DE2749991A1 - Mittel zur enzymatischen bestimmung von glucose - Google Patents

Description

Deckblatt

Die Erfindung bezieht sich auf die Bestimmung von Glucose in biologischen Proben, wie Plasma, Urin, entproteinisiertem Blut und ähnlichem, wobei ein Reaktionssystem angewandt wird, das in trockenem, pulverförmigen Zustand gelagert und unmittelbar vor der Anwendung verdünnt werden kann, ohne dass Stabilitätsprobleme auftreten. Das System umfasst Peroxidase- und Glucoseoxidase-Enzyme, eine Verbindung mit einer >CH-Gruppe in alpha-Stellung zu einer Enolgruppe und mit Doppelbindungen, die zu der enolischen Doppelbindung konjugiert sind, sowie eine Verbindung, enthaltend mindestens eine reaktionsfähige Gruppe, die an eine Struktur gebunden ist, die abgeleitet ist von 1-Phenyl-5-pyrazolin-on. Ein derartiges System kann leicht angewandt werden, ist zuverlässig und billig.

Die Erfindung betrifft ein Mittel oder, genauer, eine Kombination verschiedener Reagentien, die es ermöglichen, ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Glucose durchzuführen, das ebenfalls unter die Erfindung fällt.

Aus der IT-PS 986 838 ist es bekannt, dass Glucose enzymatisch bestimmt werden kann durch Anwendung einer speziellen Kombination von Reagentien, bei denen die Umwandlung ausgenutzt wird, die Glucose in Gegenwart von Glucoseoxidase erleidet und die anschließenden Reaktionsstufen, die auf Kosten der so gebildeten Substanzen ablaufen, wobei die wichtigste die Oxidation durch das entstandene Wasserstoffperoxid eines entsprechenden Substrats mit Hilfe eines anderen Enzyms, d.h. Peroxidase, ist.

Neben den enzymatischen Mitteln bzw. Substanzen und der möglichen Anwendung von chromogenen Substanzen besteht die Reagenskombination nach der vorliegenden Erfindung im wesentlichen aus einer Komponente, enthaltend eine >CH-Gruppe in alpha-Stellung zu einer enolischen Gruppe mit konjugierten Doppelbindungen und eine zweite Komponente mit mindestens einer reaktionsfähigen Gruppe, die an eine Struktur gebunden ist, die sich ableitet von 1-Phenyl-5-pyrazolinon.

Nach der oben erwähnten Patentschrift besteht das Reaktionssystem aus Phenol oder einer analogen Verbindung und 4-Amino-antipyrin oder einer analogen Verbindung. Das Reaktionssystem kann als gebrauchsfertige Lösung hergestellt werden, oder wahlweise können Phenol und 4-Amino-antipyrin in getrennten Lösungen vorliegen, die unmittelbar vor der Anwendung vermischt und verdünnt werden. Als weitere Alternative können die Substanzen in trockenem Zustand gelagert und später zur Herstellung der gebrauchsfertigen Lösungen gelöst werden.

Bei Verwendung von Phenol als solchem ist es jedoch nicht möglich, ein einheitliches Reaktionssystem herzustellen, bei dem die Substanzen in trockenem Zustand vermischt sind und gelöst oder verdünnt werden zu einer einzigen gebrauchsfertigen Lösung, da bei dem Vorhandensein von Phenol die Stabilität nicht gewährt ist.

Es hat sich nun erfindungsgemäß gezeigt, dass anstelle der Verwendung von Phenol für das Reagens eine Verbindung angewandt werden kann mit einer >CH-Gruppe in alpha-Stellung zu einer enolischen Gruppe mit Doppelbindungen, die zu der enolischen Doppelbindung konjugiert sind, und es dadurch möglich wird, ein einziges Reagens herzustellen, das alle wichtigen Bestandteile in trockenem Zustand enthält, d.h. in Form eines Pulvers, das vor der Anwendung gelöst wird und nicht den oben angegebenen Nachteil der Instabilität besitzt.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel, das geeignet ist zur enzymatischen Bestimmung von Glucose in Form eines einzigen Reagenssystems in trockenem Zustand, enthaltend das Glucoseoxidase-Enzym, das Peroxidase-Enzym, einen Puffer, eine Verbindung mit einer >CH-Gruppe in alpha-Stellung zu einer enolischen Gruppe mit Doppelbindungen, die zu der enolischen Bindung konjugiert sind, und eine Komponente mit mindestens einer reaktionsfähigen Gruppe, die an eine Struktur gebunden ist, die abgeleitet ist von 1-Phenyl-5-pyrazolinon.

