DE2757980A1 - Verfahren zur herstellung von d-n-carbamoyl-a-aminosaeuren - Google Patents

Description

Anmelder: Kanogafuchi Kag&ku Kogyo Kabushiki Kaisha No. 3, Nakanoshirca 3-chome, Kita-ku, Oaaka-shi, Japan

Verfahren zur Herateilung von D-N-Cp.rbaraoyl- a-&n;inosäur. η

Die Erfindung betrifft ein neues Herstellungsverfahren für D-N-1 Carbainoyl-ff-aminosäuren. Die Erfindung betrifft insbesondere j ein Verfahren zur Herstellung von D-N-Carbamoyl-K-amJnofjäuren durch biochemische Hydrolyse von 5-fiouf.-tituierten llydantuinen j unter Verwendung von Kulturbrühen, Zollen oder behandelten ZeI-' len von Mikroorganismen.

In «Febs Letters», Band 57, Kr. 2, 192 (1975) ist schon beschrieben worden, deß die D-Formen von N-Carbamoyl-a-aminosäuren hergestellt werden können, wenn man die DL-Formen von 5-substituierten Hydantoinen der Einwirkung von Hydropyrimidinhydrase von Kalbsleber unterwirft. Diese« Verfahren erfordert jedoch die Verwendung dieses teuren Enzyms.

Ein Verfahren zur Umwandlung von 5-substituierten Hydantoinen in die D-Forinen von N-Carbamoyl-a-aminosäuren durch Verwendung von Mikroorganismen ist noch nicht bekannt. Ein einziger Fall der Bildung einer D-N-Carbaicoyl-a-arainosäure durch mikrobielle Einwirkung wird in "Amino Acid and Nucleic Acid", Nr. 19, 48 bin 56 (1969) beschrieben. Nach dieser Arbeit wurde L-Methionin durch Züchten von Bacillus coagulans in einem Kulturmedium hergestellt, welches DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin enthielt. Dabei wui-de D-N-Carbamoylmethionin als Nebenprodukt gebildet. Dieses Verfahren ist Jedoch nicht dazu imstande, nur die D-N-Carbamoyl-a-aminosäure zu liefern.

Aufgabe dor Erfindung j st co, ein neuos Verfahren zur Herstellung vo?) .D-li-Cf-rbaij'Kvyl-a-firairjor.äurcri aus don DL-, D- oci^r L-Formen von 5-substituiei-ton Hydantoinen unter Vei*wond.uvi£ von I mikrob.i eilen KnsvMCii zur Verfügung ?.u Gtf;13.cn. Hierdurch sol- i lon die; ϋ-Ι·Ι-0ρα^βΓΧ·γ1-α-·ηΐηίκο.^Γίαιιιχ^ιη wirtschaft! ich und mit guten Ausbeuten herstellbar coin. Darch die Erfindung sollen auch Substanzen herstellbar se j η, die als Zwischenprodukte für die i Herstellung von Arzneimitteln geeignet sind.

Es wurde, nun gefunden, daß die obengenannte Aufgabe dadurch gelöst v/erden kann, daß man 5-substituierte Hydantoine cter Wir- ] kung einer Kulturbrühe, von Zellen oder behandelten Zellen von j Mikroorganismen unterwirft, die die Fähigkeit haben, den Hydan-' toinring asymmetrisch zu hydrolysieren.

Gemäß der Erfindung können D-Formen von H-Carbamoyl-a-aminosäuren vorteilhafterweise &.us 5-subßtituierten Hydantoinen durch
die katalytische Einwirkung von mikrobiellen Enzymen hergestellt werden, welche leicht und billig erhältlich sind. Die
erfindungsgemäß vorgesehene Reaktion kann wie folgt dargestellt' werden:

R-QI C=O R-CH-COOIl

I I I

NU Mn _> NH-C-NH,

\ / Zellen oder behandelte Il ^L

C Zellen von Mikroorganis- °
men

(DL-, D- oder L-Form) (D-Form)

In den Formeln steht R für eine Alkylgruppe, eine substituierte Alkylgruppe, eine Aralkylgruppe oder eine substituierte Aralkylgruppe.

Die intrazellularen Enzyme der Mikroorganismen, die erfindungsgeraüß verwendet wei^den, wirken selektiv auf die D-Formen der
5-substituierten Hydantoine ein, so daß sie unter Spaltung des

ß098?7/089G

Hydantoinrings hydrolysiert werden. Da die nicht-hydrolysierten L-Foriaen in dem Reaktionsmedium ritzernisieren, v/erden die D-Formen dem Reaktionssystem immer in Substanz zugeführt. Gemäß der Erfindung können daher alle DL-, D- und L-Formen der 5-substi~ ! tuierten Hydantoine verwendet v/erden. Nxir die D-Formen von N- ; Carbamoyl-a-aminosäuren können erhalten werden. \

Wie bereits ausgeführt, ist schon in der Literatur berichtet ; worden, daß bei der Herstellung von L-Hethionin aus DL-5-(2- ^! Methylthioäthyl)-hydantoin durch Einwirkung von Bakterien Ba- [ cillus coagulans ^-N-Carbamoylmethionin als Nebenprodukt gebildet wurde. Bei dem erfindungsgemäßen Vorfahren werden jedoch j praktisch ausschließlich D-N-Carbamcyl-cx-aminosäuren aus 5-substituierten Hydantoinen gebildet, ohne daß L-a-Aminosäuren er- ; zeugt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich¹ hinsichtlich der Aufgabenstellung und der Wirkungen sowie hin- j sichtlich der Art und der Bedingungen der durchgeführten Reak- j tion vollständig von dem oben erwähnten Verfahren. Wie oben bereite ausgeführt wurde, bezieht sich die Erfindung auf ein Ver-' fahren zur Herstellung von D-N-Carbamoyl-oc-aminosäuren durch j Verwendung von Mikroorganismen. Dieses Verfahren ist ein neues
Verfahren. Im Gegensatz zu einem Verfahren, bei dem Enzyme, erhalten aus inneren Organen von Tieren, wie oben erwähnt, verwendet werden, hat das erfindungsgemäße Verfahren einen großen
technischen Nutzungswert, da bei diesen Mikroorganismen verwendet werden, die leicht und billig erhältlich sind.

Es ist fernerhin bekannt, daß optisch aktive N-Carbamoyl-a-aminosäuren in optisch aktive α-Aminosäuren umgewandelt v/erden
können, ohne daß die Konfiguration verändert wird, indem mit
salpetriger Säure umgesetzt wird. Wenn man daher mit dieser Umsetzung das erfindungsgemäße Verfahren kombiniert, dann wird
die technisch vorteilhafte Herstellbarkeit der D-Formen von a-Aminosäuren möglich. Da die Bedeutung von D-α-Aminosäuren als

809827/0896

Zwischenprodukte für die Herstellung von Antibiotika, Peptid- I hormonen etc. in den letzten Jehron l.vi steigt, ict die vor liegend η F.rf.i ndiJi.g von großen Uc-;-t.

