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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur qualitativen und
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insbesondere zur quantitativen Bestimmung immunologischer Reaktionspartner
und eine Vorrichtung zu dessen Ausführung.
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Bei immunologischen Analysenverfahren mit einem trägergebundenen Reaktionspartner
bindet sich ein gesuchtes Antigen oder ein Antikörper immunologisch spezifisch an
einen trägergebundenen Antikörper bzw. an ein trägergebundenes Antigen. Dort kann
das gesuchte Antigen oder der gesuchte Antikörper mit einem ein Markierungsmerkmal
tragenden, spzifisch gegen den gesuchten Partner gerichteten Antikörper nachgewiesen
werden. Als Träger werden in der Regel die Innenflächen von Reagenzröhrchen oder
Kügelchen benutzt.
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Sie können aus verschiedenen Materialien. z.B. aus Glas, Kunststoff
oder vernetzten Kohlenhydraten, bestehen. Als Markierungsmerkmal dienen beisp-elsweise
Isotope, Enzyme oder fluoreszierende Substanzen. Enzyme und fluoreszierende Substanzen
haben gegenüber Isotopen den Vorteil, daß keine Strahlenexposition auftritt und
daß die Meßgeräte zum Nachweis einer Enzymreaktion oder einer fluoreszierenden Strahlung
wesentlich weniger Investitionsaufwand benötigen. Bei fluoreszierenden Substanzen
als Markierungsmerkmal ist unmittelbar nach Abschluß der immunologischen Reaktion
die Messung der Fluoreszenzintensität als Parameter für die Menge gebundenen Materials
und damit auch als Parameter für die Menge des gesuchten Antigens, bzw. des gesuchten
Antikörpers möglich. Bei Enzymen als Markierungsmerkmal sind nach tschluß der immunologischcn
Reaktion noch chemische Reaktionen zum Nachweis des Enzyms anzuschließen. Mit Hilfe
von fluoreszierenden Substanzen als Markierungsmittel von Reaktionspartnern einer
immunologischen Reaktion und mit Hilfe von korrespondierenden Reaktionspartnern,
die an einen Träger gebunden sind, läßt sich somit eine schnell durchzuführende
Nachweismethode für einen gesuchten imslunologischen Reaktionspartner ("Fluoroimmunoassay")
aufbauen.
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Insbesondere im Hinblick auf eine zu fordernde Empfindlichkeit von
Systemen mit trägergebundenen Reaktionspartnern zeigten sich diejenigen mit an sphärische
Partikel gegebundenen Antigenen weniger befriedigend. Man hat deshalb versucht,
ebene Trägermaterialien aus Kunststoff mit ausgewähltem Adsorptionsverhalten zur
Bestimmung von adsorkierten Reaktionspartner zu verwenden. Da Kunststoffe hinsichtlich
der Adsorption in der Regel keine hohe Spezifität aufweisen, ist diese Methode ebenfalls
mit Mängeln behaftet.
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Es war daher die Aufgabe gestellt, ein einfaches, schnelles, hochspezifisches
Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Reaktionspartnern auszuarbeiten und
Vorrichtungen für die Durchführung der immunologischen Analyse herzustellen.
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Dabei wurde gefunden, daß Träger mit claner Oberfläche, die homogen
mit dem immunologischen Reaktionspartner (Antigen oder Antikörper) beschichtet sind,
den Forderungen, die genannten Nachteile der bekannten Methoden zu vermeiden, genügen.
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Gegenstand der Erfindung ist demnach ein immunologisches Analysenverfahren
mit einem trägergebundenen immunologischen Reaktionspartner, dadurch gekennzeichnet,
daß ein hinsichtlich der Reaktion indifferenter wasserunlöslicher Träger, welcher
eine mit einem ersten immunologischen Reaktionspartner beschichtete, plane Oberfläche
besitzt, mit einer einem zweiten Reaktionspartner enthaltenden Lösung in Kontakt
gebracht wird, nach einer ausreichenden Reaktionszeit der Kontakt aufgehoben und
der die Reaktionspartner tragende Träger mit einem dritten, ein Markierungsmittel
tragenden Reaktionspartner in Kontakt gebracht wird, dessen immunologische Spezifität
gegen den zweiten Reaktionspartner gerichtet ist, wonach die Menge des gebundenen
Markierungsmittels nachgewiesen bzw. bestimmt wird.