Bezüglich der chemischen Natur und der genauen Bezeichnung der beiden zuletzt erwähnten Substanzen wird auf die oben angegebene Patentschrift verwiesen, wobei jedoch von den dort angegebenen Substanzen nur diejenigen in dem einheitlichen Reagens angewandt werden können, die bei Raumtemperatur fest sind.

Es ist auch zu betonen, dass, um ein Reaktionssystem zu erhalten, das leicht hergestellt werden kann, billig und angemessen stabil ist, von den angegebenen Verbindungen solche ausgewählt werden sollen, die gleichzeitig die folgenden Eigenschaften besitzen: sie müssen hoch schmelzend und nicht verfließend sein, sie müssen in Form von amorphen oder kristallinen Pulvern vorliegen, angemessen stabil sein, sie müssen ausreichend wenig reaktionsfähig sein in trockenem Zustand, sodaß sie keine Neigung besitzen, die enzymatischen Protein zu zerstören, die in dem pulverförmigen Gemisch enthalten sind, aber sie müssen in der gebrauchsfertigen Lösung ausreichend reaktionsfähig sein, um sie für die erfindungsgemäßen Zwecke anzuwenden.

Es ist für den Fachmann in jedem Falle leicht, aus der großen Anzahl von chemischen Substanzen, die in der oben erwähnten Patentschrift angegeben sind, diejenigen auszuwählen, die für die Herstellung eines einheitlichen pulverförmigen Reagenssystems geeignet sind, auch im Hinblick auf seine be- absichtige Anwendung, d.h. unter Berücksichtigung der speziellen Nachweis- bzw. Ablesmethode, die angewandt werden soll.

Die folgenden Beispiele sind zur näheren Erläuterung angegeben.

Beispiele für pulverförmige Zubereitungen

(einheitliches Reagenssystem)

A Variation des Puffers und der Verbindung mit einer >CH-Gruppe in alpha-Stellung zu einer enolischen Gruppe mit konjugierten Doppelbindungen