Es konnon iOle beliebigen DL-, D- und L-Formon der 5-ßi'.bsti- ■ tuierten ilyc'anto.-hO als Auor^u^runaterialiHn bei dem er-findurigsgciiiäßen Verfahren vorwendet v/erdrn. Im Falle der 5-subr:tituiox---; ten Hy dan to .inc, dir- durch Chornische Synthesen leicht horße- \ stellt werden können, werden geeigneterweise die ^L-Formen verwendet. Die DL-Forrv η werden iius den evjtaprochond'c-n Aldehyden nach dorn Buchercr-Borg-Verfahren hergsr.tellt, das als synthetisches Vorfahren zur Hei'stclDung von o:·-Aminosäuren bekannt ist. ■ V/tnn L-a-Ai'iinosäur'on im Handol orhäli lieh sind und billig ver- . fügbar nin'l, dann werden geeigneten:·?ine die L-Forinen von 5- ι substituierten Hydantoinen oingeset;:t. die sich von L-a-Aminö- ; säuren ableiten. DJc L-Fonnen der 5- Gwbstituierten Hydantoine [ leiten sich von I,-κ·-Aminosäuren ab, indem die L-a«Aminosäuren I mit Kaliuncyanat umgesetzt werden und sodann die gebildeten ! L-H-Carbamoyl-a-aminosäuren unter sauren Bedingungen zum Ringschluß erhitzt werden.

Die 5-substituierten Hydantoine, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind Verbindungen, bei denen ein Wasserstoffatom in 5-Stellung des Hydantoins durch eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, eine Aralkylgmppe mit 7 Kohlenstoffatomen oder eine solche Gruppe, die eine substituierende Gruppe trägt, substituiert ist. Die hierin verwendete Bezeichnung "Aralkylgruppe" soll hauptsächlich eine Benzylgruppe bedeuten. Die Substituentengruppen, die an die Alkyl- odor Aralkylgruppe angefügt sind, sind z.B. Halogenatome, Alkylthiogruppen, Hydroxylgruppen, Alkoxygruppen, Cyanogruppen, Aminogruppen, acylierte Aminogruppen, Indolylgruppen, Imidazolylgruppen, Carboxylgruppen und Alkoxycarbonylgruppen. Beispiele fir 5-substituierte Hydantoine, die erfindungsgemäß eingesetzt

809827/089B

werden können, sind zusammen mit den Hamen der entsprochunderj oc-Aminor>äuren in Tabelle I aufgeführt:

Tabolle I

5-svibstituiertos Hydantoin

Substituentengruppe R des Hydantoins

Entsprechende a~ Aminosäure

5-Hethy!hydantoin

5-Chlorinethylhyclantoin 5-Fluormethylhydantoin 5-Xthy!hydantoin

5- (n-l^ropyl) -hydantoin

5-(Isopropyl)-hydantoin

5-(n-ButyI)-hydantoin

5-(tert.-Butyl)-hydantoin

CH₃-

ClCII₂-

FCH₂-

CH₃CH₂CII₂

CH

CH

CHCH₂-

	CH3	JCIl	CHf
	CH3CH2
5-(Isobutyl)-hydantoin	CH3SCH2CH2-
	HOCH2
5-(2-Hethylthioäthy1)-
hydantoin	CH3OCH2-
5- (Ilydroxyäthyl) -hydantoin	HOCII2CII2-
5-(Methoxymethyl)-hydan
toin
5-(Hydroxyäthyl)-hydantoin

5-(1-"ydroxyäthyl)-hydantoin

CH-

HO Alanin ß-Chlor<'il?u'jin ß-Fluora1anin a-Aminobuttorrjäiire Norvalin

Valin

Norleucin

Leucin

Isoleucin und AlIoisoleucln

Methionin Serin

O-Methylserin Homoserin

Threonin und AlIo threonin

5-Benzy!hydantoin

Phenylalanin

806827/0868

Fortnctzvmrr Tabelle T

5...(4-.}vycivoxy1io™.yl)

5- (3- Λ; ;irio iJi'O] ij'l) -hydantoin '

■ο

II-

^rj- (.?· Cy^KKitbyl )-hydantoin NC-- (CJi_p )₂-5-(4-A).i.inobutyl).-hy(?f,.nlüin Iy-J

Tyrosin

Ornithin

Jf-Cyano-cc-amino buttersäure

Lysin

(y
toin

5-[4-(B'mzoy!amino)»butyl]-hydantoin '

5-(Indolylmethyl)-hydantoin \\ |Γ^αΐ2"

11

5- (Carboxy line ti xyl) -hydantoin " HOOC-CIIp

5- (2-Carboxyätliyl) -hydantoin

5- f (2-IIothoxy carbonyl) äthyl ]-hydantoin

1100C-CH₂CH₂-H₃COOC-CII₂CII₂-

valcriansäurc

Benzoyllysin -

Tryptophan

Asparaginsäure

Glutaminsäure

if-Hethylglutamat

Als Mikroorganismen v/erden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren solche verwendet, die dazu imstande sind, den Hydantoinring unter Ringspaltung asymmetrisch zu hydrolysieren. Sie werden in der Weise ausgewählt, daß wilde Stämme, die in der Natur vorhan den sind, Stämme, die in öffentlichen Hinterlegungsstellen hinterlegt sind, und Mikroorganismen, die durch künstliche Mutation aus diesen Stämmen erhalten worden sind, auf das Vorhandensein der obengenannten Fähigkeit untersucht werden. Der Ausdruck "Fähigkeit, den Ilydantoinring unter Ringspaltung asymmetrisch zu hydrolysieren" soll die Fähigkeit, den Hydantoinring

809827/08ΘΘ

275798Ü

der 5-substituierten Hydantoine so zu hydrolysieren, bedeuten, daß praktisch nur die D-Formen von N-Carbamoyl-cc-aminosäuren erhalten werden. Die Untersuchung auf diese Fähigkeit kann bei-; spielsweise nach folgender Methode erfolgen:

Zunächst werden die Zellen gesammelt, indem 2 ml einer Kulturbrühe der Mikroorganismen zentrifugiert werden und indem sodann' mit 2 ml von Q,9 gew.-jSiger Kochsalzlösung gewaschen v/ird. So- \ dann werden die Zellen erneut durch Zentrifugieren gesammelt« ' Die so erhaltenen intakten Zellen (Naßgewicht: AO bis 400 mg) | werden zu 2 ml einer 0,1 bis 1,0 gew.-?5igcn wäßrigen Lösung oder Suspension des 5-substituierten Hydantoins gegeben. Die Reaktion v/ird sodann 10 bis 40 h lang bei einem plMv'crt von 7 bis 10 und bei einer Temperatur von 30 bis 40⁰C durchgeführt. Nach beendigter Umsetzung v/ird zu dem Reaktionsgemisch eine konzentrierte salzsaure Lösung von p-Dimethylaminobenzaldehyd gegeben und das resultierende verfärbte Reaktionsgemisch v/ird zentrifugiert, um unlösliche Materialien, wie Zellen, zu entfernen Die Menge der in der resultierenden überstehenden Flüssigkeit erzeugten N-Carbamoyl-a-aminosäure wird sodann kolorimetrisch bestimmt. Bei einem Stamm, der eine relativ hohe Umwandlung zeigt, wird die Hydrolysereaktion des 5-substituierten Hydantoins erneut im großen Maßstab durchgeführt und die erzeugte N-Carbamoyl-a-aminosäure wird isoliert. Stämme, bei denen bestätigt v/ird, daß sie die D-Formen von N-Carbamoyl-a-aminosäuren und die entsprechenden L-a-Aminosäuren als Nebenprodukt kaum erzeugen, werden als Mikroorganismen für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet.

