DE2819384A1

DE2819384A1 - Mikrobiologisch hergestellte lipase

Info

Publication number: DE2819384A1
Application number: DE19782819384
Authority: DE
Inventors: Shinjiro Iwasaki; Yoshitaka Kokusho; Haruo Machida
Original assignee: Meito Sangyo KK
Current assignee: Meito Sangyo KK
Priority date: 1978-05-03
Filing date: 1978-05-03
Publication date: 1979-11-08
Also published as: DE2819384B2; DE2819384C3

Description

Mikrobiologisch hergestellte Lipase
Bes chre ibun Die Erfindung betrifft eine mikrobiologisch hergestellte Lipase, die dazu imstande ist, mit Gallensalzen aktiviert zu werden. Diese Lipase hat Eigenschaften, die bislang noch nicht in der Literatur beschrieben worden sind. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser Lipase und eine biologisch reine Kultur, die zur Herstellung dieser Lipase geeignet ist.
Die hierin verwendete Bezeichnung "mikrobiologisch hergestellte Lipase" soll eine Lipase bezeichnen, die durch einen Mikroorganismus hergestellt worden ist.
Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase ist dadurch charakterisiert, daß sie folgendes aufweist: (1) einen optimalen pH-Wert für die Aktivität von etlra 9 0,5, (2) eine optimale Temperatur für die Aktivität von etwa 40 bis etwa 480C, (3) eine Lipase-Aktivität, die durch Gallesalze aktiviert bzw. potentiiert wird, (4) eine Cholesterin-Esterase-Aktivität und (5) ein Molekulargewicht von etwa 30 x 104 bis etwa 40 x i04.
Verfahren zur Herstellung von Lipase unter Anwendung von Mikroorganismen, insbesondere von Bakterien, sind seit langem bekannt. Bei solchen Verfahren werden beispielsweise Mikroorganismen der Art Pseudomonas, Chromobacterium, Achromobacterium, Staphylococcus, Brevibacterium und Corynebacterium verwendet.
Es wurden bereits Untersuchungen durchgeführt, um eine Lipase mit einem optimalen pH-Wert für die Aktivität im alkalischen Bereich zu entwickeln, welche durch Gallensalze aktivierbar sein soll. Bei diesen früheren Untersuchungen wurde der Stamm Alcaligenes Sp. PL-266 Meito Strain FERM-P Nr. 3187 (niedergelegt beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan) entdeckt. Es handelt sich hierbei um einen Mikroorganismus der Art Alcaligenes, der aus der Erde isoliert worden ist. Dieser Stamm hat die Fähigkeit, eine Lipase mit einem optimalen pH-Wert für die Aktivität im alkalischen Bereich herzustellen, die durch Galle salze aktiviert werden kann. Dieses Verfahren und die mikrobiologischen Eigenschaften sowie die enzymatischen Eigenschaften der so hergestellten Lipase sind in der JA-OS 21387/77 beschrieben.
In weiteren Untersuchungen wurden nun verschiedene Stämme der gleichen Art aus der Erde der Umgebung von Tokio, Japan, isoliert. Dabei wurde festgestellt, daß diese Mikroorganismen die Fähigkeit haben, eine Lipase herzustellen, die einen optimalen pH-Wert für die Aktivität im alkalischen Bereich hat und die durch Gallensalze aktiviert werden kann. Bei der neuen Lipase handelt es sich jedoch um eine Lipase von einem unterschiedlichen Typ, die besser geeignet ist als die Lipase gemäß der oben beschriebenen Patentanmeldung. Auch die Abtrennung der durch diesen neuen Stamm gebfldeten Lipase ist gelungen.
Dieser neue Lipasetyp hat zusätzlich zu der Lipase-Aktivität eine Cholesterin-Esterase-Aktivität, die die oben beschriebene Lipase nicht besitzt. Wegen dieser Aktivität ist sie auch als Diagnostikum für verschiedene Zwecke, beispielsweise zur Bestimmung der Cholesterinspiegel, geeignet.
Die Lipasemenge, die durch den neu gefundenen Mikroorganismus erzeugt wird, ist beispielsweise so hoch wie etwa 2000 Einheiten/ml Filtrat der Kulturbrühe. Diese Menge ist erheblich größer als die Lipasemenge, die durch die Mikroorganismen gemäß der obengenannten Patentanmeldung erzeugt wird. Diese beträgt nämlich nur ettfa 320 Einheiten/ml Filtrat der Kulturbrühe.
Durch die Erfindung wird daher eine Lipase mit einem optimalen pH-Wert im alkalischen Bereich zur Verfügung gestellt. Die neue Lipase wird, wenn sie dem Menschen oder Tieren beispielsweise als Verdauungshilfsmittel oral verabreicht wird, durch die Galle in dem Darm aktiviert (alkalischer Darmsaft).
Durch die ErSindung soll daher ein neuer Typ einer mikrobiologisch hergestellten Lipase zur Verfügung gestellt werden, der einzigartige Vorteile hat und in der Literatur noch nicht beschrieben worden ist. Weiterhin soll ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Lipase zur Verfügung gestellt werden.
Weiterhin soll eine biologisch reine Kultur zur Verfügung gestellt werden, die zur Herstellung einer solchen Lipase geeignet ist.
Der zur Herstellung der erfindungsgemäßen Lipase verwendete Stamm Alcaligenes sp. PL-679 Meito wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Japan, unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 3783 hinterlegt. Der gleiche Stamm wurde bei der American Type Culture Collection, USA, unter der Hinterlegungsnummer ATCC 31371 und auch bei der deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungsnummer DSM 1239 hinterlegt.
Die mikrobiologischen Eigenschaften des Stammes Alcaligenes sp. Po,679 Meito sind wie folgt: A. Mornhologische Eigenschaften Stäbe, 0,5 bis 0,7 x 1,0 bis 4,0 pm, die einzeln und gelegentlich in Ketten mit 2 bis 4 Zellen auf dem Xåhragarmedium oder in der Nährbrühe auftreten.
Nicht-pleomorph.
Sie sind mittels 1 bis 6 um das Mundfeld bewimperter Geiseln beweglich.
keine Sporenbildung.
Gram-negativ. Üppiges Wachstum und rote Kolonien, die auf Kristallviolettagar gebildet werden.
Nicht säureecht.
B. Kultivierungseigenschaften Nährmittelagarkolonien: Kreisförmig, rauh, gefranst, durchscheinend, gelblich-braun, in der Mitte braun; keine Bildung eines diffundierbaren Pigments.
Nährmittelagar-Schrägkultur: ausgebreitet oder stachelig, durchscheinend, harzartig, orange bis gelblich-braun.
Nährbrühe: üppiges Wachstum, gelblich-braun, trübe mit Häutchen und Vorliegen eines Sediments.
Gelatineversuch: Filiform, keine Verflüssigung, üppiges Wachstum, gelblich-braun auf mittlerer Oberfläche.
