DE2645553A1

DE2645553A1 - Medikamente enthaltendes granulat von serumalbumin

Info

Publication number: DE2645553A1
Application number: DE19762645553
Authority: DE
Inventors: Jun Anthony F Yapel
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: 3M Co
Priority date: 1975-10-09
Filing date: 1976-10-08
Publication date: 1977-04-21
Also published as: FR2326934B1; JPS5247912A; SE443086B; JPH0133445B2; AU1850676A; CA1077842A; GB1567763A; FR2326934A1; AU513080B2; DE2645553C2; CH629666A5; US4147767A; SE7611064L

Description

betreffend:

"Medikamente enthaltendes Granulat von Serumalbumin"

In der Medizin wurde schon lang die Notwendigkeit der geregelten Freisetzung von Pharmaca erkannt, so daß eine Verabreichung seltener stattfinden kann, während jedoch gleichzeitig das therapeutische Niveau im Blutkreislauf des Patienten sichergestellt ist. Diese geregelte Abgabe von Pharmaca gelingt bereits bei oraler Verabreichung. Verschiedene Überzüge und Kapseln wurden dafür entwickelt, die eine verzögerte Abgabe des Inhalts gestatten. Die geregelte Abgabe von Pharmaca bei parenteraler, insbesondere intravasculärer Verabreichung stellt größere Probleme dar. Im allgemeinen erfordern · intravaskuläre Injektionen eine sorgfältige Einstellung der Dosierung, weil die Medikamente unmittelbar nach der Injektion verfügbar werden, so daß es bei Überdosen und toxischen Substanzen zu schweren Komplikationen kommen kann. Der intravaskuläre Weg ist auch beschränkt auf die Verabreichung löslicher Substanzen wegen der Gefahr der Embolie; langsam die wirksamen Substanzen freisetzende

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Präparate sind für intravaskuläre Verabreichung im allgemeinen nicht verfügbar.

Die (S-PS 931 532 betrifft ein Verfahren zur Mikro-einkapselung von Medikamenten in ein gelierbares hydrophiles Kolloid durch ein Verfahren der komplexen Coacervation. Das Kolloid bildet eine Membran um das Medikament. Die Permeabilität wird so eingestellt, daß eine allmähliche Freisetzung des Medikaments stattfinden kann.

Aus der US-PS 3 541 201 ist eine injizierbare Substanz bekannt, die einen aktiven Wirkstoff in einem metabolisierbaren "proteinartigen" Träger darstellt. Die Trägerteilchen sind als Suspension in einem nicht-wäßrigen Trägermedium injizierbar. Die metabolisierbaren Trägerteilchen werden von den Enzymen der Körperflüssigkeiten angegriffen, so daß es zu einer langsamen Freisetzung der eingeschlossenen Medikamente kommt.

Aus den US-PS 3 773 919 und 3 887 699 sind Mittel aus Polylactid und Medikamente bekannt, die parenteral verabreicht werden können und ein langsames verzögertes Freisetzen des Medikaments über eine gewisse Zeit gestatten.

Das Hauptproblem der langsamen Freisetzung von bekannten injizierbaren Verabreichungsformen liegt darin, daß die Freisetzungsgeschwindigkeit des Medikaments oft nicht korrespondiert mit dem Bedarf des Patienten. Es ist in der Medizin bekannt, daß ein Medikament,um maximalen therapeutischen Effekt zu ergeben, optimale Konzentration im Blutkreislauf des Patienten erreichen muß. Der Arzt verabreicht häufig eine hohe Anfangsdosis oder Vorratsdosis, um diese Konzentration im Blut zu erreichen. Nach dieser Vorratsdosis werden mit den folgenden Verabreichungen nur dieses Anfangsniveau gehalten.

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Die Zeit zwischen der· zu verabreichenden Dosen bestimmt sich aus dem Grundumsatz des Medikaments.

