DE2752452A1

DE2752452A1 - Verfahren zur zuechtung von mikroorganismen

Info

Publication number: DE2752452A1
Application number: DE19772752452
Authority: DE
Inventors: Joachim Dr Bauch; Herbert Dr Gentzsch; Guenter Heidenreich; Gustav-Adolf Luebbert; Gerhard Petzold; Lothar Reichelt; Ursula Reiter; Rolf Uhlig
Original assignee: PETROLCHEMISCHES KOMBINAT
Current assignee: PETROLCHEMISCHES KOMBINAT
Priority date: 1976-12-16
Filing date: 1977-11-24
Publication date: 1978-06-22
Also published as: CS194559B1; IT1088592B; FR2374414B1; DD126704A1; PL202980A1; SU945173A1; GB1544569A; BG29493A1; FR2374414A1; HU178319B; RO77365A; DD126704B1

Description

Schwedt, den 14.11.1977

Anmelder: VEB Petrolchemisches Kombinat Schwedt, 133 Schwedt/Oder

"Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen"

IPK: C 12 b-1/20

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen auf geradkettigen Kohlenwasserstoffen, insbesondere die aerobe Kultivierung von Mikroorganismen, wobei die Mikroorganismen zur Gewinnung von Einzellerprotein für Pütterungszwecke oder auch für die menschliche Ernährung gezüchtet werden.

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Die Erfindung gehört in das Gebiet der technischen Mikrobiologie und kann in Anlagen genutzt «erden, in denen aus Kohlenwasserstoffen Proteine erzeugt «erden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen;

Bei industriell genutzten Verfahren spielen die Fragen der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens neben der Qualität der Produkte eine entscheidende Bolle, wobei die nachfolgenden Hauptziele angestrebt werden:

- Hohe Nutzungsrate der eingesetzten Kohlenwasserstoffquelle für die Zellsubstanzsynthese·

- Hohe Nutzungsrate des eigetragenen Sauerstoffs für die Zellsubstanzsynthese, da für die Dispergierung des Sauerstoffs oder des sauerstoffhaltigen Gases Energie aufgewendet werden muß und ein Ve rat me η des Sauerstoffs aufterdem zu Kohlenstoffverlusten fiihrt.

- Soll die Biomasse zu Putter- oder Nahrungsmitteln aufgearbeitet werden, wird ein hoher Rohproteingehalt und eine günstige Nutzungsrate des verbrauchten Stickstoffs für verdauliche Proteine angestrebt, so daß z.B. der Nukleinsäurestickstoffanteil möglichst niedrig gehalten wird.

- Erreichung hoher Biomassekonzentrationen im Permentor, um die Verarbeitungskosten niedrig zu halten.

Um diese Zielstellungen zu erreichen, wurden bereits unterschiedliche Wege vorgeschlagen.

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Es wurden Fermentoren mit hoher Begasungsintensität und hoher SauerstoffÜbergangsrate entwickelt, z.B. Tauchstrahlfermentoren (DL-WP 111.144).

Zur Verbesserung des Stoffaustausches für den Sauerstoff aus der Luft in das Ferraentationsmedium wurde vorgeschlagen, oberflächenaktive Substanzen einzusetzen (DT-OS 1.442.296). Es wurden eine Vielzahl verschiedener Mikroorganismen untersucht und entsprechend ihren unterschiedlichen spezifischen Leistungs- und Qualitätskennziffern je nach dem Hauptziel des Verfahrens vorgeschlagen.

Und schließlich wurden verschiedene Substanzen als Wachstums- und Qualitätsstimulatoren vorgeschlagen (DT-OS 1.470.490, DT-OS 1.470.507, DL-WP 50.543 und DT-OS 2.043.206). Verwendung einer Kohlenstoffquelle mit einer bevorzugten C-Zahl von 10 - 14 zur Fermentation in einer Konzentration an η-Paraffinen in der Phase des logarithmischen Wachstums der Hefezellen zwischen 0,08 und 0,10 Gewichts-^ der Kultursuspension (DL-AP 113.927).

Alle diese vorgeschlagenen Verfahren bringen zwar Fortschritte, aber aus den theoretischen Bilanzen ist erkennbar, daß die verwendeten Mikroorganismen noch erhebliche Reserven hinsichtlich der Nutzung des verbrauchten Kohlenstoffs, Sauerstoffs und auch des Stickstoffs zugunsten der gewünschten Reinproteine besitzen.

