DE2658634C2

DE2658634C2 - Verfahren zur Bestimmung einer sauren Phosphatase und Reagenz hierfür

Info

Publication number: DE2658634C2
Application number: DE19762658634
Authority: DE
Inventors: Harald Dr. Arlesheim Galatti; Marc Dr. Genf Roth
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1975-12-24
Filing date: 1976-12-23
Publication date: 1984-03-01
Also published as: GB1563517A; NL7613768A; SE425098B; DD128970A5; CA1070597A; DE2658634A1; IT1154005B; FR2336683A1; JPS586480B2; CH625833A5; JPS5282386A; DK582776A; FR2336683B1; NL178798C; NL178798B; SE7614532L

Description

30

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung der sauren Phosphate menschlicher Herkunft, in welchem ein Reagens zur Aktivierung der sauren Phosphatase Verwendung findet.

Die saure Phosphatase ist ein Enzym, welches die Fähigkeit besitzt, im sauren pH-Bereich optimal Phosphomonoester zu spalten. Die saure Phosphatase menschlicher Herkunft kommt in verschiedenen Organen, wie z. B. in der Prostata, in der Leber, in der Milz oder in Blutzellen vor und geht bei Zellschädigungen in das Serum über. Die Bestimmung der sauren Phosphatase in Körperflüssigkeiten, insbesondere im Serum oder im Plasma spielt somit eine wichtige Rolle in der Diagnose von Erkrankungen der betreffenden Organe.

Die Aktivität der sauren Phosphatase im Serum oder Plasma wird vor allem beim Vorliegen eines Prostatakarzinoms oder einer Prostatahypertrophie wesentlich erhöht, und die Bestimmung dieser Prostataphosphatase-Aktivität ermöglicht die Diagnose dieser spezifisehen Erkrankungen.

Es wurde nun gefunden, daß die Aktivität der sauren Phosphatase menschlicher Herkunft durch Zusatz bestimmter geradkettiger Alkohole wesentlich erhöht werden kann. Da die Aktivität der sauren Phosphatase menschlicher Herkunft in Körperflüssigkeiten relativ gering ist, bedeutet eine Erhöhung dieser Aktivität einen eindeutigen technischen Fortschritt im Hinblick auf die Bestimmung dieses wichtigen Enzyms.

Aus der DE-AS 16 73 047 ist es bekannt zur Aktivierung der Phosphatase ein Polyol mit 3-6 C-Atomen und 3-6 Hydroxylgruppen, vorzugsweise D-Mannit zuzusetzen.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Bestimmung einer sauren Phosphatase mensch-Hcher Herkunft in einer Körperflüssigkeit, wobei man eine Lösung enthaltend als Substrat 50 μπιοΙ/1 bis 50 mmol/1 eines Phosphomonoesters, 50 bis 300 mmol/1 einer Puffersubstanz zum Einstellen eines pH-Wertes zwischen 4,5 und 6,5 und einen Alkohol als Aktivator bei einer Inkubatjoustemperatur zwischen 20° C und 45°C der enzymatischen Wirkung der zu untersuchenden Körperflüssigkeit unterwirft und den Substrat-Umsatz mißt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß als Aktivator n-Butanol, 1-Pentanol, 2-Pentanol und/oder 1,5-Pentandiol in einer Konzentration von 10 bis 300 mmol/1 eingesetzt wird. Überraschenderweise läßt sich mit den erfindungsgemäßen Aktivatoren, nicht jedoch mit D-Mannit, Prostataphosphatase in diesem Verfahren stark aktivieren.

Der als Substrat für die enzymatische Reaktion verwendete Phosphomonoester besitzt die allgemeine Formel

R-O- PO₃H₂
worin R ein beliebiger organischer Rest ist.

Vorzugsweise ist jedoch R ein Chromophor wie z. B. 4-Nitrophenyl, Thymolphthalein, Phenolphthalein, 2-Chlor-4-nitrophenyl; oder ein Fluorophor wie z. B. 1-Naphthyl. Als R kann aber auch Adenosin, Glycerin oder Phenyl in Frage kommen.

