DE2656063B2

DE2656063B2 - Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase

Info

Publication number: DE2656063B2
Application number: DE19762656063
Authority: DE
Inventors: Charles Thomas Rochester Goodhue; Prakash Sharatchandra Webster Masurekar
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1975-12-11
Filing date: 1976-12-10
Publication date: 1979-03-01
Also published as: JPS5290689A; JPS5746839B2; FR2334748B2; CA1067844A; FR2334748A2; FR2362927B1; FR2362927A1; DE2656063C3; DE2656063A1; GB1551452A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase durch Kultivierung eines Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus in einem einen Cholesterin-Oxidase-Auslöser und eine nichttoxische, nichtionogene, oberflächenaktive Verbindung sowie Hefehydrolysat enthaltenden Nährmedium unJ Abtrennung der erzeugten Cholesterin-Oxidase vom Nährmedium.

Mikroorganismen, die die Fähigkeit zur Metabolisierung von Cholesterin haben, sind bekanntlich potentielle Lieferanten von Enzymen, die sich für die enzymatische Bestimmung von Cholesterin in komplexen Mischungen, beispielsweise Blutserum eignen. Dies gilt insbesondere dann, wenn die Mikroorganismen Cholesterin als einzigen Kohlenstofflieferanten verwenden können, da bei diesem Bestimmungsverfahren Cholesterin durch oxidative Enzyme abgebaut werden muß.

T. C. S t a d t m a η in »Methods in Enzymology«, Band I, Herausgeber: S. P. Colowick und N. O. Kaplan, »Academic Press«, N. Y., 1955, Seite 678 sowie T. C. Stadtman, A. Cherkes sowie |. Anfinsen in »Biol. Chem.«, 206 (1954), Seite 510, berichten über die Reinigung eines Enzymes von Nocardia cholesterolicum, einem Organismus, der zuerst von Schatz und Mitarbeitern (vgl. A. Schatz, K. Savard und I. |. -, P i η t η e r in »J. Bacteriol.«, 58 [1949], Seite 117 bis 125) isoliert wurde. Das Enzym von Stadtman, als »Cholesterin-Dehydrogenase« bezeichnet wurde für die Verwendung im Rahmen einer Cholesterin-Bestimmung gereinigt die auf der Messung des Anstieges der

κι Absorption bei 250 nm aufgrund der Bildung von Cholest-4-en-3-on beruht Da, wie nunmehr festgestellt wurde, der direkte Akzeptor von Cholesterin-Elektronen bei dieser Oxidation Sauerstoff ist muß das Enzym richtigerweise als Cholesterin-Oxidase bezeichnet wer-

ii den.

Die Bakterienstämme, die von Stadtman beschrieben werden, erzeugen, wenn sie nach den in den zitierten Literaturstellen beschriebenen V& "ihren kultiviert werden, nur sehr geringe Enzymkonzentrationen,

2i) welche für eine technische Verwertung zu gering sind. Die nach den bekannten Methoden herstellbaren Konzentrationen sind derart gering, daß eine Regelung des Enzyms für die Praxis praktisch nicht in Frage kommt

r> Aus der US-PS 39 09 359 ist des weiteren ein verbessertes Verfahren für die Erzeugung der Stadtmanschen Cholesterin-Oxidase bekannt welches aus den folgenden Verfahrensstufen besteht:

(a) Züchtung des Bakteriums Nocardia cholesterolis(i cum Art NRRL 5767 oder NRRL 5768 in einem Medium, in dem Cholesterin oder ein geeignetes Derivat hiervon als Hilfs-Kohlenstofflieferant wirkt und

(b) Isolierung eines zellenfreien Extraktes mit dem i'i aktiven Enzym aus dem Medium.

Das in der US-PS 39 09 359 beschriebene Verfahren stellt eine wesentliche Verbesserung des von Stadtman beschriebenen Syntheseverfahrens dar. Es ermöglicht die Herstellung von Cholesterin-Oxidase im technischen Maßstab.

Aus der DE-OS 22 46 695 ist des weiteren ein Verfahren zur Isolierung eines Cholesterin-Oxidase-Enzyms, erzeugt von einer Kultur eines Noca^rdia-Mikroorganismus mit der Bezeichnung NRRL 5635 und

•r> NRRL 5636 bekannt. Bei diesem bekannten Verfahren werden die geernteten Zellen mit einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung behandelt und bei Raumtemperatur verrührt, so daß eine vergleichsweise große Menge des Enzyms aus den Zellen in die

~>o überstehende Flüssigkeit gelangt, wodurch eine Zellextraktion und Isolierungsmethoden überflüssig werden. Bsi Anwendung dieses Verfahrens der Enzym-Extraktion lassen sich Ausbeuten in der Größenordnung von etwa 40 bis 160 Einheiten pro Liter erhalten.

■i*i Aus einer von E. T. R e e s e und A. M a g u i r e unter der Überschrift »Surfactants as Stimulants of Enzyme Production be Microorganismus«, veröffentlichten Arbeit in der Zeitschrift »Applied Microbiology«, Februar 1969, Seiten 242-245, ist es des weiteren

mi bekannt, daß der Zusatz von Sorbitanpolyoxyäthylenmonoleat und anderer nichtionogener oberflächenaktiver Verbindungen zu Pilzkulturen, die normalerweise Εηζγπις extrazellular erzeugen, zu einem Anstieg der [■ nzymausbeute führt.

tv'i Aus der GB-PS 13 85319 ist des weiteren die Herstellung von Cholesterin-Oxidase aus Nocardia, ArI NRRL 5635 und NRRL5636 bekannt. Die Fermentation erfolgt dabei in einem Nährmedium, das pro Liter 20};

Hefeextrakt enthält. Während der Fermentation wird dem Medium langsam Cholesterin zugesetzt, vorzugsweise in Form einer Dispersion mit einer nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung. Das Cholesterin wird dabei in Mengen von insgesamt 1,2 g pro Liter Medium zugesetzt. Die Gesamtkonzentration an nichiionogener, oberflächenaktiver Verbindung ist unbedeutend.

Aus der südafrikanischen Patentschrift 73/3259 ist schließlich die Herstellung von Cholesterin-Oxidase unter Verwendung von Proactinomyces erythropolis NBC 9158, ATC 17 895, ATCC 4277 und Nocardia formica ATCC 14 811 bekannt Die Fermentation erfolgt dabei in einem Pepton enthaltenden Mineralsalzmedium, wobei, wenn die logarithmische Wachstumsphase erreicht ist, langsam Cholesterin in Form einer wäßrigen Suspension zugegeben wird, und zwar im Verhältnis zum Wachstum des Mikroorganismus, derart daß die zugesetzte Cholesterinmenge insgesamt pro Liter Medium 1 bis 20 g beträgt Gemäß Beispiel 2 der Patentschrift kann eine vergleichsweise geringe Menge an Cholesterin (0,05%) dem Medium von Anfang an zugesetzt werden. Ein Anstieg der Ausbeute an Cholesterin-Oxidase-Aktivität wird dadurch erreicht daß der Cholesterin-Suspension Hefeextrakt als Emulgiermittel in einer Menge von 0,02 bis 1 Gew.-% der Cholesterin-Suspension zugesetzt wird. Aus der Patentschrift ergibt sich, daß lediglich eine sehr geringe Menge an Hefeextrakt dem Medium zugesetzt wird. Während der Fermentierung ist keine oberflächenaktive Verbindung zugegen.

Aus der DE-OS ?5 12 606 ist es schließlich bereits bekannt, zur Herstellung von Cho!<"sterin-Oxidase in verbesserten Ausbeuten einen Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus in ein^m Nährmedium zu züchten, das einen Cholesterin-Oxidase-Auslöser, 0,1 bis 2,0 g pro Liter einer nichttoxischen, nichtionogenen, oberflächenaktiven Verbindung und eine vergleichsweise sehr geringe Menge an Hefehydrolysat enthält.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß sich Cholesterin-Oxidase in besonders hohen Ausbeuten gewinnen läßt, wenn man einen Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus in einem Nährmedium züchtet in dem Cholesterin-Oxidase-Auslöser, nichttoxische, nichtionogene, oberflächenaktive Verbindung sowie Hefehydrolysat in bestimmten Konzentrationsverhältnissen vorliegen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus in einem Nährmedium kultiviert, das (a) den Cholesterin-Oxidase-Auslöser in einer Konzentration von 1,0 bis 10 g/Liter Nährmedium, (b) 1,0 bis 5,0 g einer nichttoxischen, nichtionogenen, oberflächenaktiven Verbindung pro Liter Nährmedium und (c) mindestens 10 g eines Hefehydrolysates pro Liter Nährmedium enthält.

