DE2732437A1 - Wasserunloesliches haptoglobinpraeparat und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Wasserunloesliches haptoglobinpraeparat und verfahren zu seiner herstellung

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Description

VOSSIUS · V O Γι 5 I U S · HILTL PATENTANWALT tr
• IEBERTSTRASSE 4 ■ 8OOO MÜNCHEN θβ ■ PHONE: (Οββ) 47 4O70 O "7 O O / O Π
CABLE: BENZOLPATENT MÜNCHEN · TELEX β-2β4β3 VOPAT D / / θ/Η J /
Λ-
u.Z.: M 273 Case: A 2275-02
THE GRSEN CROSS CORPORATION Osaka, Japan
""Wasserunlösliches Haptoglobinpraparat und Verfahren zu seiner Herstellung"
Haptoglobin (nachstehend auch mit Hp bezeichnet) ist ein Blutplasmaprotein mit einem Molekulargewicht von 86 000 bis 400 000. 2s epieIt im Stoffwechsel von im Blut freigesetztem Hämoglobin eine wichtige Rolle. Bei übermäßiger Freisetzung ▼on Hämoglobin (nachstehend mit Hb bezeichnet) im Blut wird dieses durch die Nierentubuli in den Urin ausgeschieden, was nicht nur einen Eisenverlust sondern auch Störungen der Nie· rentubuli hervorruft. Haptoglobin spielt eine wichtige Rolle bei der EisenrUckgewinnung und bei der Verhinderung der Störung der Nierenfunktion, da es in vivo eine selektive und feste Bindung des Hämoglobins bewirkt und Hämoglobin-Haptoglobin-Komplexe bildet, die leicht vornehmlich durch die Leberparenchymzellen aufgenommen und dort verstoffwech eelt werden.
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Die sogenannte Hämolyse, d.h. die Freisetzung von Hämoglobin, wirft heutzutage große Probleme auf. Hämolyse wird beispielsweise durch Transfusion von unverträglichem Blut, schwere Verbrennungen, Herzoperationen und hämolytische Erkrankungen hervorgerufen. Dabei leidet der Patient häufig gleichzeitig an Nierenstörungen, die zu einer lebensbedrohenden Niereninsuffizienz führen können.
Der Verwendung von Haptoglobin bei derartigen, auf Hämolyse zurückzuführenden Nierenstörungen wurde bereits besondere Aufmerksamkeit zugewandt. Es wurde ein Verfahren zur Herstellung von hochgereinigten Haptoglobinpraparaten vorgeschlagen; vgl. JA-OS 77516/75, GB-PS 1 426 039, DT-OS 2 409 650 und PR-OS 2 251 314. Auf diese Weise werden injizierbare Haptoglobinpr äpar ate zur kausalen Behandlung der vorerwähnten Nierenstörungen erhalten. Bei der intravenösen Verabfolgung von Haptoglobinpraparaten verbindet sich Haptoglobin mit freigesetztem Hämoglobin und sorgt somit für eine Normalisierung des Hämoglobinstoffwechsels.
In jüngster Zeit wurden erhebliche Fortschritte bei Operationen unter Anwendung von extrakorporalem Blutkreislauf, beispielsweise eines künstlichen Herz-Lungen-Systems oder von künstlichen Nieren, gemacht. Bei einer längerdauernden Zirkulation des Bluts durch ein derartiges extrakorporales System erfolgt Hämolyse unter Freisetzung von Hämoglobin. Das freigesetzte Hämoglobin verursacht häufig Nierenstörun-
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gen, die eine Fortsetzung der Operation mit extrakorporalem Kreislauf erschweren. Eine Behandlung mit Haptoglobinpräparaten ist auch in derartigen, durch die fortgesetzte Anwendung des extrakorporalen Kreislaufs verursachten Fällen von Hämolyse wirksam. Jedoch können Haptoglobinpräparate nach der Verabfolgung an den lebenden Körper nicht zurückgewonnen werden, d.h. die Haptoglobinpräparate können nicht wieder verwendet werden. Außerdem vereinigt sich das in den lebenden Körper injizierte Haptoglobin mit dem Hämoglobin unter Bildung eines Hämoglobin-Haptoglobin-Komplexes (nachstehend mit Hb-Hp bezeichnet). Dieser Komplex wird in die Leber transportiert und dort dem Stoffwechsel unterworfen. Dabei tritt eine zu schwere Belastung von Patienten mit reduzierter Nierenfunktion ein. Demzufolge ist die intravenöse Injektion von Haptoglobinpräparaten bei derartigen Patienten unzweckmäßig.
