DE2115748C3 - Verfahren zur Bestimmung der sauren Phosphatase - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung der sauren Phosphatase

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Description

in der
Ri eine Methyl- oder Methoxygruppe, R2 ein Chloratom, eine Nitro- oder Benzamidogrup-
peund R3 ein Chloratom oder eine Methoxygruppe
bedeuten und einer der Substituenten Ri, R2 oder R3 ein Wasserstoffatom sein kann, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Reaktion in Gegenwart der diazotierten Verbindung durchgeführt wird.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der sauren Phosphatase, insbesondere der sauren Prostataphosphatase im Serum.
Saure Phosphatasen, d. h. Phosphatasen, die im sauren pH-Wert-Bereich ihr Wirkungsoptimum entfalten, finden sich in fast allen menschlichen und tierischen Zellen. Unter den zahlreichen sauren Phosphatasen, die insbesondere in den Erythrocytes im Prostatagewebe und im Sperma gefunden werden, ist die Prostataphosphatase von besonderer Bedeutung, da sie in der klinischen Chemie zur Diagnose und Therapiekontrolle des Prostatacarcinoms dient
Es sind bereits mehrere Methoden zur Bestimmung der sauren Phosphatasen bekannt Diese Methoden beruhen auf der Spaltung eines Phosphorsäureesters und anschließender Bestimmung eines bei der Spaltung freigesetzten Teils des Phosphorsäureesters. So wird bei einem bekannten Verfahren p-Nitrophenylphosphat mit saurer Phosphatase bei pH-Wert zwischen 4 und S gespalten, in Freiheit gesetztes p-Nitrophenol in alkalisches Medium überfahrt und darin photometrisch bestimmt. Bei einem weiteren bekannten Verfahren wird Naphthylphosphat verwendet, bei der enzymatisehen Spaltung freigesetztes «'Naphthol mit einem Diazoniumsalz versetzt und der gebildete Farbstoff photometrisch gemessen.
Nach der US-PS 30 02 893 ist ein Verfahren bekannt, bei dem von saurer Phosphatase erst a-Naphthylphos· phat enzymatisch abgespalten wird und dann das gebildete «-Naphthol mit einem Diazoniumsalz gekuppelt wird. Hierfür geeignete Diazoniumsalze sind solche von Anilin, o-Dianisidin, 4-Benzoylamino-2,5-dimethoxyanilin, 4-Amino-2,5-diäthoxybenzanilid, ?-Amino-4-chloranisol und andere. Diese Bestimmungsmethode eignet sich für eine rasche und einfache quantitative Bestimmung im Labor.
Die bekannten Methoden haben alle den Nachteil, daß danach nur eine Endwertbestimmung (Zweipunktmethode), aber keine kinetische Bestimmung möglich ist
Eine Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, bei dem die saure Phosphatase durch enzymatische Spaltung von a-Naphthylphosphat und Kupplung des so gebildeten «-Naphthols mit einem Diazoniumsalz bestimmt werden kann, und bei dem zusätzlich auch der Reaktionsverlauf kinetisch verfolgt werden kann.
Nunmehr wurde überraschend gefunden, daß es bei Verwendung ganz bestimmter Diazoniumsalze möglich ist, das Diazoniumsalz gleich zu Beginn der Reaktion zusammen mit dem Naphthylphosphat zuzusetzen, so daß sich im Maße der Abspaltung des Phosphatrestes der Farbstoff bildet der durch laufende Bestimmung eine kinetische Messung der Phosphatase ermöglicht Dies ist überraschend, da bekanntlich Diazoniumsalze allgemein Enzyme hemmen.
Gegenstand der Erfindung ist somit das Verfahren gemäß dem obigen Patentanspruch.
Unter den Verbindungen der allgemeinen Formel des obigen Patentanspruchs ist das diazotierte 2-Amino-5- chlortoluol besonders geeignet, da es keine Nebenreak tion mit Bilirubin eingeht, weitere Reaktionen mit dem Serum praktisch ebenfalls nicht auftreten und der Kurvenverlauf im kinetischen Test in allen Aktivitätsbereichen linear ist Diese Verbindung ist in der für das erfindungsgemäße Verfahren einzusetzenden diazotierten Form unter der Bezeichnung »Fast Red TR« im Handel erhältlich.