Lackmusmilch: alkalisch. Keine Peptonisierung.
Kartoffelkultur: üppiges Wachstum, orange, leicht-braunwerdend.
C. Phvsiologische Eigenschaften Bildung von Nitriten aus Nitraten.
Keine Bildung von Gas in Nitratbrühe unter anaeroben Bedingungen.
Methylrot-Test negativ.
Voges-Pro skauer-Test negativ.
Keine Bildung von Indol.
Keine Bildung von Schwefelwasserstoff.
Keine Hydrolyse von Stärke.
Citrate werden als einzige Kohlenstoffquellen verwertet (Koser's Agar und Christensen's Agar).
Nitrate und Ammoniumsalze werden als einzige Stickstoffquellen verwertet.
Ein diffundierbares Pigment wird auf Nähragar, Nährgelatine oder Kartoffeldextroseagar nicht gebildet. Ein diffundierbares blaßbraunes Pigment wird auf King-A-Agar und Czapek-Dox-Agar gebildet. Ein diffundierbares blaßgelblich-braunes Pigment wird auf King-B-Agar gebildet.
Keine Bildung von Urease.
Oxidase positiv.
Catalase positiv.
pH-Bereich für das Wachstum: Wachstum zwischen 5,5 und 11,0.
Kein Wachstum unterhalb 5,0 oder oberhalb 12,0.
Temperaturbereich für das Wachstum: Wachstum zwischen 5 und 400C. Optimales Wachstum zwischen 15 und 350C.
Aerob.
OF-Test: Sowohl in offenen als auch in geschlossenen Röhrchen wird weder eine Säure noch ein Gas erzeugt.
Aus D-Fructose und Glycerin wird Säure (latent), jedoch kein Gas im Oxidations-Fermentations-Medium von Hugh und Leifson in offenen Röhrchen gebildet. Weder Säure noch Gas wird aus L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit oder Stärke in offenen und geschlossenen Röhrchen erzeugt.
D. Andere Eigenschaften Bildung von Lipase.
Keine Bildung von 3-Ketolactose.
Schwache Bildung von Ammoniak aus Arginin.
G+C-Gehalt von DNA: 66,7 Mol-%.
Der taxonomische Status des erfindungsgemäß verwendeten Stammes mit den oben beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften wurde hinsichtlich der Angaben in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage (1974) untersucht. Es wurde bestätigt, daß der Stamm zu der Art Alcaligenes gehört. In Bergeyts Manual wird kein bekannter Mikroorganismus der Art Alcaligenes beschrieben, der die obigen mikrobiologischen Eigenschaften hat. Weiterhin unterscheidet sich der erfindungsgemäß verwendete Stamm von dem Stamm Alcaligenes sp. PL-266 Meito, der in der obengenannten offengelegten Patentanmeldung beschrieben wird. Der erfindungsgemäß verwendete Stamm wurde daher als Alcaligenes sp. Po,679 Meito bezeichnet.
In Tabelle I sind die Hauptunterschiede zwischen dem Stamm Alcaligenes sp. PL-679 Meito, der für die Herstellung der erfindungsgemäßen Lipase geeignet ist, und dem Stamm PL-266 Meito gemäß der obengenannten Patentanmeldung zusammengestellt.
Tabelle 1 Eigenschaften Stamm PL-266 Meito Stamm PL-679 Meito (erfindungsgemäß verwendet) Nähragarkolonie ganz, grau-weiß oder gefranst, gelblichgrau-gelb braun oder braun Nähragar-Schräg- grau-weiß oder grau- orange oder gelblichkultur gelb braun Nährbrühe nicht trübe, ohne trübe, mit Häutohen Häutchen Gelatineversuch kraterförmig, wird keine Verflüssigung schichtförmig Lackmusmilch Peptonisierung keine Peptonisierung Nitratreduktion negativ positiv Schwefelwasserstoffbildung positiv (schwach) positiv OF-Test oxidierend nicht-oxidierend und nicht-fermentierend Zuckeras simil ierung L-Arabinose positiv negativ D-Xylose " " D-Glucose " " D-Mannose " " D-Galactose " " Inosit " " Maltose " " Saccharose " " Lactose " " Trehalose " " D-Sorbit " " Mannit " " G+C-Gehalt von DNA 74,2 Mol-% 66,7 Mol-%.
Die bislang in der Literatur noch nicht beschriebene mikrobiologisch hergestellte Lipase mit den Eigenschaften (1) bis (5) kann wie folgt hergestellt werden: Ein Mikroorganismus der Art Alcaligenes, der die Fähigkeit hat, die Lipase mit den oben beschriebenen Eigenschaften (1) bis (5) herzustellen, wird aerob in einem Xahrkulturmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralien enthält, bei Temperaturen von etwa 5 bis etwa 400C, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 40°C, und einem pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 11, vorzugsweise etwa 6 bis etwa 10, kultiviert und die mikrobiologisch hergestellte Lipase wird aus der resultierenden Kulturbrühe gewonnen.
Gemäß der Erfindung wird auch eine biologisch reine Kultur von Alcaligenes sp. PL-679 Meito hergestellt, die die für die hinterlegten Stämme mit den Hinterlegungsnummern FERM-P Nr.
3783, ATCC 31371 und DSM 1239 charakteristischen Eigenschaften hat. Diese Kultur hat die Fähigkeit, eine mikorbiologisch hergestellte Lipase zu erzeugen, die dazu imstande ist, mit Gallensalzen aktiviert zu werden und die die oben beschriebenen Eigenschaften (1) bis (5) hat. Dies geschieht durch aerobe Fermentation in einem Nährkulturmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Mineralien enthält, bei einem pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 11, vorzugsweise etwa 6 bis etwa 10, und einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 400C, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 40°C.
Die Kohlenstoffquelle, die Stickstoffquelle und die Mineralien können alle beliebigen Materialien sein, die üblicherweise zum Züchten von Mikroorganismen verwendet werden.
Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Fructose, Maltose, lösliche Stärke, Stärke, Dextrin, Molassen, Glycerin, Öle und Fette, Weizenkleie, Lactose und Saccharose.
Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind organische oder anorganische Stickstoff enthaltende Verbindungen, wie Sojabohnenpulver, entfettetes Sojabohnenpulver, Baumwollsamenrückstände, Corzarückstände, Peptone, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Gluten, Maisquellfldssigkeit,- Casaminosäure, Harnstoff, Ammoniumsalze und Nitratsalze. Beispiele für geeignete Mineralien sind Phosphatsalze, Magnesiumsalze, Eisensalze, Kaliumsalze, Natriumsalze und Calciumsalze. Geaninschtenfalls können zu dem Kulturmedium verschiedene andere organische oder anorganische Substanzen, die für das Wachstum von Mikroorganismen oder für die Enzymproduktion geeignet sind, z.B. Siliconöle, Schaumverhinderungsmittel, Vitamine und phosphorhaltige Verbindungen, zugesetzt werden.