In dem Nährmedium sind die drei Komponenten (a), (b) und (c) zusätzlich zu einem Kohlenstofflieferanten und Spuren von Metallsalzen enthalten.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß die drei angegebenen Komponenten in den angegebenen Konzentrationen im Nährmedium einen synergistischen Effekt auf die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase ausüben, so daß Ausbeuten von bis zu etwa 900 Einheiten pro Liter erzielt werden können. Aus dem Nährmedium läßt sich die erzeugte Cholesterin-Oxidase dann nach üblichen bekannten Methoden isolieren.

Der Cholesterin-Oxidase-Auslöser kann zusätzlich als Hilfskohlenstofflieferant dienen. Die nichtionogene, oberflächenaktive Verbindung soll nichttoxisch gegenüber dem zu kultivierenden Mikroorganismus sein.

Unter einem »Hefehydrolysat« ist ein übliches, durch Hydrolyse von Hefe mit Wasser erhaltenes Produkt zu ■i verstehen. Zu Hefehydrolysaten im weitesten Sinne gehören auch die üblichen Hefeextrakte, d. h. Heißwasserextrai-te von Hefehydrolysaten sowie durch enzymatischen Aufschluß von Kulturhefen gewonnene Präparate.

in Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung lassen sich alle Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismen verwenden. Diese Mikroorganismen gehören im allgemeinen zur Klasse der Actinomycetalen. Besonders vorteilhafte Mikroorganismen der r, Klasse der Actinomycetalen gehören zu den Familien der Mycobacteriaceaen, Nocardiaceaen und Streptomycetaceaen.

Beispiele für Mikroorganismen, die sich für die

Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens be-

2i) sonders eignen, sind beispielsweise die Spezies NRRL 5635, NRRL 5636, NRRL 6767, NRRL 5768, ATCC4277, ATCC 14 349, ATCC 14 Si 1 und ATCC 17 895.

Die Abkürzung »NRRL« bedeutet dabei, daß

Kulturen der angegebenen Mikroorganismen in den

2^r> USA in dem »Agricultural Collection Investigations Fermentation Laboratory«, Peoria, Illinois, hinterlegt wurden.

Die Abkürzung »ATCC« bedeutet daß Kulturen der Mikroorganismen in den USA bei der »American Type κι Culture Collection« hinterlegt wurden.

Die angegebenen Spezies sind in der Vergangenheit durch verschiedene Genus-Namen, einschließlich Mycobacterium, Nocardia, Proactinomycetes und Streptomyces gekennzeichnet worden. Obgleich die Kriterien für r> die Klassifizierung dieser Spezies von Mikroorganismen in speziellen Gattungen als etwas unsicher erscheint und die Klassifizierung spezieller Spezies sich periodisch ändert, soweit es die Plazierung innerhalb bestimmter Gattungen von Mikroorganismen anbelangt, sind sie 4(i jedoch leicht kennzeichenbar ab Mitgieder der Klasse der Actinomycetalen.

Zwei besonders vorteilhafte Spezies von Mikroorganismen für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung lassen sich kennzeichnen als »rauhe« und 4^r. »glatte« Stämme von Nocardia cholesterolicum mit dem Kennzeichen NRRL5767und NRRL5768.

Bei dem Verfahren zur Erzeugung von Cholesterin-Oxidase nach der US-PS 39 00 359, bei dem Cholesterin-Oxidase intrazellular erzeugt wird, führt die Verwen- w dung eines üblichen primären Kohlenstofflieferanten, wie beispielsweise Glyzerin, in Kombination mit einem sekundären oder Hilfskohlenstofflieferanten, wie beispielsweise Cholesterin, Cholest-4-en-3-on oder Cholesteryllinoleat, bei denen es sich sämtlich um Cholesterin- Y, Oxidase-Auslöser handelt, zu einer Erhöhung der Ausbeute an Cholesterin-Oxidase-Enzym, die etwa lOOmal so groß ist als die Ausbeute, die dann erhalten wird, wenn kein Cholesterin-Oxidase-Auslöser verwendet wird, wenn kein Cholesterin-Oxidase-Auslöser bo verwendet wird oder wenn Cholesterin als einziger Kohlenstofflieferant verwendet wird.

So werden nach dem aus der US-PS 39 00 359 bekannten Verfahren erhöhte Ausbeuten an Cholesterin-Oxidase dann erhalten, wenn das baceterium M Nocardia cholesterolicum in einem üblichen Nährmedium von üblicher bekannter Zusammensetzung kultiviert wird, das im allgemeinen einen Stickstofflieferanten enthält, z. B. Ammoniumsulfat, ferner einen Kalium- und

einen Phosphorlieferanten, ζ. Β. Kaliumphosphat, Spuren an Metallionen sowie ferner eine Mischung aus einem primären Kohlenstofflieferanten, z. B. Glyzerin und einem Cholesterin-Oxidase-Auslöser, bestehend aus Cholesterin, Cholest-4-en-3-on, Cholesteryllinoleat oder Mischungen hiervon. Der pH-Wert des Mediums liegt dabei zwischen etwa 5,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,5 und 7,5. Die Temperatur des Nährmediums liegt bei etwa 25 bh 35° C, vorzugsweise bei etwa 30⁰C. Die Kultivierungsdauer beträgt etwa 18 bis etwa 40 Stunden, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 24 Stunden.

Die Mengen an Stickstoff-, Kalium- und Phosphorlieferanten sowie Melallionen liegen in der üblichen Größenordnung.

Zu den bevorzugt verwendeten primären Kohlenstofflieferanten gehören nach den Angaben der US-PS 39 00 359 beispielsweise Glyzerin, Glukose und Essigsäure. Dabei werden übliche bekannte Konzentrationen an primären Kohlenstofflieferanten verwendet. Diese liegen im allgemeinen bei etwa 5 bis etwa 50 g pro Liter. Die Konzentration an Choicsterin-Oxidase-Auslöser liegt vorzugsweise bei etwa 2 bis etwa 5 g^ro Liter.

Das Verfahren der Erfindung ermöglicht die Herstellung von Cholesterin-Oxidase nach dem aus der US-PS 39 00 359 bekannten Verfahren mit der Ausnahme jedoch, daß auch andere Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismen als in der Patentschrift angegeben verwendet werden können und das Nährmedium Hefehydrolysat und eine nichtionogene, oberflächenaktive Verbindung in den angegebenen Konzentrationen enthält. Die Tatsache, daß sich dadurch die intrazellulare Erzeugung von Cholesterin-Oxidase wesentlich ernöhen läßt, war nicht voraussehbar.

Der Zusatz von Hefehydrolysat hat sich als wesentlich erwiesen, um eine erhöhte Ausbeute an Cholesterin-Oxidase zu erreichen. Der Zusatz von steigenden Mengen an Hefehydrolysat erhöht die Ausbeute an Cholesterin-Oxidase, bis ein Maximum erreicht wird, wonach eine weitere Zugabe von Hefehyi'.rolysat die Ausbeute an Cholesterin-Oxidase unterdrückt, wie sich aus den später folgenden Beispielen ergibt Die Ausbeute an Cholesterin-Oxidase läßt sich bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens um beispielsweise 5000% gegenüber bekannten Verfahren durch Zusatz optimaler Mengen an Hefehydrolysal zum Nährmediu:Ti erhöhen.

