DE2660069C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Dispersion von Liposomen.

Es ist bekannt, daß gewisse Lipide die Eigenschaft besit­ zen, in Anwesenheit von Wasser mesomorphe Phasen zu bilden, deren Anordnungszustand bzw. Aufbau zwischen dem kristallinen und dem flüssigen Zustand liegt. Es ist bekannt, daß gewisse Lipide, die mesomorphe Phasen bilden können, in wäßriger Lösung quellen können, wobei in dem wäßrigen Milieu disper­ gierte Kügelchen entstehen, die aus multimolekularen Schichten und vorzugsweise aus bimolekularen Schichten mit einer Dicke von etwa 3 bis 10 nm bestehen (vgl. insbesondere Bangham, Standish und Watkins, J. Mol. Biol., 13, 238 (1965)).

Bisher war es nur möglich, Lipidkügelchen, die aus konzentri­ schen Blättchen bzw. Lamellen bestehen, unter Anwendung von Lipiden herzustellen, die eine ionische hydrophile Gruppe und eine lipophile Gruppe aufweisen, und die beschriebenen Her­ stellungsverfahren führen zu Kügelchen mit einem mittleren Durchmesser unter 100 nm. Das Herstellungsverfahren für diese Kügelchen besteht darin, eine Dispersion zu bilden, deren dis­ perse Phase die zur Bildung der Kügelchen geeignete lipide Sub­ stanz enthält und diese Dispersion einer Ultraschallbehandlung zu unterziehen. Zur Erzielung der einer Ultraschallbehandlung zu unterziehenden Dispersion kann man zunächst an einer Wand bzw. Fläche durch Verdampfen einen dünnen Film der zu disper­ gierenden lipiden Substanz bilden, anschließend die kontinuier­ liche Phase der zu bildenden Dispersion in Kontakt mit der so überzogenen Fläche bringen und schließlich rühren bzw. bewegen, um die der Ultraschallbehandlung zu unterziehende Dispersion zu erhalten. Gemäß einem anderen in der französischen Patentschrift 22 21 122 beschriebenen Verfahren kann man auch zur Herstellung der der Ultraschallbehandlung zu unterziehenden Dispersion das zur Bildung der Wände der Kügelchen bestimmte Lipid einer wäß­ rigen Phase zuführen und anschließend leicht erwärmen und kräf­ tig unter Schütteln rühren. Die aus konzentrischen Blättchen bzw. Lamellen bestehenden Kügelchen, die man so erhält und die einen maximalen Durchmesser von etwa 100 nm aufweisen, werden im allgemeinen Liposome genannt.

Man hat auch bereits empfohlen, Liposome zum Einschluß von wäßrigen Lösungen zu verwenden, die in den zwischen den Lipid­ doppelschichten enthaltenen wäßrigen Räumen aktive Substanzen enthalten, und so die eingekapselten Substanzen gegen Einwirkun­ gen von außen zu schützen (vgl. insbesondere Sessa und Weismann, J. Lipid Res., 9, 310 (1968) und Magee und Miller, Nature, Vol. 235 (1972)).

Auch die DE-OS 22 49 552 beschreibt ein Verfahren zur Her­ stellung von Liposomen mit einem maximalen Durchmesser von 100 nm. Dieses Verfahren besteht darin, daß man nach einer ersten Variante ein Lipid zu einer wäßrigen Phase gibt und leicht erwärmt, heftig schüttelt und anschließend mit Ultra­ schall behandelt. Nach einer zweiten Variante überführt man eine in einem Lösungsmittel gelöste disperse Phase in einen dünnen Film durch Verdampfen des Lösungsmittels und bringt diesen dünnen Film anschließend mit einer wäßrigen oder nicht wäßrigen Phase unter starker Agitation in Kontakt. Daran schließt sich eine Ultraschallbehandlung an. Die auf diese Weise erhaltenen Liposomen sind dazu geeignet, Lösungen che­ mischer Substanzen einzuschließen.