Durch Einarbeitung eines nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittels in das Nährkul-turnedium gemäß der Erfindung kann die Menge der mikrobiologisch hergestellten Lipase erheblich erhöht werden. Die Ausbeute der erfindungsgemäßen mikrobiologisch hergestellten Lipase kann auch dadurch erhöht werden, daß man Salze, die dazu imstande sind, Eisenionen abzugeben, wie z.B.
Eisenchlorid oder Eisensulfat, zusammen mit Natriumsalzen von organischen Säuren, wie Natriumacetat oder Natriumcitrat, verwendet.
Die Menge des verwendeten nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittels beträgt etwa 0,01 bis etwa 2 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Nährkulturmediums. Beispiele für geeignete nichtionogene oberflächenaktive Mittel sind Sorbitalkylester, Polyoxyäthylensorbitalkylester, Polyoxyäthylenalkyläther, Polyoxyäthylenalkylaryläther, Polyoxyäthylenalkylester, PolyoxySthylen/Polyoxypropylen-Copolymere und Fettsäuremonoglyceride.
Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt.
Es kann sowohl eine Tauch- als auch eine Oberflächenkultivierungstechnik angewendet werden. Gewöhnlich ist jedoch eine Tauchkultur geeignet. Für den technischen Betrieb ist es vorteilhaft, eine Tauchkultivierung unter Belüftung und unter Rühren durchzuführen. Ein geeignetes Vorgehen ist z.B. die Durchführung einer kleindimensionierten Vorkultivierung und die Inokkulierung der resultierenden Kulturbrühe in ein Kulturmedium für die Hauptkultivierung.
Die Kultivierungsbedingungen variieren etwas entsprechend beispielsweise dem verwendeten Stamm und der Zusammensetzung des Kulturmediums. Es ist empfehlenswert, Bedingungen auszumrählen, die für die Erzeugung der Lipase als Endprodukt am vorteilhaftesten sind. Die Kultivierungstemperatur beträgt im allgemeinen etwa 5 bis 40°C, vorzugsweise etlva 10 bis 40°C. Temperaturen von 20 bis 30 0C werden besonders bevorzugt. Die Kultivierungszeit variiert entsprechend den Bedingungen, beträgt aber gewöhnlich etwa 1 bis etwa 4 Tage. Die Kultivierung kann zu einem Zeitpunkt beendigt werden, wo die Menge der angesammelten Lipase ein Maximum erreicht hat. Der pH-Wert des Kulturmediums kann sich zum Zeitpunkt der Herstellung des Kulturmediums von schwach sauer bis zur Alkalinität erstrecken. Gewöhnlich ist es nicht notwendig, den pH-Wert extra einzustellen. Der pH-Wert des Kulturmediums beträgt im allgemeinen etwa 5,5 bis extra 11, vorzugsweise etwa 6 bis etwa 10, mehr bevorzugt etwa 7 bis etwa 10. Die Kultivierung kann erforderlichenfalls unter Einstellung des pH-Werts auf die vorgenannten Bereiche durchgeführt werden.
Die Gewinnung der mikrobiologisch hergestellten Lipase gemäß der Erfindung aus derresultierenden Kulturbrühe kann durch bekannte Verfahrensweisen geschehen, wie sie zur Trennung und Reinigung von Lipase angewendet werden. Beispielsweise wird im Falle einer Oberflächenkultur die Kulturbrühe mit Wasser oder einem anderen Extraktionsmittel extrahiert, um einen Extrakt zu bilden. Im Falle einer Tauchkultur werden die Mikrobenzellen oder -feststoffe von der Kulturbrühe durch eine bekannte Filtration oder Zentrifugation abgetrennt, um einen Extrakt oder ein Filtrat zu erhalten. Der Extrakt oder das Filtrat kann entweder als solcher oder nach einer Konzentrierung verwendet werden. Durch Behandlung des Extrakts, des Filtrats oder seines konzentrierten Produkts durch bekannte Techniken, wie z.B. eine Ausfällung, ein Sprühtrocknen oder eine Lyophilisierung, kann die erfindungsgemäß mikrobiologisch hergestellte Lipase in Form eines festen Produkts erhalten werden.
Geeignete Ausfällungsmittel für die Ausfällungsmethode sind z.B. lösliche Salze, wie Natriumchlorid, Ammoniumsulfat und Natriumsulfat, und hydrophile organische Lösungsmittel, wie Äthanol, Methanol und Aceton. Geeignete Stabilisierungsmittel, die beim Sprühtrocknen verwendet werden, sind z.B. Maltodextrin, Lactose, Carboxymethylcellulose, Polyäthylenglycol, Magermilch, Kasein, Sorbit und Natriumchlorid.
Das erfindungsgemäße Lipaseprodukt mit der gevanschten Reinheit und Lipasepotenz kann durch eine oder mehrere bekannte Reinigungstechniken gewonnen werden, beispielsweise durch Adsorptions- und Elutionsmethoden unter Verwendung von lonenaustauscherharzen, Calciumphosphatgel, Aluminiumoxid oder Bentonit, durch Molekularsiebmethoden mit Sephadex oder Biogel, durch chromatographische Methoden mit Cellulose oder Sephadex-Ionenaustauscher, durch Ausfällungsmethoden unter Verwendung eines Proteinausfällungsmittels, wie Tannin und Calciumsalzen, durch eine isoelektrische Ausfällungsmethode, durch eine Dialysemethode und eine elektrophoretische Methode.
Die erfindungsgemäß mikrobiologisch hergestellte Lipase hat folgende Eigenschaften: (1) einen optimalen pH-Wert für die Aktivität von etwa 9+ 0,5, (2) eine optimale Temperatur für die Aktivität von etwa 40 bis etwa 480C, (3) eine Lipase-Aktivität, die durch Gallensalze aktiviert bzw. potentiiert wird, (4) eine Cholesterin-Esterase-Aktivität und (5) ein Molekulargewicht von etwa 30 x 104 bis etwa 40 x 104.
Diese Lipase ist bislang in der Literatur noch nicht beschrieben worden. Lipasen (Fraktionen I und II), die in der JA-OS 21387/77 beschrieben werden, kommen der erfindungsgemäßen Lipase am nächsten. Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase kann von den Lipasen 1 und II in erster Linie hinsichtlich der oben beschriebenen Eigenschaften (2), (4) und (5) unterschieden werden. Weiterhin zeigt sie auch unterschiedliche,Inhibierungseigenschaften für die Aktivität. In Tabelle II sind die Eigenschaften der erfindungsgemäßen mikrobiologisch hergestellten Lipase im Vergleich zu den Eigenschaften der Lipasen I und II gemäß der JA-OS 21387/77 zusammengestellt.