Als vorteilhaft hat es sich erwiesen, wenn dem Nährmedium 10 bis etwa 30 g Hefehydrolysat oder Hefeextrakt pro Liter zugesetzt werden. Besonders vorteilhafe Konzentrationen liegen bei etwa 20 g pro Liter Nährmedium. Zu bemerken ist dabei, daß die im Einzelfalle optimale Menge an Hefehydrolysat oder Hefeextrakt etwas von dem Typ oder dem Lieferanten des Hefehydrolysates bzw. Hefeextraktes abhängen kann.

Wenn im folgenden von Hefeextrakten die Rede ist, so bedeutet dies, daß anstelle derselben ganz allgemein Hefehydrolysate verwendet werden können.

Die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase wird ferner stark durch den Zusatz einer nichtianogenen oberflächenaktiven Verbindung zum Nährmedium beeinflußt Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignen ι sich übliche bekannte nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen, z. B. Poiyäthylenglykole, Polyvinylalkohol, Polyether, Polyester und Polyhalogenide.

Wesentlich für die erfolgreiche Durchführung des Verfahrens der Erfindung sind folgende Kriterien:

'" (1) weder die im Einzelfalle verwendete nichlionogene oberflächenaktive Verbindung noch ihre Zerfallsprodukte dürfen in den angewandten Konzentrationen gegenüber dem zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendeten Mikroorganismus toxisch sein und
(2) die Menge an verwendeter oberflächenaktiver Verbindung darf die Enzymproduktion nicht inhibieren.

2(i Die Toxizität von Zerfallsprodukten der oberflächenaktiven Verbindungen läßt sich theoretisch, wie im folgenden noch näher erläutert werden wird, voraussagen. Ein positiver Test für ein solches Kriterium ist die Durchführung eines Tests mit dem zu verwendenden

2·-, Nährmedium und die Beobachtung der Effekte der erzeugten Nebenprodukte.

Zu nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindungen gehört eine Vielzahl von Verbindungen. Für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung sind alle

»ι, die nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindungen geeignet, die den beiden angegebenen Kriterien genügen.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens der Erfindung werden zur Durchführung

Γ) des Verfahrens nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen verwendet, die einen hydrophilen Rest mit Oxyäthylengruppen und einen lipophilen Rest mit einem Fettsäurerest aufweisen. Vorteilhafte nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen dieses Typs sind beispielsweise solche mit 20 Oxyäthyleneinheiten und »inem Fettsäurerest mit 16 Kohlenstoffatomen. Als besonders vorteilhaft haben sich ganz aligemein nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen erwiesen, die einen hydrophilen Oxyäthylen- oder Polyglyci-

4-, dolrest aufweisen und einen lipophilen Rest mit mindestens 9 Kohlenstoffatomen. Besonders vorteilhafte nichtionogene oberflächenaktive Verbindungen dieses Typs sind solche, in denen der lipophile Rest aus einem Fettsäurerest mit mindestens 10 Kohlenstoffato-

W men besteht.

Optimale Eigebnisse werden beispielsweise dann erhalten, wenn der Fettsäurerest mindester,.; 16 Kohlenstoffatome aufweist und der hydrophile Rest etwa 20 Oxyäthyleneinheiten.

-,-, In der folgenden Tabelle sind einige typische oberflächenaktive Verbindungen angegeben, die sich in vorteilhafter Weise zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung eignen:

HLB*)	Oberflächen	Hydrophiler Rest	Anzah;	Lipophilcr Rest	Anzahl
	aktive		Einheiten		liinhei'cn
	Verbindung
16.7	S-I	Sorbitan	I	La'irinsiiurc	I
		Polyoxyäthylen	20
13,3	S-2	Sorbitan	I	Laurinsäurc	I
		Oxyäthylen	4

Ill ICl	nherlladien-	I lydrophiler Rust	AiiAihl	I ipiipliilci IUsI	Anzahl
	,1 kl ISC		l· inhcilcii		I inhcilcii
	^ l· r htiiduiiii
I5.()	S-3	Sorbitan	I	I'iilmilinsiiurc	1
		Oxyiithylen	20
14.9	S-4	Sorbitan	I	Stearinsäure	I
		Oxyiithylen	20
(>.')	S-5	Sorbitan	I	Stearinsäure	I
		Oxyiithylen	4
10.5	S-(I	Sorbitan	1	Stearinsäure	3
		Oxyiithylen	20
15.0	S-7	Sorbitan	I	Oleinsäure	I
		Oxyiithylen	20
10,0	S-S	Sorbitan	I	Oleinsäure	I
		Oxyiithylen	5
17.1	S-¹)	Oxyiithylen	10	Nonylphenyl	I
15.0	S-IO	Oxyiithylen	15	Nonylphenyl	1
13,3	S-Il	Oxyiithylen	30	Nonylphenyl	I
13.3	S-12	(ilycidol	6	Nonylphenyl	I
13.5	S-13	(ilycidol	10	Nonylphenyl	I
Ί IK(Ir.	iphik-1 ipnphilc-lijlaiKc.

Die im Einzelfalle optimale Konzentration an nichlionogener oberflächenaktiver Verbindung im Nährmcdium hängt stark von der Zusammensetzung des Niihrmediums ab. der Empfindlichkeit des Nährmediums gegenüber der speziell verwendeten oberflächenaktiven Verbindung und der verwendeten Verbindung selbst. Bei Konzentrationen über 5,0 g pro Liter neigt die oberflächenaktive Verbindung im allgemeinen dazu, die Produktion von Cholesterin-Oxidase zu inhibieren. Als besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, die oberflächenaktive Verbindung in Konzentrationen von 1,0 bh 3,0 g pro Liter Medium zu verwenden.

Die Verwendung eines Nährmediums mit einer nichtionojenen oberflächenaktiven Verbindung kann gelegentlich zu einem Schäumen führen. Um eine Schaumbildung zu steuern, insbesondere bei größeren Ansätzen, kann deshalb die Verwendung eines üblichen, die Schäumung steuernden Mittels ratsam sein.

Abgesehen von Cholesterin. Cholest-4-en-3-on und C holesteryllinoleat, die nach den Angaben der US-PS 39 00 359 Cholesterin-Oxidase-Auslöser sind, können die verschiedensten anderen Sterine und Cholesterinester als Auslöser für ^ie Cholesterin-Oxidase verwendet we-den. Andere besonders vorteilhafte Auslöser sind 3eispielswei.se 3-j3-Hydroxysterine, z. B. /?-Sitosterin und 5-*-Cholestan-3-/?-ol sowie andere Cholesterinester w e beispielsweise Cholesteryloleat, Cholesterinlinoleat.Cholesterylformiat und Cholesterylpropionat.

Der Fermentationsprozeß erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 18 bis etwa 35"C. Ais besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen bei Temperaturen unterhalb 30'C zu arbeiten, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 30°C.

Wie bereits dargelegt, wurde des weiteren gefunden, daß Ncicardia choiesterolicum auch eine Cholesterin-F.sterase erzeugt. Dieses Enzym wird durch Cholesterin, Chole-iterinester und bestimmte Styrine des angegebenen Typs und wie in den Beispielen angegeben. induziert. Ganz allgemein hat sich gezeigt, daß Styrine bessere Auslöser ode/ Induktionsmittel der Esterase sind. Es hat sich gezeigt, daß eine gute Beziehung zwischen der Erzeugung von Cholesterin-Oxidase und Choleslerin-Esterase im Falle von wachsendem Nocardia choiesterolicum besteht. Das Verhältnis von Estcrasc zu Oxidase ist jedoch unterschiedlich, je nach dem verwendeten Auslöser.

Die folgenden Beispiele sollen das Verfahren der Erfindung weiter veranschaulichen. Die folgenden Erläuterungen dienen der Kennzeichnung der in den Beispielen verwendeten Begriffe:

(I) Kultur

Das verwendete Nocardia choiesterolicum wurde erhalten von Dr. Theresa S tad t m a η (N.I.H.. Bethesda. Md.). Verwendet wurde eine rauhe Kolonie-Variante (NRRl. 5767) sofern nichts anderes angegeben ist.