Das ideale Arzneimittel mit verzögerter Freisetzung sollte daher eine zweiphasige oder zweistufige Freisetzung des Medikaments ermöglichen. Eine anfänglich schnelle Freisetzung ist wünschenswert, um die therapeutischen Konzentrationen im Blutkreislauf zu erreichen_tund eine langsamere Freisetzungsphase ist notwendig, um im Blut das Niveau des Medikaments aufrechtzuerhalten und den Stoffwechsel nicht zu beeinflussen. Die bisherigen injizierbaren Mittel gestatteten keine derartige zweistufige Freisetzung, sondern die Freisetzung erfolgte einstufig oder in einer Phase, wobei das Medikament allmählich und konstant über eine gewisse Zeit freigegeben wird.

Das erfindungsgemäße Albuminpräparat gestattet nun die Eliminierung der bisherigen Schwierigkeiten und Probleme, indem ein System mit einer zweistufigen Mittelfreisetzung zur Verfügung gestellt wird. Das erfindungsgemäße System ermöglicht eine anfänglich hohe Freisetzung des Medikaments und in einer zweiten Phase eine langsame Freisetzung des Wirkstoffs einzustellen.

Die Anwendung von Albumin als Träger oder komplexbildendes Mittel für Medikamente ist seit langem bekannt. Kügelchen von Serumalbumin wurden als Trägerstoffe für radioaktive Diagnose oder therapeutisch wirksame Mittel angewandt (US-PS 3 66$ 685, 3 663 686 und 3 663 687). Bei diesen bekannten Albumingranulaten handelt es sich nicht um Kügelchen zur Freisetzung eingeschlossener Medikamente in zweistufiger Art.

Die Erfindung betrifft nun eine therapeutische Zubereitung

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" Γ*

für geregelte Freisetzung der Medikamente in Form eines Granulats von Serumalbumin, enthaltend homogen eingeschlossen 2 bis 70 Gew.-% eines nicht-radioaktiven organischen Medikaments, welches zu zumindest 0,01 % in Wasser von 37 C löslich ist. Während seiner Herstellung wird das Granulat Temperaturen von 110 bis 18O°C zumindest 20 min ausgesetzt, um ein Vernetzen des Albumins zu erreichen« Diese Vernetzung kann jedoch auch mit Hilfe chemischer Vernetzungsmittel stattfinden.

Im folgenden wird das Ausmaß des Erwärmens oder der chemischen Vernetzung des Granulats und dessen Bedeutung für ein zweiphasiges Freisetzen des Medikaments erläutert.

Außer der vorteilhaften zweiphasigen oder zweistufigen Freisetzung des Medikaments durch die erfindungsgemäßen Albumingranulate ergeben sich auch noch weitere wesentliche Merkmale des Systems. Die Feinheit des Granulats läßt sich sorgfältig einstellen während der Herstellung. Die Granulatfeinheit läßt sich heranziehen, um die Medikamente auf diese Weise in spezielle Körperteile zu dirigieren. So können Kugelchen mit einem Durchmesser von 10 bis 100/um leicht im Kapillarsystem der Lunge abgeschieden werden durch intravenöse Injektion. Die Medikamente enthaltenden Granulate dieser Größe wendet man also an bei Lungenleiden, wie Asthma, Tuberkulose, Lungenentzündung oder Tumor.

Ein Granulat mit einer Feinheit von 1 bis 5/um kann

in der Leber abgelagert werden. Intraarterielle Injektionen

oder Katheterisierung kann direkt mit dem Granulat in das Kapillarsystem anderer Organe oder Tumore stattfinden.

Unbestritten sind Vorteile darin zu sehen, daß das Medikament

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direkt in den Kapillarsystemen des Organs oder Tumors eingeführt werden kann. Das Medikament wird direkt an der beabsichtigten Stelle freigesetzt und toxische Nebeneffekte auf andere Gewebe sind weitgehend reduziert. Diese Tatsache macht das erfindungsgemäße Mittel besonders geeignet für die Tumorbehandlung mit anti-neoplastischen Medikamenten,die im allgemeinen hoch toxisch sind für gesundes und malignes Gewebe.