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Eine plane oder ebene Fläche im Sinne der Erfindung ist eine Fläcne,
die in einem gegebenen optischen Linsensystem der Brennebene entspricht.
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Besondere Vorteile zeigt das Verfahren bei der Verwendung eines fluoreszierenden
Markierungsmittels und eines Trägers, welcher für die mikroskopische Beobachtung
des Reaktionsergebnisses geeignet ist. Als Träger im Sinne der Erfindung kommen
deshalb vor allem planparallele Formkörper aus anorganischem oder organischem Material
in Betracht, vorzugsweise synthetische Polymere, die durch Gieß-, Extrusions-oder
Spritzgußverfahren herstelltbar sind. Anorganische Polymere wie Glas; organische
Homo- und Copolymere von Vinylverbindungen wie Olefinen, Vinylacetat, Vinylchlorid,
Vinylidenchlorid, Tetrafluoräthylen, Styrol, Acrylaten, Methacrylaten, Formaldehyd
und/oder cyclischen Acetalen und auch Polykondensate wie Polyester, Polycarbonate
oder Polyamide finden im Sinne der Erfindung Verwendung.
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Im Hinblick auf ihre Eignung in Fluoreszenz-Testsystemen werden vorzugsweise
Homo- und Copolymere verwendet, die keine Eigenfluoreszenz besitzen und dadurch
die Empfindlichkeit des Analysenverfahrens wesentlich erhöhen. Besonders vorteilhaft
erweisen sich Homo- und Copolymere von MeWhylmethacrylat.
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Die Bindung der auf dem Träger zu fixierenden immunologischen Partner
kann sowohl adhäsiv als auch kovalent erfolgen.
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Bevorzugt wird die kovalente Bindung, da hierbei die Stabilität des
trägergebundenen Reaktionspartners wesentlich größer ist. Als mögliche kovalente
Bindungsarten kommen die in der Literatur beschriebene in Betracht, beispielsweise
diejenigen, die von H.D. Orth und W. Brümmer in Angew. Chem. 84 (1972), Seite 319
- 330 und von J.H.Silman, E. Katchalski in Am. Rev. Biochem. 35 (1966), Seite 873
ff, aufgeführt sind.
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Zur kovalenten Bindung des Proteins an Homo- und Copolymerisate des
Methylmethacrylats wird vorzugsweise die sogenannte Azidmethode verwendet. Als Träger
werden Spritzgußplatten oder Folien, insbesondere Folgen von 10 - 100 ß Dicke bevorzugt.
Diese Formkörper werden unter Erhalt ihrer Form mit Hydrazinhydrat umgesetzt und
das sich bildende Säurehydrazid wird mit Natr:iumnitrit in das Säureazid überführt.
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In einer alkalischen Lösung wird sodann ein Protein, das den immnologische
Reaktionspartner darstellt, bei Raumtemperatur kovalent an die Oberfläche des Trägers
gebunden.
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Zur Herstellung einer adhäsiven Bindung wird der Träger in die Lösung
des Reaktionspartner eingetaucnt oder mit dieser überschichtet. Durch Adhäsionskräfte
wird hierbei der Träger von einer Schicht des Reaktionspartners überzonen.
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Als immunologische Reaktionspartner, welche auf den Träger aufgebracht
werden, kommen allgemein Antigene oder Antikörperwnfrage z.B.Nukleotide, Proteine,
G3ykoproteine, Lipoproteire, Glykolipide. Diese können aus Gewebsnaterial oder Blut
unterschiedlicher Tierarten, aus Bakterien, Pilzen oder Viren isoliert worden sein.
Antikörper können durch Verabreichung derartiger Stoffe an Tiere gebildet werden
oder spontan in Körperflüssigkeiten von Tieren auftreten. Sie reagieren spezifisch
mit den cben aufgeführten Stoffen beipielsweisc mit Substanzen wie DNA, Aktin, Histon,
Immunglobulinen.