Ziel der Erfindung:

Der Erfindung liegt das Ziel zugrunde, durch eine bessere Nutzung der Reserven der Mikroorganismen eine Verbesserung der Wirtschaftlichkeit des Verfahrens zur Züchtung von Mikroorganismen auf geradkettigen Kohlenwasserstoffen zu erreichen«

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Darlegung des Wesens der Erfindung;

Aus dem Ziel der Erfindung leitet sich die technische Aufgabe ab, die Verfahrensbedingungen so zu gestalten, daß ein optimaler .Reifegrad der Mikroorganismen ze Ilen erreicht werden kann.

Merkmale der Erfindung:

Überraschend wurde gefunden, daß die Zusammensetzung der n-Paraffine auf die Charakteristika der verwendeten Kohlenwasserst off rohstoffe selbst in Verbindung mit definierten Verfahrensbeding-ungen einen erheblichen Einfluß auf den Reifegrad der Mikroorganismenzellen und auch auf die Qualität der Produkte ausüben.

Beim Studium der einschlägigen Fach- und Patentliteratur ist ersichtlich, daß zur Züchtung von Mikroorganismen die Einsatzprodukte der Kohlenstoffquelle so zur Anwendung kommen, wie sie in der Baffenerie anfallen.

Andererseits werden die n-paraffinhaltigen Kohlenwasserstofffraktionen so eingesetzt, daß sie nach der mikrobiologischen Entparaffinierung dem vorgesehenen Verwendungszweck genügen. Zusammenhänge zwischen der Ausreifung der Mikroorganismenzellen, der Qualität des Endproduktes Protein im Hinblick auf die Einsatzfraktionen und die Fermentationsbedingungen wurden bisher nicht bekannt.

Durch systematische Untersuchungen wurde gefunden, daß anstelle der allgemein verwendeten Einsatzfraktionen der Siedelage 200 - 380 ⁰C definierte n-Paraffinschnitte bzw. n-paraffinhalt ige Kohlenwasserstoffgemische einer höheren Siedelage eingesetzt und jeweils für die Schnitte die Bedingungen des günstigsten Züchtungsresultates gewählt, wesentlich bessere

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Ergebnisse bei der Verbesserung des spezifischen Sauerstoff-, Kohlenstoff- und StickstoffVerbrauches zugunsten des Reinproteins erzielt werden.

Besonders hohe Biomassekonzentrationen werden erreicht, wenn die verwendeten n-Paraffinschnitte oder n-paraffinhalt igen Gemische einen um 60 - 120 ⁰C insbesondere 80 - 100 ⁰C höheren Siedebeginn haben, d.h. es ist eine höhere C-Zahl der n-Paraffine bei gleichzeitiger Einengung des C-Zahlbereiches erforderlich.

Dieser Wert wird erreicht, wenn mindestens 70 % der eingesetzten geradkettigen Kohlenwasserstoffe eine C-Zahl größer als 15 besitzen.

Ein weiteres wesentliches Merkmal der Erfindung besteht darin, daß die Verweilzeit des Fermentationsgemisches zu Mikroorganismen/Kohlenstoffquelle/wässriges Nährmedium im Permentor einen definierten Grenzwert nicht unterschreiten darf. Dieser Grenzwert liegt um ca. 1-2 Stunden höher, als entsprechend der natürlichen Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen unter den Bedingungen der Kohlenwasserstofffermentation möglich wäre und bei den bisherigen Verfahren angewendet wird.

Bei den bisherigen Verfahren unter Einsatz der normalen Gemische wurde in der Regel die Verweilzeit in der Nähe der kürzest möglichen Verweilzeit eingestellt, um die bekanntermaßen bei längerer Verweilzeit höhere Veratmungsrate der eingesetzten Kohlenstoffquelle und des eingetragenen Sauerstoffs zu vermeiden.

Diese kurzen Verweilzeiten haben jedoch den Nachteil, daß es nicht zum vollständigen Ausreifen der Zelle kommen kann. Die Unterschiede im biologischen Gesamtreaktionsablauf der Zellsubstanzsynthese bei Anwendung der erfindungsgemäßen Lösung sind außerordentlich komplexer Natur.

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Insgesamt rühren die aus diesem Unterschied resultierenden Vorteile daher, daß bei der Zellsubstanzsynthese aus längeren einheitlichen n-Paraffinketten weniger Energie und Stoffwechselprodukte aus der Zelle abgegeben werden und daß bei dem gefundenen höheren Verweilzeitoptimum ein besseres Ausreifen der Zelle ermöglicht wird, z.B. ist bei Zellen mit höherem Reifegrad das Verhältnis von Zellplasma zum Zellkern günstiger, so daß die im Zellkern gebundenen unverdaulichen Stickstoffverbindungen sich relativ verringern.