Es wurde bereits ein Verfahren zur Entfernung von freigesetztem Hämoglobin aus dem Blut vorgeschlagen, wobei die sogenannte Affinitätschromatographie angewendet wird. Dabei wird Haptoglobin an einen Agarose enthaltenden Träger gebunden, wodurch das Haptoglobin fixiert und unlöslich gemacht wird. Das erhaltene Produkt wird als Adsorptionsmittel verwendet; vgl. M. Klein und C. Mihaesco, Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 52 (1973), Nr. 3, S. 774-778.
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Das vorstehende Verfahren wurde für therapeutische Zwecke fortentwickelt. Dazu wurde ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verfügung gestellt, die als Blutfiltrationsvorrichtung bezeichnet werden kann. Mit dieser Vorrichtung wird freigesetztes Hämoglobin entfernt, indem man das Hämoglobin im zirkulierenden Blut an unlöslich gemachtes Haptoglobin, das auf verschiedene Trägerstoffe aufgebracht ist und in einem extrakorporalen Kreislaufsystem, beispielsweise einem künstlichen Herz-Lungen-System enthalten ist, bindet . Auf diese Weise gelingt es,das Hämoglobin direkt aus dem Körper zu entfernen, ohne die Leber zusätzlich zu belasten; vgl. JA-OSen 105 186/76, 79 717/76 und 79 718/76. Jedoch erwiesen sich alle diese in Wasser unlöslichen fixierten Haptoglobinpräparate für praktische Zwecke in bezug auf die Menge an fixiertem Hp, die Hb-Bindungskapazität, die physikalische Festigkeit und das Verhalten nach der Regeneration als nicht zufriedenstellend.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein wasserunlösliches Haptoglobinpräparat mit einem hohen Gehalt an aktivem Haptoglobin und einer hohen Hämoglobinbindungskapazität zur Verfügung zu stellen. Dieses Präparat soll eine ausreichende physikalische Festigkeit aufweisen, daß es als Adsorptionsmittel für Hämoglobin in einem extrakorporalem Kreislaufsystem verwendet werden kann. Ferner soll dieses Haptoglobinpräparat nach der Verwendung als Adsorptionsmittel für Hämoglobin in einem extrakorporalen Kreislaufsystem unter günstigen Ergebnissen regeneriert werden können.
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Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung des Haptoglobinpräparats zu entwickeln. Diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst. Die Erfindung betrifft somit die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstände. Die Lösung dieser Aufgaben beruht auf dem überraschenden Befund, daß Fibrin als Träger zur Fixierung von Haptoglobin besonders wirksam ist.
Im Vergleich zu herkömmlichen fixierten Hp-Präparaten oder Präparaten für Injektionszwecke sind die erfindungsgemäßen fixierten Haptoglobinpräparate für praktische Zwecke wesentlich besser geeignet, da sie eine hohe Hämoglobinbindungskapazität aufweisen und ihre Aktivität auch bei längerdauernder kontinuierlicher Verwendung behalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von unlöslich gemachtem Haptoglobin kann auf verschiedene Weise ausgeführt werden, beispielsweise durch Einbetten von Haptoglobin in Fibrin nach einem beim Unlöslichmachen von Enzymen üblichen Verfahren oder durch Umsetzen von Haptoglobin und Fibrin oder Fibrinogen mit einer bifunktioneilen Verbindung (Vernetzungsmittel), die zur Reaktion mit diesen Substanzen in der Lage ist und sie aneinander binden (vernetzen) kann, und, sofern Fibrinogen verwendet wird, anschließende Umsetzung des Reaktionsprodukts mit Thrombin zur Umwandlung des Fibrinogenrests in einen Fibrinrest.
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Für den erfindungsgemäß verwendeten Haptoglobintyp bestehen keine speziellen Beschränkungen, er hängt vielmehr vom beabsichtigten Verwendungszweck des Präparats ab. Sollen die Haptoglobinpräparate in Vorrichtungen zur Entfernung von Hämoglobin in einem extrakorporalen Kreislaufsystem verwendet werden, wird zweckmäßigerweise injizierbares, gereinigtes Haptoglobin menschlichen Ursprungs verwendet, das sich auf die vorstehend beschriebene Weise zur Herstellung von wäßrigen Haptoglobinlösungen eignet.