Die Mikroorganismen, die erfindungsgemäß verwendet werden, sind diejenigen, die aus der obigen Untersuchung hervorgehen. Sie werden aus der Gruppe Bakterien, Actinomyceten, Schimmeln, Hefen und Deuteromyceten ausgewählt. Untersuchungen haben gezeigt daß vom taxonomisehen Standpunkt aus gesehen die Mikroorganis-

609827/0896

-JK-

men in einem weiten Bereich von Arten aufgefunden worden )iör.-:io; Geeignete Bakterien sind z.B. solche der Arten Achrornabacter, Aerometer, Aerowonas, Agrobactcrium, A3caligenor>, Arthrcbacter, Bacillus, Brevibocterium, Corynebactori ura, Enterobacteria, Erwin.!*_} Esche ro ich.ia, Klobniella, Hicrobacterixjm, Ilicrococcu^, Protc.iTi.inobacter, Proteus, Psc-.udor.ionarj, Sarcina, Sorrratia und Xantboirionas. Beispiele für geeignet« Actinomyceten :r;ind solche der Arten Actinoiiiyces, Actinoplanc-s, Mycobacteriura, Nocarciin und Strcptomycos. Beispiele für geeignete Schimmel sind solche der Arten Aüporg.illuc, Paccilomycos und Penicillium. Beispiele für geeignete Hefen sind solche der Arten Candida_f Pichia, Rhodotorula und Torulopsis.

Bei dcra erfindungiigemäßon Verfahren v/ird. die katalytische Mir·- kung eines intrazellulären Enzyme in Form d&r Zellen oder behandelten Zellen von Mikroorganismen ausgenutzt. Das Enzym kann' in der V/eise hergestellt werden, daß ein Mikroorganismus in J herkömmlicher Weise gezüchtet v/ird. Obgleich die Kultivierung gewöhnlich in einem flüssigen Medium erfolgt, kann auch eine Kultur mit fester Oberfläche angev;endet werden. Im allgemeinem enthält das Kultivierungsmediura Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die die Mikroorganismen assimilieren können, sowie anorganische Salze und andere Nährstoffe, die für das Wachstum der Mikroorganismen wesentlich sind. Vorzugsweise wird eine Hydantoinverbindimg, wie Hydantoin, DL-5-Methylhydantoin oder DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin, zu dem Kulturmedium in einer Menge von 0,05 bis 0,3 Gew.-Jo gegeben, um die gewünschte Enzymaktivität zu verstärken. Die Kulturbedingungen werden im Temperaturbereich von 20 bis 05⁰C und im pH-Bereich von 4 bis 11 entsprechend den optimalen Wachstumsbedingungen des verwendeten Stamms ausgewählt. Gewöhnlich v/erden die Mikroorganismen bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C, bei einem pH-Wert von 5 bis 9 und über einen Zeitraum von 10 bis 75 h gezüchtet. Währeid der Kultivierung kann das Wachstum der Mikroorganismen

8098?7/089ß

durch Belüftung und Durchbewegung beschleunigt werden«

Die auf diese Weise gezüchteten Mikroorganismen worden in Form ' einer Kulturbrühe, von Zellen oder behandelten Zellen bei der | asymmetrischen Hydrolyse von 5-.substituierten Hydantoinen ver- ! wendet. In vielen Fällen kann die Reaktion in der Weise be- ! wirkt werden, daß man die Kulturbrühe verwendet, welche die ^! Zellen der Mikroorganismen so, wie sie sind, enthält. In Fällen, wo die Komponenten der Kulturbrühe die Reaktion behindern könnten oder wo es angestrebt wird, die Menge der Zellen zu erhö- j hen, v/erden Zellen verwendet, die von der Kulturbrühe abge- ; trennt worden sind. Obgleich die Ziele der Erfindung zufrieden-; stellend erreicht werden können, wenn man die intakten Zellen \ verwendet, können die Zellen aber auch in Form von getrockne- · ten Zellen, beispielsweise von lyophilisierten Zellen und eines Acetonpulvers, wegen der einfacheren Lagerung oder Handhabung '■ verwendet v/erden. Die Zellen können auch in Form von behandel- j ten Zellen, z.B. von zerkleinerten Zellen und eines Zellextrakts, eingesetzt werden. Schließlich können diese Zellen und die behandelten Zellen auch in herkömmlicher V/eise immobilisiert werden.

Das Reaktionssubstrat, d.h. das 5-substituierte Hydantoin, wird gewöhnlich mit der Kulturbrühe, den Zellen oder behandelten Zellen in einem wäßrigen Medium vermischt, damit die Enzyme katalytisch auf das Substrat einwirken.

Die Konzentration der 5-substituierten Hydantoine beträgt 0,1 bis 30 Gew.-%. Die Löslichkeit der 5-substituierten Hydantoine in Wasser ist im allgemeinen nur niedrig. In vielen Fällen liegen die 5-substituierten Hydantoine in suspendierter Form vor, was jedoch kein Hindernis für die Reaktion ist, da sich das Substrat fortschreitend in dem wäßrigen Reaktionsmedium im Verlauf der Reaktion auflöst.

B09827/0896

-XT-

Das tatsächliche Substrat für die mikrobiellon Enzyme, dio erfindungr.gemäß verwendet werden, sind die D-Forme η der 5-sub·· stituierten Hydantoine. Nur die D-Formen v/erden selektiv unter ' Umv/andlung in D-N-Carbsinoyl-a-arainonauren hydrolysiert. Da je— [ doch .1n dom Reaktionr.systern das Rnzemisierimgr»glcicbgrwicht ! hinsichtlich dor ^-substituierten Hydantoine vorliegt, werden | dje nioht-bydrolyaierten L-Forraen bein Verbrauch der D-Formen in die D-Formcn umgewcndelt, mit dem Ergebnis, daß die D-Forrcen dem Reoktionssyston iramer in Substanz zugeführt v/erden. Die L·- Formen stellen kein eigentliches Substrat dar, können aber als indirektes Substrat angesehen werden, da die Raxemiwidrungsreaktion der 5-substituiei*tcn Hydimtoine parallel zu der enzyraatjsehen Reaktion abläuft. Als Auagangsmaterial können daher alle DL-, D- und L-Formcn der 5-sub.stituierten Hydantoine verwendet wcrdtn.

Wenn die IJydrolyseroaktion der 5-substituierten Hydantoine in einem wäßrigen Reaktionsniedium durchgeführt v;ii'd, dann wird das Reaktionsgemisch vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7 bis 10 gehalten. In diesem pH-Bereich können die gewünschten Produkte in hohen Ausbeuten erhalten werden, solange Hikroorganis-i men mit einer hohen Aktivität verwendet werden. Wenn der pH-Wort unterhalb 7 liegt, ist die Reaktionsgeschwindigkeit sehr niedrig. Wenn andererseits der pH-Wert oberhalb 10 liegt, dann können Nebenreaktionen auftreten. Bei pH-Werten von 7 bis 10 ist die Umwandlungsgeschwindigkeit der DL- oder L-Formen der 5-substituierten Hydantoine in D-N-Carbamoyl-a-aminosäuren stark vermindert, da der optimale pH-Wert für die erfindungsgemäß verwendeten mikrobiellen Enzyme in der Nähe von 8 bis 9 liegt. Die Löslichkeit des Substrats steigt mit ansteigenden pH-Werten an und die Razemisierung des Hydantoinrings wird bei alkalischen Bedingungen wirksam beschleunigt. Im Verlauf der Reaktion nimmt der pH-Wert des Reaktionsgemisches ab. Es ist daher zu bevorzugen, zu einem geeigneten Zeitpunkt ein Neutra-

809827/0896

lisationsmittel, wie Ammoniak, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Natriumcarbonat, in das Reaktionsgeminch zu geben, um dieses beim optimalen pH-Wert zu halten. Weiterhin kann, wie es die Gelegenheit erfordert, ein organisches Lösungsmittel und ein oberflächenaktives Mittel zu dem Reaktionsmcdiiun gegeben werden.

Die Hydrolysereaktion wird bei einer Temperatur durchgeführt, '. die für das verwendete mikrobielle Enzym geeignet ist. Gewöhn- < lieh wird sie bei einer Temperatur von 20 bis 85⁰C durchge- ₍ führt. Die Reaktionszeit variiert entsprechend der Aktivität ■ der verwendeten Mikroorganismen und der Reaktionntemperatur. Sie liegt gewöhnlich im Bereich von 5 bis 100 h.

