DE2736527A1 - Verfahren und vorrichtung zum nachweis eines spezifischen bindeproteins oder einer damit bindefaehigen substanz - Google Patents

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. H. Weickmann, D1PL.-PHYS. Dr.K. Fincke Dipl.-Ing. F. A-Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

Dr-»ng. H. uaka 2736527

HCH t MÜNCHEN 86, DEN

int. Nr. 2145 postfach seo»20

MDHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 9« 39 21/22

BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
Sandhof er Straße 113-132,68OO Mannheim

Verfahren und Vorrichtung zum Nachweis eines spezifischen
Bindeproteins oder einer damit bindefähigen Substanz.

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer Komponente der Reaktion zwischen einem spezifischen Bindeprotein und der entsprechenden bindefähigen Substanz unter Ausnützung der Bindeaffinität dieser Komponenten füreinander in einem automatisierten System mit kontinuierlich fließendem Flüssigkeitsstrom, insbesondere ein Immuntestverfahren.

Die Immuntestverfahren (d. h. der Radio-Immun-Test (RIA), der Enzym-Immun-Test (EIA) und der Fluoreszenz-Immun-Test (FIA)) werden weltweit in klinischen Laboratorien verwendet. Obwohl ursprünglich auf dem Gebiet der Endokrinologie eingesetzt, werden diese Techniken unterdessen auf den verschiedenartigsten Gebieten angewandt, einschließlich der Immunologie, der Onkologie, der klinischen Pharmakologie, der Mikrobiologie und der Hämatologie. Da Antikörper mit starker Affinität für sowohl immunogene als auch nichtimmunogene Substanzen hergestellt werden können, sind Bestimmungen praktisch beliebiger Verbindungen in sehr geringen Konzentrationen möglich. Weiterhin kann die Bestimmung in einer relativ unreinen Probe durchgeführt werden, die vor der Analyse nur wenig oder nicht gereinigt wird.

Bislang war die Präzision derartiger Immuntests, wie des Radio-Immun-Tests und ähnlicher Analysenverfahren, relativ gering im Vergleich zu anderen Methoden, die in klinischen Chemielaboratorien angewandt werden. Dies beruht wahrscheinlich darauf, daß die meisten Immuntests derzeit manuell durchgeführt werden, wodurch sich Probleme ergeben, wie eine relativ geringe Präzision, ein kleiner Durchsatz, Ermüdung des Personals und die Langwierigkeit der Bestimmung. Die Automation ist seit langem auf diesem Gebiet erwünscht, wobei bislang die im Handel erhältlichen Systeme (wie LKB, Baird und Tatlock, Micromedic und Centria) diskrete Analysensysteme darstellen, die die Anwendung von Probenverdünnern umfassen, wobei eine Reihe von Proben dem Probenverdünner

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zugeführt wird. Weiterhin ist in gewissen Stufen ein manueller Eingriff erforderlich, wie die Entnahme der Probengestelle aus der Inkubiervorrichtung, das Zentrifugieren, das Abtrennen der überstehenden Flüssigkeiten und die überführung in eine Zähleinrichtung. Im allgemeinen sind diese Systeme kostspielig, mechanisch nicht verlässlich, relativ wenig flexibel und bringen im allgemeinen nur geringe Vorteile.

Daher wurde angestrebt, ein relativ einfaches, flexibles und vollautomatisches Verfahren zu schaffen, das für sämtliche Laboratorien geeignet ist. Die Attraktivität dieses Verfahrens sollte auch darin bestehen, daß man auf die Vorrichtungen und Fähigkeiten zurückgreifen kann, die man bereits in einem einigermaßen modernen Laboratorium für klinische Chemie vorfinden kann. Das Verfahren sollte flexibel und vielseitig sein, so daß sämtliche üblicherweise durchgeführten Analysen mit minimalen Schwierigkeiten durchgeführt werden können. Schließlich sollte das Verfahren billig durchzuführen sein und im Vergleich zu den herkömmlichen manuell durchgeführten, halbautomatischen oder automatischen Radio-Immun-Tests und ähnlichen Tests geringe Betriebskosten erfordern.