Das erfindungsgemäße Mittel läßt sich jedoch nicht nur auf die Behandlung von Tumoren oder gestörten Organen anwenden, sondern auch für gesunde Lunge oder Leber zur Errichtung eines Depots oder Reservoirs für die Kügelchen, aus denen systematisch über längere Zeit ein Medikament freigesetzt werden soll.

Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist das völlige Fehlen der Möglichkeit zur Emboliebildung bei intravaskulärer Verabreichung. Wasserunlösliche Medikamente, die früher nicht verabreicht werden konnten wegen der Gefahr der Embolie₍lassen sich nunmehr sicher in dem Albumingranulat verwenden.

Weitere Vorteile des erfindungsgemäßen Mittels sind bei der Herstellung zu sehen; weiters in der vollständigen Ausscheidung durch Stoffwechsel, keine Antigenwirkung, erwiesene Sicherheit bei intravaskulärer Verabreichung, die Anpassungsfähigkeit an die verschiedensten Medikamente in relativ unspezifischer Art und Weise.

Das in dem erfindungsgemäßen Mittel angewandte Trägermaterial ist Serumalbumin. Man wird im allgemeinen Humanserumalbumin bzw. in der Veterinärpraxis die entsprechenden tierischen Serumalbumine anwenden.

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Der Begriff "Medikament" umfaßt hier nicht-radioaktive organische Substanzen im Sinne der Pharmazeutik zur Behandlung von Krankheiten oder Leiden.

Die Wasserlöslichkeit des Medikaments ist weitgehend unwichtig innerhalb weiter Grenzen. Das Medikament sollte jedoch, wenn es ziemlich wasserunlöslich ist, d.h. weniger als 0,01 % in Wasser von 37⁰C löslich ist, aus dem Albumingranulat sehr langsam freigesetzt werden, wodurch die zweistufige Freisetzung aus dem Granulat weniger offensichtlich wird.

Die Konzentration an Medikament im Granulat kann über weite Bereiche schwanken und bis hinauf zu 90 % für bestimmte Mittel ausmachen. Typische Konzentration an Medikament im Granulat ist 2 bis 70 Gew.-% der Kügelchen.

Im folgenden werden einige Medikamentklassen und bestimmte Beispiele aufgeführt, die erfindungsgemäß verabreicht werden können.

Medikamentklasse Beispiele

Antiasthmatika Intal (Dinatriumchromo-

glykat)

Mittel zur Bronchiener- Epinephrin Weiterung Isoproterenol

Salbutamol

Terbutalin

Ephedrin

Aminophyllin

Analgetika Morphin

Codein

Natrxumsalicyalt, Salicylsäure Meperidin-Hydrochlorid

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Medikamentklasse Hustenmittel

Narcotika

Schleimlösende Mittel

Bakterieide Tuberkulose hemmende Mittel Mittel gegen Hypoglykämie

Beispiele

Codein Chiophedianol-Hydrochiorid

Morphin Codein Cocain Mep e ridinhydrο chiorid

(Demerol ^ )

Acetylcystein

Sulfanilamid Sulfadiazin Tetracyclin

Rifampin (rifamycin) Dihydrostreptomycin p-Aminosalicylsäure

Tolbutamid (Orinase ) Insulin

Steroide

Hydro c ο rt i s on Prednison Prednisolon Prednisolon-m-sulfobenzoat

Anti-Tumormittel Chlorambucil Busulfan

Alkaloide Colchicin

Antimetaboliten

6-Mercaptopurin Thioguanin

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Medikamentklasse Beispiele

5-Fluoruracil Hydroxyharnstοff Adriamycin (£j

Aminosäuren Methionin

Die Geschwindigkeit, mit der das Arzneimittel oder Medikament aus dem Granulat freigesetzt wird, hängt weitgehend ab von dem Ausmaß, in dem das Albumin während der Herstellung vernetzt wurde. Wie im folgenden noch ausführlich dargelegt werden soll, kann das Albumin entweder durch Wärmebehandlung oder mit chemischen Vernetzungsmitteln vernetzt werden.