Fibrinogen wird durch Einwirkung von Ihrombin zu in Wasser unlöslichem Fibrin umgewandelt. Das erfindungsgemäß eingesetzte Fibrinogen unterliegt keinen besonderen Beschränkungen. Die Wahl des Fibrinogens hängt vom Verwendungszweck des Haptoglobinpräparats ab. Bei der Verwendung des Präparats in einem extrakorporalem Kreislaufsystem wird Fibrinogen menschlichen Ursprungs bevorzugt. Derartiges Fibrinogen wird nach üblichen Verfahren gewonnen, beispielsweise nach Cohn durch Fällung mit kaltem Äthanol, wobei die Fraktion I als entsprechende Fibrinogenquelle dient. Haptoglobin, Fibrinogen und Thrombin, die in der erfindungsgemäßen Reaktion verwendet werdea, werden vorzugsweise zur Inaktivierung von Hepatitisviren nach üblichen Verfahren vorbehandelt, beispielsweise durch Erhitzen oder UV-Bestrahlung. Bei Verwendung von Ausgangsprodukten, die einer derartigen Behandlung unterzogen worden sind, erhält man Präparate, bei denen keine Gefahr einer Hepatitisvirus-Infektion besteht.
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Als Vernetzungsmittel werden erfindungsgemäß bifunktionelle Verbindungen verwendet, die als unlöslichmachende, vernetzende Mittel für Enzyme bekannt sind, wie Glutardialdehyd, Hydrazin, Äthylendiamin, Methylendibromid, Bisdiazo-o-dianisidin, Bisdiazobenzidin und Carbodiimid (Cyanamid). Besonders bevorzugt werden Glutardialdehyd und Carbodiimid, da diese Verbindungen eine hohe Vernetzungswirksamkeit aufweisen und zu Produkten führen, deren Hb-Bindungskapazität in ausreichendem Maße erhalten bleibt.
Die erfindungsgemäßen Reaktionen unter Beteiligung von Haptoglobin, Fibrinogen, einer bifunktionellen Verbindung und Thrombin werden in einem wäßrigen Medium durchgeführt. Die Reaktionsiolge der Reaktionsteilnehmer ist nicht kritisch, sofern eine Verbindung zwischen Fibrinogen oder Fibrin und Haptoglobin erreicht wird. Gemäß nachstehenden Reaktionsfolgen gelangt man zu ähnlichen Ergebnissen:
a) Ansetzen der bifunktionellen Verbindung mit einem Gemisch aus Fibrinogen und Haptoglobin und anschließende Umsetzung des Reaktionsgemisches mit Thrombin, um den Fibrinogenrest in einen Fibrinrest umzuwandeln;
b) umwandlung von Fibrinogen in Fibrin unter Einwirkung von Thrombin und anschließend Umsetzung eines Gemisches aus dem erhaltenen Fibrin und Haptoglobin mit der bifunktionellen Verbindung;
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■ζ
c) Umsetzung von Fibrin mit einem Gemisch aus Haptoglobin und der bifunktionellen Verbindung oder
d) Umsetzung von Haptoglobin mit einem Gemisch von Fibrin und der bifunktionellen Verbindung.
Vorzugsweise werden Jedoch sämtliche vier Reaktionsteilnehmer, d.h. Fibrinogen, Haptoglobin, bifunktionelle Verbindung und Thrombin, gleichzeitig miteinander umgesetzt.
Die funktioneilen Gruppen der bifunktionellen Verbindung vereinigen sich mit den funktioneilen Gruppen der Aminosäuren im Fibrin und im Haptoglobin, beispielsweise mit Aminogruppen, Carboxylgruppen und Phenolgruppen. Dadurch wird ein unlösliches, gebundenes Fibrin-Haptoglobin-Produkt gebildet.
Im allgemeinen werden folgende Reaktionsbedingungen angewendet: Das Gewichtsverhältnis von Fibrinogen zu Haptoglobin beträgt 0,5 bis 3,0:1; die Menge an zugesetztem Thrombin zur Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin beträgt 30 bis 100 NIH-Einheiten pro
1 g Fibrinogenj die bifunktionelle Verbindung wird vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 50 Millimol pro 1 Gramm Haptoglobin verwendet. Die Reaktionstemperatur kann 0 bis 400C für die Gesamtreaktion betragen, wobei für die Fixierung bzw. Vernetzung eine Temperatur von 0 bis 100C und insbesondere von 0 bis 5°C und für die Umwandlung des Fibrins
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-χ- ■"■
eine Temperatur von 20 bis 400C und insbesondere von 28 bis 32°C bevorzugt ist; der pH-Bereich des Reaktionsgemisches liegt vorzugsweise in der Nähe des Neutralpunkts, d.h. bei pH-Werten von 6 bis 8; als Reaktionsmedium wird vorzugsweise eine physiologische Kochsalzlösung oder ein 0,1 m Phosphatpuffer verwendet; die Reaktionszeit beträgt etwa 30 Minuten bis etwa 3 Stunden. In den meisten Fällen genügt eine Reaktionszeit von 2 Stunden, um die Reaktion zu Ende zu führen.