Da die Liposome variable Größen im Bereich unter 100 nm aufweisen können, kann man ihr Penetrationsver­ mögen in den menschlichen Körper variieren, wodurch zahlreiche Anwendungen auf dem Gebiet der Pharmazie in Betracht gezogen wurden, um so mehr als es ihre äußere elektrische Ladung ermög­ lichen kann, ihr Fixierungsgebiet auszuwählen (Biochem. J. (1971), 124, S. 58 P). Auf dem Gebiet der Kosmetik jedoch können durch die Anwendung von Kügelchen mit Durchmessern unter 100 nm Nach­ teile entstehen, da die Gefahr des Eindringens der Produkte durch die Haut besteht. Es ist daher ersichtlich, daß zumindest für diesen Anwendungszweck die Erzielung von Liposomen aus kon­ zentrischen Lipidblättchen bzw. Lamellen mit einem Durchmesser über 100 nm wünschenswert wäre.

Darüber hinaus besitzen die bisher zur Erzielung von Liposomen bekannten Verfahren, die zwischen ihren konzentrischen Lipid­ blättchen aktive Substanzen einschließen, beträchtliche Nach­ teile: in erster Linie wird die in der kontinuierlichen Phase der Dispersion, die man der Ultraschallbehandlung unterzieht, enthaltene aktive Substanz nur zu einem sehr geringen Aus­ maß zwischen die Lipidblättchen der Liposomen eingeschlossen, da sich zwischen den genannten Blättchen nur ein sehr geringer Teil der kontinuierlichen Phase der Dispersion eingeschlossen befindet. Wünscht man die Einkapselungs-Liposome zu isolieren, so ist es notwendig, die Dispersion, die man einer Ultraschall­ behandlung unterzogen hat, über eine Trennkolonne vom Typ "Sephadex" zu leiten, wobei man die Liposome in Form einer äu­ ßerst verdünnten Dispersion wieder erhält. Hieraus ergibt sich einerseits, daß es praktisch nicht möglich ist, mit bekannten Verfahren eine große Konzentration an Liposomen zu erhalten und andererseits, daß die aktive Substanz nur zu einem geringen Aus­ maß umkapselt ist und beim Eluieren der Trennkolonne verloren geht, ohne daß es praktisch möglich ist, sie in einfacher Weise wiederzugewinnen, wodurch sich die Gestehungskosten der in die Liposome eingeschlossenen aktiven Substanzen stark erhöhen. Es besteht daher ein Bedürfnis nach einem Herstellungsverfahren für Liposome aus konzentrischen Blättchen bzw. Lamellen, das die Herstellung einer hohen Konzentration an Liposomen mit einem verringerten Verlust an zwischen den Blättchen bzw. La­ mellen der Liposomen eingekapselten Produkt ermöglicht.

Darüber hinaus ist es bei den bisher bekannten Herstellungsver­ fahren von Liposomen so, daß man nur bestimmte Kategorien von Lipiden verwenden kann: so wurde bisher die Ver­ wendung von Phospho-lipiden, Lipiden mit einer hydrophilen ionischen und einer lipophilen Gruppe und von ungesättigten Fett­ säuren verwendet.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Ver­ fahrens zur Herstellung einer wäßrigen Dispersion von Liposomen mit einem Durchmesser unter oder über 100 nm mit erhöhten Konzentrationen und mit hoher Stabilität und geringer Permeabilität, wobei die Kügelchen aktive Substanzen mit einer großen Einschlußausbeute umkapseln können.

Der hier verwendete Ausdruck "einschließen" bzw. "umkapseln" soll anzeigen, daß man über eine wäßrige Phase im Inneren einer Kapsel verfügt, die aus Lipidkügelchen gebildet wird.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer Dispersion von Liposomen, die aus molekularen Schichten von ionischen Lipidverbindungen der Formel X - Y, worin X eine hydrophile ionische und Y eine lipophile Gruppe bedeuten, bestehen, die eine wäßrige Phase einschließen, wobei man mindestens eine in Wasser dispergierbare flüssige Lipidverbindung der obigen Formel und eine in die Liposomen einzuschlie­ ßende wäßrige Phase vermischt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß das Lipophil/Hydrophil-Verhältnis des Lipids so gewählt wird, daß das Lipid in der einzuschließenden wäßrigen Phase quillt und unter Rühren bzw. Bewegen eine lamellenartige Phase bildet, und daß man anschließend eine Dispergierflüssigkeit im Überschuß zur erhaltenen lamellenartigen Phase gibt und 15 Minuten bis 3 Stunden kräftig bewegt oder schüttelt.