Die D-H-Carbamoyl-a-aminosäuren, die durch die Hydrolysereaktion gebildet worden sind, werden aus dem Reaktionsgemisch durch pH-Einstellung oder Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz isoliert. Wenn beispielsweise das Produkt relativ hydro- _; phob, wie D-N-Carbamoylmethionin und D-N-Carbamoy!phenylalanin,\ ist, dann wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches auf 5 einge- j stellt und das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert oder filtriert, um unlösliche Materialien, wie unverändertes Substrat j und Zellen, zu entfernen. Sodann v/ird der pH-Wert der resultierenden überstehenden Flüssigkeit oder des Filtrats auf 2 bis; 4 eingestellt, um das gewünschte Produkt auszufällen. Wenn das : Produkt relativ hydrophil, wie D-N-Carbamoylserin und D-II-Car- · bamoylalanin, ist, dann wird die Isolierung oftmals in dieser j Weise, wie oben, jedoch unter Schwierigkeiten durchgeführt. In diesem Falle wird das Produkt zweckmäßigerweise durch Ionenaustauscherharzbehandlung isoliert. Die Ionenaustauscherharzbehandlung ist jedoch nicht auf diesen Fall begrenzt. Vielmehr ist sie als allgemeine Isolierungsmethode verfügbar. Das Produkt wird in der Weise adsorbiert, daß das Reaktionsgemisch aus dem zuvor unlösliche Materialien entfernt worden sind, durch

809827/0896

1t 275798Ü

eine Säule eines basischen Anionenauntau.scheiiiarzeG geleitet wird und sod?jra«. Rur> dein Aniononuu.stauscherharz mit einem Lc--

sungs^ittel, wie verdünn bor Salzsäure, eluicrt wird. Das Eluat j wird γ. ο dann neutralisiert und bei vermindertem Druck konzen- | triert, wodurch Kristalle des gewünschten Produkts erhalten werden.

D-li'-Carbanoyl-a-farainosäuren, die nach dein crfindungsgemäßon Verfahren erhältlich sind, stollen einsetzbare Zwischenprodukte für die Herstellung von Arzneimitteln dar. Da bekanntlich D-H-Carbainoyl-a- aminosäuren durch Umsetzung mit salpetriger Säure leicht in D-a-Aininosaurfsn umgewandelt werden können, können D-a-AminoRäurtm in vorteilhafter V/eise in technischem Maßstab hergestellt werden, wenn man das erfindungr;gcnäße Verfahren mit dem bekannten Verfahren kombiniert.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Wenn nichts anderes angegeben ist, dann sind alle Prozentangaben auf das Gewicht bezogen.

Die in den Beispielen verwendeten Mikroorganismen sind bereits bekannt. Stämme, die mit IAM, IFO oder ATCC bezeichnet sind, sind Stämme, die unter den angegebenen Katalognummern bei den folgenden Hinterlegungsstellen hinterlegt sind:

IAM: Institute of Applied Microbiology, the University¹

of Tokyo (Japan)

IFO: Institute for Fermentation, Osaka (Japan) ATCC: American Type Culture Collection (USA).

Beispiel 1

Es wurden die folgenden flüssigen Kulturmedien (A) und (B) hergestellt. Jeweils 100-ml-Portionen davon wurden in 500-ml-

809827/0890

Schüttelkolben eingegeben und 15 min lang bei 120⁰C dampfsteri-

lisiert.	Kulturmedium (A)	2,050	Kulturmedium (B)	0,5%
FIe i s chextrakt	0,6%	Fleischextrakt	1,0%
Glyzerin	0,1%	Pepton	0,5%
HydantoJ.n	5,5	Hefeextrakt	0,1%
pH '		Hydantoin	0,15%
		NaCl	7,0
		pH

Pseuclomonas striata IFO 12996 und Acrobacter cloacae IAIl 1221, die zuvor 24 h auf einer Bouillon-Agar-Schrägkultur bei 30⁰C j gezüchtet worden waren, wurden getrennt in das Kulturmedium (A): inokuliert. Corynebacterium sepedonjcum IFO 3306, der zuvor in J der gleichen Weise, wie oben beschrieben, gezüchtet worden war, wurde in das Kulturmedium (B) inokuliert. Es wurde bei 30°C unter Schütteln 18 h lang bei Verwendung von Pscudomonas striata IFO 12996 und Corynebacterium sepedonicura IFO 3306 und 40 h lang bei Verwendung von Aerobacter cloacae IAII 1221 gezüchtet. Die Zellen wurden von den resultierenden Kulturbrühen abzentrifugiert und mit 100 ml 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugieren gesammelt und sodann in 50 ml 0,9%iger Kochsalzlösung suspendiert. Jede der so erhaltenen Zellsuspensionen wurde als Komponente des unten beschriebenen Gemisches verwendet.

Die in Tabelle II angegebenen 5-substituierten Hydantoine wurden als Heaktionssubstrat verwendet.

Komponenten des Gemisches:

(1) 1,0 ml einer wäßrigen Substratsuspension mit einer Konzentration von 100 mM, hergesteDt durch Suspenlie-

809827/0896

run ft vor· ';■ r;ul>r.ti ivuir γ-Ι c ;i Hydantoin in cinnr 0,111-

JialiOO-,-· il^!.VpCiO.,.-!differ] örrovc ni.it eiriL-ni plJ-Uert von 9»ί··. ;

lOin )lci\[,-ί:;.ίβr..r, )i.it (;c;r.c hi.ii'f(;))CT! Γ>ΐό'ρ;:ο1 vrrde rn.it don obift'-ri Iionponcircen (1) ν ι-λ) (P.) bt ::vArxr);'c_r lloO.niro uv.rde dir- Heel; tion ! 20 Ii bei 33°C -v.ntcr wildcM .ScJnM Lc Πτι durui^cXUhrt. Uninittoll··:¹:':· ■ nach ]>;(.ijdiftunr; d;;r Reaht.ioii v/uvdcn t,u dem Roa)-:tior;r;ftei.-.;i cell ! 0,5 ml rxnt.-r IG'/J^on xraih-irjn Lönvnc von TrichlorcG.siftciiuro, ! 0,13 ml cir.f-.r lO/ii^on l,'u:.\n>i; yon ρ-D.iincihyuaioinobon.iitldohyd in 6IJ—Sr-.II ■/.:-iiurc; und 3,0 ml rcincü \J;\::-<-r ^^^(,bcri. Dar. vorfärbtt-Hcal:ti<'ii.';^05'ii:jc!i \;urdo y.xn- Entfcjnnnft von uvilonlicliCjn Materialien zentriiu/p ort und Joii-raul vnjrde die; H-Carbanioyl-a-amino·· Biiure b(;.i t\20 ijin Jto].or.ii.n;-lrj.scli bc'f:tiir.int. Diono Reaktion^- und I}(!fät:ii.ii;iu:;i'..'.ontLnaI)Vifjn ν,^τ\υ·α( r>. für Jcd.on Jjikroorganirnms und. Jf-

In Tabelle II nind die Ilonnon dor in den Ucaktionsßcmiccben crzeu{;1cn IJ-Carbiii'ioyl-a-aninottäuj'·^ und die UirWandlungen der ¹J-eubßtiluiorton Uydnntoine zusammengestellt.