Das einfache Einbetten von Haptoglobin in Fibrin, das eine weitere Ausführungsform zur Herstellung des erfindungsgemäßen unlöslich gemachten Haptoglobins darstellt, kann durchgeführt werden, indem man Fibrinogen und Haptoglobin in einem wäßrigen Medium vermischt und das erhaltene Gemisch mit Thrombin versetzt, um das Fibrinogen in Fibrin zu verwandeln. Die Menge der verwendeten Ausgangsmaterialien und die Reaktionsbedingungen entsprechen dabei etwa den vorgenannten Angaben.
Das auf diese Weise erhaltene unlöslich gemachte Haptoglobinpräparat, insbesondere das durch Vernetzung unlöslich gemachte Präparat, ist von großem praktischen Wert im Hinblick auf die Menge des fixierten Hp, die Hb-Bindungskapazität, die physikalische bzw. mechanische Festigkeit und die Wiederverwendbarkeit, wie aus den Versuchsbeispielen 1 bis 3 hervorgeht. Beim Vergleich der Ergebnisse dieser Versuchsbeispiele untereinander
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ORIGINAL INSPECTED
läßt sich feststellen, daß die erfindungsgemäß hergestellten Haptoglobinpraparate im Vergleich zu herkömmlichen Präparaten etwa die 2- bis 10-fache Menge an fixiertem Haptoglobin enthalten, eine etwa 2- bis 9-fache größere Hb-Bindungskapazität und eine 2- bis 6-fache höhere physikalische Festigkeit aufweisen und etwa 3- bis 7 mal so viel Hb binden, wenn sie wiederholt verwendet werden. Die Menge an fixiertem Hp beträgt etwa 100 bis mg/Si bezogen auf das Trockengewicht, und die Hb-Bindungskapazität etwa 20 bis 115 mg Hb/g, bezogen auf das Trockengewicht.
Wenn die erfindungsgemäßen Haptoglobinpraparate einem extrakorporalem Kreislaufsystem als Filterbett in Form eines Granulats einverleibt werden, wodurch vermieden werden soll, daß das Präparat durch das strömende Blut wegtransportiert wird, hat man ein wertvolles Hilfsmittel zur Prophylaxe und Therapie von hämolytischen Nierenstörungen, die durch kontinuierliche Verwendung des extrakorporalen Kreislaufsystems verursacht werden, zur Verfügung. Die Mindestkorngröße beträgt in diesem EaIl etwa Mikron, vorzugsweise 50 bis I50 Mikron. Bei geringeren Korngrößen wird Hämoglobin wirksamer gebunden.
Das erfindungsgemäße . Präparat läßt sich in seiner physikalischen Festigkeit und der Hb-Bindungskapazität weiter verbessern, wenn man die Oberfläche des Fibrinogens dadurch vergrößert, daß man es in die Form einer auf einen Hilfsträger aufgebrachten Membran bringt. Als entsprechende Hilfsträger kommen wärmebeständige Fasern in Form von Fäden, Folien oder
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Netzen in Frage. Als wärmebeständige Fasern können natürliche oder synthetische Fasern je nach dem beabsichtigten Verwendungszweck des Haptoglobinpräparats verwendet werden. Beispiele für entsprechende Fasern sind Fasern aus Polyolefinen, Acrylnitril-Polymerisaten, Polyestern, Polyacetaten und Vinylalkohol-Polymerjgaten.
Die auf einen Hilfsträger aufgebrachten unlöslich gemachten Haptoglobinpräparate werden zweckmäßig so hergestellt, daß roan entweder Fibrinogen, das in Form einer Membran auf einen Hilfsträger aufgebracht ist, mit Thrombin unlöslich macht und anschließend die unlöslich gemachte Fibrinmembran, Haptoglobin, die bifunktionelle Verbindung und den Hilfsträger gleichzeitig miteinander umsetzt oder daß man direkt ein Gemisch aus Fibrinogen, Haptoglobin, Thrombin und der bifunktionellen Verbindung in Gegenwart eines Hilfsträgers gleichzeitig miteinander umsetzt. Die bifunktionelle Verbindung reagiert auch mit den aktiven Gruppen des Hilfsträgers, so daß sich aktives, unlöslich gemachtes Haptoglobin mit hoher physikalischer Festigkeit ergibt.
Da das erfindungsgemäße Haptoglobinpräparat sich mit in wäßrigem Medium freigesetztem Hämoglobin verbindet, ist es nicht nur zur Entfernung von Hämoglobin aus einem extrakorporalem Zirkulationssystem, sondern auch für die allgemeine Blutanalyse wertvoll. Ferner eignet es · sich auch aufgrund seiner Kombinationsselektivität zur Durchführung von Plasmafraktionierungen und zur Wiedergewinnung von Hämoglobin.