Ein vollständig automatisiertes Verfahren mit kontinuierlich fließendem Flüssigkeitsstrom würde sicherlich die oben gesetzten Anforderungen erfüllen. Die kritischsten Teile eines solchen Verfahrens sind einerseits die Einrichtung, die die freien von den in der unlöslichen Phase vorliegenden markierten Resten trennt, und andererseits im Fall des Radio-Immun-Tests, jedoch nicht bei den anderen Tests, ein Zählersystem zur Bestimmung der Radioaktivität. In Anal. Biochem. _6J> (1975) 355-361, wird ein automatisches System mit kontinuierlicher Strömung beschrieben, das an rote Blutkörperchen gebundene Antikörper verwendet. Zur Trennung des an die Antikörper gebundenen markierten Antigens von dem freien Rest werden die Erythrozyten mit Hilfe von Polybrene (Hexamethrinbromid) ausgeflockt oder agglutiniert

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und durch Dekantieren von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt. In Clin. Chim. Acta, £3 (1975) 69, wird ein Festphasensystem beschrieben, das auf der Verwendung von Antikörpern beruht, die kovalent an mit Polymeren beschichtetem Eisenoxid (Enzacryl) gebunden sind. Sowohl zum Vermischen der Reaktionsteilnehmer als auch zur Abtrennung der an die Antikörper gebundenen Markierung von der freien Fraktion wird ein Elektromagnet verwendet. Dieses Prinzip stellt die Basis für ein völlig automatisiertes System dar.

In jüngster Zeit wurde von einem automatischen on-line-System mit der Bezeichnung "Gammaflow" berichtet, bei dem die Abtrennung des freien Liganden von dem gebundenen markierten Liganden mit Hilfe einer Mischbett-Trennsäule aus Aktivkohle-Dowex-Harz erreicht wird.

Sämtliche bekannnten vollautomatischen Systeme mit kontinuierlicher Strömung weisen jedoch verschiedene Nachteile bzw. Einschränkungen auf. Das an rote Blutkörperchen gebundene, Antikörper verwendende System ist für einen geringen Durchsatz (10 Proben pro Stunde) nicht geeignet und zeigt eine geringe Empfindlichkeit und eine geringe Präzision. Das die Verwendung von magnetischen Teilchen umfassende System erfordert eine äußerst aufwendige magnetische Abtrennung, die die Vorrichtung kompliziert und teuer macht. Die Verwendung einer Mischbett-Säule zur Trennung der gebundenen von den freien Resten hat auch ihre Beschränkungen, da das System nicht universell dazu verwendet werden kann, in wirksamer Weise sämtliche Arten von antigenem Material zu trennen. Beispielsweise können mit Hilfe einer solchen Säule Immunglobuline und auch hochmolekulare Antigene nicht getrennt werden. Das System ist ebenfalls nicht für den Enzym-immun-Test geeignet, bei dem der Ladungsund Massenunterschied zwischen den gebundenen Resten und den freien Resten sehr gering ist.

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Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, flexibles und vollautomatisches Verfahren zu schaffen, das insbesondere zur Durchführung des Radio-Immun-Tests, des Enzym-Immun-Tests und des Fluoreszens-Immun-Tests geeignet ist.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer Komponente der Reaktion zwischen einem spezifischen Rindeprotein und der entsprechenden bindefähigen Substanz unter Ausnützung der Bindeaffinität dieser Komponenten füreinander in einem automatisierten System mit kontinuierlich fließendem Flüssigkeitsstrom, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß aufeinanderfolgend Mischungen des Probenmaterials mit einer bestimmten Menge einer Komponente der Reaktion in markierter Form und einer weiteren Komponente in an einen unlöslichen, teilchenförmigen oder leicht in unlöslichen, teilchenförmigen Zustand überführbaren, trägergebundener Form in den Flüssigkeitsstrom so eingebracht werden, daß die einzelnen Mischungen separiert bleiben, inkubiert und kontinuierlich in eine Trenneinrichtung eingeführt werden, in welche gegebenenfalls nach vorhergehender Unlöslichmachung des Trägers mindestens ein Teil der flüssigen Phase von der festen Phase abgetrennt und in einer der getrennten Phase die Menge der enthaltenen markierten Komponente gemessen wird.

Im Fall des Radio-Immun-Tests erfolgt die Messung mit einer Zähleinrichtung, in der die Radioaktivität aufeinanderfolgender Mengen der auszumessenden Phase bestimmt wird. Im Fall des Fluoreszenz-Immun-Tests und des Enzym-Immun-Tests werden zum Nachweis und zur Bestimmung ein Fluorimeter und ein Kolorimeter verwendet.

Als spezifisches Bindeprotein kommen im Rahmen der Erfindung Antikörper, Anti-Antikörper, Hormonrezeptoren, andere, zur Hormonbindung befähgite Proteine, wie z. B. das Thyroxin bin-

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dende Globulin TBG, Intrinsic-Faktor und dergleichen, in Betracht.

Unter der entsprechenden bindefähigen Substanz wird eine Verbindung verstanden, die mit dem spezifischen Bindeprotein eine im allgemeinen komplexartige Bindung einzugehen vermag. Typische Beispiele hierfür sind Antigene, Haptene, Steroide, Antikörper und andere, mit einem spezifischen Bindeprotein bindefähige Substanzen.

