockneten Extrakten extrahiert werden.

Die Glucoseisomerase, die man aus Microbenstämmen erhält, <ü_e einen Hauptgegenstand der Erfindung darstellen, ist durch eine Bufriedenstellende Hitzestabilität charakterisiert.

Die Isomerisierung von Glucose kann nach jedem üblichen Verfahren erfolgen. Die Glucoselösung kann direkt zu einer Kultur von Mikroorganismen gefügt werden, d. h. zu frischem Mycel oder zu Mycel, . das gefriergetrocknet und gelagert wurde, sowie zu acetonischem Pulver oderzu gefriergetrocknetem Mycel. In diesen Fällen ist es notwendig, die Isomerisierung zu stabilisieren durch Behandlung des Mycels während 30 Minuten bei 75 C mit einem pH-Wert von 7,5.

Es ist auch möglich, Präparate zu verwenden, die Isomerase in der Form von Extrakten oder deren Konzentraten enthalten, Präparate von roher oder gereinigter Isomerase und die erhalten wurden aus den Mycelien der vorstehend aufgeführten Mikroorganismen.

Schließlich kann eine weitere technische und wirtschaftliche Verbesserung erzielt werden, wenn man das Enzym immobilisiert durch Kombinationen makromolekularer Verbindungen durch Bildung chemischer Bindungen mit der Matrix oder Bindungen eines ionischen Typs oder durch physikalische Immobilisierung.

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Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Es wurde eine Kulturbrühe hergestellt mit der folgenden Zusammensetzung:

Hefeextrakt 10 g/l

enzymatisches Caseinhydrolysat 10 g/l

Na₃HPO₄.12H₂O 6 g/l

KH₂PO₄ 3 g/l

NH₄Cl lg/1

MgSO₄.7H₂O 0,2 g/l ·

Glycerin · 10 g/l

Die vorstehenden Bestandteile wurden in entionisiertem Wasser gelöst und mit Soda auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht.

Das so hergestellte Kulturmedium wurde in 500 ml Weithalskolben verteilt, wobei in jedem Kolben 100 ml Brühe gefüllt wurden. Es wurde 30 Minuten bei 116°C sterilisiert.

Die Brühen wurden inoculiert mit einer Suspension in sterilem, entionisiertem Wasser von Sporen des Stammes Cl 71/A von Streptomyces, gezogen während 4-5 Tagen bei 30°C auf Asparagin Fe-Co-Schrägkultüren. Die Schrägkulturen waren wie folgt zusammengesetzt:

L-Asparagin 10 g/l

Fleischextrakt 2 g/l

KH₂PO₄ 0,5 g/l

CoCl₂.6H₂O 1 mg/l} einer frisch

FeSO..7H,0 1 mg/1 ( bereiteten

4 2 ^y/ _J Losung

. Xylose 10 g/l

Agar 20 g/l

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Diese Bestandteile wurden in entionisiertem Wasser gelöst, und die resultierende Lösung wurde mit Soda auf den pH-Wert 7,0 eingestellt. Es wurde 30 Minuten bei 116°C sterilisiert. Die Inkubation erfolgte unter orbitalem Rühren (220 UpM) bei 30⁰C, Nach 24 Stunden, beginnend mit der Inoculierung, wurden zu jedem Kolben 1 g Xylose und 0,024 g CoCl₂.6H₃O gefügt. Nach 24 weiteren Stunden Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen und mit einem 0,1 111-Na₂SO₃-PUffer vom pH-Wert 7,0 gewaschen, der Co⁺⁺ (lO"⁴m) und Mg⁺⁺ (5 χ lo"³m) enthielt.

100 ml dieser Kulturbrühe ergaben 4,9 g feuchte Zellen.

Diese Zellen wurden in 49 ml des vorstehend erwähnten 0,1 In-Na₂SO₃-Puffer vom pH-Wert 7,0 erneut aufgeschlämmt (1 g feuchte Zellen in 10 ml Puffer), und die Zellaufschlämmungen wurden durch eine "French Pressure Cell"-Presse geführt, bis die Zellen gebrochen waren. In dem so erhaltenen Rohextrakt wurde die Enzymaktivität bestimmt: 1 g feuchte Zellen enthielten 290 Enzymeinheiten.

Ein Anteil feuchter Zellen wurde in einen Vakuumofen eingebracht, um das Trockengewicht zu bestimmen, und aus 1,76 g feuchten Zellen erhielt man 0,340 g getrockneter Zellen. Die Enzymaktivität wurde auf folgende Weise bestimmt:

Zu einem Reaktionsgemisch aus 4,5 ml einer Lösung von Substrat (3,67 m D-Glucose, 5 χ lO~³m Mg⁺⁴, io"⁴m Co⁺⁺, 0,1 m Na₃SO₃ in ' entionisiertem Wasser vom pH-Wert 7,0) wurden 0,5 ml Rohextrakt gefügt. Die Inkubation erfolgte während 2 Stunden auf einem Wasserbad bei 6O⁰C. Die Reaktion wurde durch Kühlen des Gemischs auf O⁰C unterbrochen. Die optischen Drehwerte der Probe (α₀₀., ) und

tU

der Probe (a_Q) wurden bei Raumtemperatur in einem Perkin-Elmer 141-Polarimeter gemessen, Natriumlinie (549 nm), optischer Weg der Küvette =0,1 dm.