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Diese ersten immunologischen Reaktionspartner sind zur Bestinmlung
von Stoffen geeignet, die in der Regel oSer im Krankheitsfall in Körperflüssigkeiten
vorkommen. Die zweiten Reaktionspartner sind im wesentlichen Bestandteile des Blutplasma
oder anderer Körperflüssigkeiten oder in ihnen vorkommende Mikroorganismen, hieraus
entstandene Antigene oder ihre Stoffwechselprodukte.
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Es liegt im Sinne der Erfindung, daß ein dritter immunologischer Reaktionspartner
zum Einsatz kommt, welcher gegen den zu analysierenden zweiten Reaktionspartner
gerichtet ist und mit einem Markierungsmittel versehen ist. Als dritter Reaktionspartner
kommen vorzugsweise gegen das zu bestimmende immunologisch reaktive Material gerichtete
spezifische Antikörper infrage.Es sind dies im Hinblick auf die beispielshaft aufgeführten
zu bestimmenden Substanzen folgende Antikörper bzw. Antlserum-Präparationen: Native
Antikörper, z.B. Präparationen gegen menschliche Ininunglobuline oder gegen andere
Serumproteine, Antikörper gegen Mikroorganismen, Antigen oder Stoffwechselprodukte
von Mikroorganismen, desweiteren Spaltprodukte von Antikörpern, welche mit dem zu
analysierenden Partner eine Verbindung eingehen, wie F (ab)1- oder F(ab)2-Spaltprodukte
der Immunglobulinmoleküle.
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Derartige Antikörper werden von Wirbeltieren, vorzugsweise von hierfür
üblicherweise verwendeten Versuchstieren wie Kaninchen, Ziege, Hammel, Rind oder
Pferd, durch Immunisierung mit dem betreffenden Antigen und Gewinnung des Blutserums
gewonnen.
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Wie bereits eingangs erwähnt, ist der zuletzt in die Reaktion eingeführte
dritte Reaktionspartner m4t einem Flarkierungsmittel zu dessen Nachweis und/oder
zu dessen Bestimmung versehen. Für die radioaktive Markierung kommen beispielsweise
die in folgender Arbeit erwähnten Verfahren infrage: W.M. Hunter, British Medical
Bulletin, Band 30, Seite 18 - 23 (1974) "Pre2aration and assessment of radioactive
tracers". Für die Enzymmarkierung können beispielsweise die in folgender Arbeit
erwähnten Verfahren zur Anwendung gelangen: G.B.Wisdom, Clin. Chemistry, Band 22,
Heft 8, Seite 243 (1976) "Enzymimmunoassay".
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Für die Markierung mit fluoreszierenden Substanzen werden Verfahren
beschrieben von W. Page Faulk, H. Hijmans, Progr. Allergy, Vol. 16 Seite 9 - 39
(1972) und von G. Wick, S. Baudner, F. Herzog, Immunfluoreszenz, Medizinische Yerlagsgesellschaft,
Marburg/Lahn, Seite 44-46, (1976). Von den zahlreichen für die Fluoroimmunoassays
bekannten fluoreszierenden Substanzen werden bevorzugt im Sinne der Erfindung eingesetzt
Pluorescein-isothiocyanat (FITC) und Tet ramethyl rhodamin- i sothiocyana t (TRITC>.
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Neben den beschriebenen Verfahren ist im besonderen Gegenstand der
vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zur Ausführung des Verfahrens. Sie ist gekennzeichnet
durch einen hinsichtlich der Reaktion indifferenten wasserunlöslichen Träger mit
einer planen Oberfläche, welche mit einem immunologischen Reaktionspartner beschichtet
ist.
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Geeignete Träger sind oben beschrieben, bevorzugt werden Homo- und
Copolymere von Methylmethacrylat. Diese Homo-und Copolymeren, die auf Grund,ihrer
niedrigen Eigenfluoreszenz für Fluoreszenz-Immuno-Analysen besonders geeignet sind,
haben folgende Strukturbausteine:
Diese Elemente können allein oder gemeinsam mit den Strukturelementen eines oder
mehrerer zur Copolymerisation mit Methylmethacrylat geeigneter Monomere wie Acrylnitril,
Styrol
Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Vinyläthern, Acrylaten oder
Methacrylaten sowie Acrylsäure oder Methacrylsäure das Trägermaterial aufbauen.