Wenigstens eine der Komponenten der bindefähigen Substanzen, also das spezifische Bindeprotein oder die damit bindefähige Substanz, wird in markierter Form eingesetzt. Es kann sich dabei sowohl um das spezifische Bindeprotein als auch die entsprechende bindefähige Substanz handeln. Als Markierung kommen z. B. in Frage Einführung von radioaktiven Atomen oder Gruppen, Enzym-, Coenzym- oder Substratmarkierung oder Einführung fluoreszierender bzw. lichtabsorbierender Substanzen. Auch andere Markierungen sind anwendbar, bei denen der Rest durch eine andere physikalische Methode, z. B. Elektronenspinresonanz, angeregt wird.

Typische Beispiele für im Rahmen der Erfindung anwendbare radioaktive Atome sind Jod, Tritium, Schwefel, Selen, Chrom, Kohlenstoff und Phosphor. Häufig als Markierung verwendete Enzyme sind z. B. Peroxidase, Glucoseoxidase, alkalische Phosphatase und ß-Glucosidase. Typische geeignete fluoreszierende Substituenten sind Rhodamin, Fluoreszein-isothiocyanat (FITC) und Umbeliferrylderivate.

Die markierte Komponente der Reaktion (Tracer) kann die gleiche wie die im Verfahren zu bestimmende Substanz sein, also beispielsweise wenn es um die Bestimmung eines Antigens geht, ein markiertes Antigen. Der Tracer kann aber auch eine weitere, mit der zu bestimmenden Komponente bindefähige Substanz sein, beispielsweise ein weiterer markierter Antikörper.

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Als Träger kommen ein unlösliches, teilchenförmiges oder zellförmiges Material, wie z. B. poröses Sephadex, poröse Sepharose, mikrokristalline Zellulose, Latex, Glaskügelchen oder Zellen, wie Erythrozyten, an welches Material der Antikörper oder das Antigen kovalent gebunden ist, in Betracht. Die Sperrigkeit oder das Volumen dieses Trägers beeinträchtigt die Antigen-Antikörper-Reaktion nicht und ermöglicht eine angemessene Trennung der gebundenen Reste von den freien Resten. Alternativ k-ann man poröse teilchenförmige, ionenaustausch fähige Trägermaterialien (wie ein Ionenaustauschergel, Sephadex oder ein Harz) dazu verwenden, die nichtgebundene markierte Komponente, z. B. das Antigen, von dem an die andere spezifische Bindungskomponente, also z. B. den Antikörper gebundenen Teil der markierten Komponente, abzutrennen. Diese Ausführungsform eignet sich für solche Komponenten, die sich wie anionische oder kationische Reste verhalten, wie z. B. manche Haptene. Bei dieser Ausführungsform sind z. B. die Antikörper nicht an einen teilchenförmigen Träger gebunden, sondern werden als solche nach einer geeigneten Verdünnung des Antiserums verwendet.

In der Regel wird im erfindungsgemäßen Verfahren ein von vornherein fester, teilchenförmiger Träger verwendet. Es ist aber auch möglich, einen flüssigen, jedoch präzipitierbaren Träger, vorzugsweise einen reversibel präzipitierbaren Träger zu verwenden. Hier handelt es sich also um Träger, die nicht ständig als Feststoff vorliegen. Beispiele hierfür sind z. B. eine Latex-auf-Polyacrylamidbasis, die in Abhängigkeit vom pH-Wert flüssig oder fest vorliegt. Diese Ausführungsform der Erfindung hat den Vorteil, daß man die eigentliche Iiranunreaktion in homogener flüssiger Phase durchführen kann, vor der Phasentrennung den Träger jedoch in die feste Form überführt, beispielsweise durch pH-Wertveränderung. In der bevorzugten Ausführungsform kann dann anschließend der präzipi tier te Träger reversibel wieder verflüssigt werden, was Vorteile für die Genauigkeit der Meßreaktion hat, falls die-

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jenige Phase der Messung unterworfen wird, in der sich die festen Teile befinden.

Die Präzipitcction des Trägers kann besonders zweckmäßig durch den VerdünnungsmitteIstrom erfolgen, der bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung nach der weiter unten erläuterten Verdünnungszwangsfiltration kurz vor Erreichen der Filtermembran zugeführt wird. Das Verdünnungsmittel kann also beispielsweise aus einer organischen Flüssigkeit, einer Salzlösung oder einer Pufferlösung bestehen, welche die Fällung bewirkt durch Änderung der Ionenkonzentration, des pH-Werts oder dergleichen.