009827/0896

BAD ORIGINAL

- 15 -

Tabelle II

! F.ealctionssubstrat

Produkt Fseudosonas striata Corynebacterium Aerobacter IFO 12996 sepedonicun cloacae

Menge Umwandlung IFO 3306 IAi-I 1221

ng/nl MoI-Ji Menge Unwand- Menge Ito/andf

/l lung ng/al lung

VloI'% Mol-90

i DL-5-Ι·Ιε thy !hydantoin

j DL-5-(Iscpropyl)-hydantoin

I DL-5-(tert.-Butyl)-hydantoin

ylalanin 3,0 1,-Ccrbssoyl valin 5,3 ll-Carbasoylleucin 2,4

1 DL-p- {2-I'Isthylthioäthyl) -hy- E-Cartanoylaecantoin

thicnin

j L-5-(Hydrcxyr:ethyl)-hydantoin li-Carbacoylserin 4,6

j DL-5-Benzylhydantcin Ιί-Carcaz.oylphe-

j nylalanin 1,2

■ L-5-(Carcc:cyr.3thyl)-hycantoin K-Carcacoylaspara-

; " ginsäure 0,32

j L-5- (2-Cartc::yathyl) -hydantoin !!-Carcanoylglu-

I taninsäure 0,38

^] DL-5-(4-Aninocutyl)-hydantoin N-Carbanoyllycin 0,72

46

73 23

66 62

12 3,6

4,0 7,6

2,6 0,8

2,6 2,5

40

9,5 16

27 33

2,2 0,25 2,8

0,21 2,2 0,34 3,6

3,6 3,2 2,4

5,8 2,0

60 27

0,2 1,9

0,2 2,2

0,0 0,0

0,83 9,3

27573ÖU

tinier Υγ··γ... . ■■ i.liuig dc;.)· [■;,!(.·.\ch^r..i ι n:i];rooy,';.prirme. ι ν.· ic jr. 13ο χ :·.);.; el i 1 wurde ([i.f Jiyclroly.·.^.reaktion cu.-r in VfibeJlo 111 anp.ußc-T-^nrn [ 5--Miib:;t.J tu i ι: -lan llyck'u toino in einen; größeren I Io ßi; tab al;; in J^.if.ji.i cl 1 :'.!). dor ff>1 goml'.'ii V.^rc.i.fjc dirfcligcfiOirt:

Die: /Jiiclit\u\';; dor !!.Drrooi'^anir-i'.Oii orfolf;tc in dr.-r ^loicbon \#^rci·- J sr. v/ie im ]k:.ir»piol 1, ntLL der /lunnahiro, daß ^OO-Ml-Poi-tioncti · ov.r, Kultu) i".;;-tlluMs (Λ) oder (B) genondt it in ?.■ L -ilchuttcilkolhon CoI)IViCl) t v.'urden. Auf. Jcdei' rcr.nltiere aOon Kultxa-briihG vnu-don j 7,c'llcn durch Zontrl Γυ^ίοι-εη ftb^otecinut und nit 300 ΐ!·.1 0,9^i&or I KoclK;alr.l.ö.^froj)f'; Rewa:dion. IUo Zellen wurden crnout durch ZontrifußLeren ^ormümcIl· und fjodoim in 100 ral 0,9/'ißcr liochfialzlönunii r.ui.jtc-Ddiort. T)Lo aui" diene Mcir-u erhaltenen Zollnurspon- ; Gioncn wurden ,)ev;nil:; air; Koinjjonente de;; unten bjr.c Gciair.chof; veί v/cnde fc.

Konponent(;n don

(1) 1,0 (5 Ιί-πιιϊ)ί·.tituicrloü Hydantoin.

(2) OO ill. einer O, IH-Ik'IXX)-.,-IJa₂CO--PufferTönung r.iit einem pll-Uoi't von 9,5.

(3) 20 ml ZcllKuspenuion.

Da» (lemifjch au.·; den obLpen Komponenten (1), (2) und (3) wurde in einen 300-nL-ErLoi)muyer--Kol.ben mit geschliffenem Stöpsel gebracht. Die Reaktion wurde bei ;3;>°C 20 h lnnß unter mildem Schütteln durchgeführt. Während der Reaktion wurde das Gemisch durch Zugabe von 21MIaOH zu geeigneter Zeit bei einem pll-V/ert von B,'j bus 9,0 gehalten.

Ilach beendigter Umsetzung wurde das Rcoktioncgch-ir.ch auf einen
pH-Wert von 5,0 eingestellt und sodann zentrifugiert, um unlösliche Materialien, wie unverändertes Substrat vnd Zellen, zu

ι entfernen. Die resultierende überstehende Lösung vmrde lyophl- j lisiort. Daß erhaltene Pulver wurde nut Äthanol extrahiert.

Nach der Zugabe von 5 G Silikagel zu dem Extrakt vmrde clan ÄtJia· nol abdestilliert. Der Rückstand wurde in eine Säule gepackt ^! und zur Reinigung vmrde eine Sililutgel-Säulcnchromntcgrcphie
durchgeführt. Die Säule wurde zuerst mit Aceton und sodann mit
Äthanol eluiert. Dan Produkt v/urde erhalten, indem das J.ö.sur.'gs·-' mittel aus der Fraktion abdestilljert wurde, die die iJ-Carba- '

moyl-a-atnjnosäure enth.ieüt. Wenn die Rcinitunc immer noch nicht, ausreichend war, dann v/urde die Rcinißunf; v,^reitcr{:oführt, wobei ■ ein /jiionenaur.tpuscher vom Acetattyp (unter den l/ariüjr.cichen
Ambcrlite IRA-^OO von Rühm u Haas Co. erhältlich) vcr\;endet
vmrde. llach den Eluieren jait 1,5 bis SlI-Kscin^mire vairde das
Eluat lyophilisiert, wodurch ein Produkt mit höherer Reinheit
erhalten wurde.

Die obigen VerfrJarensmaßnahmen vmrden mit allen nikroorßanirwen und Substraten durchceführt.

In Tabelle III sind die erhaltenen Mengen, Schmelzpunkte und
die spezifische Drehung der erhaltenen ll-Carbamoyl-oc-aminosäuren zusammengestellt.

Die Ergebnisse der Elementaranalyse und des Infrarotspektrums
der Produkte stehen mit den theoretischen Werten im Kinl'Jang. j Aus den Ergebnissen der Dünnschicht-Silikagelcliromatograinine | (Lösungsmittel: n-Butanol/Essigsäure/Wasser =4:1:1) vmrde
bestätigt, daß die Reinheit hoch v/ar. Aus den Werten der spezifischen Drehung ergab sich, daß alle Produkte die D-l'orm hatten

	Stamm	- 18	Substrat	-	Ausbeute ng	Schmelz punkt 0C	spezifische Drehung	ν:
	Pseudomonas striata IFO 12996	Tabelle	DL-5-Methylhydantoin	III	395	177-179	-20,5° (c- 2,0, 1N- NH4OH) -0,66° (ο- Ι,8, 1N- NH4OH) -33,4° (c- 2,8, 1N- NH4OH)
		DL-5-(tert.-Butyl)-hydan toin L-5-(Hydroxymethyl)-hy dantoin	Produkt	105 563	206-208 140-141	-19,6° (ο- Ι,6, 1N- NH4OH)
	Corynebacterium sepedo- nicum IFO 3306	DL-5-Methylhydantoin	D-N-Carbamoyl- alanin	310	177-179	-37,5° (c- 2,0, 1N- NH4OH) -17,8° (ο- Ι,9, 1N- NH4OH) -14,0° (c- 2,6, 1N- ΝΗλΟΗ)
8608		DL-5-Benzylhydantoin	D-N-Carbamoyl- leucin D-N-Carbamoyl- s er in	205	199-200
27/0	Aerobacter cloacae IAM 1221	DL-5-Methylhydantoin	D-N-Carbamoyl- alanin	408	175-178
co α> α»		DL-5-(Isopropyl)-hydan toin	D-N-Carbamoyl- phenylalanin	355	211-213
			D-N-Carbamoyl- alanin
	D-N-Carbamoyl- valin

rrmso

Beispiel 3

Die in Tabelle IV angegebenen Mikroorganismen wurden auf Bouil· lon-Agar-Schrägkulturcn inokuliert und 24 h lang bei 33°C gezüchtet .