Tabelle II Eigenschaften erfindungsgemäße Lipase gemäß der JA-OS Lipase 21387/77 Lipase I Lipase II Lipsase-Aktivität + + + Cholesterin-Esterase-Aktivität + - -Lipoprotein-Lipase-Aktivität + + + optimaler pH-Wert + + für die Aktivität 9 + 0,5 9 + 0,5 10 + 0,5 optimale Temperatur für die Aktivität 40 bis 480C 70 bis 750C 70 bis 800C Moldekulargewicht 34x104-37x104 18#1x104 3,2x104-3,7 Aktivierungsinhibie- Inhibierung keine Inhi- Inhibierung rung durch Hg++, Fe++, (mehr als 50%) bierung durch Cd++ Zn++, Sn++, Cd++ oder (10 bis 20%), Cr+++ (Konzentration, jedoch nicht 109 Mol) deren Metallionen Aktivitätsinhibierung Inhibierung keine Inhi- keine Inhidurch Natriumascor- (mehr als 50%) bierung bierung bat (Konzentration, 10-2 Mol) Aktivitätsinhibie- Inhibierung keine Inhi- keine Inhirung durch Monojod- (mehr als 50%) bierung bierung essigsäure (Konzentration, 103 Mol) Die enzymologischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen mikrobiologisch hergestellten Lipase werden nachstehend genauer beschrieben.
Herstellung der Proben Die Mycelien und andere Feststoffe werden durch Filtration von der Kulturbrühe abgetrennt. Das Filtrat wird auf etwa 50C abgekühlt und Ammoniumsulfat wird unter Rühren zu dem Filtrat bis zu einer Sattiguzig von 40% gegeben. Das Gemisch wird 24 h lang bei etwa 5°C stehen gelassen. Das ausgefällte Enzym wird gesammelt und in fließendem Wasser bei etwa 180C 2 Tage lang unter Verwendung einer dialytischen Cellophanmembran dialysiert.
Das Dialysat wird sodann 24 h bei etwa 5 0C gegen eine Tris-Pufferlösung (Konzentration 0,01 Mol; pH 9,0) weiter dialysiert.
Die dialysierte Enzymlösung wird mit etwa 50 auf eine Säule von DEAE-Cellulosetonenaustauscher aufgebracht, der genügend mit einem Tris-Puffer (Konzentration 0,07 Mol; pH 9,0) ins Gleichgewicht gebracht worden ist. Die Säule wird sodann mit einem Tris-Puffer (Kon2entration 0,01 Mol; pH 9,0) gewaschen und mit einem Tris-Puffer (Konzentration 0,01 Mol; pH 9,0) eluiert, wobei die Konzentration von Natriumchlorid in dem Puffer allhhhlich auf 0,4 Nol erhöht wird. Die Aktivität des Abstroms wird gemessen und aktive Fraktionen werden gesammelt. Die aktiven Fraktionen werden sodann in eine dialytische Cellophanmembrane gebracht und unter Verwendung von Polyäthylenglycolpulver konzentriert. Das Konzentrat wird in fließendem Wasser von etwa 180C 24 st lang in der gleichen Weise, wie oben beschrieben, dialysiert. Sodann wird es weiter gegen einen Tris-Puffer dialysiert. Das Dialysat wird erneut chromatographiert und die resultierenden aktiven Fraktionen werden erneut, wie oben beschrieben, konzentriert. Das Konzentrat wird sodann zentrifugiert, um die Feststoffe zu entfernen. Die erhaltene Enzymlösung wird gelfiltriert, indem sie durch eine Säule mit Sephadex G-200 geleitet wird, wobei der gleiche Tris-Puffer wie oben verwendet wird. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt. Die resultierenden aktiven Fraktionen werden wie oben konzentriert und zentrifugiert. Die resultierende Enzymlösung wird in der gleichen Weise wie oben gelfiltriert, wobei eine Säule mit Sepharose 4B verwendet wird. Auf diese Weise wird eine gereinigte Probe erhalten.
Unter Verwendung der gereinigten Probe werden die Eigenschaften (1) bis (7) gemessen. Die Bestimmung erfolgt nach folgenden Methoden.
(4) Cholesterin-Esterase-Aktivität: Die Messung der Cholesterin-Esterase-Aktivität erfolgt nach der Verfahrensweise, beschrieben von Leschroue et al. in Z.
Klin. Chem. Klim. Biochem., 12, 403 (1974).
(5) Molekulargewicht: Die Messung und die Errechnung des Molekulargewichts werden von der von P. Andrews in Biochem. J. it, 222 (1964) beschriebenen Methode durchgeführt. Eine Säule mit den Abmessungen 2,5 x 100 cm wird mit einem Gel von Sephadex G-200 bepackt.
Als Standardsubstanz werden Katalase (Molekulargewicht 240000) und Ferritin (Molekulargewicht 540000) verwendet. Ein i/i00M Tris-HCl-Puffer (pH 8,7) wird als Elutionspuffer verwendet.
(6) Lipoprotein-Lipase-Aktivität: Die Lipoprotein-Lipase-Aktivität wird nach der Methode von Saiki et al [Agr. Biol. Chem. g, 1459 (1968)3 bestimmt. Als Humanserum wird frisches lyophilisiertes Humanplasma (Miles Laboratories, Inc.) verwendet. Fatgen (Produkt von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) wird als Öl und Fett verwendet.
(7) Aktivitätsinhibierung des Natriumascorbats und der Monojodessigsäure: Eine wäßrige Lösung der Lipaseprobe (etwa 3 Einheiten/ml) wird 10 min lang mit den einzelnen Inhibierungsmitteln bei 370C in Kontakt gebracht. Die Lipase-Aktivität wird gemessen. Die Konzentration von Natriumascorbat beträgt 10 2 Mol und die Konzentration von Monojodessigsäure beträgt 10 3 Mol.
Die Bestimmung der charakteristischen Eigenschaften (1), (2) und (3) bezüglich der enzymologischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lipase erfolgt auf die nachfolgend beschriebene Weise.
(1) Wirkungsweise: Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase ist ein Enzym, das Öle und Fette zu Glycerin und Fettsäuren hydrolysiert, wobei große Mengen von Monoglyceriden als Zwischenprodukte während der Hydrolyse erhalten werden.
(2) Substratspezifizität: Die Lipase-Aktivitäten der erfindungsgemäßen mikrobiologisch hergestellten Lipase gegenüber Ölen und Fetten und verschiedenen Estern sind in Tabelle III, ausgedrückt als prozentuale Aktivität, bezogen auf die Aktivität gegenüber Olivenöl, angegeben.