Es wird offensichtlich weniger Sauerstoff, Kohlenstoff und Stickstoff für Stoffwechselprodukte und unverdauliche Stickstoffverbindungen verbraucht, wobei die bei der höheren Verweilzeit bekanntermaßen höhere Veratmungsrate durch die eintretenden Vorteile mehr als oder mindestens kompensiert wird.

Die Erfindung betrifft also im wesentlichen ein neues Verfahren, bei dem das Erreichen des optimalen Reifegrades der MO-Zeile für die Proteingewinnung unter den günstigsten ökonomischen Bedingungen ermöglicht wird· Weiterhin ergibt sich ein direkter Vorteil bei Einsatz höherer Schnitte in der Form, daß bei der aeroben Fermentation natürlichen Verdampfungsverluste an Kohlenwasserstoffen auf etwa die Hälfte gesenkt werden.

Wird das erfindungsgemäße Verfahren im Zusammenhang mit der Produktverarbeitung der Mineralölwirtschaft oder eines erdölverarbeitenden bzw. petrolchemiechen Kombinates gesehen, können weiterhin eine Reihe Vorteile hinsichtlich der ökonomischen Nutzung der Bestandteile schwerer Erdölfraktionen für die Proteingewinnung eintreten sowie auch in der Form, daß die leichteren bisher eingesetzten Bestandteile einer ökonomisch bzw. volkswirtschaftlich günstigeren Verwendung zugeführt werden können.

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Ausführungsbei s pie let

In den folgenden Beispielen sind zwei Verfahrensvarianten unter Verwendung von Candida guilliermondii als Produktionskultur angegeben.

In den anschließenden zusammenfassenden Tabellen sind die Vorteile gegenüber eines üblichen Verfahrensbeispiel dargestellt. Wie die Kennziffern ausweisen, sind erhebliche Vorteile bei der industriellen Nutzung zu erkennen.

Die Anwendung von Candida guilliermondii ist als Beispiel, jedoch nicht als Einschränkung aufzufassen. Die prinzipiellen Tendenzen besitzen wie auch thermodynamisch belegt werden kann, Gültigkeit für alle Mikroorganismen, die vorwiegend η-Paraffine zur Zellsubstanzsynthese verwerten können.

Beispiel 1

In einem 500 1-Rührkesselversuchsfermentor, der mit allen für die aerobe kontinuierliche Züchtung von MO notwendigen Einrichtungen und der erforderlichen Meßtechnik ausgerüstet ist, wurde Candida guilliermondii auf gereinigten n-Paraffinen unter folgenden Bedingungen gezüchtet:

Siedebeginn der n-Paraffinfraktion 300 ⁰C Siedeende der n-Paraffinfraktion 380 ⁰C

Durchschnittliche C-Zahl der η-Paraffine C^g

Fermentationsgemisch im Permentor 200 kg

Verweilzeit des Permentatbnsgemisches 8 h

Zufuhr an n-Paraffinen 1,05 kg/h

Temperatur 34 ⁰C

pH-Wert 4,2

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Die Konzentration an Nähr- und Spurenelementen im Fermentationsgemisch wurde durch kontinuierliche Dosierung bei einer entsprechenden Nährlösung gehalten bei:

NH₄"	100	- 155	mg/1	Mg⁺*	20 - 30 mg/1
^P0C	200	- 300	mg/1	Zn⁺⁺	3-6 mg/1
so₄	50	- 100	mg/1	Mn⁺⁺	3-6 mg/1
K⁺	60	- 90	mg/1	Cu⁺	0,02 mg/1
Ca⁺⁺	10	- 15	mg/1	Pe⁺⁺	5-7 mg/1

Spezifische Beliiftungsrate: 70 1 Luft/kg Ferment at ions gemisch

Spezifischer Leistungseintrag

durch das Rührwerk (Netto): 10 Watt/kg Permentationsgemisch

Der Versuch wurde über ca. 10 Tage durchgeführt, wobei die Biomasse entnommen, gereinigt und getrocknet zur Analytik und den entsprechenden Tests gegeben wurde. Folgende Resultate wurden erzielt (Spalte 2). In der Tabelle 1 sind zum Vergleich die Resultate einer üblichen Fermentation mit dem n-Paraffingemisch der Siedelage

200 - 380 ⁰C und der	üblichen Verweilzeit	0 85	2	,5 ,01	von 4 Stunden an
gegeben.			40 1
	1		Dimension
Biomassekonzentration Biomasseerzeugung	17, o,		g/kg kg/h

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275245?