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/η
In den nachstehenden Beispielen werden die Mengen an unlöslich gemachtem Haptoglobin aus den Mengen an nicht fixiertem Haptoglobin, das aus den Waschflüssigkeiten nach der Fixierung des Haptoglobins an Fibrin wiedergewonnen wird, mit Hilfe der radialen Immundiffusion (vgl. G. Mancini, A.O. Carbonara und T.F. Heremans, Immunochem., Bd. 2 (1965)» S. 235) berechnet. Sofern nichts anderes angegeben ist, werden die Hb-Bindungskapazitäten erhalten, indem man eine Säule mit dem unlöslich gemachten Haptoglobin füllt, einen Überschuß an Hämoglobinlösung auf die Säule gibt, um das Hämoglobin mit dem Haptoglobin zu verbinden, sodann die tenge an restlichem Hämoglobin in der Lösung nach dem Cyanmethämoglobin-Verfahren (vgl. E.J. Kampen, Clin. Chim. Acta., Bd. 6 (1961), S.538) bestimmt und die Menge an gebundenem Hämoglobin berechnet.
Die Figuren erläutern eine Vorrichtung, die erfindungsgemäß eingesetzt wird, sowie die Ergebnisse von Vergleichsversuchen, die mit erfindungsgemäß unlöslich gemachtem Haptoglobin, herkömmlichem unlöslich gemachtem Haptoglobin und Haptoglobin, das nach dem bekannten Enzym-Immobilisierungsverfahren unlöslich gemacht worden ist, durchgeführt worden sind. Fig. 1 ist eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Kreislaufführung von Flüssigkeit, die zur Messung der physikalischen Stärke des unlöslich gemachten Haptoglobins verwendet wird. In Fig. 2 sind die Ergebnisse dieser Messungen wiedergegeben. Entsprechende Erklärungen bezüglich der Vorrichtung und der Untersuchungsergebnisse sind im Versuchsbeispiel 2 enthalten. Fig. 3 zeigt
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die Ergebnisse von Regenerationsversuchen mit unlöslich gemachtem Haptoglobin. Dieser Versuch ist im Versuchsbeispiel 3 erläutert.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
1 Liter einer 2,0prozentigen (Gewicht/Volumen) Lösung (pH-Wert 7, 0,1 m Phosphatpuffer) von gereinigtem Fibrinogen aus menschlichem Plasma wird mit 20 g gereinigtem Haptoglobin aus menschlichem Plasma und anschließend mit 200 ml Thrombin mit 10 NIH-Einheiten/ml versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 300C stehengelassen, um für eine ausreichende Koagulation des Fibrins zu sorgen. Nach dem Waschen wird die Fibrinmasse lyophilisiert. Man gewinnt ein Granulat mit gleichmäßigen Teilchen (50 bis 15 Das Granulat wird 2 mal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Man erhält 38 g eines fixierten Haptoglobinpräparats. Beim ersten Waschen beträgt der Gehalt an fixiertem Haptoglobin 390 mg/ g, bezogen auf das Trockengewicht. Beim zweiten Waschen beträgt dieser Wert 100 mg/g, bezogen auf das Trockengewicht, und der Wert für die Hb-Bindungskapazität liegt bei etwa 20 mg Hb/g, bezogen auf das Trockengewicht.
Beispiel 2
2 Liter einer 2,0prozentigen (Gewicht/Volumen) Lösung (pH-Wert 7» 0,1 m Phosphatpuffer) von gereinigtem menschlichem Fibrinogen werden mit 20 g gereinigtem menschlichem Haptoglobin und an-
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schließend unter Rühren mit Glutaraldehyd bis zu einer Endkonzentration dieser Verbindung von 10 millimolar versetzt. Das Gemisch wird 20 Minuten bei 0 bis 5°C gerührt. Nach Zugabe von 200 ml Thrombin mit 10 NIH-Einheiten/ml wird das Gemisch 2 Stunden bei 300C stehengelassen. Die erhaltene Fibrinmasse wird gewaschen und lyophilisiert. Die erhaltenen Teilchen werden auf eine einheitliche Korngröße (50bis 150^) ausgesiebt. Nach dem Waschen und Trocknen erhält man 52 g eines fixierten Haptoglobinpraparats. Der Gehalt an fixiertem Haptoglobin beträgt etwa 384 mg/g, bezogen auf das Trockengewicht, und die Hb-Bindungskapazität etwa 115 mg Hb/g, bezogen auf das Trockengewicht. Es tritt kein merklicher Unterschied im Gehalt an fixiertem Haptoglobin nach dem ersten und zweiten Waschen ein.