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen beträgt das Gewichtsver­ hältnis von wäßriger einzuschließender Phase, die in Kontakt mit den Lipiden gebracht wird, und der die lamellenartige Phase bildenden Lipide 0,1 bis 3; kann die wäßrige einzuschließende Phase Wasser oder eine wäßrige Lösung des aktiven Produkts sein; liegt das Gewichtsverhältnis von Dispersionsphase, die man zufügt, zu der lamellen­ artigen Phase, die man dispergiert, bei 2 bis 100; sind die Dispersionsphase und die einzuschließende wäßrige Phase isoosmotisch; kann die Dispersionsphase vorteilhaft eine wäßrige Lösung sein; wird das Bewegen bzw. Rühren als letzte Phase des Verfahrens mittels eines Schüttlers durch­ geführt; wird das Verfahren bei Raumtemperatur oder einer höheren Temperatur durchgeführt, wenn das Lipid bei Raum­ temperatur fest ist, vorzugsweise bei einer Temperatur, die mindestens gleich der Schmelztemperatur des Lipids ist.

Zur Bildung der Lamellenphase kann man ein einziges Lipid oder eine Mischung von Lipiden verwenden. Das (die) Lipid(e), das bzw. die man verwendet, weist bzw. weisen eine lange lipophile Kette mit 12 bis 30 Kohlenstoffatomen auf, die gesättigt oder ungesättigt, verzweigt oder linear sein kann. Man kann insbesondere Ketten des Olein-, Lanolin-, Tetradecyl-, Hexadecyl-, Isostearyl-, Laurin­ alkohols bzw. Oleyl-, Lanolyl-, Tetradecycl-, Isostearyl-, Lauryl- oder Alkylphenylketten wählen. Vorzugsweise ist die Verbindung X - Y eine zwei lipophile Ketten enthaltende Asparaginverbindung oder eine Assoziation von zwei organi­ schen Ionen mit langer Kette und umgekehrtem Vorzeichen.

Man kann eine einzuschließende wäßrige Phase verwenden, die aktive Substanzen jeglicher Art und insbesondere Substanzen ent­ hält, die von pharmazeutischem Interesse, von Interesse auf dem Nahrungsmittelgebiet sind oder Substanzen mit einer kosmetischen Wirksamkeit. Die aktiven Substanzen können beispielsweise, was die Kosmetik betrifft, Produkte sein, die zur Pflege der Haut oder der Haare bestimmt sind, beispielsweise Befeuchtungsmittel, wie Glycerin, Sorbit, Pentaerythrit, Inosit, Pyrrolidoncarbonsäure und ihre Salze; künstliche Bräunungsmittel, wie Dihydroxyaceton, Ery­ thrulose, Glycerinaldehyd, die δ-Dialdehyde, wie der der Weinsäure entsprechende Aldehyd (wobei diese Produkte gegebenenfalls zu­ sammen mit Farbstoffen vorliegen können); wasserlösliche Sonnen­ schutzmittel; Antitranspirationsmittel, desodorierende Mittel, adstringierende Mittel, erfrischende, tonisierende, narbenbil­ dende, keratolytische, enthaarende Produkte; wäßrige Parfums, Extrakte von tierischen oder pflanzlichen Geweben, wie Proteine, Polysaccharide, Amnionsflüssigkeiten; wasserlösliche Farbstoffe, Antischuppenmittel, Antiseborrhoemittel, Oxidationsmittel (Ent­ färbungsmittel), wie Wasserstoffperoxid, Reduktionsmittel, wie Thioglykolsäure und deren Salze. Als pharmazeutisch wirksame Substanzen kann man nennen: Vitamine, Hormone, Enzyme (beispiels­ weise Dismutasesuperoxid), Vaccine, antiinflammatorische Mit­ tel (z. B. Hydrocortison), Antibiotika, Bactericide.

