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Die Erfindung bezieht sich auf ein Analysenhilfsmittel
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mit mehreren zu einer Einheit verbundenen Lagen und ein Verfahren
zum Analysieren einer flüssigen Probe zur Bestimmung der Komponenten in dieser Flüssigkeit,
insbesondere einer Körperflüssigkeit.
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Eine einfache bekannte Testmethode für klinische Untersuchungen ist
die "Testpapiermethode", von der die Urintestmethode weitverbreitet angewendet wird.
Die Bestimmung der Urinkomponenten mit dem Urintestpapier ist unerlässlich als ein
Sichttest, der über eine Störung des lebenden Organismus informiert,ohne sich auf
den Körper des Patienten belästigend auszuwirken.
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Andererseits sind in letzter Zeit verschiedene Testpapiere für die
Bestimmung von Blutkomponenten, bei denen die Anforderungen, die an die Genauigkeit
gestellt werden, höher sind, entwickelt worden. Dies ist auf die steigende Nachfrage
nach Testpapier auf dem Gebiet der biochemischen Bluttests zurückzuführen, weil
Testpapier nicht die Herstellung von Reagenz und Reaktionsgefäß erfordert und keine
Anordnung wie Probe und Reagenzmischung, mit "Festreagenz" gegenüber "Flüssigreagenz"
bezeichnet, erforderlich macht.
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Die Tests jedoch, bei denen gewöhnliches Papier als Substrat für das
Reagenz verwendet wird, haben Nachteile wie unzureichende Meßgenauigkeit infolge
Unebenheit des Papiers selbst und, wegen der schlechten Säure und Alkali-Beständigkeit
des Papiers die Beschränkung auf verwendbare Reagenzien und demgemäß auf die bestimmbaren
Komponenten.
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Deshalb wurde die Technik der Verwendung von wasserfesten polymeren
Materialien als das Reagenzsubstrat entwickelt (z.B. JA-PS 49-33800). Dabei wird
ein wasserfester Film durch Aufbringen eines Gemisches von einem Reagenz, das mit
der zu bestimmenden Komponente reagiert, und wasserfestem polymerem Material auf
Kunststoffstreifen, wie Polyester, hergestellt. Die Oberfläche dieses Films ist
gleichmäßiger und die Meßgenauigkeit gegenüber der von Testpapier verbessert, aber
die unporöse Oberfläche erlaubt der aufgetropften Probe kaum einzudringen. Folglich
ist es zeit- und arbeitsaufwendig, vor der Messung überschüssige Probe zu entfernen,
was eine automatische Bestimmung sehr erschwert. Außerdem macht das geringe Probeaufsaugvermögen
höher empfindliche Bestimmungen schwierig. So ist der Film zur Bestimmung von Spurenkomponten,
wie Harnsäure im Blut, nicht geeignet.
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Zur Beseitigung dieser Nachteile ist das Mehrlagen-Analysenelement
entwickelt worden, das in der JA-PS 53-21677 offenbart ist. Es ist aus einer Reagenzlage,
aufgebracht auf einem transparenten Substrat und versehen mit einer Lage nichtfaserigen
porösen Mediums, das darauf ausgebreitet ist, zusammengesetzt. Diese Entwicklungslage
dient dazu, eine nahezu konstante Probemenge pro Flächeneinheit aufzubringen, ohne
eine chromatografische Erscheinung der zu analysierenden Komponente in der Probe
zu verursachen.
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Eine gegebene Zeit nach dem Auftropfen der Probe auf die Entwicklungslage
wird die sich in der Reagenzlage entwickelnde Farbe von der Substratseite (der der
Entwicklungslage entgegengesetzt liegenden Seite) aus gemessen, um die Konzentration
der gesuchten Komponente in der Probe zu bestimmen. Mehrlagige Analysenelemente,
die dieser ähnlich sind, sind in den JA-OS 55-164356 und 56-24576 beschrieben. Bei
der zuerst genannten wird ein hydrophil behandeltes Gewebe als Entwickler lage benutzt
und bei der zweiten ein faseriger poröser Träger für den gleichen Zweck.
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Diese Mehrlagen-Analysenelemente überwinden weitgehend die vorstehend
beschriebenen Nachteile, verursachen aber neue Probleme, die nachstehend angegeben
werden.