(2) Nährmcdium

Die Zusammensetzung des Nährmediums, das in den Beispielen verwendet wurde, war wie folgt:

(A) Glyzerinmedium

pro Liier

Ammoniumsulfat	2.0 g	pro Liter einer
Dibasisches, wasserfreies		0.1 N HCL-Lösung
Kaliumphosphat	2,0 g	25,0 g
Salzlösung »C«	5,0 ml	0,1g
Glyzerin	5,0 g	2,8 g
Trypton	0,1g	1.7 g
Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf	0,06 g
1 Liter	0,6 g
Salzlösung »C«

MgSO₄ · 7 H₂O
CaCI₂ ■ 2 H₂O
FeSO₄ · 7 H₂O
MnSO₄ H₂O
ZnSO₄ - 7 H₂O
NaCI

(B) Inoculum pro Liter

Glukose 10,0 g

Hefeextrakt*) 10,0 g

Dibasischcs wasserfreies
Kaliumphosphat 1,0 g

Salzlösung Λ-1 2,0 ml

Salzlösung Λ-2 2,0 ml

Agar 20,0 g

pH-Wert eingestellt auf 7,0 und mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf I Liter

Salzlösung Λ-Ι	pro Liter
MgSO₄ · 7H₂O	100,Og
F'cSO₄ · 7 IhO	10,Og
MnSO₄ ■ 7 H₂O	1,0 g
NaMoO₄ · 2H₂O	0,5 g
Eingestellt auf I Liter einer
ö,i N iiCi-i.ösung

Salzlösung Λ-2 pro Liter

CaCI₂ -2 H₂O 10,0 g

Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf I Liter

*) Rs wurde ein handelsüblicher llefecxtrakt verwendet, im vorliegenden Falle ein Heicextrakt mit der Bezeichnung »Bacto yeast extract«. Hersteller Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA.

(C) Modifiziertes Glyzerin-Medium

	pro Liter
Ammoniumsulfat	2,0 g
Dibasisches wasserfreies
Kaliumphosphat	2,0 g
Salzlösung »C«	5,0 ml
Glyzerin	5,0 g
Oberflächenaktive
Verbindung S-3	3,0 g
Hefeextrakt*)	20,0 g
Cholesterin	1,0 g
Mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf
1 Liter

*) Es wurde der gleiche Hefeextrakt wie zur Bereitung des Inoculums verwendet.

(3) Aufbewahrung der Kulturen

Die Kulturen wurden auf den Schrägen des Glyzerin-Mediums mit einem Gehalt an Cholesterin aufbewahrt und jeden zweiten Tag auf eine andere Schräge eines Glyzerin-Mediums mit einem Cholesteringehalt übertragen. Des weiteren wurden die Kulturen in flüssigem Stickstoff gefroren aufbewahrt

(4) Herstellung eines Inoculums (kleiner Ansatz)

Eine Inoculum-Schräge wurde mit Nocardia Cholesterolicum (rauh) von einer zwei Tage alten Glyzerin-Schräge incculiert und 48 Stunden lang bei 30⁰C inkubiert Die Kultur von dieser Schräge wurde mit einer Drahtschleife abgeschabt und in 25 ml sterilem destilliertem Wasser durch kräftiges Schütteln resuspendiert Die Trübung dieser Suspension lag bei 1,8 bis O.D.- Einheiten bei 660 nm. 60 ml dieser Suspension wurden als Inoculum pro Liter Nährmedium verwendet

(5) I lerstellung eines Inoculums für eine
[■'ermentation in größerem Maßstab

Nocardia cholesterolicum (rauh) wurde nach 48stün-ι diger Züchtung auf Inoctilum-Schrägen zur Inoculieriing von 7,5 Litern sterilisiertem modifiziertem Glyzerinmedium in einem 14 Liter fassenden Fementationsgerät (Chemapec, Männcdorf, Schweiz) verwendet. Zu diesem Zweck wurden acht Schrägen verwendet. Das Medium

κι wurde belüftet, und zwar mit 0,5 Volumenicilcn Luft pro Volumenteil Medium pro Minute und mit einem flachen, J-Blatt-Turbinenrührer, der mit einer Geschwindigkeit von 1300 Umdrehungen pro Minute umlief, in Bewegung gehalten. Die Temperatur wurde auf JO"C

i) eingestellt. Nach einer ISstündigen Inkubationsdaucr wurde der Inhalt des Fcrmenticrgcrätcs aseptisch in ein 150 Liter fassendes Fermeniiergcräl überführt.

(6) Fermentation
(Λ) In kleinem Maßstab

Die Fermentationen wurden in 250 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben durchgeführt. Das Volumen des Mediums in den Erlenmeyer-Kolbcn betrug 25 rnl. Das

.'"> Medium der Kolben wurde in der beschriebenen Weise inoculiert, worauf bei 30°C inkubiert wurde. Die Schüttelgeschwindigkeit lag bei 200 Umdrehungen pro Minute (5,08 cm Schüttelweg). Die Prüflinge wurden alle 24 Stunden aseptisch auf die Cholesterin-Oxidasc-Akti-

Hi vität untersucht.

(B) Im großen Maßstab

Das 150 Liter fassende Fermentiergerät wurde mit 75 Litern sterilisiertem modifiziertem Glyzerin-Medium

π gefüllt. Nach erfolgter Inoculierung wie, unter (5) beschrieben, wurde das Medium bei einer Temperatur von 3O⁰C belüftet und bewegt. Der Belüftungsgrau entsprach 0,5 vvm, d. h. 0,5 Volumenteilen Luft pro Volumenmedium pro Minute. Die Umdrehungsge-

H) schwindigkeit des Rührers im Medium lag bei 250 Umdrehungen pro Minute. Alle 2'/2 Stunden wurden mittels eines automatischen Probenehmer aseptisch Proben abgezogen. Die Proben wurden dann wie unter (8) beschrieben auf ihre Cholesterin-Oxidase-Aktivität

r. untersucht. Die Zellen wurden »geerntet« nachdem die Cholesterin-Oxidase-Konzentration einen maximalen Wert erreicht hatte. Die für die Fermentation erforderliche Zeitspanne lag bei 17 bis 25 Stunden.

^r,o (7) Abtrennung der Zellen

(A) In kleinem Maßstab

Die Zellen wurden geerntet (d. h. von der Fermentationsbrühe abgetrennt) durch 15 Minuten langes « Zentrifugieren in einer gekühlten Zentrifuge (Hersteller Du Pont Co, Instrument Products Di v- Sorvall Operations, Newton, Conn„ USA) bei 12 350 χ g.

(B) In großem Maßstab

W) Das Fermentationsgerät wurde mit kaltem Wasser gekühlt wenn die Produktion des Enzymes den maximalen Wert erreicht hatte. Die Zellen wurden von der Brühe mittels einer kontinuierlich arbeitenden Zentrifuge abgetrennt, die eine Kugel mit einer

b5 Kapazität von 8 Litern aufwies (verwendet wurde eine Cepa-Zenirifüge, hergestellt in der BRD). Die Zellen wurden des weiteren zum Zwecke der Isolierung und Reinigung von Cholesterin-Oxidase aufgearbeitet