M>

Spezifischer Sauerstoff	2,5	2,1	kg	0₂/kg HTS
verbrauch
Spezifischer n-Paraffin-	1,23	1,04	kg	nP/kg HTS
verbrauch	58,0	64,0	⁰Jo
Rohproteingehalt	47,0	56,0	%
Reinprotein

Anteil des verbrauchten Stickstoffs im
Reinprotein

81,0 87,5

Beispiel 2

In der Versuchsstation gemäß Beispiel 1 wurde Candida guilliermondii unter ähnlichen Bedingungen wie in Beispiel 1 wie folgt kontinuierlich gezüchtet:

Belüftungsrate: 70 1 Luft/kg Fermentationsgemisch

Spezifischer Leistungseintrag durch das Rührwerk: 8 Watt/kg Fermentationsgemisch Die Konzentration an Nähr- und Spurensalzen wurde analog Beispiel 1 gehalten.
Temperatur:
pH-Wert:

33 ⁰C

Verweilzeit:

Es wurde ein G-asöl-

schnitt der Siedelage:

'23 809825/0666

295 - 370 ⁰C aus einem Erdöl eingesetzt, das 20,1 Gewichts-^ n-Paraffine mit einer mittleren C-Zahl von C₁₈ enthielt, im Bereich C^c-

- 10 -

Die Gasölkonzentration
im Permentationsmedium
betrug:

26,5 *

Der Versuch wurde Über 8 Tage gefahren.

Nach der Fermentation wurde das unverbrauchte Gasöl mittels eines kontinuierlich arbeitenden Te Hers eparat ors abgetrennt. Die vom Gasöl weitestgehend befreite Hefesuspension wurde getrocknet. Danach wurde in diskontinuierlichen Chargen mit einem organischen Lösungsmittelgemisch (Benzin/Isopropanol) extrahiert, getrocknet und entsprechend analysiert. Folgende Ergebnisse wurden erhalten (Spalte S). In Spalte 1 sind zum Vergleich die Ergebnisse eines analogen Versuches nach einem bisher üblichen Verfahren mit einem Gasölschnitt der Siedelage 230 - 350 ⁰C angegeben. Die Verweilzeit betrug bei diesem Versuch 4 Stunden. Die Gasölkonzentration 14 f> bei 19,8 % η-Paraffinen im Gasölschnitt· Die mittlere C-Zahl der im Gasölschnitt enthaltenen η-Paraffine im Bereich Cq - C₂₂ betrug

π·

	1	2	Dimension
Biomassekonzentrat ion	14,2	28,1	g/kg
Biomasseerzeugung	0,71	0,804	kg/h
Spezifischer Sauer-
s t offverbrauch	2,4	2,t2	kS σ₂/kg HTS
Spezifischer n-Paraffin-
verbrauch	1,13	1,00	kg nP/kg HTS
Eohproteingehalt	63,0	67,0
Heinproteingehalt	51,7	57,5
Anteil des verbrauchten
Stickstoffs im Beinprotein 82,0	86,0	*

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- 11 -

Claims

-u-

Erf indungs an s pruchi

Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen auf geradkettigen Kohlenwasserstoffen zur Gewinnung von Einzellerprotein durch eine verbesserte Ausreifung der Mikroorganismenzellen gekennzeichnet dadurch, daß die verwendete η-Paraffin- oder η-paraffinhaltige Einsabzfraktion gegenüber den bisher verwendeten Fraktionen von 200 - 380 ⁰C einen um 60 - 120 ⁰C, insbesondere 80 - 100 ⁰C, höheren Siedebeginn und damit eine höhere durchschnittliche C-Zahl der η-Paraffine von mindestens 17 aufweist, wobei der C-Zahlbereich so eingeengt wird, daß mindestens 70 Io der eingesetzten geradkettigen Kohlenwasserstoffe eine C-Zahl größer als 15 besitzen und die Verweilzeit des Fermentationsgemisches, bestehend aus Mikroorganismen, Kohlenstoffquelle, wäßriges Nährmedium, im Permentor mindestens 5 Stunden beträgt.

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