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Die Träger werden nach bekannten Polymerisationsverfahren, z.B. durch
radikalische oder ionische Polymerisation hergestellt und in bekannter Weise, z.B.
mittels Extrusion oder Spritzguß, verarbeitet.
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Unter Berücksichtigung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur analytischen
Bestimmung immunologischer Reaktionspartner ist es zweckmäßig, die beanspruchte
Vorrichtung und die übrigen Reagenzien, insbesondere das zum Nachweis und zur Bestimmung
des zweiten Reaktionspartners notwendige mit dem Markierungsmittel versehenen Reagenz
(dritter Reakeqor partner), in einem Testsystem zusammenzufassen. Ein derartiges
Testsystem, welches aus einer oder mehreren der beanspruchten Vorrichtungen und
in einer gemeinsam äußere Verpackung das mit dem Markierungsmittel versehene Reagenz
enthält, ist ebenso wie dessen Verwendung zum Gegenstand der Erfindung zu zählen.
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Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele näher erläutert:
Beispiel
1 1. Aktivierung einer Folie aus Polvmethylmethacrylat Eine 50 µ dicke Folie (80
x 250 mm> aus Polyrnethylmethacrylat (pMZ1A) wird 15 Minuten bei 90°C mit Hydrazinhydrat
im Überschuß behandelt, in Methanol mit 28 Essigsäure gespült und anschließend mit
Wasser gewaschen.
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Die Folie wird in einer Lösung von 1 000 ml Eiswasser und 500 ml
l-molarer Salzsäure mit 120 ml l-molarer Natriumnitrit-Lösung vcrsetzt. Nach 15
Minuten wird die Folie mit Eiswasser neutralgewaschen und lyophilisiert.
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Kovalente Bindung zwischen Folie und immunologischem Reaktionspartner
An die so aktivierte Polymethylmethacrylat-Fclie wird Human-IgG durch Eintauchen
in eine 1%ige Lösung des Proteins in phosphatgepufferter Xochsalzlösung pH 8,3 (PBS
8,) für 24 Stunden bei 40C gebu:iden.Anschließend wird die Folie aus der Lösung
herausgenommen, dreimal mit der gepufferten Kochsalzlösung gewaschen. Nach der Trocknung
bei Raumtemperatur steht die Folie zur immunologischen Bestimmung eines gegen IG-gerichteten
Antikörpers zur Verfügung.
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Bestimmung des Anti-Igd Die Folie wird 2 Stunden lang bei 200C in
mehrere Verdünnungen von Anti-Human-IgG von der Ziege, ausgehend von einer 1 %igen
Lösung, gehalten.
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Überschüssiges Anti-Human-lgG wird durch dreimaliges Waschen mit
PBS 7,0 entfernt. Danach wird die Folie für 2 Stunden bei 200C mit einer Lösung
(0,34% g/v an Eiweiß)
eines Anti-Ziegen-Serums von Kaninchen, welches
mit Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) konjugiert wurde, in Kontakt gebracht. Nach
dieser Inkubationszeit werden die Folien mehrfach mit PBS bzw. mit destilliertem
Wasser gespült. Die Auswertung erfolgt quantitativ durch Bestimmung der Fluoreszenzstärke
mit einem entsprechenden Mikroskop (AXIOFAT der Firma ZEISS).
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Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 wiedergegeben:
Ta b e 1 1 e 1: m = Mittelwert s = Standardabweichung im Vergleich zu einem Standard-Uranylactet
A-H IgG IgG m s m s 1 : 1 163,5 10,7 140,9 7,3 1 : 10 159,3 10,8 121,0 5,4 1 : 100
143,7 5,8 108,0 4,7 1 : 1000 123,9 7,8 101,4 2,9 1 : 10 000 108,6 3,2 103,0 2,9
Es konnte somit gezeigt werden, daß Antikörper gegen humanes Immunglobulin G im
Ziegengammaglobulin bis zu einer Empfindlichkeit von 10 - 100 nanog/ml (Verdünnung
1 : 10 000) nachgewiesen werden konnte.
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Beispiel 2 Adhäsive windung zwischen Träger und immunoligischen Reaktionspartner
In Aceton entfettete Glasobjekttragcr werden bei 200C mit einer 1%gen Human-Gamçma-Globulinlöbung,
welche 2t Rinder-Serurn-Albumin enthält, überschichtet. Die Proteine wurden in phosphatgepufferter
Kochsalzlösung vom pH-Wert 8,0 gelöst.