Erstens, die Erscheinung, daß sich die aufgetropfte Probe
radial entwickelt und ausdehnt, erfordert eine verhältnismäßig großflächige Reagenzlage,
was zu einem wirtschaftlichen Verlust an Material wie des Reagenzes führt, und die
spezielle Struktur macht es erforderlich, die zu analysierende Komponente davor
zu schützen, chromatografische Erscheinungen zu verursachen, was das Element sehr
teuer macht. Zweitens, da die Probe auf die obere Oberfläche getropft wird und die
Farbe an der Bodenseite gemessen wird, muß das transparente Substrat frei von Flecken
und Kratzern sein, die eine optische Störung erzeugen können, und ein Schutzhalter
für den Testchip kann erforderlich werden, um Kratzer und Flecke zu verhindern.
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Ein weiterer Nachteil besteht in der schlechten Meßempfindlichkeit,
weil das Licht, das durch die Reagenzlage hindurchgeht, von der Entwicklerlage schlecht
reflektiert wird. Drittens, die Reaktion nimmt relativ lange Zeit in Anspruch, weil
sie in einem Gel bewirkt wird.
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Um den zweiten Nachteil zu beheben, ist vorgeschlagen worden, zwischen
der Reagenzlage und der Entwicklungslage eine Lage aus porösem Metallfilm (JA-OS
55-26428) oder eine Metallpulverlage (JA-OS 55-26429) mit hoher Lichtreflektion
vorzusehen. Diese Maßnahme macht aber die Analysenelemente noch komplexer, was zu
kleinerer Produktionskapazität und höheren Kosten führt.
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Die "festen Reagenzien", einschließlich solcher, die ein Reagenzsubstrat
aus üblichem Papierfilm und verschiedenen Mehrlagenstrukturen haben, weisen die
folgenden beiden Nachteile auf: Erstens ist die Bestimmung mit-festem Reagenz hinsichtlich
hoher Reproduzierbarkeit nicht gut-, weil die Reaktion unter der Bedingung, daß
die Probe und das Reagenz vollständig miteinander gemischt sind, schwer zu erreichen
ist; es fehlt der Mischvorgang. Zweitens kann es nur für Messungen im begrenzten
Konzentrationsbereich angewendet werden,und zwar wegen dem begrenzten Mengenverhältnis
von Reagenz zu Probe; diese enthält aber eine Vielzahl von Komponenten, was bei
klinischen Untersuchungen Bestimmungen in einem Bereich von relativ grossen Mengen
zu Spurenmengen erforderlich macht.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe- zugrunde, ein Hilfsmittel zum Analysieren
einer flüssigen Probe anzugeben, das einfache, schnelle, richtige und genaue Messungen
gibt und bei welchem die Nachteile des Standes der Technik weitgehend beseitigt
sind. Das Analysenhilfsmittel soll vom Mehrlagentyp sein und leicht und wirtschaftlich
herstellbar sein. Darüber hinaus soll ein Verfahren zum Analysieren einer flüssigen
Probe angegeben werden, bei dem dieses Hilfsmittel verwendet werden kann.
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Die Aufgabe wird durch das Analysenhilfsmittel des Anspruchs
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und das Verfahren des Anspruchs 4 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den
Unteransprüchen angegeben.
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Die Aufgabe wird durch ein Analysenhilfsmittel mit mehreren zu einer
Einheit verbundenen Lagen gelöst. Das Mehrlagen-Analysenhilfsmittel enthält: Eine
Reagenzlage, welche ein Reagenz enthält, das eine optisch nachweisbare Änderung
durch Reagieren mit der gesuchten Komponente in der flüssigen Probe erzeugt und
sich selbst in dem Lösungsmittel der Probe löst oder mit ihm ein Sol bildet; und
eine Nachweislage, die dazu dient, die flüssige Probe zur Reagenzlage zu überführen
und die optisch nachweisbare erzeugte oder verringerte Substanz in der Reaktionslage
gleichmäßig auszubreiten, die auf einer Seite eines Substrats oder eines Substratsystems,
welches Licht reflektieren kann, als Schicht aufgetragen ist.
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Ein unterscheidendes Merkmal dieses Analysenhilfsmittels vom Stand
der Technik ist, daß die Reaktion des Reagenzes mit der Probe und das Halten der
gemischten Reaktionslösung, die in der Reaktionslage gebildet worden ist, getrennt
sind, und das Halten der gemischten Reaktionslösung von der Nachweis lage bewirkt
wird.