Für die eingesetzte Substratmenge wird vorzugsweise eine optimale Konzentration gewählt, die bei den einzelnen Substraten verschieden «st und auch vom pH-Wert beeinflußt wird. Die optimale Substratkonzentration, die bei einem bestimmten pH-Wert die maximal mögliche Enzym-Aktivität bewirkt, kann an Hand einer Substrat-Aktivitätskurve abgelesen werden.

Die Substrat-Aktivitätskurve für ein bestimmtes Substrat wird dadurch erhalten, daß unter sonst gleichen Bedingungen die Enzym-Aktivität mit verschiedenen Substrat-Konzentrationen gemessen wird.

In der Regel liegt die optimale Substratkonzentration für die saure Phosphatase zwischen 50 μΐηοΐ/ΐ und 50 mmol/1; vorzugsweise 60 μΐηοΐ/ΐ und 25 mmol/1. So beträgt bei einem pH-Wert von 5,5 die optimale Substratkonzentration ungefähr 25 mmol/1 für /?-Glycerophosphat, 2,5 mmol/1 für 4-Nitrophenylphosphat und 100 μηηοΐ/ΐ für Phenolphthalein-diphosphat.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird der pH-Wert mittels einer Puffersubstanz zwischen 4,5 und 6,5, vorzugsweise zwischen 5 und 6 eingestellt. Geeignete Puffersubstanzen sind z. B. Citratpuffer und Acetatpuffer. Die Pufferkonzentration liegt in der Regel zwischen 50 mmol/1 und 300 mmol/1, vorzugsweise 100 mmol/1.

Gemäß vorliegender Erfindung ist der verwendete Aktivator n-Butanol, 1-Pentanol, 2-Pentanol und/oder 1,5-Pentandio!. Besonders bevorzugt sind 1-Pentanol und 2-Pentanol.

Die Konzentration des Aktivators beträgt 10 bis 300 mmol/1, vorzugsweise 100 bis 200 mmol/1.

Der Aktivator kann einen oder mehrere dieser Alkohole enthalten. Mit Vorzug bestehtjedoch der Aktivator aus einem einheitlichen Alkohol.

Nach Vermischen einer Probe der zu analysierenden Körperflüssigkeit mit der Testlösung erfolgt die enzymatische Reaktion durch Inkubieren der Lösung bei einer definierten Reaktionstemperatur, die zwischen 20 und 40° C, vorzugsweise zwischen 30 bis 37° C liegt. Die Inkubationsdauer beträgt in der Regel zwischen 5 und 60 Minuten. Vorzugsweise wird jedoch die Reaktion nach 30 Minuten mittels einem geeigneten Zusatz wie z. B. mittels Natronlauge oder einer Trinatriumphosphatlösung abgestoppt.

Bei Auswahl eines geeigneten Substrates wie z. B. 2-Chlor-4-nitrophenylphosphat ;st es auch möglich, die enzymatische Reaktion kinetisch zu messen.

Der Substrat-Umsatz ist die Meßgröße für die Enzym-Aktivität. Er wird gemessen, indem die Abnahme des eingesetzten Phosphomonoesters oder die Zunahme des freigesetzten organischen Restes bestimmt wird. Da die Aktivierung der sauren Phosphatase durch eine Iransphosphorylierung, d. h. eine Phosphatübertragung vom eingesetzten Phosphomonoester auf den als Aktivator eingesetzten Alkohol erfolgt, entspricht die Menge des freien Phosphats nach der enzymatischen Reaktion nicht dem Substratumsatz und kann dementsprechend nicht als dessen Maß genommen werden.

Die Art der Messung hängt vom eingesetzten Substrat ab. So kann bei Verwendung von 4-Nitro-phenylphosphat, Thymolphthaleinphosphat, Phenolphthaleinphosphat oder bei Verwendung von Naphtyiphosphat die Zunahme des freigesetzten organischen Rests nach geeignetem Abstoppen der enzymatischen Reaktion direkt photometrisch bzw. fluorimetrisch bestimmt ^werden.

• Bei Verwendung anderer Substrate wie z. B. /?-Glyce-•.rophosphat, Phenylphosphat oder Adenosinmonophosiphat erfolgt die Messung des Substratumsatzes in der «Weise, daß der freigesetzte organische Rest chemisch oder enzymatisch in eine Substanz umgewandelt wird, die photometrisch gemessen werden kann.