Au« dem Ausmaß der Vernetzung des Albumins beeinflussen verschiedene Faktoren die Freisetzungsgeschwindigkeit eines bestimmten Medikaments, u.a. das Molekulargewicht des Medikaments, seine Wasserlöslichkeit und eventuelle elektrostatische oder hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Medikament und Albumin.

Die Konzentration der Albuminlösung für die Herstellung des Granulats hat auch einen gewissen Einfluß auf die Freisetzung des Medikaments. Das Granulat wird im allgemeinen hergestellt aus einer 20- bis 50gew.-%igen (Gew. in VoI) wäßrigen Albuminlösung, jedoch wurden auch schon Produkte aus Lösungen mit nur 2 bis 5 % Protein oder auch bis hinauf zu 70 bis 80 % hergestellt. Insbesondere für die Vernetzung in der Wärme werden die Kügelchen aus höher konzentrierten Lösungen dichter sein und das eingebrachte Medikament wird damit langsamer freigesetzt als bei Lösungen niederer Konzentration, wenn alle anderen Faktoren sonst konstant gehalten werden.

098Ϊ6/1050

- /to·

Allgemein kann man sagen, daß ein bestimmtes Gewicht von sehr kleinen Kügelchen (z.B. 1 bis 5 /um), enthaltend eine bestimmte Menge an Medikament, diese schneller freisetzt als das gleiche Gewicht größerer Kügelchen (z.B. 50 bis 100 /um), enthaltend die gleiche Medikamentmenge und zwar aufgrund der größeren spezifischen Oberfläche der kleineren Kügelchen. Werden alle anderen Parameter gleich gehalten, so setzen kleinere Kügelchen im allgemeinen das Medikament schneller frei als größere aufgrund der Unterschiede der spezifischen Oberfläche. Variationen in der Größe des Granulats können daher angewandt werden zusammen mit anderen Parametern zur Regelung der Freisetzungsgeschwindigkeit des Medikaments.

Obwohl die obigen Faktoren die Freisetzungsgeschwindigkeiten bestimmter Medikamente aus Albuminkügelchen beeinflussen, so haben doch die Eigenschaften des Albumins selbst, vernetzt in einem bestimmten Ausmaß, in unerwarteter Weise * das Freisetzen in zwei Stufen.

Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Granulate geht man im wesentlichen nach den Maßnahmen der US-PS 3 663 687 vor, wonach ein Vorläufer für das Albumingranulat erhalten wird, jedoch können auch andere Verbesserungen noch zur Anwendung gelangen.

Das bestimmte Medikament wird gelöst oder dispergiert in der wäßrigen Serumalbuminlösung in der gewünschten Konzentration. Die Konzentrationen des Albumins liegen im allgemeinen zwischen 20 und 60 % (Gew./Vol.). Die Medikamentkonzentrationen in der Albuminlösung betragen 5 tis 30,Gew.-%, bezogen auf Albumin. Um gleichmäßige homogene Verteilung von weitgehend in Wasser unlöslichen Medikamenten in der Albuminlösung zu gewährleisten, sollte man das Medikament zur besseren Verteilung in der Lösung mahlen.

»Einfluß auf

709816/1Ü5Ö

Nach Zugabe des Medikaments zu der Albuminlösung wird das Ganze etwa 15 bis 60 min äquilibriert; während dieser Zeit können gewisse Anteile des Medikaments an Stellen des Albuminmoleküls gebunden werden. Die tatsächlich gebundene Medikamentmenge hängt ab von Faktoren wie Art der bindenden Stellen des Albumins, Menge und Polarität der elektrostatischen Ladung des Trägermaterials und des Medikaments, Konzentration von Medikament und Trägermaterial in der zu äquilibrierenden Lösung, Gleichgewichtskonstante zwischen den Bindungsstellen des Trägermaterials und den Medikamentmolekülen, Temperatur und in gewissem Umfang auch Faktoren aus dem Massenwirkungsgesetz.