Beispiel 3
Ein Stück einfache Nylongaze mit einer lichten Maschenweite von etwa 149 μ (100 mesh ASTM) der Abmessungen 165 x 200 mm wird an beiden Enden mit einem Draht aus korrosionsbeständigem Stahl verschweißt und zu einer Spirale eingerollt. Die spiralenförmige Nylongaze wird in eine Glassäule mit einem Fassungsvermögen von 90 ml (28 mm Innendurchmesser und 145 mm Höhe) gebracht und mit einer ausreichenden Menge einer Thrombinlosung mit 20 NIH-Einheiten/ml benetzt. Nach dem Entfernen der überschüssigen Thrombinlosung wird ein Gemisch aus 20 ml einer 2prozentigen (Gewicht/Volumen) Lösung von gereinigtem menschlichem Fibrinogen (gelöst in physiologischer Kochsalzlösung), 200 mg gereinigtem menschlichem Haptoglobin und
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5 mMol Glutardialdehyd rasch auf die Säule gegeben.
Die Temperatur der Fixierungsvorrichtung und der Reaktionsflüssig keit wird während des vorstehend beschriebenen Verfahrens auf eingestellt. Nachdem sich die gemischte Lösung genügend über die Nylongaze verteilt hat, wird die überschüssige Lösung entfernt. Sodann rotiert man die Säule 2 Stunden bei 300C, um das gebildete Fibrin auf der Nylongaze abzuscheiden. Anschließend läßt man das Fibrin genügend schrumpfen, indem man es etwa 45 Stunden bei 4°C stehen läßt. Anschließend wird es gründlich mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen*
Das auf diese Weise erhaltene fixierte Haptoglobin weist einen Gehalt an fixiertem Haptoglobin von 180 mg/fixierte Säule und eine Hb-Bindungskapazität von 65 mg/fixierte Säule auf.
Beispiel 4
Man verfährt wie in Beispiel 3» mit der Abänderung, daß man anstelle von Glutardialdehyd 10 mMol Carbodiimid verwendet. Die Ergebnisse unterscheiden sich nicht merklich von den Ergebnissen von Beispiel 3. Der Gehalt an fixiertem Haptoglobin beträgt 175 mg/fixierte Säule und die Hb-Bindungskapazität 62 mg Hb/fixierte Säule.
Versuchsbeispiel 1
Die gemäß den Beispielen 1 und 2 erhaltenen fixierten Haptoglobinpräparate sowie herkömmliche Präparate, die an mit aktivem
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Ester copolymerisiertem Polyacrylamidgel fixiertes Haptoglobin (PAE-Hp) und an Sepharose (Agarose der Firma Pharmacia Co., Ltd., Schweden) fixiertes Haptoglobin (S-Hp) enthalten, werden in bezug auf ihren Gehalt an fixiertem Hp und ihre Hb-Bindungskapazität miteinander verglichen. Das PAE-Hp wird hergestellt, indem man gereinigtes menschliches Haptoglobin mit mit einem aktiven Ester copolymerisierten Polyacrylamidgel umsetzt (vgl. Schnaar und Lee, Biochem., Bd. 14 (1975), S.1535). Das S-Hp wird gemäß dem Verfahren von Klein und Mihaesco, a.a.O., hergestellt. Als Haptoglobin wird ein gereinigtes humanes Haptoglobinpräparat in einer Menge von 20 g verwendet.
Gehalt an fixiertem
Hp (mg/g, bezogen
auf das Trocken
gewicht)		 Hb-Bindungskapazi-
tät (mg Hb/g, be
zogen auf das
Trockengewicht)
unlöslich gemachtes
Hp von Beispiel 1
(in Fibrin eingebettet)		 100 20
unlöslich gemachtes
Hp von Beispiel 2
(Fibrin-Glutaraldehyd-
Vernetzung)		 384 115
S-Hp 76 14
PAE-Hp 60 13
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Yersuchsbeispiel 2
Mit Ausnahme des Präparats von Beispiel 1 werden die in Versuchsbeispiel Λ eingesetzten, unlöslich gemachten Haptoglobinpsäparate in bezug auf ihre physikalische Beständigkeit gegen einen durch den Flüssigkeitsstrom verursachten Zerfall untersucht.