(8) Bestimmung der Choleslerin-Oxidase-Aklivitäl

(Λ) Herstellung von Zellenfraktioncn für die
Bestimmung der Cholcstcrin-Oxidase

Die Cholcstcrin-Oxidase kann außerhalb der Zellen oder cxlra/cllular und innerhalb der Zellen oder intrazellular vorliegen. Des weiteren kann das intrazellulare Enzym als f. eies oder lösliches Enzym vorliegen und als gcbundcndcs oder unlösliches Enzym. Das cxtrazcllulare Enzym kann in der Brühe nach Entfernung der Zellen durch Zentrifugieren bestimmt werden. Zur Ermittlung des intrazellularen Enzyms werden die Zellen durch Ultraschallbehandlung zerstört. Das Zcllcnkügelchen, das durch Zentrifugieren erhalten wurde, wurde in I l.itcr destilliertem Wasser suspendiert, worauf durch Zusatz eines 50 mM Kaliumphosphatpuffers (pH-Wert 7,0) auf 20 ml verdünnt wurde. Die Suspension wurde dann 5 Minuten lang in einem F.k-Wiissrrhiiil rini-r Ultraschallbehandlung aiKigovpt-sl, wobei nach einer Ultraschallbehandlung von I Minute eine Ruhepause von 30 Sekunden eingelegt wurde, bis von neuem eine Ultraschallbehandlung von I Minute erfolgte. Die behandelten Suspensionen wurden dann in der Kälte 15 Minuten lang bei 27 000 χ g zentrifugiert. Die Aktivität der überstehenden Flüssigkeit wird als intrazellulare, lösliche Aktivität bezeichnet. Die Zellenmasse wurde in einer 2%igen Natriumdeoxycholatlösung resuspendiert und im Eis 10 Minuten lang stehengelassen. Daraufhin wurde die Suspension 15 Minuten lang in der Kälte bei 27 000 χ g zentrifugiert. Die Cholesterin-Oxidase-Aktivität in der überstehenden Flüssigkeit wird als intrazellulare unlösliche Aktivität bezeichnet. Die Summe aus der extrazellularen, der löslichen intrazellularen und der unlöslichen intrazellularen Aktivität wird als Gesamtaktivität bezeichnet. Es ist des weiteren auch möglich, die Gesamtaktivität ohne Aufbrechen der Zellen zu ermitteln. Zu diesem Zweck wird die gesamte Fermentalionsbrühe mi* den Zellen verdünnt, um Störungen aufgrund der Trübung der Brühe auf ein Minimum zu reduzieren, worauf die verdünnte Brühe als Enzymlösung verwendet wird.

(9) Enzym-bestimmung

Die Cholesterin-Oxidase-Aktivilät läßt sich nach folgendem Verfahren ermitteln:

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',A) Reagenzien

1. 5OmM Kaliumphosphatpuffer, pH-Wert = 7,0 (KP-Puffer): 30,5 ml einer 0,2molaren K₂HPO₄-Losung + 19,5 ml einer 0,2molaren KH2PO4-Lösung, mit Wasser aufgefüllt auf ein Endvolumen von 200 ml.

2. O,l°/oige Dianisidinlösung: 10mg 3,3'-Dimethoxybenzidindihydrochlorid pro ml Wasser. Keine pH-Werteinstellung.

3. Reagenzpuffer·. Zu 40 ml des beschriebenen KP Puffers wurden 0,5 ml Dianisidinlösung und 1,4 mg Peroxidasepulver (Sigma-Type II, Mcerrcttich-Peroxidase, RZ 1,0 bis 1,5 Nr. P 8250) zugegeben, worauf gründlich vermischt und durch Zusatz von KP-Pufferlösung auf ein Volumen von 40 ml verdünnt wurde. Bei Zugabe der Dianisidinlösung erfolgt zunächst eine Trübung, die jedoch beim ΚΛj«:phf»n t\e*r K^Γ*ΓΠ^ηΓ1Π^ρΠ'.^ρΠ wipftpr vprsrhwinHpl Die Lösung soll nach Möglichkeit bis zur Verwendung im Kalten aufbewahrt werden. Im vorliegenden Falle wurde der Reagenzpuffer 3 Tage lang bei 4°C ohne Probleme aufbewahrt. In vorteilhafter Weise wird die Pufferlösung jedoch täglich frisch von neuem bereitet.

4. Cholesterin-Lösung:Zu 10 ml einer oberflächenaktiven Verbindung, bestehend aus einem Alkylarylpolyätheralkohol (Triton X-100, Hersteller Rohm und Haas, Philadelphia, Pa., USA), die auf einer Heizplatte erwärmt wurde, wurden 500 ml pulverförmiges Cholesterin zugesetzt, worauf die Mischung mittels eines Magnetrührers so lange gerührt wurde, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Dann wurden 90 ml Wasser zugesetzt, worauf weiter gerührt wurde. Die Lösung wurde zunächst trüb. Bei weiterem Mischen und bei Kühlung mittels eines Stromes von kaltem Wasser wurde die Lösung wieder klar. Die Trübung erfolgte dadurch, daß sich die oberflächenaktive Verbindung aus der Lösung ausschied. Durch die erfolgte Kühlung wurde die Verbindung wieder rehydratisiert und das Steroid wurde vollständig gelöst. Die Lösung erwies sich auf eine Dauer von einer Woche stabil, wenn sie bei Raumtemperatur aufbewahrt wurde.

(B) Reaktionen

oberflächenaktive Verbindung

Cholesterin + O, -> Cholest-4-en-3-on + H₂O₂

Oxidase

Pcroxidase H₂O₂ + Dianisidin »2 H₂O + Farbstoff

(C) Bestimmung

6 ml Reagenzpuffer + 0,1 ml Substrat + 0,9 ml Wasser wurden in einem Teströhrchen miteinander vereinigt und vermischt, worauf das Teströhrchen mit der Mischung in ein Wasserbad einer Temperatur von 37°C gebracht wurde. Nach 5 Minuten wurden 1,0 ml Enzym zugesetzt, so daß das Volumen in dem Teströhrchen 8 ml betrug. Das Röhrchen wurde dann in ein Spektrophotometer gebracht (Typ Spectronic 20 Spektrophotometer, Hersteller Bausch und Lomb, USA) wonach die Durchlässigkeit bei 430 nm ermittelt wurde. Das Röhrchen wurde danach wiederum in das Wasserbad eingesetzt. Alle 5 Minuten lang (insgesamt Minuten lang) wurde das Teströhrchen von neuem in das Spektrophotometer eingesetzt und untersucht Ermittelt wurde die Geschwindigkeit der Farbentwicklung aus einer Kurve eines Diagrammes, in dem die O.D.-Veränderung in Abhängigkeit von der Zeit aufgetragen wurde, indem ein Mittelwert der O.D.-Veränderung des linearen Anteils der Kurve gebildet wurde. Die Aktivität wurde unter Verwendung einer Konstante (molarer Extinktionskoeffizient) berechnet, die vorher für das Farbstoffsystem aus einer Standard-

kurve ermittelt wurde. Die Enzym-Präparate wurden verdünnt, so da(3 0,005 bis 0,06 Einheiten Choleslerin-Oxidase pro Bestimmungsröhi chcn verwendet wurden. Eine Cholesterin-Oxidase-Aktivität.s-Einhsit ist gleichzusetzen mit der Menge an Enzym, welche die Erzeugung von I μΜοΙ HjC^/Min. bei 37°C und einem pH-Wert von 7,0 katalysiert.

(10) Bestimmung der Cholesterin-Esterase-Aktivität

Die Esterasc-Aktivität wurde durch enzymatische ι Ermittlung des durch Hydrolyse von C'holcstcrinlinoleat freigesetzten Cholesterins ermittelt. Zellfraktionen für die Bestimmung der Cholesterin-Esterase wurden in gleicher Weise wie unter (8) (A) beschrieben, bestimmt.

(A) Reagenzien

1. Substrat-Emulsion: 6/10 g Cholesteryllinoleal wurden in 10,0 g einer heißen Lösung der beschriebenen oberflächenaktiven Verbindung (Triton X-i0O) gelöst, worauf die Lösung durch Zusatz von deionisiertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 100 ml gebracht wurde. Die Lösung wurde unter fließendem kaltem Wasser gekühlt, so daß sich die oberflächenaktive Verbindung löste. Es wurde eine milchigweiße Emulsion von Cholesteryllinoleat erhalten.

2. Esterase-Bestimmungsmischung: Die Estcrase-Bestimmungsmischung enthielt 6,7 ml Pufferlösung, 0,3 ml Cholesteryllinolc. temulsion.0,5 ml Cholcstcrin-Oxidaselösung (I U/ml) und 0,5 ml einer verdünnten Zellsuspension.