Es wurde ein flüssiges Medium mit einem pH-Wert von 7,0, das die folgenden'Komponenten enthielt, hergestellt. 1Oml-Portionen davon wurden in Reagensgläschen gebracht und 10 min lang bei 120⁰C dampfsterilisiert.

Komponenten des Mediums:

Fleischextrakt	0,556
Hefeextrakt	0,59$
Pepton	1,0#
Hydantoin	0,1#
NaCl	0,15!

Die einzelnen Mikroorganismen, die auf den Bouillon-Agar-Schrägkultüren gezüchtet worden waren, wurden mit einer Platinschleife in das flüssige Medium jedes Reagensglases hineinokuliert. Nach 24-stündigem Züchten bei 33°C unter Schütteln wurden die Zellen von der resultierenden KulturbrUhe abzentrifugiert und mit 10 ml 0,9#iger Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugieren gesammelt und sodann in 3,3 ml 0,9#Lger Kochsalzlösung suspendiert. Jede der so erhaltenen Suspensionen wurde als Komponente des unten beschriebenen Gemisches verwendet.

Komponenten des Gemisches:

(1) 3,3 ml einer wäßrigen Substratsuspension mit einem pH-Wert von 7,6, die 3,0# DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin enthielt.

809827/089β

275798Ü

(2) 3,3 ml O,2H-Phosphatpufferlösung rait einem pH-Wert von 7,6.

(3) 3,3 ml Zellsuspension.

Ein Reagensglas wurde mit den obigen Komponenten (1), (2) und (3) beschickt und die Reaktion wurde unter mildern Schütteln h lang bei 33°C durchgeführt. Nach beendigter Reaktion wurden 2,0 ml des Reaktionsgemisches abgenommen und das N-Carbamoylmethionin wurde wie im Beispiel 1 kolorimetrisch bestimmt. Die gleiche Verfahrensweise wurde für jeden Mikroorganismus wiederholt.

In Tabelle IV sind die Mengen des in den Reaktionsgemischen erzeugten N~Carbamoylmethionins und die Umwandlungen von DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin zusammengestellt.

Tabelle IV

Stamm Menge von Umwand-

N-Carba- lung ! moylmethionin
mg/ml

Achromobacter delmarvae IFO 12668 1,9 17

Aerobacter cloacae IAM 1221 4,6 42

Aeromonas hydrophile IFO 3320 0,3 3

Agrobacterium rhizogenes IFO 13259 3,4 31

Alcaligenes faecalis IFO 13111 0,2 2

Arthrobacter simplex IFO 12069 0,6 5

Bacillus sphaericus IFO 3525 0,3 3

Brevibacterium incertum IFO 12145 2,2 20

Corynebacterium sepedonicum IFO 3306 4,2 38

Enterobacter cloacae IFO 13535 0,1 1

Erwinia aroidiae IFO 12380 0,1 1

88

23	0	,1	2757980	Mikroorgani smen	0C	dampfsteri-
Fortsetzung Tabelle IV	0	,2
Escherichia coli ATCC 21148	1	,5	1
Klebsiella pneumoniae IFO 3319	2	,3	2		096
Ilicrobacterium flavum ATCC 10340	3	,6	14	mit einem pH-Wert	5#
Micrococcus roseus IFO 3764	3	,9	21	wurden gesondert in;	096
Mycobacterium sciegmatis ATCC 607	0	,2	33	120	3%
Nocardia corallina IFO 3338	0	,3	36		3%
Protaminobacter alboflavus IFO 3707	3	,8	2
Proteus morganii IFO 3348	5	,3	3	1,
Pseudoraonas chlororaphis IFO 3904	0	,3	35	o,
Pseudomonas striata IFO 12996	0	,1	48	1,
Sarcina marginata IFO 3066	0	,1	3	o,
Serratia plymuthicum IFO 3055			1	o,
Xanthomonas campestris IAM 1671		1
Beispiel 4
	Die Hydrolyse von DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin wurde un
	ter Verwendung der in Tabelle V angegebenen
durchgeführt.
Es wurde das folgende flüssige Kulturmedium
von 7,0 hergestellt. 300-ml-Portionen davon
2-1-Schüttelkolben gebracht und 10 min bei '
lisiert.
Komponenten des Mediums:
Fleischextrakt
Hefeextrakt
Pepton
DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin
NaCl
800827/080·

275798Ü

Jeder Mikroorganismus, der zuvor auf einer Bouillon-Agar-Schrägkultür 24 h bei 33°C gezüchtet v/orden var, wurde in dar, flüssige Kulturmedium in Schüttcüiolben hincinokuliert. Ea wurde 22 h boi 33°C unter Schütteln gezüchtet. Die Zellen wurden von J der resu!) tierrndcn Kulturbrühe abzontrifugiert und mit 150 vl 0,9/oiRor Kochsalzlösung gov/aschen. Die Zellen wurden erneut durch Zentrifugiorung gesammelt und sodann in !30 nil einer O_f9?oißen Kochsalzlösung suspendiert. Die so erhaltenen Zellsuspensionen wurden als Komponente des unten beschriebenen Gemisches verwendet.

Komponenten des Gemisches:

(1) 33 ml einer wäßrigen Substratsusponsion mit einem pH-Wert von 7,6, enthaltend 3,0% DL-5-(2-Methylthioäthyl) hydantoin.

(2) 33 ml einer 0,211-Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,6. .

(3) 33 ml Zcllsuspension.

Das Gemisch aus den obigen Komponenten (1), (2) und (3) wurde in einen 300-ml-Erlenmeyer-Kolben mit geschliffenem Stöpsel eingebracht und die Reaktion wurde 64 h lang bei 33⁰C unter mildem Schütteln durchgeführt.

Nach beendigter Umsetzung wurde das Reaktionsgemisch auf einen pH-Wert von 5,5 eingestellt und sodann zentrifugiert, um unlösliche Materialien, wie unverändertes Substrat und Zellen, zu entfernen. Die resultierende überstehende Lösung wurde lyophilisiert und das erhaltene Pulver wurde mit Äthanol extrahiert. Nach der Zugabe von 5 g Silikagel zu dem Extrakt wurde das Xtha nol abdestilliert. Der Rückstand wurde in eine Säule gepackt

8098?7

25 " /Y5798Ü

und zur Reinigung wurde sodann eine Silikagel-Säulenchromatographie durchgeführt. Die Säule v;urde zuerst mit Aceton und sodann mit Methanol eluiert. Die N-Carbarnoylmethionin enthaltende Fraktion wurde abgenommen und das Lösungsmittel wurde abdestil-;

i liert, wodurch ein Pulver erhalten wurde. Das Pulver wurde so- : dann aus einem Äthanol/Wasser-Lösungsraittel umkristallisiert, ! wodurch H-Carbamoylmethionin mit hoher Reinheit erhalten wurde.'

Die obigen Reaktions- und Reinigungsmaßnahmen wurden für jeden Mikroorganismus wiederholt.

In Tabelle V sind die Ergebnisse hinsichtlich der Menge, der Schmelzpunkte und der spezifischen Drehung des erhaltenen N-Carbamoylmethionins zusammengestellt.