A1 Phosphatpuffer pH 7,5 150 mMol/l

GOD 18 000 E/l

POD 1 000 E/l

4-Amino-antipyrin 0,4 mMol/l

Na-4-hydroxybenzoat 10 mMol/l

A2 Phosphatpuffer pH 7,3 150 mMol/l

GOD 18 000 E/l

POD 1 000 E/l

4-Amino-antipyrin 0,4 mMol/l

K-3-hydroxybenzoat 10 mMol/l

A3 Tris-maleat-Puffer pH 7,7 300 mMol/l

GOD 18 000 E/l

POD 1 000 E/l

4-Amino-antipyrin 0,5 mMol/l

Na-salicylat 12 mMol

A4 2-Amino-2-methyl-1,3-propandiolpuffer

pH 7,8 200 mMol/l

GOD 25 000 E/l

POD 2 000 E/l

4-Amino-antipyrin 0,6 mMol/l

Salicylamid 7 mMol/l

A5 Tris-KH[tief]2PO[tief]4-Puffer pH 7,6 150 mMol/l

GOD 18 000 E/l

POD 1 000 E/l

4-Amino-antipyrin 0,4 mMol/l

Vanillinsäure 12 mMol/l

A6 Phosphatpuffer pH 6 150 mMol/l

GOD 20 000 E/l

POD 2 000 E/l

4-Amino-antipyrin 0,35 mMol/l

Chromotrope Säure (4,5-Dihydroxy-

2,7-naphthalin-disulfonsäure) 4 mMol/l

A7 Acetat-Maleat-Puffer pH 6 100 mMol/l

GOD 25 000 E/l

POD 2 500 E/l

4-Amino-antipyrin 0,6 mMol/l

8-Hydroxychinolin-citrat 15 mMol/l

A8 Phosphat-Puffer pH 6,7 100 mMol/l

GOD 18 000 E/l

POD 500 E/l

4-Amino-antipyrin 0,35 mMol/l

Barbitursäure 4 mMol/l

B) Variation des 4-Amino-antipyrins

B1) Phosphat-Puffer pH 7,5 150 mMol/l

GOD 18 000 E/l

POD 1 000 E/l

Na-Salz von Sulfamipyrin (2,3-Dimethyl-

1-phenyl-5-pyrazolon-4-aminomethan-

sulfonsäure) 1 mMol/l

Na-4-hydroxybenzoat 10 mMol/

Beispiele für die praktische Anwendung

C Ablesung nach vollständiger Farbentwicklung

Probe: Serum, Plasma, Urin (deproteinisiertes Blut) 0,02 ml (0,2)

Pulverförmiges Reagens, gelöst in H[tief]2O 2,5 ml

Es wird bei einer solchen Temperatur und solange vermischt und inkubiert, dass die Farbentwicklung vollständig ist und ihr Maximum erreicht. Die photometrische Ablesung wird bei der optimalen Wellenlänge des angewandten chromogenen Systems durchgeführt (z.B. bei 340 oder 500 bis 510 nm bei Verwendung von 4-Hydroxybenzoat und 4-Amino-antipyrin bei 340 oder 600 nm bei chromotroper Säure und 4-Amino-antipyrin usw.).

Die Berechnung kann durchgeführt werden unter Anwendung des Extinktionskoeffizienten des gefärbten Chromogens oder unter Anwendung von einer oder mehreren Vergleichslösungen (Standsards) mit bekannten Glucosegehalten, die auf die gleiche Weise behandelt worden sind wie die Probe und unter Beziehung auf diese Standards wird die Rechnung folgendermaßen durchgeführt:

Konzentration der Standardlösung x D.O. der Probe = D.O. des Standards

= Konzentration der Probe

Die Abmessung der Volumina und Vermischung der Reaktionspartner kann entweder manuell wie angegeben oder mit Hilfe spezieller Vorrichtungen zur Durchführung der verschiedenen Operationen durchgeführt werden.

D "Kinetische" Ablesung

Probe: Serum, Plasma, Urin (deproteinisiertes Blut)

0,01 ml/(0,1)

Pulverförmiges Reagens, gelöst in H[tief]2O 2 ml

Es wird vermischt und sofort die Photometerablesung bei der optimalen

Wellenlänge für das angegebene System (siehe C) durchgeführt. Die

Photometerablesungen können in regelmäßigen Zeitintervallen oder

kontinuierlich vorgenommen und auf Papier aufgetragen werden.

Die gemessene Änderung <Formel> = proportional der Glucosekonzentration in der Probe

Auch das "kinetische" Verfahren kann manuell, wie angegeben, durchgeführt werden oder unter Anwendung spezieller Vorrichtungen zur mechanischen und automatischen Durchführung von Operationen, wie Abmessung der Reagentien, Vermischung, photometrische Ablesung, Zeitbestimmung, thermostatische Einstellung, Notierung, Berechnung usw. Die Berechnung erfolgt entsprechend Beispiel C, oben.

Die angewandten Abkürzungen besitzen die folgende Bedeutung:

GOD = Glucoseoxidase

POD = Peroxidase

D.O. = optische Dichte

nm = Nanometer

t = Zeit

Claims (1)

1. Mittel zur enzymatischen Bestimmung von Glucose in Form eines einheitlichen Reagenssystems in trockenem Zustand, bestehend aus Glucoseoxidase, Peroxidase, einem Puffer, einer Verbindung mit einer >Gruppe in alpha-Stellung zu einer enolischen Gruppe mit Doppelbindung(en) konjugiert zu der enolischen Doppelbindung sowie einer Komponente mit mindestens einer reaktionsfähigen Gruppe, die an eine Struktur gebunden ist, die abgeleitet ist von 1-Phenyl-5-pyrazolin-on.