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Ein weiteres Merkmal des erfindungsgemäßen Hilfsmittels besteht darin,
daß die Reaktion in flüssigem oder im Solzustand bewirkt wird, um gleichmäßige und
glatte Diffusion der Reaktionsprodukte zu erreichen. Gemäß dem erfindungsgemäßen
Analysierhilfsmittel erreicht die aufgetropfte Probe die Reaktionslage, sich etwas
durch die Nachweis lage ausbreitend, und breitet sich seitlich in der Grenzfläche
zwischen der Nachweislage und der Reagenzlage aus, und überführt die ganze Reaktionslage
schnell in einen gleichmäßigen Lösungs- oder Sol-Zustand, jede Komponente in der
Lage lösend. In der Reaktionslage läuft die bestimmte Reaktion glatt ab und die-gemischte
Reaktionslösung, die optisch nachweisbare Substanzen enthält, wird schnell durch
Kapillarkräfte in die Nachweislage diffundiert. Wenn die optisch nachweisbare Substanz
entsprechend der Menge der gesuchten Komponente erzeugt oder verringert ist, kann
die Konzentration der gesuchten Komponente in der Probe durch Vergleich mit einer
im voraus festgelegten Eichkurve bestimmt werden, wenn: die Nachweis lage mit einem
Licht bestrahlt wird, das von der optisch nachweisbaren Substanz absorbiert wird
und die Absorption gemessen wird. Wenn erforderlich, ist es möglich, die Reaktion
in der Reaktionslage ohne jegliche Beeinflussung durch ein inhibierendes Material
durchzuführen, indem der Nachweis lage ein Vorbehandlungsmittel zugefügt wird.
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Die Erfindung wird nun näher erläutert, wobei auf die beigefügten
Figuren Bezug genommen wird.
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Fig. 1 ist ein vergrößertes Querschnittsbild einer Ausführungsform
des Analysenhilfsmittels aus mehreren miteinander vereinigten Lagen nach der Erfindung.
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Fig. 2 und 3 sind perspektivische Darstellungen des in Fig. 1 gezeigten
mehrlagigen Analysenhilfsmittels, an einem Halter angebracht.
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Fig. 4 ist ein Querschnittsbild des beispielhaften Analysenhilfsmittels,
bestehend aus einer Reagenzlage und einer optischen Nachweislage, direkt auf einem
halterförmigen Substrat als Schicht oder Lage aufgetragen.
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Fig. 5 ist eine Standardkurve, die das Verhältnis von Harnsäurekonzentration
zu Reflexionvermögen zeigt.
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Fig. 6 ist eine Eichkurve, die das Verhältnis von Glukose zu Reflexionsvermögen
zeigt.
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Fig. 7 ist eine grafische Darstellung, die die Beziehung zwischen
den Messergebnissen, erhalten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und erhalten
mit einem Glukose-Analysiergerät, zeigt.
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In Fig. 1 ist ein beispielhaftes Mehrlagen-Analysenhilfsmittel 1 gezeigt.
Das Hilfsmittel 1 enthält eine Reagenzlage 3, gebildet durch Aufbringen eines Reagenzes
mit einer bekannten Auftragsvorrichtung auf ein Substrat 2 von der Form eines Filmes
oder einer Platte, und Trocknen des Reagenzes, das eine optisch nachweisbare Änderung
durch Reaktion mit der gesuchten Komponente in der Probe erzeugt; und als Schicht
auftragen (laminate) eine Nachweis lage 4 auf der Reagenzlage 3 mittels Lösungsmittelschweißen
(solvent welding) und dergleichen. Der Schichtstoff aus miteinander vereinigten
Lagen wird in die bestimmten Größen geschnitten, z.B. 5 x 10 mm.
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Wenn das Analysenhilfsmittel 1 auf dem Ende eines streifenförmigen
Halters 5 mittels eines beidseitig mit Klebstoff beschichteten Streifens 6, wie
in Fig. 2 gezeigt, oder auf einen Halter 5 von quadratischem Querschnitt, wie in
Fig. 3 gezeigt, befestigt ist, ergibt sich ein für den Gebrauch geeignetes Mehrlagen-Analysenhilfsmittel
1A.
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Das in der Erfindung verwendete Substrat 2 trägt die Reagenzlage 3
und die Nachweis lage 4, verhindert, daß die Probe, die durch die Nachweislage 4
zur Reagenzlage 3 übergeführt ist, zu anderen Teilen übergeführt wird, und dient
als Reflektor für das Licht, das durch die
Nachweis lage 4 hindurchgeht,
wenn die optische Änderung in dieser Lage 4 gemessen wird. Ein Teil des auf die
Nachweis lage 4 einfallenden und durch sie hindurchgehenden Lichts kann zur Verstärkung
der Menge geänderten Lichts durch Reflektieren an dem Substrat 2 benutzt werden.