Die Trennung der gebundenen markierten Komponente von der freien markierten Komponente wird vorzugsweise durch Verwendung einer hochporösen Membran erreicht. Man läßt den Flüssigkeitsstrom an einer Seite der Membran vorbeifließen, wobei man ihn stromaufwärts verdünnt, um den Druck zu erhöhen. Man kann auch auf der anderen Seite (Filtratseite) der Membran einen negativen Druck anlegen. Die erste Phase erhält man daher auf dieser Filtratseite, während die zweite, die unlöslichen Anteile enthaltende Phase stromabwärts der Retentatseite erhalten wird. Die Menge und die Art des Verdünnungsmittels und/oder die Menge der durch die Membran filtrierten Flüssigkeit kann beliebig eingestellt werden. Diese Technik wird als durch Verdünnung erzwungene Filtration oder Verdünnungszwangsfiltration bezeichnet.

Obwohl man bei der Anwendung eines Systems mit kontinuierlicher Strömung auf den Immuntest eine Reihe von Problemen erwarten sollte, haben sich diese überraschenderweise nicht in merklichem Ausmaß eingestellt. Zu diesen Problemen gehören die Schwierigkeit der Trennung der gebundenen und der freien markierten Komponente am Ende der Bestimmung, eine unzureichende Inkubationszeit, die verhindert, daß die Reaktion so weit abläuft, daß sich eine zufriedenstellende Präzision und

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Empfindlichkeit ergibt, die Schwierigkeit des Pumpens geringer Mengen an markierter Komponente, da insbesondere eine Neigung dafür besteht, daß in den Leitungen des Systems Adsorptionsverluste auftreten, und Verschleppungsprobleme. Voruntersuchungen haben jedoch gezeigt, daß geringe Mengen von markierter und nichtmarkierter Komponente in einem System mit kontinuierlicher Strömung, beispielsweise unter Anwendung von Luftsegmenten, gepumpt werden können, ohne daß ernsthafte Probleme in bezug, auf Adsorptionsverluste oder eine Verschleppung der Materialien auftreten.

Zur weiteren Erläuterung der Erfindung seien nachstehend einige Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die begefügte Zeichnung beschrieben. In dieser zeigen:

Fig. 1 eine schematische Schnittansicht einer erfindungsgemäßen Trenneinrichtung,

Fig. 2 eine schematische vertikale Schnittansicht eines Radioaktivitätszählkopfs,

Fig. 3 ein Blockdiagramm eines erfindungsgemäßen Radio-Immun-Testsystems,

Fig. 4 ein Blockdiagramm eines erfindungsgemäßen Enzym-Immun-Testsystems und

Fig. 5 eine mit dem System von Fig. 4 erstellte Standard-Kurve.

Das Verfahren verwendet in den Anfangsstufen übliche kontinuierliche Strömungssysteme und Vorrichtungen, die nicht näher erläutert werden. Die Proben der Tracer, also z. B. das markierte Antigen und die in fester Phase vorliegende Komponente, z. B. der Antikörper, werden in genau gemessenen Mengen, die durch die Röhrengröße des Rohrverteilers bestimmt werden, zugeführt. Zwischen den Proben liegt eine Waschflüssigkeit vor, die charakteristisch identifiziert sein kann, beispielsweise

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durch Anfärbung. Dies ist nur von Bedeutung im Fall des Radio-Immun-Tests, nicht jedoch bei anderen Immuntestsystemen, denn man kann die Zähleinrichtung derart steuern, daß sie die zu bestimmende Menge aufgrund dieser charakteristischen Eigenschaft auswählt. Der durch Luftabschnitte in Segmente unterbrochene Strom wird durch eine Rohrschlange mit gesteuerter Temperatur gefördert, wodurch ein gutes Durchmischen der Reagenzien im Verlaufe der Inkubationszeit erreicht wird. Die B. Huber

Inkubationszeit kann 25 Minuten oder weniger betragen. Der Flüssigkeitsstrom wird dann in die Trenneinrichtung überführt, die in der Fig. 1 dargestellt ist. In dieser wird eine Verdünnungszwangsfiltration durchgeführt. Sie umfaßt einen geteilten Block, der vorzugsweise aus durchsichtigem Kunststoffmaterial besteht, der zwischen den Hälften 1 und 2 ein Filter 3 aus einem porösen Material aus Kunststoff, Nylon, Teflon oder einem anderen organischen oder anorganischen synthetischen Material umfaßt. Die Porengröße dieser Membranen soll gleichmäßig und groß (beispielsweise 10,Um), jedoch geringer als die Trägerteilchen oder die Materialien, die dazu verwendet werden, den nichtgebundenen Liganden zu absorbieren, sein. Der Halbblock 1 besitzt eine Einlaßleitung 4 für den segmentförmigen Strom und eine weitere Einlaßleitung 5 für ein Verdünnungsmittel. Diese Leitungen vereinigen sich stromaufwärts einer Trennkammer 6, die durch halbzylindrische gegenüberliegende Ausnehmungen in den Halbblöcken 1 und 2 gebildet und durch die Membran 3 getrennt wird. Am gegenüberliegenden Ende der Kammer 6, stromabwärts der Einlaßleitungen, findet sich in dem Halbblock 1 eine Auslaßleitung 7 mit einstellbarem Querschnitt (nicht gezeigt) und in dem Halbblock 2 eine Auslaßleitung 8. Das Volumen der Flüssigkeits/Luft-Mischung, die an der Auslaßleitung 7 austritt, wird eingestellt und mit der Größe des Unterdrucks in Einklang gebracht, der an die Auslaßleitung 8 angelegt wird.