Aufgrund der Ergebnisse der Bestimmung der spezifischen Drehung wurde bestätigt, daß das gesarate N-Carbamoylmethionin in D-Form vorlag.

Auch die Ergebnisse der Elementaranalyse und des Infrarotspektrums des Produkts standen mit den theoretischen V/erten im Einklang. Aus den Ergebnissen der Silikagel-Dünnschichtchromatographien (Lösungsmittel: n-Butanol/Essigsäure/V/asser = 4:1:1) wurde auch bestätigt, daß die Reinheit hoch war.

Tabelle V

Stamm Aus- Schmelz- Spezifische

beute punkt Drehung

■ng o_{c [a]}2₅

Aerobacter chloacae IAM 1221 305 159-162 +23,4° (c = 2,

5N-HC1)

Agrobacterium rhizogenes IFO +23,1° (c = 2,

13259 95 159-161 5N-HC1)

809827/0896

- ■*■ ■-■>"-"■·

0.(9 Z75798Ü

Fortsetzung Tabelle V

Corym: bacterium sepcdonicum

IFO* 3306 137 150-162 -i-20,4° (c = 2,

5N-HC1)

Mycobp.cteriu-ü ßwoßmotii: ATCC 607 215 160-162 +23,5° (c = 2,

5N-HC1)

Pseudoraonas η triota IFO 12996 330 160-162 +24,2° (c « 2,

5IMIC1)

Beispiel 5

Ein flüssigen Kulturmedium mit einem pH-Wert von 7,0, das die folgenden Komponenten enthielt, wurde hergestellt. 10-ml-Tfcile davon wurden in Reagensgläser gebracht und 10 min lang bei 120°C dampfsterilisiert.

Komponenten des Mediums:

Glukose	2,0%
Sojabohnenmehl	1,0%
Hefeextrakt	0,25%
(NH4)2S04	0,1%
CaCO*	0,5%
K2HPO4	0,4%
DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin	0,3%.

Die in Tabelle VI angegebenen Mikroorganismen wurden auf Bouillon- Agar-Schrägkul türen von Kulturkollektionen inokuliert und zunächst 70 h bei 3O⁰C gezüchtet. Die erhaltenen Zellen wurden in die flüssigen Kulturmedien in den Reagensgläsern mit einer Platinschleife hineinokuliert. Nach 72-stündigem Züchten bei 30⁰C unter Schütteln wurden die erhaltenen Kulturbrühen in der gleichen V/eise wie im Beispiel 3 behandelt, wodurch Zellsuspensionen erhalten wurden. Unter Verwendung der so erhaltenen

809827/0896

Zellsuspensionen wurde die Hydrolyse von DL~5-(2-Hethylthio~ äthyl)-hydantoin bei 33° C 40 h lang in der gleichen V/eise wie im Beispiel 3 durchgeführt. Die Mengen des in dem Reaktionsgemisch erzeugten 11-Carbamoylmethionins und die Umwandlungen von DL-5-(2-IIethylthioätbyl)-hydantoin wurden in der gleichen V/eise wie im Beispiel 3 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI ' zusammengestellt.

Tabelle VI

Stamm Menge von Umwand-

N-Carbamoyl- lung methionin Mol-# mg/ml

Actinorayces griseoruber IFO 12072 Actinoplanes philippiensis IAM 0120 Streptomyces almquisti ATCC 618 Streptomyces aureus IFO 3175 Streptomyces flaveolus IFO 3408 Streptomyces griseus ATCC 10137

Die Umsetzung wurde sodann im größeren Maßstab unter Verwendung von Actinoplanes philippiensis IAIl 0120 und Streptomyces alumquisti ATCC 618 in der folgenden V/eise durchgeführt:

Jede Brühe des Mikroorganismus, die zuvor in 10 ml des obengenannten flüssigen Kulturmediums gezüchtet worden war, wurde mit jeweils 90 ml des gleichen Kulturmediums vermischt, worauf die Züchtung durchgeführt wurde. Nach der Abtrennung der Zellen von den resultierenden Kulturbrühen und dem Waschen mit einer 0,9%igen Kochsalzlösung wurden die Zellen in 33 ml 0,956-iger Kochsalzlösung suspendiert, wodurch Zellsuspensionen erhalten wurden, die als Komponente des unten beschriebenen Gemisches verwendet wurden.

809827/0896

0,8	7
	38
3,0	27
1,4	13
1,1	10
2,3	21

Komponenten des Gemisches:

(1) 33 ml einer wäßrigen Substratsuspension mit einen pH-Wert von 7,6, enthaltend 3,055 DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin.

(2) 33 ml 0,21-1-Pho sphntpuff er lösung mit einem pH-Wert von 7,6. .

(3) 33 ml ZellsuRpension.

Ein 300-ml-Erlenmeyer-Kolben mi.t geschliffenem Stöpsel wurde mit den obigen Komponenten (1), (2) und (3) beschickt, worauf die Umsetzung 40 h bei 33°C unter mildem Schütteln durchgeführt wurde. Nach beendigter Umsetzung wurden Kristall© mit hoher Reinheit durch Behandlung dos Reaktionsgemisches gemäß Beispiel 4 erhalten.

Die Ergebnisse der Bestimmung der Menge und der spezifischen Drehung des erhaltenen N-Carbamoylmethionins sind in Tabelle VII zusammengestellt.

Aus den Ergebnissen der spezifischen Drehung wurde bestätigt, daß das Produkt in der D-Form vorlag. Weiterhin standen die Ergebnisse der Elementaranalyse und des Infrarotspektrums mit den theoretischen Werten im Einklang. Es wurde auch aus den Ergebnissen der Silikagel-Dünnschichtchromatographie (Lösungsmittel: n-Butanol/Essigsäure/Wasser = 4 : 1 : 1) bestätigt, daß die Reinheit hoch war.

809827/0896

' Z75798Ü

Tabelle VII Stemm Ausbeute spezifische Drehung

Actinoplanes philippiensis IAH +23.7° (c = 2, 5N-

0120 ' 280 HCl)

Streptomyces alumquisti ATCC 618 205 +24.0° (c = 2, 5N-

Beispiel 6

Ein flüssiges Medium mit einem pH-Wert von 7,6, enthaltend die folgenden Komponenten, wurde hergestellt. 10-ml-Portionen davon wurden in Reagensgläschen gegeben und 10 min lang bei 120 C dampfsterilisiert.

Komponenten des Mediums:

Saccharose . 10,096

Hefeextrakt 0,296

0,296 0,1?6

MgSO₄-7H₂O 0,196

CaCO₅ 0,296

DL-5- (2-Methylthioäthyl) -hydantoin 0,296

Die einzelnen Mikroorganismen, die in Tabelle VIII angegeben sind, welche zuvor 24 h auf einer Malz-Agar-Schrägkultur bei 30⁰C gezüchtet worden waren, wurden in jedes Kulturmedium mit einer Platinschleife hineinokuliert. Es wurde unter Schütteln 40 h lang bei 30⁰C gezüchtet. Die Zellen wurden von der resultierenden Kulturbrühe abzentrifugiert und sodann wie im Beispiel 3 behandelt, wodurch Zellsuspensionen erhalten wurden.

809827/0896

Unter Verwendung der so hergestellten Zollsuspensioncn wurde die Hydrolyre von DL-5-(2-Iiethyltbioätbyl)-hydantoin 40 h lang bei 33°C durchgeführt. Sodann wurde v/io im Beispiel 3 die Analyse durchgeführt.

Die Mengen des in dem Reaktionsgemisch erzeugten N-Carbamoyl·· methionins und die Umwandlungen des DL-5-(2-Methylthioäthyl)- hydantoins sind in Tabelle VIII zusammengestellt.