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Nach 24 Stunden werden die beschichteten Objektträger mit phosphatgepufferter
Kochsalzlösung vom pH 7,0 dreimal gewaschen und danach gefriergetrocknet. Nach der
Trocknung steht der Objektträger für die immunologische Bestimmung eines gegen Human-Gammaglobulin
gerichteten Antikörpers zur Verfügung.
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Bestimmung des Anti-Human-Gammaglobulins An vorher markierten Stellen
des mit dem Human-Gammaglobulin beschichteten Objektträgers werden verschiedene
Verdünnungen von Anti-Human-Immunglobulin vom Kaninchen und als Kontrolle normales
Kaninchen-Immunglobulin, beide :nit Flucreszienisothiocyanat (FITC) konjugiert,
aufgetragen und 30 Minuten bei 200C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der inkubierten
Objektträger mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH 7,0 wird der Objektträger
mit Anti-Kaninchen-Gammaglobulin von der Ziege ebenfalls mit FITC konjuqiert, in
einer Verdünnung von 1 : 40 überschichtet und nochmals' 30 Minuten bei 200C inkubiert.
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Nach erneutem Waschen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH
7,0 werden die Objektträger an der Luft getrocknet, in einem mikroskopischen Gerät
für die quantitative Immunfluoreszenz (AXIOSET der Firma ZEISS) wird die Fluoreszenzstärke
in einem festgelegten Ausschnitt bestimmt. Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle
festgehalten: Tabelle 2 Es sind Mittelwerte (m) und Standardabweichungen (s) der
Fluoreszenz im Vergleich zu einem Standard-Uranylacetat wiedergegeben.
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Anti-H IgG Kan.-IgG a m+s 1 : 1 16,3 2,7 19,4 1,6 1 : 10 28,9 1,8
14,3 1,2 1 :-100 21,3 1,9 13,0 0,8 1 : 1000 14,7 0,5 13,8 0,8 1 : 10 000 13,4 0,5
12,6 0,5 leerwert 10,5 + 0,5 Es konnte somit die Nachweismöglichkeit von spezifischen
Antikörpern gegenüber Human-Immunglobulin im Kaninchen-Garmaglobulin gezeigt werden.
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Beispel 3 Adhäsive Bindung eines immunologischen Reaktionspartners
und eier Folie aus Polymethylmetbacrylat ~~~~~ Eine Polymethylmethacrylat-Folie,
wie in Beispiel 1 verwendet, wird für 24 Stunden bei 4 0C in eine 1 %igen Lösung
von Desoxyribonucleinsäure in Trishydroxymethylamino:nethangepufferter Kochsalzlösung
gestellt.Danach wird die Folie dreimal mit dem genannten Puffer gewaschen und bei
Raumtemperatur getrocknet.
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Bestimmung von Desoxyribonucleinsäure-Antikörpern Die mit DNA beschichtete
Folie wird für drei Stunden bei 200C mit einem Anti-DNA -Serum vom. Waschen in Kontakt
gebracht. Als Kontrolle dient Kaninchen-Normalserum. Nach der Inkubation wird dreimal
mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,0, gewaschen. AnschlieSend erfolgt
eine Inkubation mit einem Fluoreszienisothiocyanat-markierten Anti-Kaninchen-Gammaglobulin
von der Ziege in einer Verdünnung von 1 : 20 während 30 Minuten bei 200C. Im Anschluß
daran wird die Folie dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung vom pH 7,0 und
einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und danach getrocknet. In einem mikroskopischen
Gerät für die quantitative Immunfluoreszenz (AXIOMAT der Firma ZEISS) wird die Fluoreszenzstärke
in einem Ausschnitt der Folie bestimmt.
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Das Ergebnis ist in der Tabelle 3 dargestellt. Es zeigt den Fluoreszenzwert
(m) mit der zugehörigen Standardabweichung (s) im Vergleich zu einem Standard Uranylacetat:
T a b e 1 1 e 3: m s Anti-DNA 58,4 3,6 Kan.-NS 37,6 1,4 Leerwert 30,4 1,6