Während des Betriebs wird der segmentierte Fluidstrom durch

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das Verdünnungsmittel verdünnt, bevor er die Kammer 6 erreicht und in segmentierter Form unter der Membran 3 durchgeführt wird. Der durch die Zugabe des Verdünnungsmittels und die Einschränkung des Ausströmens über die Auslaßleitung 7 geschaffene Druck zwingt überschüssige Flüssigkeit und Teilchen, die kleiner sind als die Porengröße des Filters, durch die Membran hindurch. Die Filtration wird auch durch einen entsprechenden negativen Druck unterstützt, der an der Auslaßöffnung 8 angelegt wird. Die Filtrate, die ungebundenen Tracer, im Beispiel also Antigen, enthalten, können zur Bestimmung des freien Restes verwendet werden, indem man die Radioaktivität im Fall des Radio-Immun-Tests auszählt oder im Fall des Fluoreszenz-Irranun-Tests oder des Enzym-Immun-Tests die Intensität der Fluoreszenz oder einer Veränderlichen der Enzymreaktion, z. B. der Absorption, mißt. Der an die feste Phase gebundene Tracer (Antigen) verbleibt aufgrund seiner großen Teilchengröße (die üblicherweise oberhalb 20 ,um liegt) in dem segmentierten Strom und wird am Auslaß 7 aufgefangen. Das Material kann dann einer Nachweiseinrichtung zugeführt werden, wie der, die weiter unten zur Auszählung der Radioaktivität beschrieben ist.

Es ist in dieser Weise möglich, entweder die gebundenen oder die nichtgebundenen Tracer in Abhängigkeit von dem gewählten Auslaßstrom zu zählen. In jedem Fall kann man die Stärke des negativen Drucks und die Menge des zugeführten Verdünnungsmittels dazu verwenden, das durch die Membran filtrierte Volumen innerhalb sehr enger und genauer Grenzen zu steuern.

Viele der hochporösen Membranen nehmen leicht eine elektrostatische negative Ladung an und behalten diese bei, wodurch der Betrieb der Membran in vielfältiger Weise beeinflußt werden kann. Beispielsweise können Teilchen zurückgehalten werden, die kleiner sind als die Porengröße. Die elektrostatische Ladung kann jedoch dadurch auch nützlich sein, daß sie eine Verstopfung durch größere, in der Flüssigkeit vorhande-

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ne Teilchen sowie durch aus der Luft zugeführte Teilchen in dem System auf einem Minimum hält. Die Intensität der elektrostatischen Ladung hängt von dem pH-Wert ab und kann durch die Verwendung verdünnender Puffer mit dem gewünschten pH-Wert modifiziert werden. Wenn die Membran aus einem leitenden Material besteht, kann man eine äußere Quelle zur Beeinflussung der Ladung verwenden. Das Verdünnungsmittel kann auch eine Lösung sein, die eine spezielle Funktion ausübt. So kann sie beispielsweise eine Substanz, wie Polyvinylalkohol, enthalten, die die Membran beschichtet und in dieser Weise gewünschtenfalls die elektrostatische Ladung vermindert. Als Verdünnungsmittel kann auch eine Flüssigkeit verwendet werden, welche die Präzipitation des Trägers bewirkt, z. B. eine Salzlösung, welche durch Erhöhung der Ionenkonzentration auf den Träger präzipitierend wirkt.

Das Auszählen der Radioaktivität kann in einer Vorrichtung durchgeführt werden, wie sie in Fig. 2 dargestellt ist, die einen üblichen ι -Zählkopf 21 umfaßt, der eine geschlossene Küvette 22 aufnimmt. Diese ist mit einem Einlaßrohr 23, das mit einem elektrischen Fühler 24 zusammenarbeitet und einem Auslaßrohr 25 versehen, an das ein Unterdruck angelegt wird. Das Auslaßrohr 25 ist über Rohr 26 und Ventil 27 mit einer Schlauchpumpe oder einer anderen Saugvorrichtung verbunden, wobei das Ventil 27 von dem Fühler 24 und einer (nicht dargestellten) Zeitmeßeinrichtung gesteuert wird.