Das Substrat ist vorzugsweise ein einziges Material mit den Eigenschaften,das Meßlicht
mehr als etwas zu reflektieren und die Reagenzlage 3 und die Nachweislage 4 zu tragen,
aber diese Eigenschaften können einzeln genommen, von einem zusammengesetzten Material
gegeben werden. Materialien, die mit diesen Eigenschaften versehen sind, schließen
ein: Metalle, Kunststoffe, Glas und Keramik, wovon weiße Kunststoffilme vom Standpunkt
der Verarbeitung am besten geeignet sind. Am meisten bevorzugt sind weiße Filme
oder Folien aus Polyester, Polypropylen und PVC. Obwohl ein Substrat aus einem einzigen
Material bevorzugt wird, wie vorstehend gesagt, kann auch ein Material wie ein transparenter
Polyester- oder Polypropylen-Film, welcher die Reagenzlage tragen kann, verwendet
werden, wenn er z.B. mit einem weißen Überzug beschichtet wird oder mit einem weißen
Film oder Papier verklebt wird, so daß er als das ganze Substrat die oben angegebenen
Eigenschaften erhält.
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Wenn ein Halter 5 verwendet wird, wie in Fig. 2 und 3 gezeigt, kann
die lichtreflektierende Funktion durch das ganze Tragesystem 7 erfüllt werden, einschließlich
Befestigungsmittel,
wie durch den Halter 5, das Substrat 2 und
das Doppelklebeband 6. D.h., wenn der Halter 5 oder das Klebeband 6 lichtreflektierende
Funktion hat, wird es ein Substrat aus transparentem Kunststoffilm tun. Als Material
für den Halter kann auch Pappe oder ein anderes als die vorstehend genannten Materiien
verwendet werden. Wenn jedoch das Substrat 2 selbst so ausgedehnt ist, daß es den
Halter bildet, wie in Fig. 4, muß es lichtreflektierende Funktion haben. In Fig.
4 sind die Reagenzlage 3 und die Nachweis lage 4 direkt auf einen Teil des Films
oder dergleiche aufgetragen und auf angemessene Größe geschnitten, um das Mehrschicht-Analysenhilfsmittel
1B zu bilden.
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Die Reagenzlage 3 enthält ein Reagenzsystem, das optisch nachweisbare
Änderung durch Reaktion mit der gesuchten Komponente verursacht, sowie einen Binder,
der das Reagenzsystem hält. Beispielhaft für das Reagenz sind für die Glukosebestimmung
eine Kombination Glukoseoxidase, Peroxidase, oxidierbares Chromogen und ein Puffer;
für die Bilirubinbestimmung eine Kombination von Diazobenzolsulfonsäure und organische
Säure; für die Glutaminsäure-Brenztraubensäure-Transamylasebestimmung eine Kombination
von Alanin-oL-ketog lutars äure, Brenztraubensäure-Oxidase, oxidierbares Chromogen
und ein Puffer; für die Milchsäuredehydrogenase-Bestimmung eine Kombination von
Brenztraubensäure,
reduziertes Nikotinamid-adenindinucleotid (NADH)
und ein Puffer, und für die Harnstoffbestimmung eine Kombination von Urease und
einem Puffer.
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Das erfindungsgemäß verwendete Bindemittel ist vorzugsweise ein solches,
das in der flüssigen Probe gelöst wird oder mit ihr ein Sol bildet, z.B. ein hydrophiles
Polymer, das bei Raumtemperatur fest ist, insbesondere polymere Polysaccharide,
wie Natriumalginat und kristalline Zellulose sowie synthetische Polymere, wie Polyvinylalkohol
und Polyvinylpyrrolidon.Gelatine und Agar sind auch geeignet, aber sie sind gelförmig
und eine darauf getropfte flüssige Probe wird in das Gel eingesaugt,ohne es zu lösen.
In einem solchen Fall empfiehlt es sich, das System auf eine Temperatur, bei welcher
Umwandlung in ein Sol stattfindet, zu erwärmen, um Reaktion im Solzustand zu verursachen.