Die Lipide zur Einkapselung der gewünschten wäßrigen Phase in stabiler Weise wählt man je nach Funktion der in der wäßrigen Phase enthaltenen aktiven Substanzen. Zur Erzielung stabiler Liposomen aus den die lamellenartige Phase bildenden Lipiden sollte eine ausreichende laterale bzw. Seitenkettenwirkung zwischen den Ketten der Lipide vorliegen, die, Seite an Seite liegend, die Schichten oder Blättchen der Kü­ gelchen bilden, so daß die Van-der-Waals-Kräfte zwischen den Ket­ ten eine ausreichende Kohäsion der Blättchen bzw. Lamellen si­ cherstellen. Diese Bedingung ist für die Lipide mit den Charakteristika der vorstehend gegebenen allgemeinen De­ finition erfüllt. Die Lipide, die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, gehören der Klasse der Emulgiermittel vom Typ Wasser-in-Öl an.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die einzukapselnde wäßrige Phase eine wäßrige Lösung einer aktiven Substanz; die aktiven Substanzen der wäßrigen einzukapselnden Phase sind Produkte mit kosmetischer Wirkung; die kontinuierliche Phase der Dispersion ist eine wäßrige Phase; der Gewichtsanteil der Kü­ gelchen, bezogen auf das Gewicht der kontinuierlichen Phase der Dispersion liegt bei etwa 0,01 bis etwa 0,5; die kontinuierliche Phase der Dispersion ist vorteilhaft isoosmotisch mit der in die Liposomen eingeschlossenen wäßrigen Phase.

Die wäßrigen Dispersionen sind insbesondere interessant auf dem Gebiet der Kosmetik, da die Anwendung von Liposomen mit großen Dimensionen die Gefahren verringert, die sich durch das Eindringen der Präparate durch die Haut ergeben.

Die Anwendung der erfindungsgemäßen wäßrigen Dispersionen in der Kosmetik hat einen beträchtlichen Vorteil im Vergleich zur Anwendung von Emulsionen. Wünscht man in der Praxis Präparate anzuwenden, die gleichzei­ tig Fettkörper und Wasser enthalten, so ist es notwendig, zur Sicherstellung der Stabilität der Emulsion amphiphile Emulgier­ mittel zu verwenden. Es ist bekannt, daß bestimmte Emulgier­ mittel eine ziemliche Reizwirkung ausüben können, wenn sie auf die Haut aufgetragen werden. Im Rahmen der vorliegenden Erfin­ dung wurde gefunden, daß diese Wirkung der Emulgiermittel mit gegebener chemischer Struktur beträchtlich von der Form abhängt, in der sie angewendet werden. So konnte bewiesen werden, daß eine Wasser/Öl-Emulsion aus 42% Perhydrosqualen, 8% Emulgier­ mittel und 50% Wasser eine starke Reizwirkung ausübt, wohin­ gegen eine wäßrige Dispersion mit 8% des gleichen Emulgier­ mittels praktisch eine unbedeutende Reizwirkung aufweist und das Perhydrosqualen absolut unschädlich ist. Hieraus ergibt sich ein Synergismus für die Reizwirkung, wenn man ein Emul­ giermittel und eine ölige Phase vorliegen hat. Die erfindungs­ gemäßen wäßrigen Dispersionen ermöglichen es, gleichzeitig ein Emulgiermittel und ein Öl zu verwenden, wodurch sich auf dem Ge­ biet der Kosmetik ein beträchtlicher Vorteil ergibt.

Es sei festgestellt, daß man zu den erfindungsgemäßen Disper­ sionen von Liposomen verschiedene Hilfsstoffe fügen kann, um das Aussehen oder den organoleptischen Charakter zu modifizie­ ren, wie Trübungsmittel, gelbildende Mittel, aromagebende Mit­ tel, Parfums oder Farbstoffe.

Die erfindungsgemäßen Dispersionen ermöglichen die Einarbeitung von hydrophilen Substanzen in ein im wesentlichen lipophiles Medium. Es ergibt sich unter diesen Bedingungen, daß diese in maskierter Form vorliegen, woraus ein Schutzeffekt gegenüber verschiedene mögliche verändernde Einwirkungen, wie Oxidations­ mittel, Verdauungssäfte und allgemein gegenüber den eingekapsel­ ten Substanzen reaktive Verbindungen resultiert. Das Eindringen und/oder die Fixierung der aktiven Substanzen kann durch Variation der Größe der Kügelchen und ihrer elektrischen Ladung modifi­ ziert werden. Ihre Wirkung kann auch aufgeschoben werden (Ver­ zögerungseffekt). Darüber hinaus erlaubt es die Maskierungswir­ kung, ihren organoleptischen Charakter und insbesondere den Ge­ schmack zu unterdrücken oder wesentlich zu verändern. Schließ­ lich weisen die in den Präparaten verwendeten Lipide selbst eine günstige, beispielsweise weichmachende, gleitendmachende oder glänzendmachende Wirkung auf.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

In einem 50 ml-Rundkolben bringt man 300 mg Sphingomyelin mit 0,350 ml einer 0,3 m-Lösung von Glucose in Kontakt und homogeni­ siert die Mischung bei Raumtemperatur.