Der Fühler 24 spricht auf die Eigenschaften der Waschflüssigkeiten, beispielsweise deren Farbe, an, wobei bei Erkennen dieser charakteristischen Eigenschaft das Ventil 27 geschlossen, die Küvette gefüllt wird, worauf das Zählen beginnt. Nach Ablauf einer vorherbestimmten Zeitdauer wird der Zähler angehalten und auf Null gestellt, währenddem das Ventil 27 geöffnet und die Küvette über den Unterdruck entfernt wird, der ständig an dem Auslaß 25 angelegt wird. Das Zählergeb-

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nis kann ausgedruckt csder in anderer Weise aufgezeichnet oder angezeigt werden. Von Bedeutung ist, daß die Zählmethode auf einem neuen Konzept beruht, nämlich einer "Simultan-Zufuhr-Zählung". Voruntersuchungen zeigten, daß die Beziehhung zwischen der Zahl der Zählimpulse und der Zeit einer Kurve folgt, die durch eine quadratische Gleichung wiedergegeben werden kann. Diese Zählmethode kann vorteilhaft sein, da bei der Anwendung eines Minicomputers starke Unregelmäßigkeit innerhalb eines Probensegments zu deutlichen Abweichungen von einer errechneten Kurve führen können. Dies kann festgestellt werden und man kann Fehler ermitteln.

Bezugnehmend auf die Fig. 3 sei das weiterentwickelte grundlegende System anhand einer Antigen-Bestimmung beispielsweise weiter erläutert. In diesem Fall werden die Reagenzien, die das Antigen in Serum oder Urin enthalten, wie oben beschrieben, über die auf konstanter Temperatur gehaltenen Schlangen 31 in einem durch Luftabschnitte unterteilten Strom der in der Fig. 1 dargestellten Trenneinrichtung 32 zugeführt, in der die Verdünnungszwangsfiltration abläuft. Hierdruch wird das an die feste Phase gebundene Antigen von dem freien und nichtgebundenen Antigen sowie den anderen Serumbestandteilen getrennt. Die letzteren werden verworfen, während der segmentförmige Strom sich mit einem anderen spezifischen Antikörper

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(der gegen das gleiche Antigen wirkt), jedoch mit J markiert ist, vermischt. Es ergibt sich eine zweite Antikörperreaktion während des Hindurchlaufens durch eine weitere, auf konstanter Temperatur gehaltene Schlange 33, was zur Bildung eines markierten Komplexes in fester Phase führt, indem das Antigen zwischen zwei Antikörpern vorliegt, von welchen einer an die feste Phase gebunden ist (immobilisierter Antikörper) und der andere markiert ist. Nach dieser Reaktion wird der an die feste Phase gebundene Komplex in einer zweiten Trenneinrichtung 34 von dem markierten freien Antikörper getrennt. Die freie Fraktion wird dann ausgezählt und die gebundene Fraktion wird verworfen oder umgekehrt.

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Die Erfindung kann auch dazu verwendet werden, einen üblichen Radio-Immun-Test zu automatisieren (d. h. einen Test, bei dem der Antikörper als solcher verwendet wird, ohne daß er verändert wird, beispielsweise an eine feste Phase gebunden) . Die Automatisierung dieses Tests wird dadurch erreicht, daß man den segmentförmigen Strom, der das inkubierte Analysenmaterial enthält (z. B. den Antikörper, das markierte (Tracer) und das nichtmarkierte Antigen) mit einem teilchenförmigen Material vermischt, das dazu in der Lage ist, sich entweder mit den freien oder den gebundenen Komponenten zu verbinden. Ein Beispiel für ein Material der ersteren Art ist ein poröses Ionenaustauschergel oder -harz, das dazu geeignet ist, anionische oder kationische Teilchen aufzufangen, während ein Beispiel für ein Material der letzteren Art ein zweiter Antikörper ist, der kovalent an eine poröse Gelmatrix, wie Sephadex oder Sepharose, gebunden ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch dazu geeignet, die Bestimmung von Steroiden und Arzneimitteln bzw. Drogen, bei denen keine Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel erforderlich ist, zu automatisieren. Das Verfahren ist ferner zum Automatisieren von anderen Untersuchungsmethoden als Immuntest geeignet. Beispielsweise umfaßt die Bestimmung des gesamten Eisenbindungsvermögens die Zugabe von überschüssigem Eisensalz, um das Trägerprotein Transferrin zu sättigen. Die Abtrennung des überschüssigen Eisens kann in einem Strömungssystem erfolgen, indem man es mit einem porösen Kationenaustauscher vermischt und anschließend die Verdünnungszwangsfiltration durchführt. In dem Filtrat kann man dann das Eisen mit Hilfe üblicher Methoden bestimmen.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß das beschriebene Verfahren dazu geeignet ist, den Radio- Immun-Test, den Enzym-Immun-Test oder den Fluoreszenz-Immun-Test und auch andere Bestimmungsmethoden, bei denen teilchenförmige Materialien

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wie ein poröses Gel oder Harz als analytisches Reagenz verwendet wird, zu automatisieren. Zur Erzielung bester Ergebnisse sollten die Teilchen eine abriebfeste Matrix umfassen, die sphärisch geformt ist und eine gleichmäßige Teilchengröße aufweist.