Es ist jedoch kein unerläßlicher Faktor, daß die Reagenzlage 3 durch die Probe gelöst
oder in ein Sol umgewandelt wird. Selbst wenn das Bindemittel ein hydrophobes polymeres
Material ist, oder in einem Gel erstarrt, wird die gemischte Reaktionslösung sicher
in die Nachweis lage diffundiert. Ein solches Material kann auch als Bindemittel
verwendet werden. Es ist aber vorteilhaft, wenn die Reaktionslage 3 gelöst oder
in ein Sol umgewandelt wird, weil die Reaktion erleichtert wird und die Diffusion
in die Nachweis lage schnell bewirkt wird.
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Die Nachweis lage 4 setzt sich zusammen aus einem Material, das die
aufgetropfte flüssige Probe die Reagenzlage 3 erreichen läßt, sich etwas ausbreitend
und sich seitlich verbreiten läßt, jede Komponente der Reagenzlage 3 lösend, und
das die gemischte Reaktionslösung aufnimmt, welche optisch nachweisbare Substanzen,
die durch die bestimmte Reaktion erzeugt oder verringert sind, enthält, und optische
Messung von der Probenauftropfseite her gestattet.
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Das Material, das die Probe absorbiert und die Reaktionsmischung diffundiert,
ist beispielsweise ein Membranfilter, Papier, Gewebe, Nylonsieb oder ein Glasfaserfilter;
bevorzugt werden Filterpapier für die Chromatografie, Membranfilter und feines Baumwolltuch
wegen des gleichmäßigen und hohen Diffusionsvermögens und der guten Bearbe itbarke
it.
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Wenn die Reaktion in der Reaktionslage eine Redox-Reaktion ist und
Ascorbinsäureoxidase in der Nachweis lage enthalten ist, zersetzt sie die Ascorbinsäure,
die eine eingreifende Substanz ist, in der Zeit, in der die Probe die Reaktionslage
erreicht.
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Das Analysenhilfsmittel nach der Erfindung wird verwendet, wie nachstehend
beschrieben: Eine bestimmte Menge (z.B. 10 pl) Probe wird auf die Nachweislage 4
(in L-Richtung der Fig. 1) getropft. Die
Probe erreicht die Reagenzlage
3, sich etwas durch die Nachweis lage 4 ausbreitend, und breitet sich seitlich in
der Zwischenfläche zwischen der Nachweis lage und der Reagenzlage beim Lösen jeder
Komponente der Reagenzlage aus. In der Reagenzlage 3 findet die Reaktion mit der
zu analysierenden Komponente in flüssigem (oder Sol-) Zustand statt, und die gemischte
Reaktionslösung, die die in der Reagenzlage 4 erzeugte optisch nachweisbare Substanz
enthält, wird mittels Kapillarkräften gleichmäßig in die Nachweis lage 4 diffundiert.
Durch Bestrahlen der Nachweis lage 4 in diesem Zustand in L-Richtung mit Licht,
das von der optisch nachweisbaren Substanz absorbiert wird, und Messen der Menge
reflektierten Lichts wird die gesuchte Komponente bestimmt.
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Zur weiteren Veranschaulichung der Erfindung werden die nun folgenden
Beispiele gebracht, auf die die Erfindung jedoch nicht beschränkt ist.
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Beispiel 1 - Analysenhilfsmittel für die Harnstoffbestimmung Uricase
200 mg Peroxidase 300 mg 4-Aminoantipyrin 200 mg Natriumsalz von N-Ethyl-N-(2-hydroxi-3-sulfopropyl)-m-toluidin
500 mg Polyvinylpyrrolidon 10 g Triton X-100 100 mg 0,1M Phosphorsäure-Pufferlösung
100 m
Ein Reagenz der vorstehenden Zusammensetzung wurde gleichmäßig
in einer Breite von 50 mm und einer Dicke von 0,2 mm auf ein Substrat aus weißem
Polyesterfilm (von Toray Co.) aufgebracht und bei 45 OC drei Stunden getrocknet,
um die Reagenzlage zu bilden. Nach leichtem Anfeuchten der Oberfläche der Reagenzlage
wurde ein Membranfilter (TM-500 von Toyo Filter Paper Co.) unter Druck aufgeklebt
und das Laminat auf 5 x 10 mm geschnitten, um das Analysenhilfsmittel zu erhalten.
Dann wurde das Hilfsmittel zur leichteren Handhabung auf das Ende eines Halters
aus 5 x 70 mm Polyesterfilm unter Verwendung eines Doppelklebstreifens (beidseitig
mit Klebstoff beschichteter Streifen) geklebt.