Tabelle III Substrat relative Aktivität (%) Olivenöl 100 Methyl-n-butyrat 1 Methyl-n-ceproat 3 Methyl-n-caprylat 6 Methyl-n-caprat 6 Methyllaurat 6 Methylmyristat 7 Methylpalmitat 34 Methylstearat 33 Methyloleat 18 Tributyrin 60 Tricaproin 52 Tricaprylin 123 Tricaprin 100 Triolein 141 Monolein 86 Monolaurin 40 Dilaurin 75 Trilaurin 128 Span 85 29 Tween 85 20 Rizinusöl 85 Pufferfptt 53 Aus Tabelle III wird ersichtlich, daß die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase nicht nur auf Glycerinester von höheren Fettsäuren, wie natürliche Öle und Fette, einwirkt, sondern auch auf wasserlösliche Ester, wie Ideen 85.
Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase wirkt auch auf Cholesterinester von Fettsäuren und wandelt sie in Fettsäuren und Cholesterin um.
(3) Optimaler pH-Bereich für die Stabilität [Bestimmung der Eigenschaft (i)3: Die erfindungsgemäße Lipase wird mit einer Konzentration von 2,5 bis 5 E/ml aufgelöst und der optimale pH-Wert wird bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 1 zusammengestellt, welche ergibt, daß die maximale Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 9 + 0,5 erhalten wird.
Die erfindungsgemäße Lipase wird in einer Konzentration von 50 bis 100 E/ml in Puffern von verschiedenen pH-Werten bei 5°C 24 st lang gehalten. Sodann wird der pH-Wert mit einem Glycinpuffer auf 8,6 eingestellt. Die restliche Lipase-Aktivität wird gemessen. Die Werte sind in Figur 2 dargestellt. Es zeigt sich somit, daß die Lipase bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 6,5 bis etwa 10,5 im wesentlichen stabil ist. Ein McIlvaine-Puffer (1/10tI-Zitronensäure, 1/5M-Na2HP04) wird für den pH-Bereich von 2,5 bis 8,0, ein i/5M-Trismaleatpuffer für den pH-Bereich von 5,5 bis 8,5, ein i/iOM-Na2CO3-H3B04-KCl-Puffer für den pH-Bereich von 8,0 bis 10,5 und ein i/5-Na2HP04-NaOH-Puffer für den pH-Bereich von ii bis 12 verwendet.
(4) Geeignete Aktivitätstemperatur tBestimmung der Eigenschaft (2)j: Der geeignete Aktivitätstemperaturbereich der erfindungsgemäßen Lipase ist in Figur 3 dargestellt. Der optimale Temperaturbereich beträgt etwa 40 bis etwa 480C. Die Bestimmung erfolgt nach folgender Methode: Das bei der Aktivitätsuntersuchungsmethode verwendete Reaktionssubstrat wird 10 min lang auf verschiedene Temperaturen vorerhitzt. 1 ml einer Enzymlösung (Konzentration 0,01 mg/ml) wird zugesetzt und es wird 10 min lang bei der Temperatur des Vorerhitzens umgesetzt. Die Aktivitäten bei den verschiedenen Temperaturen werden als prozentuale Aktivitäten, bezogen auf die Aktivität der Lipase bei 450c, ausgedrückt.
(5) Inaktivierung durch pH- und Temperaturbedingungen: Die Lipase wird in Wasser mit einer Konzentration von 4 E/ml aufgelöst und die Lösung wird bei einer Temperatur von 70 bis 800C gehalten. Veränderungen der Aktivität der Lipase werden periodisch durch die nachstehend beschriebene Analysenmethode bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 4 dargestellt. Es wird ersichtlich, daß durch 30-minütige Wärmebehandlung bei 800C die Lipase fast vollständig inaktiviert wird.
Die Lipase wird in Wasser mit einer Konzentration von 25 bis 50 E/ml aufgelöst und mit einer gleichen Menge eines McIlvaine-Pulvers (pH 3,0) bzw. eines 1/4M-Na2HP04-NaOH-Puffers (pH 12,0) vermischt. Die erhaltenen Gemische werden bei 370C gehalten und sodann werden zu vorbestimmten Zeiten Proben abgenommen.
Die Probengemische werden jeweils mit einem iM-Glycin-Puffer (pH 8,7) auf das 5-fache verdünnt und die Aktivität der Lipase wird gemessen. Bei einem pH-Wert von 3,0 gehen mehr als 95% der Lipase-Aktivität in i 0 min verloren. Bei einem pH-Wert von 12,0 gehen mehr als 95ges der Lipase-Aktivität in 120 min verloren.
(6) Inhibierung: Die Lipase wird mit einer Konzentration von etwa 3 E/ml 10 min lang mit verschiedenen Inhibierungsreagentien bei 37°C kontaktiert. Sodann wird die Lipase-Aktivität gemessen. Wenn die Konzentration des Inhibierungsreagenses i0-3 Mol beträgt, dann wird festgestellt, daß die Lipase-Aktivität mehr als 50sps durch Hg++, Fe+++, Zn++, Sn++, Cd++ und cm+++ inhibiert wird.
Die Inhibierung beträgt mehr als 50% mit 102 Mol Natriumascorbat, etwa 100% mit 103 Mol Monojodessigsäure, etwa 10 bis etwa 20ió mit 10 2 Mol Kaliumferricyanid, Pyrophosphatsalzen, Natriumazid und Natriumäthylendiamintetraacetat, etwa 95% mit 102 Mol Jod und etwa 70% mit 102 Mol Äthoxyameisensäureanhydrid.
(7) Aktivierung [Bestimmungsmethode der Eigenschaft (3)3: Bei der unten unter (8) beschriebenen Bestimmungsmethode für Lipase-Aktivität werden verschiedene Gallensalze in destilliertem Wasser aufgelöst und die Lipase-Aktivität wird gemessen. Wie in Tabelle IV gezeigt wird, wird die erfindungsgemäße Lipase offensichtlich durch Gallensalze aktiviert.
Tabelle IV Gallensalze Konzentration des Gallensalzes (%) 0,2 0,4 0,6 0,8 Taurocholat 221 229 224 226 Glycocholat 218 221 232 224 Cholat i97 221 211 229 Desoxycholat 289 300 305 303 Die in der obigen Tabelle gezeigten Aktivitäten sind prozentuale Aktivitäten, die auf die Lipase-Aktivität in Abwesenheit eines Gallensalzes bezogen sind.
(8) Bestimmung der Aktivität: (a) Zusammensetzung des Reaktionsgemisches: Enzymlösung 1,0 ml Glycinpuffer Ci Mol, pH 8,7) 2,0 ml Olivenölemulsion 2,5 -ml destilliertes Wasser 0,5 ml Die Olivenölemulsion wird in der Weise hergestellt, daß 20 g Olivenöl zu 180 ml einer 10o/oigen wäßrigen Lösung von Gummi arabikum gegeben werden, daß das Gemisch bei 110wo Upm 15 min lang homogenisiert wird, während es auf 5 bis 10°C abgekühlt wird, und daß der pH-Wert des homogenisierten Gemisches auf 8,7 eingestellt wird.