Beispiel 1

Automatische Thyroxinbestimmung unter Verwendung einer Anordnung nach Fig. 3

Einschalten des Zählers und des Interface

1. Membranwechsel

2. Pumpen des Puffers zur Erzielung eines guten Blasenmusters durch den Filter - wichtig!

3. Pumpen der Markierung zur Bestimmung der Gesamtzählrate (die 20 bis 25000 betragen sollte)

4. Zugabe von AB und Pumpen des Farbstoffs durch die Probenleitung

5. Wenn der Farbstoff auftritt Prüfen der Bindung durch Aktivieren des Zählers - Einstellen des Niveaus.

6. Beginn der Probennahme

Probenplatte = 5 χ ¹O¹

Standardkurve

2 Kontrollseren bei 39 und 40 8 Proben
2 Kontrollseren
etc.

7. Berechnen in üblicher Weise
Reagenzien

1. (AB (unlöslicher Antikörper)

Man verdünnt 10 ml Sepharose T4 auf 100 ml mit Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 8,5

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2. Markierung 1,0 ml (1O/Ul)

40 ml Tris-Puffer 4 ml 5 % Albumin 250 mg A.N.S.

3. Waschlösung 1,8 % NaCl + 1 ml Brij/1

zur Verwendung durch einen I.um-Filter filtrieren

4. Farbstoff 15 % Rinderalbumin - 100 ml + 8 ml grüner Farb

stoff

5. Tris-Puffer 12 g/l Tris-Puffer mit HCl auf einen pH-Wert

von 8,5 eingestellt. Man gibt 2,5 g Azid zu und filtriert vor der Verwendung durch ein 1 .um-Filter.

Standardlösungen

Standardlösung T4 ¹A¹: 57,21 mg reines T4 in 6 ml 0,1n NaOH-Auffüllen mit absolutem Äthanol auf 50 ml und Tiefgefrieren.

Standardlösung T4 ¹B¹: Man verdünnt 0,1 ml der Standardlösung A mit 1,9 ml Tris-Puffer, der 0,5 % Albumin enthält und bewirkt das Tiefgefrieren.

Arbeitsstandardlösung: 19,9 ml 5 %-iges Rinderalbumin +0,1 ml der Standardlösung B = 325 nMol/1. Doppelverdünnung mit 5 % Humanalbumin (das mit Harz behandelt worden ist) unter Bildung von 163,82, 41,20 und 10 nMol/1.

6. Antikörper: Man bindet 1 ml Beneden T4-Antikörper an 5 g Sepharose, verdünnt mit Tris-Puffer auf 100 ml, gibt 0,1 g Azid durch und bewirkt das Tiefgefrieren von aliquoten Anteilen von jeweils 10 ml.

Einstellungen:
Probenzeit: 75 Sekunden Verzögerung: 5 Sekunden Aufzeichnung: 2 V

Waschzeit: 15 Sekunden Zählung: 55 Sekunden

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Beispiel 2

Automatisierte Thyroxin-(T4-)Bestimmung mittels Enzym-Immun-Test.

Vorbereitungen wie beim Radio-Immun-Test von Beispiel 1.

I. Reagenzien;

1. T4-Antikörper

Wurde nach Vorschrift des Herstellers (Pharmacia) kovalent an BrCN-aktivierte Sepharose gebunden und mittels Magnetrührer in 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH = 8,5, mit 0,1 % Brij suspendiert.

2. Tracer

T4 wurde mit Peroxidase (EC 1.11.1.7, Boehringer Mannheim, Kat.-Nr.: 15629) markiert und mit Tris-HCl-Puffer, pH = 8,5, mit 0,5 % Albumin, 250 mg A.N.S. (8-Anilinonaphthalin-sulfonsäure-d) ammoniumsalz) und 0,1 % Brij auf ein Endvolumen von 50 ml verdünnt.

3. Verdünnungsmittel

0,2 M Phosphatpuffer, pH = 8,0, mit 0,1 % Brij.

4. Enzymreaktionsgemisch

0,1 M Phosphat-Puffer, pH = 8,0, mit 11 mM 2,4-Dichlorphenol, 1,2 mM 4-Aminophenazon und 1,5 mM Na-Perborat.

5. Waschlösung:

1,8 % NaCl mit 0,1 % Brij.