(B) Bestimmungsmethode

Teströhrchen mit der Bestimniungsmischung ohne Zellsuspension wurden in einem Wasserbad 15 Minuten lang bei 37°C geschüttelt. Daraufhin wurde die zu untersuchende Zellsuspension zugesetzt, worauf in Abständen von 5 Minuten in dem beschriebenen Spektrophotometer die Durchlässigkeit bei 430 nm ermittelt wurde. Die Menge an Enzym ergibt sich aus der Geschwindigkeit der Farbentwicklung. Das Bestimmungsverfahren ist dem Bestimmungsverfahren zur Ermittlung der Cholesterin-Oxidase somit sehr ähnlich.

Eine Cholesterin-Esterase-Aktivitäts-Einheit entspricht der Menge, welche die Hydrolyse von 1 μΜοΙ Cholesterinlinoleat pro Minute bei 37°C und einem pH-Wert von 7,0 katalysiert.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Sofern nichts anderes angegeben wurde, beziehen sich die angegebenen Konzentrationen auf Gew.-%. Die Ausbeuten von Versuchen, die im kleinen Maßstab unter Verwendung von Flaschen durchgeführt wurden, waren im allgemeinen geringer als die Ausbeuten von Versuchen, die im großen Maßstab in Fermentiergeräten durchgeführt wurden. Es zeigte sich jedoch, daß die relativen Effekte der verschiedenen Fermentationsparameter sehr ähnlich waren.

Beispiel 1 Einfluß von Hefeextrakt

Hefeextrakt erwies sich als wesentlich für die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase, wie sich aus der folgenden Tabelle 1 ergibt.

Die Ausbeute an Enzym stieg von 2,7 Einheiten pro Liter in Abwesenheit von Hefeextrakt auf 140.4 Einheiten pro Liter im Falle der Zugabe von 2,0% Hefccxlrakl an. Eine weitere Erhöhung der Hefcextraktkonzentration unterdrückte die Synthese des Enzyms. Der I-lefecxtrakl beeinflußte des weiteren den Ort der Enzym-Produktion. In Gegenwa-t von Hefeextrakt wurden höchstens 5% des Enzyms cxtrazellular erzeugt, während der Rest intrazellular erzeugt wurde. Eine maximale Enzymmenge ergab sich nach 24 Stunden.

Tabelle I

KinHuß von llelccxtrakt auf (lic Urzeugung von Cholesterin-Oxidase

Konzentra	Cholestcrin-Oxiiliisc-	i/Liier	Ircigeselztes
tion von	liinhuitci	ul.ir Tnhil	l-.n/ym, % eier
I Iclccxlmkl	!■«iRi-'/rli;		(icsiimlmcng.
in Tn		2,7
0,0	2,7	0,5	100
0,1	0,5	20,5	100
0,5	0,3	56,2	2
1,0	2,5	140,5	5
2,0	2,7	68,1	2
XO	0,2	0

Das zur Durchführung der Versuche verwendete Glyzerin-Medium enthielt 0,01% Trypton, 0,5% der oberflächenaktiven Verbindung S-3. Verschiedenen Anteilen des Mediums wurden dann die in der Tabelle 1 angegebenen Hefeextraktmengen zugesetzt.

Bei der verwendeten oberflächenaktiven Verbindung S-3 handelte es sich um ein technisches Produkt (Tween 40, Hersteller Atlas Chemicals, Wilmington, Delaware. USA).

Beispiel 2

Einfluß von Cholesterin (Versuche im kleinen Maßstab im Erlcnmeyer-Kolben)

Es erfolgte keine Enzymsynthese in Abwesenheit von Cholesterin, wie sich aus der folgenden Tabelle 2 ergibt. In dem Medium, das 0,5% der oberflächenaktiven Verbindung S-3 enthielt, erfolgte ein äußers¹ starker Anstieg an produziertem Enzym bei Ergänzung des Mediums mit Cholesterin, wie die Ergeb lisse der

ι Tabelle 2 zeigen. Die Erzeugung von Choles :erin-Oxidase erreichte ein Maximum in dem Medium das 0,1% Cholesterin enthielt.

Es erfolgte kein weiterer Anstieg in der Enzymausbeute bei weiterer Erhöhung der Konzentration an ; Cholesterin.

Das Cholesterin hatte einen weniger ausgeprägten Einfluß auf das Zellwachstum. Es trat eine höchstens 40%ige Zunahme des Gewichtes der trockenen Zellen durch Zusatz des Cholesterins zum Medium auf.

ι Im wesentlichen die gleichen oder ähnliche Beobachtungen wurden bezüglich des Einflusses des Cholesterins auf die Erzeugung des Enzyms in einem modifizierten Glyzerinmedium mit 0,3% der oberflächenaktiven Verbindung S-3 gemacht. Es erfolgte ein

; geringer Anstieg in der Ausbeute an Cholesterin-Oxidase, wenn die Konzentration an Cholesterin auf über 0,1% in dem Medium mit 0,3% der oberflächenaktiven Verbindune erhöht wurde.

Tabelle 2

Einfluß von Cholesterin auf die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase in Gegenwart von 0,5% oberflächenaktiver Verbindung

Konzentration von
Cholesterin in %

Cholenerin-CKidase

Einheiten/Liter

Trockenzellengewicht

g/Liter

0,0
76,7
126,2
143,5
124,8
142,2

8,3 8,9 8,8 8,5 7,7 9,5

Konzentration der
oberflächenaktiven
Verbindung

Trockenzellengewicht

g/Liter

Cholesterin-Oxidase

Einheiten/Liter

6,0
6,9
4,7
6,6
6,0

39,6

«5,4

129,1

124,7

72,4

praktisch wieder auf den Kontrollwert gebracht. Ein< weitere Erhöhung der Glyzerinkonzentration veränder te die Enzymkonzentration nicht wesentlich.

Auch das Wachstum der Kultur wurde durch da; Glyzerin beeinflußt. Es wurde ein praktisch 50%ige Anstieg des Trockenzellengewichtes in dem Glyzerit enthaltenden Medium gegenüber dem Medium ohne Glyzerin (vgl. Tabelle 4) verzeichnet

Tabelle 4

Einfluß des Glyzerins für die Erzeugung von
Cholesterin-Oxidase

Konzentration Trockenzellenr, an Glyzerin gewicht

^{il! %} g/Liter

Cholesterin-Oxidase

Einheiten/
Liter

Das zur Durchführung der Versuche verwendete Medium enthielt 0,5% der oberflächenaktiven Verbindung S-3. Im übrigen hatte das Medium die Zusammensetzung des modifizierten Glyzerin-Mediums. Die Cholesterinkonzentration des Mediums wurde in der aus Tabelle 2 ersichtlichen Weise eingestellt.

Beispiel 3 Einfluß der oberflächenaktiven Verbindung

Die Erzeugung des Enzyms wurde stark durch die oberflächenaktive Verbindung S-3 beeinflußt, wie sich aus den in Tabelle 3 zusammengestellten Daten ergibL So trat ein dreifacher Anstieg der Enzymausbeute dann auf, wenn das Medium durch Zusatz von 0,2% der oberflächenaktiven Verbindung ergänzt wurde. (Vergleiche Tabelle 3.) Eine maximale Enzymproduktion ergab sich bei einer Konzentration der oberflächenaktiven Verbindung von 0,2 bis 03%- Höhere Konzentrationen an oberflächenaktiver Verbindung (>03%) inhibierten die Produktion des Enzyms. Es wurden höchstens 0,6% Enzym in das Medium entlassen.

Tabelle 3

Einfluß der oberflächenaktiven Verbindung auf die Produktion von Cholesterin-Oxidase

% der Vergleichsprobe")

0.0

0,25

0,5

5,8
8,2
8,3

108,9
142,3
150,5

72

95

100

^;l) = Als Vergleichsprobe wurde ein modifiziertes Glyzerin ,- Medium mit 0,5% Glyzerin verwendet.