Der Versuch wird jeweils an 30 ml eines unlöslich gemachten Haptoglobinpräparats, das in einen Barrier-Filter (Johnson & Johnson Co.) von 50 ml Fassungsvermögen gefüllt ist, durchgeführt. Der Filter befindet sich in der in Fig. 1 abgebildeten Kreislaufvorrichtung. Diese Kreislaufvorrichtung besteht aus einer Kammer C1 die den Barrier-Filter F für extrakorporales Blut, enthält, einer mit der Kammer C verbundenen endlosen Leitung L und der in der Leitung L angeordneten Pumpe P. 1 Liter physiologische Kochsalzlösung wird mittels der Pumpe P in der Leitung L mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 500 ml/ 0,50 cnr/min im Kreislauf geführt. Proben der zirkulierenden Kochsalzlösung werden in Stündlichen Abständen während 5 Stunden entnommen. Die Anzahl der Teilchen des unlöslich gemachten Haptoglobinpräparats, die aufgrund von Zerfall in der Probe auftreten, werden mit Hilfe eines Hämatometers mit einer Vergrößerung von 50 bestimmt. Der Porendurchmesser des Barrier-Filters für extrakorporales Blut beträgt 20 bis 40 ^u, während das unlöslich gemachte Haptoglobinpräparat auf eine Korngröße von 50 bis I50 )X ausgesiebt ist. Der zeitliche Verlauf der Anzahl der Haptoglobinteilchen ergibt sich aus Fig. 2, wobei die Ordinate die Anzahl der Hp-Teilchen, die in 1 ml
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«Λ
physiologischer Kochsalzlösung auftreten, und die Abszisse die Zeit der Kreislaufführung angibt.Aus Fig. 2 ergibt sich, daß die physikalische Festigkeit des gemäß Beispiel 2 erhaltenen unlöslich gemachten Haptoglobinpräparats die Festigkeit herkömmlicher Präparate um den Faktor etwa 2 bis 7 übertrifft.
Versuchsbeispiel 3
Die Wiederverwendbarkeit der in Versuchsbeispiel 1 verwendeten Haptoglobinpraparate wird untersucht. Dieser Versuch wird auf folgende Weise durchgeführt:
5 ml des unlöslich gemachten Haptoglobins werden mit einer ausreichenden Menge Hämoglobin vereinigt. Das mit Hämoglobin beladene Präparat wird mit 30 ml einer wäßrigen 5 m MgCl^-Lösung (pH-Wert etwa 4,3) vermischt, um die Hp-Hb-Bindung vollständig zu
des in der Lösung freigesetzten Hb spalten. Die Menge/wird bestimmt. Daraus wird die Hb-Bindungskapazität des unlöslich gemachten Haptoglobins berechnet. Das beim Freisetzen von Hämoglobin regenerierte Haptoglobin wird wieder mit einer ausreichenden Menge Hämoglobin vereinigt und anschließend auf die vorstehende Weise behandelt, um das Hämoglobin freizusetzen. Die vorstehend geschilderte Behandlung wird wiederholt. Die Änderung der Hb-Bindungskapazität bei diesen wiederholten Behandlungen wird untersucht.
Die Ergebnisse sind in Fig.3 wiedergegeben. Die Ordinate gibt die restliche Hb-Bindungskapazität (mg Hb/g, bezogen auf das Trockengewicht) und die Ordinate die Anzahl der Regenerationen an. Aus Fig.3 ergibt sich,daß das gemäß Beispiel 2 erhaltene Haptoglobinpräparat
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nach einer 4-maligen Regeneration eine etwa 4- bis 8-fach größere Hb-Bindungskapazität als herkömmliche Präparate aufweist.
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e e r s e ι I e

Claims (1)

  1. VOSSIUS · V O ti 5 I U S HILTL
    PATENTANWÄLTE
    SIEBERTSTRASSE * ■ βΟΟΟ MÜNCHEN 8β · PHONE: (Οββ) 47 4Ο 7β .» O. JU[i VJ-' /
    CABLE: BENZOLPATENT MÜNCHEN · TELEX 5-28 403 VOPAT D
    u.Z. : M 273 (Vo/H)
    Case: A 2275-02
    THE GREEN CROSS CORPORATION,
    Osaka, Japan
    "Wasserunlösliches Haptoglobinpraparat und Verfahren zu seiner Herstellung"
    Priorität: 27. August 1976, Japan, Nr. 102 763/1976
    Patentansprüche
    1. Wasserunlösliches Haptoglobinpraparat, gekennzeichnet durch einen Gehalt an durch Fixierung an Fibrin unlöslich gemachtem aktivem Haptoglobin.
    2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es etwa 100 bis 600 mg fixiertes Haptoglobin pro 1 g enthält.
    3. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Hämoglobinbindungskapazität von etwa 20 bis etwa 115 mg Hb/g aufweist.
    809809/0685 L
    . . ORIGINAL INSPECTED
    4. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es frei von infektiösen Hepatitis Virus-Bestandteilen ist.
    5. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das an Fibrin fixierte aktive Haptoglobin eine Korngröße von 50 bis 150 μ aufweist.
    6. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fibrin und das aktive Haptoglobin menschlichen Ursprungs sind.