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Proben von je 10 pl Serum bekannter Konzentrationen wurden auf das
so hergestellte Analysenhilfsmittel getropft und 4 Minuten nach dem Auftropfen das
Reflektionsvermögen bei 560 nm Licht gemessen (unter Verwendung eines-Spektrofotometers
220A mit Integrationskugel für Reflexionsstärkemessungen, hergestellt von Hitachi
Ltd.). Die den Harnsäurekonzentrationen entsprechenden gemessenen Reflexionsvermögen,
auch mit Reflexionsstärken bezeichnet, die erhalten worden sind, sind in Tabelle
1 zusammengestellt. Die Standardkurve, die das Verhältnis von Harnsäurekonzentration
im Blut zu Reflexionsvermögen wiedergibt, ist in Fig. 5 gezeigt.
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Tabelle 1 Probe Konzentration Reflexionsvermögen A 1,38 mg/dl 45,3
B 0,95 mg/dl 50,2 C 1,21 mg/dl 47,8 D 6,12 mg/dl 22,1 E 12,47 mg/dl 13,2 Beispiel
2 - Analysenhilfsmittel für Bilirubinbestimmung Sulfosalicylsäure 6,0 g Sulfanilsäure
1,0 g Natriumnitrit 0,5 g Carboximethylcellulose 1,5 g gereinigtes Wasser 100 ml
Unter Verwendung eines Reagenzes vorstehender Zusammensetzung wurde ein Analysenhilfsmittel
aus mehreren miteinander verbundenen Lagen der gleichen Art, wie in Fig. 1 dargestellt,
hergestellt. Auf dieses Analysenhilfsmittel wurden zwei Typen von Patienten-Blutserum
aufgetropft und gleichzeitig 10 Mehrfachmessungen des Reflexionsvermögens bei Licht
von 565 nm an jedem Beispiel 3 Minuten nach dem Auftropfen vorgenommen. Dies ergab
gute Reproduzierbarkeit, wie aus der Tabelle 2 zu ersehen.
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Tabelle 2 n Probe A (ru6) Probe B (R%) 1 26,8 14,7 2 28,1 14,3 3
2712 .14,7 4 26,8 15,1 5 27,5 14,6 6 27,6 14,5 7 27,4 14,6 8 27,6 15,0 9 27,3 14,9
10 26,7 14,6 x 27,3 14,7 S.D. 0,44 0.,24 Die Bilirubin-Konzentration der beiden
Serumproben war, bestimmt nach der Eberin-Maloy-Methode (J. Biol. Chem.
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119,481, 1937): 3,2 mg/dl für die Probe A und 9,1 mg/dl für Probe
B.
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Beispiel 3 - Analysenhilfsmittel-für die Bestimmung der Milchsäure-Dehydrogenase
NADH (Nicotinamid-adenindinucleotidreduzierter Typ) 60 mg Lithium-pyruvat 20 mg
Bridge 35 1,0 g-Polyvinylalkohol (Nr. 500) 15 g 0,1M Phosphorsäurepufferlösung 100
ml
Unter Verwendung eines Reagenzes der vorstehenden Zusammensetzung
wurde ein Mehrlagen-Analysenhilfsmittel wie in Beispiel 1 hergestellt. Zwei Typen
von Kontrollseren (Multienzym von flighland Co.) wurden auf dieses Analyse hilfsmittel
aufgetropft und das Reflexionsvermögen von 340 nm Licht an diesen Proben gemessen.
-Es gab gute Reproduzierbarkeit, wie aus Tabelle 3 zu ersehen. Die Indikation der
beiden Kontrollserumproben war 373 U/1 für A und 643 U/1 für B.
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Tabelle 3 n Probe A tR%) Probe B (R%) 1 8,6 15,9 2 8,3 14,7 3 8,4
16,2 4 8,6 15,8 5 9,2 16,3 6 8,5 14,9 7 8,6 15,4 8 8,8 16,5 9 7,9 16,1 10 9,1 16,2
X 8,6 15,8 S.D. 0,38 0,61
Beispiel 4 - Analysenhilfsmittel für
Glucosebestimmung Glucose-Oxidase 100 mg Peroxidase 200 mg 4-Aminoanitipyrin 100
mg Natriumalginat (30 cps) 3g 3,5-Dimethoxi-N-ethyl-N-(2-hydroxi-3-sulfopropyl)-anilin
Natriumsalz 300 mg Tween 20 200 mg 0,fM Zitronensäurepufferlösung (pH 5,5) 100 ml
Ein Reagenz der vorstehenden Zusammensetzung wurde gleichmäßig in einer Dicke von
0,2 mm und einer Breite von 20 mm auf einen weißen Polyesterfilm (von Toray Co.)
aufgebracht und bei 40 OC zwei Stunden unter Bildung einer Reagenzlage getrocknet.