Beispiel 5

Sterine und Cholesterinester als Auslöser für
Cholesterin-Oxidase

In Beispiel 2 wurde der Einfluß von Cholesterin au die Synthese von Cholesterin-Oxidase veranschaulicht Vier andere, von Cholesterin verschiedene Sterin« sowie 12 Cholesterinester wurden auf ihre Aktivität al:

j-, Auslöser oder Induktionsmittel für Cholesterin-Oxidase getestet Sämtliche Auslöser wurden in einer Konzen tration von 0,1% verwendet Als wirksamster Auslöse von Cholesterin-Oxidase erwies sich /?-Sitosterin (JJ-Si tosterol), wie sich aus Tabelle 5 ergibt Die gesamt« ausgelöste Enzymaktivität lag bei 122% der durch Cholesterin ausgelösten Aktivität Zwei weitere Steroi de, nämlich 5-«-Cholestan-3-jJ-ol sowie Cholest-4-en 3-on erwiesen sich als mäßig effektiv bezüglich dei Enzymbildung. Von den getesteten Cholesterinestem

r, (Tabelle 6) führen Cholesteryloleat und Cholesleryllino leat zu einer ungefähr 90%ijten Bildung der Enzymmen ge, die durch Cholesterin erzeugt wurde, während Cholesterylprapionat und Cholestcryllinoleat zu einer 75%igen bzw. 65%igen Bildung führten.

Tabelle 5

Vfirksamkeit von Sterinen als Auslöser

Zur Durchführung der Versuche wurde ein modifiziertes Glyzerin-Medium mit verschiedenen Konzentrationen an oberflächenaktiver Verbindung verwendet.

Beispiel 4 Einfluß von Glyzerin

Durch Weglassen des Glyzerins aus dem Medium wurde die Enzymproduktion um 28% vermindert, wie sich aus der folgenden Tabelle 4 ergibt. Die Enzymkonzentration wurde durch Zugabe von 0.25% Glyzerin

S:crin^b)	y>	Cholesterin	üeiamt-Aktivitäl	Enzym-Akti-
	^h" /y-Sftosterin	(Einheiten/Liter)	vität in % de Vergleichs-
5-a-Cholestan-3-.j8-ol		probc")
Cholest-4-cn-3-on	163,6	100
7-Dehydrocholesterin	199,5	122
105,6	65
101,0	62
0	0

Zur Durchführung der Versuche wurde ein modifizierte (ily/crin-Mediuni verwendet.

') Uns Vcrglcichsmcditim enthielt Cholesterin ills Auslöse '') Die Konzentration an getestetem Sterin lag bei 0,1*/«

Tabelle 6 Wirksamkeit von Cholesterinestern als Auslöser

Cholesterinester^h) I	Conzen-	Oxidase-Aktivi-
t	ration	tät in % der Ver
(	mMole)	gleichsprobe¹')
Cholesterin ',	!,6	100
Cholesterylformiat Ά	!,4	64
Cholesterylpropionat \	»,3	75
Cholesterylbutyrat ;	>,2	54
Cholesterylhexanoat ;	U	52
Cholesterylbenzoat Ί	>,0	13
Cholesteryl-p-nitrobenzoat	,9	0
Cholesteryldecanoal	,9	26
Cholesteryllaurat	,8	36
Cholesterylmyristat	,7	21
Cholesterylpalmitat	,6	14
Cholesteryloleat	,5	91
Cholesteryllinoleat	,5	89
Cholesteryllinoleat	,6	65

Verwendet wurde ein modifiziertes Glyzerin-Medium. ^a) = Vergleichsmedium enthielt als Auslöser Cholesterin. ^h) = Die Konzentration der getesteten Cholesterinester lag bei 0,1%.

Beispiel 6 Verwendung anderer Hefeextrakle

Aus Beispiel 1 ergibt sich die Bedeutung des Zusatzes vom Hefeextrakt zum Nährmedium.

Es wurde die Wirksamkeit von mehreren verschiedenen Hefehydrolysalen untersucht Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 7 zusammengestellt

Aus den erhaltenen Ergebnissen ergibt sich, daß die Wirksamkeit von 2,0% eines handelsüblichen Hefehydrolysates (Amber BYF 100 sowie Amber BYF 50X) vergleichbar war mit der Verwendung von 2,0% eines üblichen Hefeextraktes (Bacto).

Das beste getestete handelsübliche Hefehydrolysat (Amberex 1003) stimulierte in einer Konze^¹.ration von 1,0% die Enzym-Produktion auf einen Wert von 112%, bezogen auf das Vergleichsmedium. Weitere Versuche zur Bestimmung der optimalen Konzentration an diesem Hydrolysat (Ämerex 1003) zeigten eine maximale Aktivität die mehr als zweimal so groß war als die des Vergleichsmediums.

Hersteller der getesteten Hefehyrolysate war die Firma Amber Laboratories, Juneau, Wisconsin, USA.

Tabelle 7 Wirkung von Hefehydrolysaten auf die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase Hefehydrolysate

Hefeextrakt (Difco [Bacto]) Hefehydrolysat (Amber BYF 100)

Hefehydrolysat (Amber BYF 50X) Hefehydrolysat (Amber BYF 300) Hefehydrolysat (Amberex 1003)

Verwendet wurde ein modifiziertes Glyzerin-Medium. ") = Das Vergleichsmedium enthielt einen handelsüblichen Hefecxtrakl (Difco).

Konzentration	Cholesterin-	Enzym-Aktivität
in%	Oxidase	in % des Ver
	(Einheiten/Liter)	gleichsmediums¹')
2,0	141,2	100
0,5	51,7	37
1,0	91,8	65
2,0	152,4	108
5,0	44,2	34
0,5	0	0
1,0	0	0
2,0	127,3	90
5,0	0	0
0,5	53,6	38
1,0	65,7	47
2,0	95,0	67
0,5	122,4	87
1,0	157,8	112
2,0	153,9	109
5,0	57,0	40

Die Wirksamkeit eines Hefeextraktes oder eines Hefehydrolysates kann je nach seinem Ursprung etwas verschieden sein.

Im Einzelfalle läßt sich die Wirksamkeit eines Hefeextraktes oder eines Hefehydrolysates durch Vergleich mit einem wirksamen Hefeextrakt, beispielsweise vom Typ des verwendeten Difco-Hefeextraktes ermitteln. Als besonders vorteilhafte Hefeextrakte haben solche zu gelten, die Ausbeuten von mindestens 70% der Ausbeute liefern, die bei Verwendung von 2% Difco-Hefeextrakt (vgl. Tabelle 7) oder eines äquivalenten Hefeextraktes erhalten wird. Die Hefeextrakte können dabei in Konzentrationen von bis zu 5,0% in

dem beschriebenen modifizierten Glyzerin-Medium getestet werden.

Beispiel 7

Einfluß von Cholesterin auf die Erzeugung von Cholesterin-Oxidase in größerem Maßstab bei Verwendung eines größeren Fermentiergerätes

Für die Durchführung der Versuche wurde ein 150 Liter fassendes Fermentiergerät verwendet und mit 75 Litern des modifizierten Glyzerin-Mediums beschickt. Das Medium enthielt pro Liter 0,3 g eines eine übermäßig Schäumung unterdrückenden Mittels (Poly-

glykol P-2000). Es wurden mehrere Versuche mit verschiedenen Cholesterin-Konzentrationen (vgl. Tabelle 8) durchgeführt. Nach der Sterilisation wurde das Medium in der beschriebenen Weise inoculiert, und zwar unter Verwendung eines in der beschriebenen Weise hergestellten Inoculums. Das Medium wurde belüftet (0,6 vvm) und unter Verwendung eines flachen 3-Blatt-Turbinenrührers, der mit einer Geschwindigkeit von 250 Umdrehungen umlief, in Bewegung gehalten. Alle 2'/2 Stunden wurden Proben entnommen, bis die Produktion an Cholesterin-Oxidase einen optimalen Wert erreicht hatte.

Tabelle 8 Einfluß von Cholesterin auf die Erzeugung von Choleslerin-Oxidase in größerem Maßstab

Konzentration an Cholesterin in g/Liter

Cholesterin-Oxidase Einheiten/Liter

177
356
749
888

II)

20

Bei den in Tabelle 8 angegebenen Cholesterin-Oxidase-Einheiten handelt es sich um Durchschnittswerte von 4 oder noch mehr Versuchen.