    7. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das aktive Haptoglobin mittels einer bifunktionellen Verbindung an das Fibrin fixiert worden ist.
    8. Präparat nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß als bifunktionelle Verbindung Glutardialdehyd oder Carbodiimid verwendet worden ist.
    9. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das fixierte aktive Haptoglobin auf einen Träger aufgebracht ist.
    10. Präparat nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus natürlichen oder synthetischen Fasern besteht.
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    ORIGINAL INSPECTED
    11. Präparat nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die synthetischen Fasern Polyolefine, Acrylnitril-Polymerisate, Polyester, Polyacetate oder Vinylalkohol-Polymerieate sind.
    12. Verfahren zur Herstellung des wasserunlöslichen Haptoglobinpräparats, dadurch gekennzeichnet, daß man Fibrinogen, Haptoglobin, Thrombin und eine bifunktionelle Verbindung miteinander zur Reaktion bringt.
    13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man Fibrinogen und Haptoglobin menschlichen Ursprungs verwendet.
    14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als bifunktionelle Verbindung Glutardialdehyd oder Carbodiimid verwendet.
    15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als bifunktionelle Verbindung Glutardialdehyd verwendet .
    16. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man als bifunktionelle Verbindung Carbodiimid verwendet.
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    17· Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert von 6 bis 8 durchführt.
    18. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion unter Anwendung eines Reaktantenverhaltnisses von 1 g Haptoglobin, etwa 0,5 bis etwa 3,0 g Fibrinogen, 1 bis 50 Millimol einer bifunktionellen Verbindung und 15 bis 300 NIH-Einheiten Thrombin durchführt.
    19- Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion bei Temperaturen von 0 bis 400C durchführt.
    20. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion stufenweise durchführt, wobei zunächst die bifunktionelle Verbindung mit einem Gemisch aus Fibrinogen und Haptoglobin und anschließend das erhaltene Reaktionsgemisch mit Thrombin umgesetzt werden.
    21. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion stufenweise durchführt, wobei zunächst Thrombin mit Fibrinogen und anschließend das erhaltene Fibrin und Haptoglobin mit der bifunktionellen Verbindung umgesetzt werden.
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    22. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktionsteilnehmer gleichzeitig miteinander umsetzt.
    23. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion mit Thrombin bei
    Temperaturen von 20 bis 400C durchführt.
    24. Verfahren nach Anspruch 21,dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion mit Thrombin bei
    Temperaturen von 20 bis 400C durchführt.
    25. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion mit der bifunktionellen Verbindung bei Temperaturen von 0 bis 100C durchführt.
    26. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion mit der bifunktionellen Verbindung bei Temperaturen von 0 bis 10°C durchführt.
    27. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Gegenwart eines HiIfsträgers durchführt.
    28. Verfahren nach Anspruch 27,dadurch gekennzeichnet, daß man als Hilfsträger natürliche oder synthetische Fasern verwendet.
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    29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man synthetische Fasern aus einem Polyolefin, Acrylnitrilpolymerisat, Polyester, Polyacetat oder Vinylalkohol-Polymerisat verwendet.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4462989A (en) * 1981-05-04 1984-07-31 Evreka, Inc. Method and agents for arresting infection
US4442655A (en) * 1981-06-25 1984-04-17 Serapharm Michael Stroetmann Fibrinogen-containing dry preparation, manufacture and use thereof
US5464814A (en) * 1986-06-20 1995-11-07 Northfield Laboratories, Inc. Acellular red blood cell substitute
DE69831248T2 (de) * 1997-02-28 2006-04-13 The Regents Of The University Of California, Oakland Verfahren und zusammensetzungen zur optimierung des sauerstofftransportes in zellfreien systemen
US20030153491A1 (en) * 2002-01-11 2003-08-14 Winslow Robert M. Methods and compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
US20050164915A1 (en) * 2002-04-01 2005-07-28 Sangart, Inc. Compositions for oxygen transport comprising a high oxygen affinity modified hemoglobin
JP3912206B2 (ja) * 2002-07-05 2007-05-09 株式会社日立製作所 筒内直接燃料噴射装置用燃料ポンプ
CA2512169A1 (en) * 2003-01-29 2004-08-12 Northfield Laboratories, Inc. Polymerized hemoglobin solutions having reduced amount of tetramer and method for preparing
WO2007087570A2 (en) 2006-01-24 2007-08-02 Northfield Laboratories, Inc. Polymerized hemoglobin media and its use in isolation and transplantation of islet cells
US20090004159A1 (en) * 2006-01-24 2009-01-01 The Board Of Trustees Of The University Of Illinoi Polymerized Hemoglobin Media and Its Use in Isolation and Transplantation of Islet Cells

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