So wird z. B. bei Verwendung von Phenylphosphat das freigesetzte Phenol mit Hilfe des Phenolreagens (Folin-Ciocalteus, Merck 9001) in einen blauen Farbstoff umgewandelt.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich sowohl für manuelle wie für automatische Bestimmungen der sauren Phosphatase. Als Bestimmungsgut können z. B. Serum, Plasma, Blut, Liquor oder Urin verwendet werden.

■ Den zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens notwendigen Reagenzien, nämlich Phosphomonoester, Puffer und Aktivator, können für diagnostische Zwecke geeignete Zusätze wie z. B. Detergentien wie Brij-35 (Polyoxyäthylenlauryläther) oder Stabilisatoren wie Magnesium-Ionen zugesetzt werden.

Die Reagenzien können in eine Reagenziengarnitur verpackt werden. Eine für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Reagenziengarnitur enthält in einem oder in mehreren Behältern

a) einen Phosphomonoester,

b) eine Puffersubstanz zum Einstellen eines pH- ^ Wertes zwischen 4,5 und 6,5,

c) den Alkohol als Aktivator.

Die Reagenziengarnitur kann auch noch zusätzlich einen Behälter mit einer Kontroll- oder Eichlösung und/oder einen Behälter mit einem Reagens zum Abstoppen der Reaktion und/oder einen Behälter mit einem zur weiteren Umwandlung des freigesetzten organischen Rests und/oder einen Behälter mit den erwähnten, für diagnostische Zwecke geeigneten Zusätzen, wie Detergentien oder Stabilisatoren, enthalten.

Es ist jedoch nicht notwendig, Reagenzien und Zusätze in separaten Behältern aufzubewahren. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine Reagenziengarnitur, worin einige der zur Durchführung des srilndungsgemäßen Verfahrens notwendigen Bestandteile gemeinsam im gleichen Behälter aufbewahrt werden.

So kann z. B. die Puffersubstanz zusammen mit dem Aktivator in gelöster Form in einem einzigen Behälter aufbewahrt werden.

Mit Ausnahme des Aktivators, welcher stets in flüssiger Form vorliegt, können die verschiedenen Reagenzien und Zusätze sowohl in flüssiger als auch in fester Form, wie z. B. als Pulver, Granulat, Tabletten oder Lyophilisat verpackt werden.

Die ErPndung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Zu 2,0 m! Substratpufferlösung, bestehend aus 0,1 mol/I Citratpuffer (pH 5,25), 5 g/l Brij-35 und 5 mmol/1 4-Nitrophenylphosphat, mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,1 ml saure Prostataphosphataselösung (isoliert nach der Methode von Lam et al., CHn. Chem. 19, 483, 1973) zugemischt und bei 37° C während 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1,0 ml 1 N Natronlauge abgestoppt und das freigesetzte 4-Nitro-Phenolat bei der Wellenlänge 405 nm photometrisch gemessen.
·:, Die Versuchsergebnisse werden ,in der nachstehenden Tabelle I in % der Prostataphosphatase-Aktivität ohne Zusatz von 1-Pentanol wiedergegeben.

1-Pentanol Konzentration in der	Beispiel	■ Aktivität der Prostata- I
Testlösung	phosphatase I
0 mmol/1	100%
50 mmol/1	137%
100 mmol/1	173%
150 mmol/1	189%
200 mmol/1	139%
2 I

Das Verfahren nach Beispiel 1 wird wiederholt mit 2-Pentanol anstatt 1-Pentanol. Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle II in gleicher Weise wiedergegeben.

2-Pentanol Konzentration in der	Aktivität der Prostata-
Testlösung	phosphatase
0 mmol/1	100%
50 mmol/1	138%
100 mmol/1	172%
150 mmol/1	190%
200 mmol/1	139%

Beispiel 3

Das Verfahren nach Beispiel 1 wird wiederholt mit 1,5-Pentandiol anstatt 1-Pentanol. Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle III wiedergegeben.