(b) Verfahrensweise: Das Reaktionsgemisch wird in einem 25-ml-Glasstöpselröhrchen eingebracht und genau 10 min lang bei 370C umgesetzt. Sodann wird die Reaktion durch Zugabe von 1 ml 2N-Schwefelsäure abgebrochen und 15 ml eines Gemisches aus n-Heptan und Isopropanol im Verhältnis von 11 : 4 werden zugesetzt. Das Gemisch wird 30 sec lang heftig geschüttelt und mehr als 30 min stehen gelassen. 5 ml der oberen Schicht werden gesammelt und unter Stickstoffgas mit einer 0,01N-äthanolischen Kaliumhydroxidlösung titriert, wobei Thymolblau als Indikator verwendet wird. Eine 2N-Schwefelsäurelösung wird zu einem Reaktionsge misch mit der gleichen Zusammensetzung wie oben gegeben und hierauf wird die Enzymlösung zugefügt. Das Gemisch wird in der gleichen Weise wie oben beschrieben, behandelt und das resultierende Produkt wird mit einer Kaliumhydroxidlösung titriert.
Der erhaltene Meßwert wird von dem oben erhaltenen Meßwert abgezogen. Die Menge der freigesetzten Fettsäure wird aus dem resultierenden Titrationswert anhand einer Eichlinie errechnet, die unter Verwendung einer bekannten Menge von Palmitinsäure aufgestellt worden ist.
Eine Lipaseeinheit ist als diejenige Enzymmenge definiert, die 1 P Mol Fettsäure in 1 min bei den oben beschriebenen Versuchsbedingungen freisetzt.
(9) Reinigungsmethode: Die erfindungsgemäße Lipase kann durch Aussalzen, durch eine Celluloseionenaustauscherchromatographie und Gelfiltration gereinigt werden, wobei auch geeignete Kombinationen dieser Maßnahmen angewendet werden können. Eine Ausführungsform ist im Beispiel 5 dargestellt.
Wie bereits ausgeführt, sind die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lipase sehr ähnlich wie diejenigen einer Pankreaslipase eines Tieres hinsichtlich des optimalen pH-Wertes (in Alkalinität) für die Aktivität und der Aktivierung mit Gallensalzen.
Die erfindungsgemäße Lipase hat auch die Fähigkeit, Cholesterinester zu zersetzen (d.h. eine Cholesterin-Esterase-Aktivitt).
Es ist bislang noch nicht bekannt gewesen, daß eine Lipase mit solcher Eigenschaft durch einen Mikroorganismus der Art Alcaligenes erzeugt wird.
In Tabelle V sind die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lipase im Vergleich zu den Eigenschaften von bekannten mikrobiologisch hergestellten Lipasen, die mit Gallensalzen aktiviert werden können, zusammengestellt.
Tabelle V Mikroorganismus optimaler optimale aktivie- Choleste- Moleku- Lipopro- Inhibie- LiteraturpH-Wert Tempera- rungsfak- rin-Este- large- tein- rung durch referenzen tur (°C) tor durch rase wicht Lipase Reagntien Gallensalze Chromobacterium Agr.Biol.
viscosum var. 120000 Chem. 37 paralipolytica 7,0 65 1,5 - 30000 nein - 999 (1973); JA-PS 29787/71 und J.Biochem.
81, 1639 (1977) Pseudomonas stut- JA-PS zeri (ATCC 10754/69 19154) 9 bis 9,5 - 6 bis 10 - - - -Phvcomvces sp. 6 bis 7 40 2 - 26500 JA-PS - - - #500 ja - 17559/75; Zusammenfassung der Niederschriften des jäkrlichen Treffens der Agriculturel Chemical Society of Japan im Jahre 1974; Zu sammenfassungen der Niederschrii ten des Trei fens der Fortsetzung Tabelle V Western Divisions of the Agricultural Chemical society of Japan im Jahre 1977 Muccr 7,0 - 2 bis 5 - - - - Yakunzaigaku ("Pharmaceutical javanicus Schience") 27, 314 (1967); Eisei Kagaku ("Hygienic Chemistry"), 13, 257 (1967) Alcaligenes I 8,5-9,5 70-75 2 nein 180000 ja keine In- JA-OS 21387/77 sp. PL-266 #10000 hibierung Meito II 9,5-10,5 70-80 2 nein 32000- durch As-37000 corbinsäure und Monojodessigsäure Alcaligenes sp. PL-679 Meito (erfindungsgemäß ver 300000- Inhibiewendet) 8,5-9,5 40-48 2 ja 400000 ja rung durch Ascorbinsäure und Monojodessigsäure Wie aus Tabelle V ersichtlich wird, ist Lipase, hergestellt von Chromobacterium viscosum, Phycomyces sp. und Mucor javanicus, der erfindungsgemäßen Lipase hinsichtlich des Aktivierungsfaktors durch Gallensalze ähnlich, jedoch liegen die optimalen pH-Werte für diese Lipasen im neutralen Bereich und unterscheiden sich somit von den entsprechenden Werten für die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase. Die durch Pseudomonas stutzeri hergestellte Lipase unterscheidet sich von der erfindungsgemäßen Lipase hinsichtlich des Aktivierungsfaktors durch Gallensalze und ihre optimale pH-Kurve unterscheidet sich erheblich von derjenigen der erfindungsgemäßen Lipase (vgl. Figur 1).
Die erfindungsgemäße Lipase unterscheidet sich auch von der Lipase, die durch Alcaligenes sp. PL-266 Meito erzeugt wird, hinsichtlich der optimalen Temperatur für die Aktivität und dadurch, daß sie eine Cholesterin-Esterase-Aktivität besitzt.
Wie in Tabelle II gezeigt wird, liegen auch Unterschiede beispielsweise der Molekulargewichte und der Inhibierung durch Metallionen vor.
Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase kann für eine weite Vielzahl von Anwendungszwecken verwendet werden, beispielsweise als Arzneimittel und Diagnostika. Sie kann weiterhin zur Herstellung von Fettsäuren, Glycerin und Monoglyceriden, zur Verstärkung des Milcharomas, zur Verbesserung der Qualität von Brot und Keksen und dergleichen, zur Anwendung bei der Abwasserbehandlung und weiterhin auch der Ledergerbmittel, Haarspülmittel, Badezubereitungen, Waschzubereitungen für das Gesicht und für Nahrungsmittel verwendet werden.
Da die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase einen optimalen pH-Wert im alkalischen Bereich hat und da sie durch Gallensalze aktiviert wird, hat sie den Vorteil, daß wenn sie beispielsweise oral als Verdauungshilfsmittel verabreicht wird, durch die Gallensalze im Darmsaft aktiviert wird, und eine erhöhte Aktivität zeigt. Die erfindungsgemäße mikrobiologisch hergestellte Lipase zersetzt Lipoprotein in Nahrungsmitteln, da sie eine Lipoprotein-Lipase-Aktivität besitzt.