Tabelle VIII Stamm Menge von Umwand- N-Carbamoyl- lung

methionin Mol-% mg/ml

Candida utilis IAM 4220 0,3 3 Candida macedoniensis IFO 0706 0,2 2 Pichia vini IFO 0795 0,1 1 Rhodotorula glutinis IFO 0559 0,6 5 Torulopsis utilis IAl-I 4246 0,1 1 Beispiel 7

Ein flüssiges Medium mit einem pH-Yfert von 6,0, enthaltend die folgenden Komponenten, wurde hergestellt. 10-ml-Portionen davon wurden in Reagensgläser gebracht und 10 min lang bei 120°C dampfsterilisiert.

Komponenten des Mediums:

Glukose 10, Pepton 0,2%

KNO₃ 0,2%

(NH₄)H₂PO₄ 1,096

809827/0896

" 275798Ü

0,0.595

CaCl₂ 0,019»

DL-5-(2-Hethylthioäthyl)-hydantoin 0,2%.

Die in Tabelle IX gezeigten Mikroorganismen, welche zuvor 70 h ! lang bei 28°C auf einer Bennett's Agarschrägkultur gezüchtet worden waren, wurden mit einer Platinschleife in das flüssige ι Kulturmedium hineinokuliert. Es wurde unter Schütteln 40 h J lang bei 26⁰C gezüchtet. Die Zellen wurden von den resultieronden Kulturbrühen abzentrifugiert, worauf Zcllsuspensionen, wie im Beispiel 3, hergestellt wurden.

Die Hydrolysereaktion von DL-5-(2-Methylthioätbyl)-hydantoin und die kclorimetrische Bestimmung des erzeugten N-Carbamoylmethionins erfolgten wie im Beispiel 3. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengestellt.

Tabelle IX

Stamm Menge von Umwand-

N-Carbamoyl- lung methionin Mol-96 mg/ml

Aspergillus nigar IAM 3009 0,2 2

Paecilomyces varioti IFO 5476 0,4 4

Penicillium citrinum IFO 6352 0,1 1

Beispiel 8

Ein flüssiges Medium, das die folgenden Komponenten enthielt, wurde hergestellt. 10-ml-Portionen davon wurden in große Reagensgläser gegeben.

Komponenten des Mediums:

Fleischextrakt 0,59·

809827/0896

Hefeextrakt 0,5%

MgSO₄-H₂O 0,1%

CaCl₂-2H₂O 40 ppm

Hydantoin, DL-5-Mothylhydantoin und DL-5-(2-Ilethylthioäthyl)-hydantoin wurden gesondert in jedes Reagenzglas in einer Mcn^e von 20 Wg (Konzentration: 0,2%) gegeben. Iiach Einstellung des pH-Werts auf 7,0 wurden die einzelnen Kulturmedien 15 min bei 120⁰C dampfsterilisiert. Fseudomonas striata IFO 12996 wurde mit einer Platinschleife hineinokuliert. Die Züchtung erfolgte sodann unter Schütteln 16 h lang bei 30⁰C. Die Zellen wurden von den resultierenden Kulturbrühen abzentrifugicrt und mit 10 ral 0,9%iger Kochsalzlösung gewaschen. Die Zellen wurden orneut durch Zentrifugieren gesammc?lt und sodann in 10 ral 0,9/6-iger Kochsalzlösung suspendiert, wodurch eine Zellsuspension erhalten wurde. Die gleiche Arbeitsweise wurde für jede Hydantoinverbindung wiederholt.

Gemische aus (1) 2,0 ml einer wäßrigen Substratlösung, hergestellt durch Auflösen von DL-5-(2-Methylthioäthyl)-hydantoin in 0,1 M-MI₄Cl-IiH₄OH-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 9,5 (Substratkonzentration: 2,0%), und (2) 2,0 ml der obigen Zellsuspension wurden hergestellt und in Reagensgläser gebracht. Sodann wurde die Hydrolysereaktion bei 30⁰C 1 h lang unter Schütteln durchgeführt. Unmittelbar nach Beendigung der Umsetzung wurden 1,0 ml einer 10%igen v/äßrigen Lösung von Trichloressigsäure, ip ml einer 10%igen Lösung von p-Dimethylaminobenzaldehyd in 6N-Salzsäure und 6,0 ml destilliertes Wasser zu je dem Reaktionsgemisch gegeben. Die verfärbten Reaktionsgemische wurden zentrifugiert, um unlösliche Materialien zu entfernen. Die Mengen des erzeugten N-Carbamoylmethionins in den Reaktionen gemischen wurden kolorimetrisch durch Messung der Absorption bei 420 nm bestimmt. Als Kontrollversuch wurden die obigen

809827/0896

Maßnahmen wiederholt, mit der Ausnahme, daß keine Hydantoinverbindung verwendet wurde.

Die Tabelle X zeigt die Mengen des in den Reaktionsgemischen erzeugten li-Carbamoylmethionins und die Mengen des pro Trockengewicht (mg) Zellen erzeugten N-Carbamoylmethionins.

Aus diesen Ergebnissen wurde bestätigt, daß zu dem Kulturmedium zugesetzte Hydanto inverbinduiigen die Fähigkeit der Mikroorganismen zur asymmetrischen Hydrolyse erhöhten.

Hydantoinverbindung

Tabelle X

Menge von N- Menge von N-Carba-Carbamoylmoylmethionin pro methionin Trockengewicht der mg/ml Zellen

mg/ml/mg Zellen

Hydantoin DL-5-Methylhydantoin

DL-5-(2-Methylthioäthyl) · hydantoin

Kontrolle

3,0 3,0

2,2 2,0

1,0 1,1

0,96 0,70

80 9 8 711 08

Claims (9)

2757930 Patentansprii ehe

1. Verfahren zur Herstellung von D~lI-Ce.rfcc.moyl~a-smino-■süuren mit der allgemeinen Formel:

R-CII-COOH NH-C-IiH 0

worin R für eine Alkylgruppe, eine substituierte Alkylgrupps, eine Aralkylgruppe oder eine substituiarte Aralkylgruppe steht, dadurch gekennzeichnet, daß man 5-substltuierte Hydantoine mit der allgemeinen Formel:

R-CH C=O

worin R die oben angegebene Bedeutung hat, der Einwirkung einer Kulturbrühe, von Zellen oder behandelten Zellen eines Mikroorganismus unterwirft, der die Fähigkeit hat, den Hydantoinring in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 7 bis 10 asymmetrisch zu hydrolysieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus einen Organismus der Art Achromobacter, Aerobacter, Aeroinonas, Agrobacterium Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichla, Klebsiella, Microbacterium, Micrococcus, Protaminobacter, Proteus, Pseudomonas, Sarcina, Serratia, Xanthomonas, Actinomyces, Actinoplanes, Myco

«09827/0895

275798Ü

bacterium, Mocardia. Streptoiayccs, Aspergillus, Paecilofcyces, Per.icillium, Candida, Pichia, Rhodotorula oder Torulopsis verwendet .

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zellen intakte Zellen oder getrocknete Zellen vei-wendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η -

ζ e ic h η e t , daß man als Zellen zerkleinerte Zellen oder Zellextrakt verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen verwendet, die immobilisiert sind.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man behandelte Zellen verwendet, die immobilisiert sind.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus einen solchen verwendet, der in einem Kulturmedium gezüchtet worden ist, welches eine Hydantoinverbindung zur Erhöhung der Fähigkeit zur asymmetrischen Hydrolyse des Hydantoinrings enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die 5-substituiertaiHydantoine in der DL-Form vorliegen.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die 5-substituierten Hydantoine in der L-Form vorliegen.