Nach leichtem Anfeuchten der Oberfläche der Reagenzlage wurde ein 2 cm breites feines
Baumwolltuch (von Toyobo Co., Ltd.) mittels Druck damit verbunden. Der Reagenzteil
wurde in Auftragsrichtung in zwei Hälften geschnitten und dann im rechten Winkel
dazu auf eine Breite von 5mm. So wurde ein Mehrlagen-Analysenhilfsmittel mit einer
Nachweislage und einerReagenzlage von 5 x 10 mm erhalten.
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Auf diese Analysenhilfsmittel wurden je 10 1ll verschiedene wäßrige
Glucoselösungen getropft und nach 3 Minuten das Lichtreflexionsvermögen in gleicher
Weise wie.in Beispiel 1 gemessen. Die Eichkurve, die das Verhältnis zwlschen
Glucosekonzentration
und Lichtreflexionsvermögen repräsentiert, ist in Fig. 6 wiedergegeben.
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Je 10 pl von 30 Typen von Patienten-Blutserum wurden auf die Mehrlagenanalysen-Hilfsmittel
getropft und das Reflexionsvermögen nach 3 Minuten gemessen, um die Konzentration
mit Hilfe der Eichkurve in Fig. 4 zu bestimmen.
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Die Glucosekonzentration wurde auch mit einem Glucoseanalysiergerät
nach dem Prinzip der GOD-Sauerstoff-Elektrodenmethode (Glucolizer von Kyoto Daiichi
Kagaku, Ltd.) bestimmt. Das Verhältnis zwischen beiden Meßergebnissen ist in Fig.
7 gezeigt. Beide Messungen stimmen gut überein mit dem Korrelationskoeffizienten
von 0,992 und der Regressions-Geradengleichung y = 0,99x - 0,6 (x ist das Meßergebnis
des Glucose-Analysiergerätes und y das des Analysenhilfsmitte ls).
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Beispiel 5 - Analysenhilfsmittel für Glucosebestimmung Ein Analysenhilfsmittel
wurde wie in Beispiel 4 hergestellt, ausgenommen, daß die 3 g Natriumalginat gegen
10 g Gelatine ausgetauscht wurden. Nach Bebrüten bei 37 oC unmittelbar nach Auftropfen
der Probe ging die Gelatine in der Reagenzlagevom Gel in den Sol-Zustand über, und
die in der Reagenzlage erzeugte blaue Substanz diffundierte in die Nachweislage,
eine blaue Farbe zeigend, die der Glucose-Konzentration in der Probe entsprach.
Die
Konzentration jeder der unterschiedliche Glucosekonzentration
aufweisenden Serumproben wurde 15 mal mit Bezug auf die Eichkurve gemessen, die
vorher mit Glucosestandardlösungen aufgezeichnet worden war es gab einen Schwankungskoeffizienten
(CV%) von 1 bis 3 %.
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Die vorstehenden Beispiele sind bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung;
es sei bemerkt, daß. viele Änderungen daran vorgenommen werden können, die noch
in den Rahmen der Erfindung fallen.
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Als Substrat kann irgendein Material verwendet werden, soweit es Licht
reflektieren kann und die notwendige Festigkeit für das Analysenhilfsmittel hat.
Es ist nicht auf eine Ein-Lagen-Struktur beschränkt, Mehrlagenstrukturen, wie z.B.
transparente Kunststoffilme oder Folien, versehen mit einem Überzug oder mit gefärbten
Kunststoffilmen zusammengeklebt, können verwendet werden. -Bei demAnalysenhilfsmittel
1', das einen Halter 5 hat, kann das Substrat aus transparentem Kunststoffilm sein,
wenn der Halter 5 aus Licht reflektierendem Material ist. Kurz gesagt, wenn ein
Halter verwendet wird, genügt es, wenn das gesamte Substratsystem einschließlich
Halter, das Befestigungsmittel, wie Klebeband, die vorstehenden Eigenschaften hat.