II. Durchführung;

1. Spülen mit Waschlösung und Einstellen eines konstanten Blasendurchsatzes durch den Separator.

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2. Dosieren des Tracers, Zugabe des Enzymreaktionsgemisches, Abgleichen des Photometers und Einstellen des Schreibers: Bestimmung der Gesamtaktivität des Tracers.

3. Zugabe des T4-Antikörpers, überprüfen der Tracer-Bindung, neuerliches Abgleichen des Photometers und des Schreibers.

4. Beginn der Probennahme
Probenteller 5 ml 'O'-Standard (=C )

S t an da rdkurve
2 Kontrollseren
8 Proben
2 Kontrollseren
8 Proben etc.

5. Auswertung der Ergebnisse in üblicher Weise nach Schreiberdi agamm.

In analoger Weise k,ann bei Ersatz der Enzym-Markierung durch Fluoreszens-Markierung und Verwendung eines Fluorimeters der FIA-Test durchgeführt werden, z. B. unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Spektralfluorimeters, Mod. 1000 oder eines Kontron-Spektralfluorimeters S FM 22.

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Leerseite

Claims (15)

1. Patentansprüche

   Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung einer Komponente der Reaktion zwischen einem spezifischen Bindeprotein und der entsprechenden bindefähigen Substanz unter Ausnützung der Bindeaffinität dieser Komponenten füreinander in einem automatisierten System mit kontinuierlich fließendem Flüssigkeitsstrom, dadurch gekennzeichnet, daß aufeinanderfolgend Mischungen des Probenmaterials mit einer bestimmten Menge einer Komponente der Reaktion in markierter Form und einer weiteren Komponente in an einen unlöslichen teilchenförmigen oder leicht in unlöslichen teilchenförmigen Zustand überführbaren Träger gebundenen Form in den Flüssigkeitsstrom so eingebracht werden, daß die einzelnen Mischungen separiert bleiben, inkubiert und kontinuierlich in eine Trenneinrichtung eingeführt werden, in welche gegebenenfalls nach vorhergehender Unlöslichmachung des Trägers mindestens ein Teil der flüssigen Phase von der festen Phase abgetrennt und in einer der getrennten Phasen die Menge der enthaltenen markierten Komponente gemessen wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung der Phasen durch Filtrieren erfolgt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Druck im kontinuierlich fließenden Flüssigkeitsstrom vor Erreichen der Filtermembran durch Einleiten eines weiteren Flüssigkeitsstroms erhöht wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Druck auf der Filtratseite der Filtermembran erniedrigt wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Separierung der Probenmischungen ein durch Gasblasen

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   ORIGINAL INSPECTED

   segmentierter, kontinuierlich fließender Flüssigkeitsstrom verwendet wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Separierung der Probenmischungen der kontinuierlich fließende Flüssigkeitsstrom durch eine damit im wesentlichen unmischbare Flüssigkeit segmentiert wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

   daß die Probenmischungen blockartig ohne wesentliche Änderung der Strömungsgeschwindigkeit in den kontinuierlich fließenden Flüssigkeitsstrom eingeführt werden.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine radioaktiv oder durch ein Enzym oder einen fluoreszierenden Rest markierte Komponente verwendet wird.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Bindeprotein ein Antikörper bzw. Antiantikörper oder Hormonrezeptor und die entsprechende bindefähige Substanz ein Antigen, Hapten bzw. Antikörper oder ein Hormon ist.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein präzipitierbarer löslicher Träger verwendet wird.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß ein reversibel präzipitierbarer Träger verwendet wird.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 3 und 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Präzipitation durch den weiteren, vor der Filtermembran zugeführten Flüssigkeitsstrom erfolgt.

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13. 13. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 12, gekennzeichnet durch eine Trenneinrichtung zur Abtrennung wenigstens eines Teils der flüssigen Phase von der festen Phase und eine Meßvorrichtung für eine der getrennten Phasen.
14. 14. Vorrichtung nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch einen geteilten Block mit zwei Hälften (1 und 2), die ein Filter (3) einschließen, eine Einlaßleitung (4) für den Probenstrom, eine Einlaßleitung (5) für Verdünnungsmittel, die sich stromaufwärts einer Trennkammer (6) vereinigen und eine Auslaßleitung (7) in der Blockhälfte (1), sich gegenüberliegende Ausnehmungen in den Blockhälften (1, 2), welche die Trennkammer (6) bilden und eine Auslaßleitung (8) in der Blockhälfte (2).
15. 15. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßvorrichtung einen Zählkopf (21) erhält, in dem eine geschlossene Küvette (22) angeordnet ist, welche eine Einlaßrohr (23) mit einem Fühler (24) und ein Auslaßrohr (25), welches über Leitung (26) und Ventil (27), das vom Filter (24) gesteuert wird, mit einer Saugvorrichtung verbunden ist, aufweist.

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