Als Einheit v/urde der Anteil de& Enzyms definiert, der 1 mg Fructose während einer Stunde unter den vorstehend genannten Testbedingungen erzeugte; die Enzymeinheiten pro Gramm feuchter Zellen

können durch folgende Gleichung berechnet werden:

Einheiten pro Gramm _ ^O^StdJ ^{X (mg} Testglucose) x 10 feuchter Zellen ~ (a_G1 ) - (^a _Fruct#) xO,IxCxO,5x2

worin

■^(aGluc.>' - ⁺⁵⁴° ^{X 16}

■««PructJ- -⁹⁸° ^{X 35}
C = g/ml
0,1 -ss optischer Weg in Dezimeter (1 dm = 0,1 m).

Beispiel 2

Kulturbrühen des Streptomyces-Stammes Cl 77/22, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden unter orbitalem Rühren bei 30 C inkubiert.

Nach 24 Stunden, beginnend mit der Inoculierung, wurden in jeden ' Kolben 1 g Xylose und 0,024 g CoCl₂-OH₂O gefügt. Nach 24 weiteren Stunden Inkubation bei 30°C wurden die Zellen durch Zentrifugieren gesammelt und mit 0,1 m-Na-SO^-Puffer vom pH-Wert 7 gewaschen,der 10"V Co⁺* ua<3 5 x 1CT³In Mg⁺⁺ enthielt.

Man erhielt aus 100 ml dieser Kulturbrühe 5,-2 g feuchter Zellen·.

Diese Zellen wurden erheut in 52 ml des vorstehend erwähnten 0,1m Na-SOg-Puffers vom pH-Wert 7,0 aufgeschlämmt (Ig feuchter Zellen in 10 ml Puffer), und die Zellaufschlämmung wurde durch eine "French Pressure Cell"-Presse geführt, bis die Zellen gebrochen waren. In dem so erhaltenen Extrakt wurde die Enzymaktivität bestimmt und 1 g feuchter Zellen ergaben 300 Enzymeinheiten.

Ein Teil der feuchten Zellen wurde in einen Vakuumofen zur Bestimmung des Gewichts eingebracht: aus 1,80 g feuchten Zellen erhielt man O,312 g getrocknete Zeilen.

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Beispiel 3

Kulturbrühen des Streptomyces-Stammes C1 71/A, di^e nach dem Beispiel 1 hergestellt wurden und inoculiert wurden in einem Wachstumsmedium der gleichen Zusammensetzung, wie in Beispiel 1, mit der einzigen Ausnahme, daß Glycerin durch Xylane als C-Quelle ersetzt worden war, wurden unter Rühren bei 30⁰C inkubiert. Nach 24 Stunden, beginnend mit der Inoculierung, wurden in jeden Kolben 0,024 g CoCIp.6HpO gefügt. Nach weiteren 24 Stunden Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen und mit einem 0,1 m-Na₂SO₃-Puffer vom pH-W^rt 7,0, der 10 m Co⁺⁺ und 5 χ 10~" m Mg⁺⁺ enthielt, gewaschen. 100 ml dieser Kulturbrühe ergaben 3,3 g feuchte Zellen. Diese Zellen wurden erneut in 33 ml des vorstehend erwähnten 0,1 In-Na₂SO₃-PUffers vom pH-Wert 7,0 aufgeschlämmt (Ig Zellen in 10 ml Puffer), und die Zellaufschlämmungen wurden in eine "French Pressure"-Zellpresse eingebracht, bis die Zellen gebrochen waren. Die E_nzymaktivität wurde in dem so erhaltenen Extrakt bestimmt und 1 g Zellen ergaben 190 Enzymeinheiten.

Beispiel 4

Kulturbrühen des Streptomyces-Stammes Cl 77/22, hergestellt nach Beispiel 3, wurden unter Rühren bei 30°C inkubiert. Nach 24 Stunden, beginnend mit dem Inoculieren, wurden in jeden Kolben 0,024 g CoCIp.6HpO gefügt. Nach 24 weiteren Stunden Inokubation bei 30°C wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen und mit 0,1 m-Na₂SO₃-PUffer vom pH-W_ert 7,0, der 10"⁴m Co⁺⁺ und 5 χ 10~³m Mg⁺⁺ enthielt, gewaschen. 100 ml dieser Kulturbrühe ergaben 3,2 g feuchte Zellen. Diese Zellen wurden erneut in 32 ml des vorstehend erwähnten 0,1 In-Na₂SO₃-PUf fers vom pH-Wert 7,0 auf geschlämmt (Ig feuchte Zellen in 10 ml Puffer), und die Zellaufschlämmungen wurden durch eine "French Pressure"-Zellpresse geführt, bis die Zellen gebrochen waren.