Die wäßrige Albuminlösung,enthaltend gelöst oder dispergiert das Medikament, wird mit einer 20- oder 25iger Injektionsnadel in ein Bad aus Pflanzenöl, welches heftig gerührt wird 500 bis 2500 UpM, eingebracht und bei weiterem Rühren das Ölbad auf eine Temperatur von 110 bis 180 C 15 bis 30 min erwärmt und dann noch zumindest 20 min bei dieser Temperatur gehalten. Eine Wärmebehandlung über 10 h ist im allgemeinen nicht erförderlich. Während dieser Wärmebehandlung zur Vernetzung und letztlich Desolubilisierung der Kügelchen wird der Teil des unlöslichen Medikaments

der *

oder Überschuß von nicht chemisch gebunden ^,eingeschlossen oder eingebaut innerhalb der Zwischenräume zwischen den Trägermaterialketten, die die dreidimensionale Kügelchenstruktur bilden. Durch dieses Rühren und Erwärmen erhält man ein in Wasser unlösliches Granulat mit einem Durchmesser von 5 "bis 80 /um. Die Korngröße der Kügelchen kann eingestellt werden durch Variieren der Einbringungsgeschwindigkeit der Lösung oder Dispersion in das Ölbad und/oder durch Veränderung der Rührgeschwindigkeit des Bads. Zusätzlich kleine Anteile (0,1 bis 2 %) eines oberflächenaktiven Mittels zu der Albuminlösung beeinflußt auch die Größe der fertigen Albuminteilchen durch den indirekten Einfluß auf Oberflächen- und Grenzflächenspannung. Die biologische Abbaufähigkeit und

♦löslichem Medikament, der

7 0 -^! 8 1.6 / 1 0 5 Ci

Porosität der Kügelchen läßt sich einstellen durch Variieren der Zeit und Temperatur des für die Wärmebehandlung angewandten Ölbads. Wenn die anderen Bedingungen gleich "bleiben, führen im allgemeinen höhere Temperatur und längere Erwärmungszeiten zu härteren, weniger porösen und damit langsamer abbaufähigen Kugelchen. Wenn das gewünschte Ausmaß der Insolubilität der Teilchen erhalten ist, wird das Ölbad entweder an der Luft oder mit Eiswasser abgekühlt und die Kügelchen aus dem öl durch Ultrafiltration oder Absaugen auf einem mikroporösen Filter (0,4-5/um Porenweite) gewonnen. Anschließend wird mehrfach mit Heptan und/oder Äther gewaschen zur Entfernung des restlichen Öls. Nach dem Trocknen an der Luft erhält man das Medikament enthaltende Granulat in freifließender pulveriger Form verschiedener Färbung in Übereinstimmung mit der Farbe der eingeschlossenen Medikamente. Für die intravaskuläre Injektion werden die Kügelchen in einem pharmazeutisch tragbaren Medium suspendiert.

Diese Insolubilisierung durch Wärme ist besonders vorteilhaft, weil sie angewandt werden kann für wasserunlösliche wie auch wasserlösliche Medikamente. Außer diesen Vorteilen besitzt die Insolubilisierung in der Wärme einen Nachteil und das ist, daß während der Bildung des Granulats und der Einkapselung des Medikaments das Granulat oft auf Temperaturen über 110 C erwärmt werden muß. Obwohl hohe Temperaturen auf die Stabilität der Medikamente oft nur geringe Einwirkung haben, so kann es doch zu einem Abbau und Verlust der Wirksamkeit bei weniger stabilen Medikamenten kommen. Um dieses Problem zu überwinden, ist eine Insolubilisierung bei Raumtemperatur entwickelt worden. Dafür werden chemische Vernetzungsmittel, insbesondere Formaldehyd und Glutarsäurealdehyd, die hervorragende Härter für Albumin sind, angewandt.