Weitere gut geeignete Verbindungen der allgemeinen Formel sind jeweils diazotiertes 4-Chlor-2-aminoanisol
J5 und S-Nitro^-aminoanisol. Beispiele für weitere geeignete Verbindungen sind jeweils diazotiertes 4-Benzamido-23-dimethoxyanilin und 5-Benzamido-4-chlor-2-aminotoluol. Die erfindungsgemäß verwendeten Diazoniumsalze hemmen nicht nur die enzymatische Aktivität der sauren Phosphatase nicht, sondern gehen auch eine rasche und vollständige Reaktion mit dem «-Naphthol ein.
Das Verfahren wird zweckmäßig bei pH-Werten zwischen 4 und 6, vorzugsweise zwischen etwa 43 und 5,4, durchgeführt. Die pH-Wert-Einstellung erfolgt durch geeignete Puffer. Geeignet sind grundsätzlich alle im obengenannten pH-Wert-Bereich puffernden Substanzen, ausgenommen Phosphatpuffer, welcher die Phosphatase hemmt Neben dem vorzugsweise verwende deten Citrat-Puffer sind beispielsweise Acetat-Puffer und Phlhalai-Puffer ebenfalls gut geeignet. Die Puffermolaritäten liegen zweckmäßig zwischen O1OS und 0,3 M, vorzugsweise zwischen 0,1 und 0,2 Mol. Zur spezifischen Bestimmung der sauren Prostata-
phosphatase bedient man sich der Tatsache, daß letzteres durch 2· Hydroxycarbonsäuren, insbesondere durch Tartrat, gehemmt wird. Durch zwei Parallelbestimmungen mit und ohne Tartratzusatz erhält man so auf einfache Weise die Gesamtaktivität der sauren
μ Phosphatasen sowie die Aktivität der sau.en Phosphatasen, ausgenommen der Prostataphosphatase. Aus der Differenz läßt sich die Aktivität der sauren Prostataphosphatase leicht berechnen. Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweckmäßig
μ bei Raumtemperatur durchgeführt. Es können aber auch etwas höhere und niedrigere Temperaturen zur Anwendung kommen. Es ist jedem Fachmann bekannt, daß Diazoniumsalze
und Enzyme in der Regel nicht nebeneinander beständig sind, denn einerseits reagieren Diazoniumsalze mit Phenolen und andererseits enthalten alle Proteinketten phenoüsche und damit kupplungsfähige Aminosäuren. Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann aber überraschenderweise ohne störende Nebenreaktion in Gegenwart der kupplungsfähigen Diazoniumverbindungen gearbeitet werden. Das heißt, erfindungsgemäß ist es möglich, die Diazoniumverbindung schon zu Beginn der enzymatischen Reaktion zuzusetzen und somit den Verlauf der Reaktion auch kinetisch zu verfolgen.
Das Beispiel erläutert das erFindungsgemäße Verfahren.
Beispiel
5 ml 0,3 M Citratpuffer, pH 5,2, werden unter leichtem Umschütteln zu einem Gemisch von 15 mg a-Naphthyl-
phosphat (naphtholfrei) und 10 mg diazotierten! 2-Amino-5-chlortoluol hinzugefügt. Nach vollständiger Auflösung (ca. 2 bis 3 Minuten) werden 0,5 ml frisches haemolysefreies Serum hinzugefügt. Der Reaktionsansatz wird auf zwei ausgemessene Glasküvetten annähernd gleich verteilt In eine Küvette werden 20 μ| 2 M Tartrallösung, pH 5,2, zugesetzt und sorgfältig vermischt Dann werden die Extinktionsänderungen bei 405 nm im Spektrallinienphotometer bei 25° Wasserbadtemperatur unter Anwendung eines Extinktionsschreibers mit Wechselautomatik fortlaufend registriert. Das Verfahren eignet sich auch zur Anwendung der Zweipunktmethode, falls eine Kinetik nicht erforderlich ist In diesem Fall wird die Extinktionsdifferenz in den R^aktionsansätzen mit und ohne Tartrat zu Beginn und wiederum nach 30 Minuten gemessen.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Bestimmung der sauren Phosphatase durch enzymatische Spaltung von a-Naphthylphosphat und Kupplung des so gebildeten a-Naphthols mit einem Diazoniumsalz der allgemeinen Formel
DE19712115748 1971-03-31 1971-03-31 Verfahren zur Bestimmung der sauren Phosphatase Expired DE2115748C3 (de)

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