Beispiele in

Vergleiche eines modifizierten Glyzerin-Mediums mit einem Medium des Standes ..er Technik

Es wurden mehrere verschiedene Mikroorganismen, von denen bekannt ist, daß sie Cholesterin-Oxidase zu r, erzeugen vermögen, getestet. Verwendet wurden Stämme von dem Agricultural Collection Investigations Fermentation Laboratory Peoria, Illionois, USA, und der American Type Culture Collection (ATCC Culture Collection). Untersucht wurde die Wirksamkeit eines ■»(> beim Verfahren der Erfindung verwendeten modifizierten Glyzerin-Mediums im Vergleich zu zwei bekannten Medien des Standes der Technik.

Dar eine Vergleichsmedium, als Vergleichsmedium A bezeichnet (NRDC-Medium), wurde in einem kleineren 4^r> Maßstab gemäß den Angaben der GB-PS 13 85 319 hergestellt.

Das zweite Vergleichsmedium — als Vergleichsmedium B bezeichnet (B-M-Medium) — wurde in kleinerem Maßstab gemäß den Angaben des Beispiels 2 der "><> südafrikanischen Patentschrift 73/3259 hergestellt, mit der Ausnahme jedoch, daß Ammoniumacetat anstelle von Casein- Pepton verwendet wurde.

Die verschiedenen Bakterien wurden in den drei verschiedenen Medien gezüchtet, worauf ihre Cholesterin-Oxidase-Aktivität ermittelt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 9 zusammengestellt. Aus den Ergebnissen ergibt sich die Verbesserung, die bei Verwendung eines beim Verfahren der Erfindung verwendeten Mediums erzielt wird.

Zur Erleichterung des Vergleiches der Daten wirden die Daten eines jeden Stammes gegenüber dem Vergleichsversuch angegeben.

Tabelle

Vergleich des modifizierte:! Glyzerin-Mediums mit
Medien des Standes der Technik

15

Stamm Cholesterin-Oxidase-Aktivität (in % des

als Vergleichsmedium dienenden erfindungsgemäß verwendeten Mediums)

	Medium	Verg'eichs-	Vergleichs
	gemäß	medium A	medium B
	Erfindung
ATCC 4277	100	57	27
NRRL 5635	100	54	30
NRRL 5636	100	22	21
ATCC 14811	-^b)	-^b)	-^h)
ATCC 14349	100^c)	116^C)	82°)
ATCC 17895	100	44	-^b)
NRRL 5767	100		20

) = Unterhalb der Bestimmungsgrenze. ^c) = Die Gesamtmenge an Cholesterin-Oxidase, die durch diesen Stamm erzeugt wurde, war sehr gering und lag bei ungefähr 20 Einheiten/Liter, d. h. der Wert lag an der unteren Grenze der Bestimmungsmöglichkeit. Den relativen Werten ist somit eine geringe Bedeutung beizumessen.

Beispiel 9

Esterase- und Oxidase-Produkticn in einem modifizierten Glyzerin-Medium

(a) Um ihre Wirksamkeit zu testen, wurden verschiedene Sterine an Stelle von Cholesterin in einer Konzentration von 0,1% verwendet Die Konzentration an Cholesterin in dem modifizierten Glyzerin-Medium lag ebenfalls bei 0,1%.

Die höchste Enzymkonzentration wurde durch ß-Sitosterin und 5-«-Cholestan-3-/?-ol ausgelöst, wie sich aus Tabelle 10 ergibt. Mittlere Enzymausbeuten wurden bei Verwendung von Cholesterin und Cholest-4-en 3-on erhalten. Kein Enzym fand sich in dem Medium mit 7-Dehydrocholesterin.

Tabelle 10

Einfluß von Sterinen auf die Produktion von Cholesterinesterase und Cholesterin-Oxidase in einem modifizierten Glyzerin-Medium

Sterin

Trockenzellengewicht Esterase Oxidase

g/Liter Einheiten/Liter Einheiten/Liter

Cholesterin	6,3
j8-Sitosterin	7,7
5-ff-Cholestan-3-_/?-ol	6,8
Cholest-4-en-3-on	7,9
7-Dehydrocholesterin	7,6

37,9	121,6
48,5	119,9
49,2	72,3
21,5	44,0
0,0	0,0

(b) Zur Ermittlung des Effektes verschiedener Ester wurden 0,1% der Ester an Stelle des Cholesterin verwendet Das zu Vergleichszwecken verwendete modifizierte Glyzerin-Medium enthielt 0,1% Cholesterin.

Sämtliche der sechs in einem modifizierten Glyzerin-Medium getesteten Cholesterinester erwiesen sich als

Tabelle 11

Esterase-Auslöser, wie sich aus Tabelle 11 ergibt. Die maximale Ausbeute an Enzym wurde in Gegenwart von Cholesteryllinoleat erzielt. Die Esterasekonzentrationen, die von den anderen Estern erzeugt wurden, lagen bei etwa der Hälfte der Esterasekonzentration, die bei Verwendung des Linole.uesters erzielt wurde.

Einfluß von Cholesterinestem auf die Produktion von Cholesterinesterase und Cholesterin-Oxidase in einem modifizierten Glyzerin-Medium

Cholesterinester

Trockenzellengewicht Esterase Oxidase

g/Liter Einheiten/Liter Einheiten/Liter

Cholesterin

Cholesterolpropionat

Cholesterylbutyrat

Cholesterylhexanoat

Cholesteryloleat

Cholesteryllinoleat

Cholesteryllinolenat

6,3 7,6 7,6 8,2 8,2 6,8 7,6

37,9	121,6
14,9	45,3
19,6	38
14,9	59,5
16,0	87,2
49,7	95,9
23,0	71,6

Die Cholesterin-Oxidase-Erzeugung in Gegenwart von Cholesterin und /?-Sitosterin war beträchtlich höher (40 bis 60%) als im Falle der anderen drei getesteten Sterine (Tabelle 10). Cholesteryloleat und Cholesteryllinoleat führten ebenfalls zu hohen Oxidase-Konzentrationen wie sich aus Tabelle 11 ergibt. Mäßige Konzentrationen an Enzym wurden in dem Medium bei Verwendung der anderen vier Cholesterinester erzielt (Tabellen).

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Cholesterin-Oxidase durch Kultivierung eines Cholesterin-Oxidase erzeugenden Mikroorganismus in einem einen Cholesterin-Oxidase-Auslöser und eine nichttoxische nichtionogene, oberflächenaktive Verbindung sowie Hefehydrolysat enthaltenden Nährmedium und Abtrennung der erzeugten Cholesterin-Oxidase vom Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroorganismus in einem Nährmedium kultiviert, das (a) den Cholesterin-Oxidase-Auslöser in einer Konzentration von 1,0 bis 10 g/Liter Nährmedium, (b) 1,0 bis 5,0 g einer nichttoxischen, nichtionogenen oberflächenaktiven Verbindung pro Liter Nährmedium und (c) mindestens 10 g Hefehydrolysat pro Liter Nährmedium enthält

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Hefehydrolysat in einer Konzentration von 10 bis 30 g/Liter Nährmedium verwendet

3. Verfahren nach einem der Ansprüche i und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus einen de;· folgendea Stämme kultiviert: NRRL 5635; NRRL 5636; NRRL 5767; NRRL 5768; ATCC 4277; ATCC 14 349 undIATCC 17 895.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als nichtionogene oberflächenaktive Verbindung eine Verbindung mit einem hydrophilen Polyoxyäthylen- oder Polyglyzidolrest und einem lipophilen Rest mit mindestens neun Kohlenstoffatomen verwendet

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nichtionogene oberflächenaktive Verbindung mit einem hydrophilen Rest mit mindestens 20 Oxyäthyleneinheiten und einem lipophilen Rest, bestehend aus einem Fettsäurerest mit mindestens 10 Kohlenstoffatomen verwendet.

6. Verfahren nach Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nichtionogene oberflächenaktive Verbindung mit einem hydrophilen Rest aus einem Sorbitanrest und 20 Oxyäthyleneinheiten und einem lipophilen Rest mit einer Palmitinsäureeinheit verwendet.