Man fügt darauf 5 ml einer 0,145 m-Lösung von NaCl, KCl zu. Der Kolben wird in eine Schüttelvorrichtung eingebracht und zwei Stunden unter kräftiger Bewegung gehalten.

Man erhält eine milchige Dispersion mit einem Durchmesser der Liposomen von etwa 2 µm.

Beispiel 2

In einem 50 ml-Rundkolben bringt man 300 mg Sphingomyelin mit 0,350 ml einer 0,3 m-Lösung von Ascorbinsäure in Kontakt und homogenisiert die Mischung bei Raumtemperatur.

Man fügt darauf 2,650 ml einer 0,145 m-Lösung von NaCl, KCl zu. Man bringt den Kolben in eine Schüttelvorrichtung ein und bewegt kräftig während 4 Stunden.

Man erhält eine milchige Lösung und einen Durchmesser der Liposomen von etwa 2 µm.

Gegebenenfalls kann man die Dispersion über eine Kolonne von "grobem Sephadex G 50", gequollen in einer 0,145 m-Lösung von NaCl, KCl filtrieren.

Beispiel 3

In einem 50 ml-Rundkolben löst man 142 mg des Natriumsalzes von N²-(Alkyl-Talg)-N-dodecyl-N-(N′, N′-diäthylaminoäthyl)-asparagin in 2 ml einer Chloroform-Methanolmischung im Verhältnis 2 : 1. Man verdampft das Lösungsmittel mittels eines Rotationsverdampfers und eliminiert letzte Spuren an Lösungsmittel durch einstündige Behandlung des Produkts unter dem verminderten Druck einer Flü­ gelpumpe.

Man bringt 10 ml einer 0,3 m-Lösung von Glucose mit dem Lipid in Kontakt.

Der auf eine Schüttelvorrichtung aufgebrachte Kolben wird vier Stunden kräftig bewegt, wobei man bei Raumtemperatur arbeitet. Die Größe der Liposomen liegt bei etwa 1 µm. Die Dispersion wird anschließend über eine Kolonne von "grobem Sephadex G 50"-Gel, gequollen in einer Lösung von 0,145 m (NaCl, KCl) filtriert.

Claims (8)

1. Verfahren zur Herstellung einer Dispersion von Liposomen, die aus molekularen Schichten von ionischen Lipidverbin­ dungen der Formel X - Y, worin X eine hydrophile ioni­ sche und Y eine lipophile Gruppe bedeuten, bestehen, die eine wäßrige Phase einschließen, wobei man mindestens eine in Wasser dispergierbare flüssige Lipidverbindung der obigen Formel und eine in die Liposomen einzuschlie­ ßende wäßrige Phase vermischt, dadurch gekennzeichnet, daß
das Lipophil/Hydrophil-Verhältnis des Lipids so gewählt wird, daß das Lipid in der einzuschließenden wäßrigen Phase quillt und unter Rühren bzw. Bewegen eine lamellen­ artige Phase bildet, und
daß man anschließend eine Dispergierflüssigkeit im Über­ schuß zur erhaltenen lamellenartigen Phase gibt und 15 Minuten bis 3 Stunden kräftig bewegt oder schüttelt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die einzuschließende wäßrige Phase, die in Kontakt mit den Lipiden gebracht wird, und die die lamellenar­ tige Phase bildenden Lipide in einem Gewichtsverhältnis von 0,1 bis 3 verwendet.

3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als einzuschließende wäßrige Phase Wasser verwendet.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man als einzuschließende wäßrige Phase eine wäßrige Lösung eines aktiven Produktes verwendet.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man die Dispergierflüssigkeit und die lamellenartige Phase, die dispergiert werden soll, in einem Gewichtsverhältnis von 2 bis 100 verwendet.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man eine Dispergierflüssigkeit verwen­ det, die mit der wäßrigen einzuschließenden Phase isoosmo­ tisch ist.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man als Dispergierflüssigkeit eine wäßrige Lösung verwendet.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man bei einer Temperatur arbeitet, die mindestens gleich der Schmelztemperatur des Lipids bzw. der Lipide ist.