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Die Gestalt des Halters 5 kann quadratisch sein, wie in
Fig.
3 gezeigt. In diesem Fall kann das Analysenhilfsmittel die gleiche Form wie der
Halter 5 haben.
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Außerdem kann das Substrat selbst ausgedehnt sein, wie in Fig. 4 gezeigt,
um den Halter zu bilden, und die Reagenzlage 3 kann direkt auf einen Teil der Folie
usw.
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laminiert sein, dicker als in den vorstehenden Beispielen, und auf
geeignete Größe geschnitten, um ein Analysenhilfsmittel 1B aus mehreren miteinander
vereinigten Lagen zu bilden. Die Analysenhilfsmittel 1, 1A und 1B stehen in verschiedenen
Formen zur Verfügung, wie als durchgehende Bänder oder Streifen mit Rahmen, in Übereinstimmung
mit den Mitteln zur Vereinigung oder den Gebrauch.
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Der Reagenzlage 3 kann ein Netzmittel oder ein Surfactant zugefügt
werden, wenn erforderlich. Das Bindemittel der Reagenzlage kann irgendeines sein,
wenn es das Reagenz halten kann.
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Die Nachweis lage 4 kann aus irgendeinem Material sein, wenn es der
Probe gestattet hindurchzudringen und wenn es die Reaktionsmischung halten kann.
Der Nachweis lage kann, wenn erforderlich, ein Netzmittel, ein Surfactant oder Ascorbinsäure-Oxidase
zur Zersetzung der Ascorbinsällre zugesetzt sein.
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Wie weiter vorn näher erläutert, ist das Mehr lagen-Analysenhilfsmittel
nach der Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß es ein Laminat ist von: einem Substrat
oder einem Substratsystem, das einer Flüssigkeit nicht gestattet hindurchzudringen,
das aber Licht reflektiert; einer Reagenzlage, die an einer Seite des Substrats
oder einer Substratlage angefügt ist und ein Reagenz enthält, das eine optisch nachweisbare
Änderung durch Reagieren mit der Komponente in der Probe verursacht; und einer optischen
Nachweis lage, die an der Oberfläche der Reagenzlage gegenüber dem Substrat angefügt
ist und gleichmäßige Diffusion des optisch nachweisbaren Materials gestattet.
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Demgemäß erfordert das Analysenhilfsmittel nach der Erfindung nicht,
daß überschüssige Probe entfernt wird.
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Das Analysenhilfsmittel gestattet gleichmäßigen Übergang der Probe
in die Reagenzlage und gleichmäßige Diffusion des optisch nachweisbaren Materials
in die Nåchweislage.
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Daher kann die Konzentration der gesuchten Komponente in der Probe
einfach und genau lediglich durch Auftropfen der Probe und Abwarten eine bestimmte
Zeit bestimmt werden.
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Außerdem gestattet es die Einstellung des Verhältnisses von Reagenzmenge
und Probemenge entsprechend der relativen Menge der gesuchten Komponente lediglich
durch Änderung der Dicke der Nachweislage und des Materials, trotzdem es ein festesReagenz
ist.
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Ferner gibt das Analysenhilfsmittel nach der Erfindung höhere Analysiergenauigkeit
und genaue Analyse von Spurenkomponenten infolge der höheren Reaktivität im Vergleich
zu der Reaktion im Gelzustand, die bei übli chen mehrlagigen Analysenelementen festgestellt
wurde, weil sich das als Bindemittel in der Reaktionslage verwendete hydrophile
Polymer in der flüssigen Probe löst und ein Sol bildet, so daß die Reaktion mit
der gesuchten Komponente in flüssigem oder Solzustand abläuft.
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So gestattet die Erfindung die Herstellung eines mehrlagigen Analysenhilfsmittel
in guter Produktionskapazität. Das Analysenhilfsmittel läßt sich ausgezeichnet handhaben
und ist wirtschaftlich und gestattet eine schnelle,einfache, genaue Analyse der
Konzentration der Komponenten in sehr kleinen Probemengen. Der praktische Wert ist
außerordentlich groß.
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Das Verfahren nach der Erfindung kann nicht nur mit den vorstehend
beschriebenen Analysenhilfsmitteln durchgeführt werden, sondern allgemein mit solchen
Konstruktionen, in denen die Reaktion zwischen der Probelösung und der Reagenzlage
im flüssigen Zustand oder Solzustand abläuft und die Reaktionsprodukte in die Nachweis
lage diffundieren.