Wenn die erfindungsgemäße Lipase als Verdauungshilfsmittel verwendet wird, kann sie oral in einer Dosis von beispielsweise 1000 bis 8000 E/Tag verabreicht werden. Bei Verwendung als Diagnostikum kann der Cholesterinspiegel des Bluts unter Verwendung von 0,1 bis2,0 E Cholesterin-Esterase in einem Einzeltest bestimmt werden. Weiterhin kann durch Verwendung von 100 bis 1000 E Lipoprotein-Lipase in einem Einzeltest der Triglyceridspiegel des Bluts bestimmt werden.
Als die erfindungsgemäße Lipase Ratten mit einer Dosis von 2,5 bzw. 5,0 g/kg 1 Monat lang und einer Dosis von 2,5 g/kg 3 Monate lang durch natürliche Aufnahme verabreicht wurde, um die subakute Toxizität zu bestimmen, wurden keine Veränderungen des allgemeinen Verhaltens, der Fäces, des Urins, der Blutzusammensetzung, durch Autopsiebefunden und des Gewichts der Organe festgestellt. Auch bei der histologischen Untersuchung wurden keine signifikanten Veränderungen festgestellt.
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.
Beispiel 1 Schüttelkolben mit 500 ml wurden jeweils mit 50 ml eines flüssigen Kulturmediums gefüllt, das 3% Sojabohnenpulver, 1% entfettetes Sojabohnenpulver, 1% Maisquellwasser, 0,5<0 Dikaliumphosphat und 0,25% Natriumnitrat enthielt. Es wurde auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und das Kulturmedium wurde 15 min lang mit Dampf bei 1200C sterilisiert.
Alcaligenes sp. PL-679 Meito (FERM-P-Nr.-3783-Stamm) wurde in die Medien einokkuliert. Es wurde 40 h lang unter Schütteln bei 30°C kultiviert. Die Kulturbrühe wurde zentrifugiert. Die Lipase-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde gemessen und es wurde festgestellt, daß sie 50 E/ml betrug. Ammoniunsulfat wurde zu einer Sättigung von 50% zu 100 ml der Kulturbrühe zugesetzt. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und getrocknet, wodurch 1,5 g rohes Enzympulver mit einer Lipase-Aktivität von 2560 E/g erhalten wurden.
Beispiel 2 Es wurde wie im Beispiel 1 verfahren, mit der Ausnahme, daß 0,5% Sorbitoleylester zu dem im Beispiel 1 beschriebenen Kulturmedium gegeben wurden. Die Lipase-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit der Kulturbrühe betrug 351 E/ml.
Ein Enzympulver in einer Menge von 1,4 g wurde wie im Beispiel aus der resultierenden Kulturbrühe gesammt. Die Lipase-Aktivität des Pulvers betrug 16000 E/g.
Beispiel 3 Ein flüssiges Kulturmedium, enthaltend 3% Sojabohnenpulver, 0,5% entfettetes Sojabohnenpulver, O,5% Maisquellwasser, O,1% Weizenstärke, 0,2% Dikaliumphosphat, 0,5% Polyäthylenstearyläther, 120xó Natriumnitrat und 0,075% Silicon, wurde auf einen pH-Wert von 9,5 eingestellt. 50 ml des Kulturmediums wurden in einen 500-ml-Schüttelkolben eingefüllt und 15 min lang bei 120°C dampfsterilisiert. Alcaligenes sp. PL-679 Meito (Stamm FERM-P Nr. 3783) wurde inokkuliert. Es wurde 4Q h lang bei 300C kultiviert. Die Kulturbrühe wurde filtriert. Das Filtrat hatte eine Lipase-Aktivität von 500 E/ml, eine Cholesterin-Esterase-Aktivität von 3,7 E/ml und eine Llpoprotein- Lipase-Aktivität von 155 E/ml. Zu 500 ml Filtrat wurde kaltes Aceton bis zu einer Konzentration von 80% zugegeben. Der Niederschlag wurde gesammelt, mit kaltem Aceton gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wodurch 12,5 g eines rohen Enzympulvers erhalten wurden. Das Pulver hatte eine Lipase-Aktivität von 13200 E/g, eine Cholesterin-Esterase-Aktivität von 99 E/g und eine Lipoprotein-Lipase-Aktivität von 4100 E/g.
Beispiel 4 Zu 15 1 des im Beispiel 3 beschriebenen Kulturmediums wurden 0,4 Natriumcitrat und 0,028% Eisen(II)-sulfat gegeben und das Gemisch wurde in einen 30-l-Becherfermentator gegeben.
Als Antischaummittel wurden 5 g Siliconöl zugesetzt und das Gemisch wurde dampfsterilisiert.
Alcaligenes sp. PL-679 Meito (Stamm FEF2I-P Nr. 3783) wurde in das so hergestellte Kulturmedium einokkuliert. Es wurde 38 h unter Belüften und Rühren bei 240C kultiviert. Die Kulturbrühe wurde filtriert, wodurch 12,0 1 eines Filtrats mit einer Lipase-Aktivität von 800 E/ml erhalten wurden. Die Absorption dieses Filtrats bei 280 nm betrug 100. Das Filtrat hatte eine Cholesterin-Esterase-Aktivität von 6 E/ml und eine Lipoprotein-Lipase-Aktivität von 250 E/ml.
Ammoniumsulfat wurde zu 2,4 1 dieses Filtrats bis zu einer Sättigung von 40% gegeben und das Gemisch wurde 24 h lang bei 50C stehen gelassen. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und der Niederschlag wurde durch Zentrifugiertrennung gesammelt. Etwa 73% der Lipase-Aktivität wurden in dem Niederschlag wiedergewonnen, der durch die Zugabe von Ammoniumsul fat gebildet worden war.
Beispiel 5 Der im Beispiel 4 durch die Zugabe von Ammoniumsulfat erhaltene Niederschlag wurde in ein Cellophanrohr gegeben und 2 Tage lang in fließende, Wasser und sodann weiterhin 24 h bei 5°C gegen einen 0,01M-Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 9,0 dialysiert. Die Filtration des Dialysats lieferte 1,3 1 einer Enzymlösung mit einer Lipase-Aktivität von 1020 E/ml und einer Absorption bei 280 nm von 23,5.
Die Enzymlösung wurde auf eine Säule eines DEAE-Celluloseionenaustauschers aufgebracht, der genügend mit einem 0,0114-Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 9,0 ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die adsorbierte Enzymlösung wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und mit einem Tris-Puffer (0,01 Mol, pH 9,0) eluiert, wobei allmählich die Konzentration von Natriumchlorid in dem Puffer auf 0,4 Mol erhöht wurde. Fraktionen mit einer Lipase-Aktivität wurden eluiert, als die Konzentration von NaCl sich im Bereich von 0,05 bis 0,2 Mol befand. Ihre Aktivitäten wurden gemessen und die aktiven Fraktionen wurden gesammelt. Die gesammelten Fraktionen wurden konzentriert und durch Sephadex G-200 und Sepharose 4B in dieser Reihenfolge gelfiltriert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt.