Die Enzymaktivität wurde in dem so erhaltenen Extrakt bestimmt und

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1 g feuchte Zellen enthielten 200 Enzymeinheiten.

Beispiel 5

Kultürbrühen des Stammes Streptomyces Cl 71/A wurden hergestellt, und die Zellen wurden wie in Beispiel 1 inkubiert.

Nach beendeter Inkubierungsstufe wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen und mit 0,1 m-Na^SO.--Puffer vom pH-W_rt 7 ge-

-4 ++ -3 ++ waschen, der 10 m Co und 5 χ 10 m Mg enthielt. Aus 400 ml dieser Kulturbrühe wurden 18,3 g feuchte Zellen erhalten.

6,2 g feuchte Zellen wurden erneut in 25 ml eines 0,1 m-NapSO--Puffers vom pH-Wert 7,0 aufgeschlämmt und unter Rühren bei -IQ⁰C zu 120 ml Aceton gefügt. Nach 15minütiger Behandlung wurden die Zellen auf einem Papierfilter gewonnen, mit Aceton gewaschen, gesammelt und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Aus 6,2 g feuchten Zellen erhielt man so 1,1 g trockene Zellen. An dem acetonischen Pulver wurde die Enzymaktivität bestimmt, und 1 g mit Aceton behandelte Zellen enthielten 2370 Enzymeinheiten.

Beispiel 6

Kulturbrühen des Streptomyces-Stammes Cl 77/22 wurden hergestellt, und die Zellen wurden wie in Beispiel 1 inkubiert. Nach beendeter Inkubationsstufe wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewonnen und mit einem 0,1 In-Na₂SO₃-PUffer vom pH-Wert 7,0 gewaschen, der 1O~ m Co⁺⁺ und 5 χ 1O^-" m Mg⁺⁺ enthielt. Aus 400 ml dieser Kulturbrühe erhielt man 28,2 g feuchte Zellen. 9,2 g feuchte Zellen wurden erneut in 25 ml des 0,1 Ir₁-Ma₂SO₃-PUffers vom pH-Wert 7,0 aufgeschlämmt und unter Rühren bei einer Temperatur von -10⁰C zu 120 ml Aceton gefügt. Nach einer 15minütigen Behandlung wurden die Zellen auf einem Filterpapier gewonnen, mit Aceton gewaschen, ge-

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sammelt und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Aus 9,2 g feuchten Zellen erhielt man so 1 g getrocknete Zellen.

An dem acetonischen Pulver wurde die Enzymaktivität bestimmt, und es wurde gefunden, daß 1 g mit Aceton behandelte Zellen 2100 Enzymeinheiten enthielten.

Beispiel 7

Zellen des Stammes Streptomyces Cl 77/A wurden wie in Beispiel 1 angegeben hergestellt und mit Aceton wie in B_eispiel 5 beschrieben behandelt.

Die mit Aceton behandelten Zellen wurden verwendet zur Bestimmung des Prozentsatzes der Isomerisierung von Glucose als Funktion der Zeit in dem R_eaktionsgemisch.

Es wurde unter folgenden Testbedingungen gearbeitet:

a) mit Aceton behandelte Zellen: 10 g

b) Volumen des Substrats: 1 1

c) Reaktionstemperatur: 60 C

Das Substrat wies folgende Zusammensetzung auf:

Glucose 60 % (Gew./Vol.), Mg⁺⁺5mM, Co⁺⁺ 0,1 mM, Na₃SO₃ 100 mM,

pH-Wert 7,0.

Man erhielt folgende Isomerisierungs-Prozentsätze:

Zeit/Stunde	Umwandlung %
3	12
6	20
-9	27,2
12	32,6
15	37,1

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Zeit/Stunde Umwandlung %

18 40,5

23 44,5

Zusammenfassend betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Fructose und Fructose und Glucose enthaltenden Sirups, das darin besteht, daß man eine Lösung von Glucose mit einem Mikroorganismus des Genus Streptomyces sp. in Kontakt bringt, insbesondere mit den Stämmen NRRL 11.120 und NRRL 11.121, hinterlegt bei dem Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, 111.

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Claims

Dr, F. Zumstein sen. - Dr. tr. Assmanr. - Dr. Pi. Koenigsberger Dipi.-Phys. R. Holzbauer - DipL-lng. r=. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun. PATENTANWÄLTE SCX)O München 2 · Brauhai sstraße 4 · Telefon Sammel-Nr. 22 S3 41 · Telegramme Zum pat ■ Telex 529979 Case 1084 12/10/nc Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Fructose und Fructose und Glucose enthaltenden Sirups, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung von Glucose mit einem Mikroorganismus des Genus Streptomyces sp. und mit dem davon stammenden Enzym in Kontakt bringt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Kontakt mit den Streptomyces sp.-Stämmen NRRL 11.120 und NRRL 11.121 herbeiführt.

3. Bakterienstämme des Genus Streptomyces sp. mit den Nummern NRRL 11.120 und NRRL 11.121.

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