1,5-Pentandiol Konzentration in der Aktivität der Prostata-Testlösung phosphatase

0 mmol/1

50 mmol/1

100 mmol/1

100%
120%
131%

Fortsetzung

1,5-Pentandiol Konzentration in der Aktivität der Prostatu-Testlösung phosphatase

150	mmol/I	B	e i	sp	iel	140%	4
200	mmol/1				14C%

IO

Das Verfahren nach Beispiel 1 wird wiederholt mit 1-Butanol anstatt 1-Pentanol. Die Versuchsergebnisse werden in der nachsiehenden Tabelle IV wiedergegeben.

1-Butanol Konzentration in der
Testlösung

Aktivität der Proslataphosphalase

0 mmol/1

50 mmol/1

ilOO mmol/1

150 mmol/1

200 mmol/1

100% 119% 131% 131% 116%

15

20

Beispiel 7

Zu 0,2 ml 0,1 mol/1 Acetatpufl'er(pH 5,5), 5 mmol/14-Nitrophenylphosphat und 5 g/l Brij-35 mit unterschicllichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,1 ml Erythrozytenphosphatase zugmischt. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37⁰C wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 1,0 ml IN Natronlauge abgestoppt und das freigesetzte 4-Nitrophenolat bei der Wellenlänge 405 nm photometrisch bestimmt.

Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VH wiedergegeben.

1-Pentanol Konzentration in der
Testlösung

Aktivität der Erythrozytenphosphatase

0 mmol/1 50 mmol/1

100 mmol/1

150 mmol/I

200 mmol/I

100%
132%
153%
162%
136%

25

B e i s ρ i e 1 5 (Vergleichsbeispiel)

Das Verfahren nach Beispiel 1 wird wiederholt mit 1-Hexanol anstatt 1-Pentanol. Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle V wiedergegeben.

30

1-Hexanol Konzentration in der
Testlösung

Aktivität der Prostataphosphatase

35

0 mmol/1

25 mmol/1

50 mmol/i

100 mmol/1

100% 107% 114% 120%

45

Beispiel 6

Zu 2,0 ml 0,1 mol/1 Acetatpuffer, pH 5,5 mit 62 μπιοΙ/1 Phenolphthalein-di-Phosphat mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,05 ml Prostataphosphataselösung zugegeben und die Lösung während 15 Minuten bei 37° C inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion sowie zur Färb entwicklung werden 2,0 ml 0,4 mol/1 Natriumphosphatpuffer, pH 10 zugemischt und die Farbintensität bei der Wellenlänge 546 nm gemessen.

Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle VI wiedergegeben.

1-Pentanoi Konzentration in der	Aktivität der Prostata-
Testlösung	phosphatase ⁶⁰
0 mmol/1	100%
50 mmol/1	154%
100 mmol/1	174% ⁶¹
150 mmol/1	177%
200 mmol/1	131%

Beispiel 8

Zu 0,5 ml 0,1 mol/1 Citratpuffer, pH 5,5 und 5 mmol/1 4-Nitrophenylphosphat werden 0,1 ml Serum zugemischt. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37° C wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 2,5 ml 0,1 N Natronlauge abgestoppt und das freigesetzte 4-NitrophenoIat bei der Wellenlänge 4Ö5 nm photometrisch gemessen. Diese Aktivitätsbestimmung der sauren Phosphatase wird einmal ohne 1-Pentanol und einmal mit 150 mmol/1 1-Pentanol durchgeführt.

Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VIII wiedergegeben.

40

Aktivität ohne
1-Pentanol (U/l)

Aktivität mit 150 mmol/1 an 1-Pentanol (U/l)

Serum 1
Serum 2
Serum 3
Serum 4

1,12
16,63
18,41
20,65

2,10
24,55
31,53
33,59

Beispiel 9

Zu 2,0 ml 0,1 mol/1 Acetatpuffer, pH 5,5 und verschiedenen Konzentrationen an Phenylphosphat werden 0,1 ml Prostataphosphataselösung zugemischt. Nach 5 Minuten Inkubation bei 37° C werden 0,5 ml Phenolreagens (Folin-Ciocalteus) und 1,0 ml 20%ige Na₂COj-Lösung zupipettiert und die Mischung weitere 10 Minuten bei 37° C inkubiert. Die Intensität des blauen Farbstoffes, der der Konzentration an freigesetztem Phenol entspricht, wird bei der Wellenlänge 578 nm bestimmt. Die Versuche werden parallel einmal ohne 1-Pentanol und einmal mit 150 mmol/1 Pentanol-1 in der Substratpufferlösung durchgeführt.

Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IX wiedergegeben.

Fortsetzung

Phenylphosphatkonzentration
in der Testlösung

ohne 1-Pentanol

ΛΕ578 _nm/5 Min.

mit 150 mmol/l

4E578 nm/5 Min.

0,078 mmol/l	0,105	0,169
0,155 mmol/l	0,150	0,280
0,312 mmol/l	0,198	0,390
0,625 mmol/l	0,245	0,490
1,25 mmol/l	0,275	0,550
2,50 mmol/l	0,280	0,590
5,00 mmol/I	0,280	0,590
	Beispiel 10

Zu 1,0 ml 0,1 mol/I Acetatpuffer (pH 5,5) und 0,5 mmol/l Phenolphthalein-Monophosphat mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,05 ml gereinigte Prostataphosphataselösung zugemischt. Nach 10 Minuten Inkubation bei 37° C wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 2,0 ml 0,4 mol/1 Natriumphosphatpuffer vom pH 10 abgestoppt und das freigesetzte Phenolphthalein bei der Wellenlänge 546 nm photometrisch bestimmt.

Die Versuchsergebnisse sind- in der nachstehenden Tabelle X wiedergegeben.

I-Pentanol Konzentration in der
Testlösung

Aktivität der Prostataphosphatase

30 1-Pantanol Konzentration in der
Tesllösung

Aktivität der Prostaiaphosphatase

10

50	mmol/l	B e i sp i	el	125%
100	mrnol/l		135%
150	mmol/l		140%
			11

Zu 1,0 ml 0,1 mol/1 Citratpuffer(pH 5,75), l,2mmol/l Thymolphthaleinphosphat, 5 g/l Brij-35 mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,05 ml gereinigte Prostataphosphataselösung zugemischt. Nach 10 Minuten Inkubation bei 37° C wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 2,0 ml 0,2 mol/1 Bicarbonatpuffer vom pH 10 abgestoppt und das freigesetzte Thymolphthalein bei der Wellenlänge 578 nm photometrisch gemessen.

Die Resultate sind in der folgenden Tabelle XI zusammengestellt.

0 mmol/l

100%

1-Pentanol Konzentration in der	Aktivität der Prostata-
Testiösung «	phosphatase
0 mmol/l	100%
50 mmol/l	117%
100 mmol/l	125%
150 mmol/l	140%

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung einer sauren Phosphatase menschlicher Herkunft in einer Körperflüs- ^r» sigkeit, wobei man c ine Lösung enthaltend als Substrat 50 μΐηοΐ/l bis 50 mmol/1 eines Phosphomonoesters, 50 bis 300 mmol/1 einer Puffersubstanz zum Einstellen eines pH-Wertes zwischen 4,5 und 6,5 und einen Alkohol als Aktivator bei einer Inkubationstemperatur zwischen 20° C und 45° C der enzymatischen Wirkung der zu untersuchenden Körperflüssigkeit unterwirft und den Substrat-Umsatz mißt, dadurch gekennzeichnet, daß als Aktivator n-Butanol, 1-Pentanol, 2-Pentanol und/oder 1,5-Pentandiol in einer Konzentration von 10 bis 300 mmol/1 eingesetzt wird.

2. Reagenz zur Bestimmung einer sauren Phosphatase menschlicher Herkunft enthaltend als Substrat 50 μΐηοΐ/ΐ bis 50 mmol/1 eines Phosphomonoesters, 50 bis 300 mmol/1 einer Puffersubstanz zum Einstellen eines pH-Wertes zwischen 4,5 und 6,5 und einen Alkohol als Aktivator, dadurch gekennzeichnet, daß der Aktivator n-Butanol, 1-Pentanol, 2-Pentanol und/oder 1,5-Pentandiol ist und in einer Konzentration von 10 bis 300 mmol/1 vorliegt.