Die gesammelten aktiven Fraktionen wurden erneut dialysiert und auf einer Säule von DEAE-Cellulose rechromatographiert.
Die aktiven Fraktionen wurden nach der Konzentrationsgradientenmethode unter Verwendung von Natriumchlorid eluiert. Die Fraktionen mit einer Lipase-Aktivität wurden konzentriert und lyophilisiert, wodurch 293 g eines gereinigten Lipase-Pulvers erhalten wurden. Eine 0,1%ige wäßrige Lösung des gereinigten Enzympulvers hatte eine Absorption bei 280 nm von 0,43. Das Enzympulver hatte eine Lipase-Aktivität von 890 E/mg, eine Cholesterin-Esterase-Aktivität von 6,6 E/mg und eine Lipoprotein -Lipase-Aktivität von 275 E/mg. Die Lipase hatte einen optimalen pH-Bereich von etwa 9 + 0,5 und eine optimale Temperatur von etwa 45°C. Sie konnte mit 0,2% Natriumtaurocholat auf das 2-fache ihrer ursprünglichen Aktivität potentiiert werden. Das Molekulargewicht betrung etwa 35 x 104. Die Aktivitätsinhibierung der Lipase durch Natriumascorbat betrug etwa 52% und durch Monojodessigsäure etwa 98% Beispiel 6 50 ml eines flüssigen Kulturmediums, enthaltend 3% Sojabohnenpulver, 1% Fructose, 0,2% Kaliumphosphat, 1% Natriumnitrat, 0,674 Natriuncitrat, 0,03% FeSO4.7H20, 0,5% Polyäthylenglycolstearyläther und 0,253 eines Antischaummittels, wurden in einen 500-ml-Schüttelkolben eingefüllt und 15 min lang bei i200C dampfsterilisiert.
Der Stamm Alcaligenes sp. PL-679 Meito FERM-P Nr. 3783 wurde in das sterilisierte Kulturmedium einokkuliert und es wurde 42 h lang unter Schütteln bei 25°C kultiviert. Die Kulturbrühe wurde zentrifugiert und die Enzymaktivität der überstehenden Flüssigkeit wurde gemessen. Es wurde festgestellt, daß die Lipase-Aktivität 2000 E/ml, die Cholesterin-Esterase-Aktivität 15 E/ml und die Lipoprotein-Lipase-Aktivität 625 E/ml betrug. Zu 100 ml der resultierenden überstehenden Flüssigkeit wurden 400 ml kaltes Aceton gegeben. Der resultierende Niederschlag wurde gesammelt und mit Aceton entwässert sowie bei 250C vakuumgetrocknet, wodurch 1,8 g eines Enzympulvers mit einer Lipase-Aktivität von 77000 E/g, einer Cholesterin-Esterase-Aktivität von 585 E/g und einer Lipoprotein-Lipase-Aktivität von 24000 E/g erhalten wurden.
Ende der Beschreibung.
L e e r s e i t e

Claims

Patentansrüche 1. Mikrobiologisch hergestellte Lipase mit folgenden Eigenschaften: (1) einem optimalen pH-Wert für die Aktivität von etwa 9-+ 0,5, (2) eine optimale Temperatur für die Aktivität von etwa 40 bis etwa 480C, (3) eine Lipase-Aktivität, die durch Gallensalze aktiviert bzw. potentiiert wird, (4) eine Cholesterin-Esterase-Aktivität und (5) ein Molekulargewicht von etwa 30 x 104 bis etwa 40 x 104.
2. Lipase nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , daß sie weiterhin (7) eine Lipoprotein-ipase-Aktivität aufweist.
3. Lipase nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h -net, daß sie eins Cholesterin-Esterase-Aktivität von mindestens 300 E/g in rohem Zustand und von mindestens 6600 E/g in gereinigtem Zustand aufweist.
4. Lipase nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , daß sie weiterhin (8) eine Äktivitätsinhibierung von mindestens etwa 50% durch Natriumascorbat in einer Konzentration von 1012 Mol und Monojodessigsäure in einer Konzentration von 10 3 Mol aufweist.
5. Lipase nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , daß sie durch einen Mikroorganismus der Art Alcaligenes hergestellt worden ist, der die Fähigkeit hat, die mikrobiologisch hergestellte Lipase nach Anspruch 1 zu erzeugen.
6. Lipase nach Anspruch 5, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , daß der Mikroorganismus Eigenschaften hat, die seine Identifizierung als Stamm Alcaligenes sp. PL-679 Meito gestatten.
7. Lipase nach Anspruch 6, dadurch g e k e n n z e 1 c h -n e t , daß der Mikroorganismus der Stamm Alcaligenes sp.

PL-679 Meito FERM-P Nr. 3783, der Stamm Alcaligenes sp. PL-679 Meito ATCC 31371 oder der Stamm Alcaligenes sp. PL-679 Meito DSM 1239 ist.
8. Verfahren zur Herstellung der mikrobiologisch hergestellten Lipase nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man einen Mikroorganismus der Art Alcaligenes mit der Fähigkeit, die Lipase nach Anspruch 1 zu erzeugen, in einem Nährkulturmedium, welches eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralien enthält, bei einem pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 11 und bei einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 400C aerob kultiviert und daß man die mikrobiologisch hergestellte Lipase aus der resultierenden Kulturbrühe gewinnt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß man ein Kulturmedium verwendet, das weiterhin ein nicht-ionogenes oberflächenaktives Mittel enthält.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch g e k e n n -z e i c h n e t , daß die Menge des nicht-ionogenen oberflächenaktiven Mittels etwa 0,01 bis etwa 2 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht des Nährkulturmediums, ist.
11. Biologisch reine Kultur von Alcaligenes sp. PL-679 Meito mit den charakteristischen Eigenschaften der hinterlegten Stämme FERM-P Nr. 3783, ATCC 31371 oder DSM 1239, welche die Fähigkeit besitzt, eine mikrobiologisch hergestellte Lipase, die dazu imstande ist, durch Gallensalze potentiiert zu werden, und die folgende Eigenschaften aufweist: (1) einen optimalen pH-Wert für die Aktivität von etwa 9 - 0,5, (2) eine optimale Temperatur für die Aktivität von etnAra 40 bis etwa 480C, (3) eine Lipase-Aktivität, die durch Gallensalze aktiviert wird, (4) eine Cholesterin-Esterase-Aktivität und (5) ein Molekulargewicht von etwa 30 x 104 bis etwa 40 x 104, durch aerobe Fermentation in einem Nährkulturmedium, enthaltend eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralien, bei einem pH-Wert von etwa 5,5 bis etwa 11 und einer Temperatur von etwa 5 bis etwa 400C zu erzeugen.