Es wurde festgestellt, daß lipophiletrocknende Alkohole (Butanol, 2-Ä'thylhexanol) in Pflanzenölen leicht löslich sind,

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ein
wie Baumwollsaatöl, standardisiertesMedium für die

Koagulation (spheroidizing bath medium). Die vernetzenden Mittel (Formaldehyd, Glutarsäurealdehyd) werden in den trocknenden Alkoholen gelöst, insbesondere bis 25 Vbl.-% wasserlösliches Vernetzungsmittel Glutarsäurealdehyd (als 25%ige wäßrige Lösung)oder Formaldehyd(als 37%ige Lösung) lassen sich in einem lipophilen trocknenden Alkohol, wie n-Butanol, lösen. Wenn etwa 1 bis 40 Vol.-Teile

einer solchen Lösung von Glutarsäurealdehyd oder Formen aldehyd in Butanol gemischt werd mit ^Q bis 500Teilen

Baumwollsaatöl, so erhält man ein Bad, in dem sowohl das Vernetzungsmittel als auch der trocknende Alkohol gelöst sind. Wird nun eine wäßrige Lösung von 25 bis 50 % Serumalbumin in dieses Bad unter Rühren mit etwa 1200 bis 1500 UpM eingeführt, so erhält man ein Granulat mit einer Körnchengröße von 20 bis 100 /um (kleinere Körnchen erhält man durch schnelleres Rühren oder geringere Konzentration an Trägermaterial in der ursprünglichen Lösung). Das Wasser innerhalb der Kügelchen geht über in den trocknenden Alkohol, während diese durch das Aldehyd vernetzt werden. Die Kügelchen werden nun nach einer Berührungszeit mit dem Vernetzungsmittel von zumindest 20 min abfiltriert. Die Freisetzung des Medikaments durch ein solches Granulat entspricht in etwa dem der Insolubilisierung durch Wärme. Das Ausmaß der Vernetzung läßt sich einstellen durch Variieren der Berührungszeit der Kügelchen mit dem Vernetzungsmittel und der Menge an Vernetzungsmittel.

Obiges Verfahren ist besonders vorteilhaft, weil hier die Bildung des Granulats die Entwässerung und die Vernetzung in einem einzigen üblichen Verfahrensschritt erreicht wird. Wenn ohne Vernetzungsmittel gearbeitet wird, erhält man chemisch entwässerte trockene freifließende Albuminteilchen, die sich in Berührung mit Wasser auflösen.

70 98 16/10 SO

Dieses Verfahren bei Raumtemperatur eignet sich ganz besonders für die Einbettung von temperaturempfindlichen wasserlöslichen oder-unlöslichen Medikamenten, obwohl es auch für wärmebeständige Medikamente anwendbar ist. Eine Variation dazu kann darin gesehen werden, daß man bis auf 105 C erwärmen kann.

Nach diesem modifizierten chemischen Vernetzen wird das Gemisch von Albumin und Medikament in ein Niedertemperaturbad (unter 105⁰C), wodurch die Kügelchen teilweise insolubilisiert werden. Es ist aber auch möglich, das Granulat zu bilden und es ohne Vernetzung chemisch zu entwässern. Das Granulat wird isoliert und in einen Trockner gegeben, woraufhin es zumindest 20 min den Dämpfen von Glutarsäurealdehyd oder Formaldehyd ausgesetzt wird. Diese Aldehyde können auf dem Boden des Trockners in handelsüblicher 37%iger bzw. 25%iger Lösung vorgesehen werden. Die Behandlung mit Aldehyddampf wird einige Tage fortgesetzt, wodurch die Kügelchen immer dichter, weniger porös und weniger wasserlöslich werden. Nach dem Vernetzen im Aldehyddampf wird überschüssiges Aldehyd leicht entfernt von den Kügelchen durch Absaugen oder Trocknen im Vakuum.

Beispiele für weitere Vernetzungsmittel sind zwei-, drei- oder vierwertige Metallkationen (Fe , Al^⁺), die leicht löslich sind in Butanol oder 2-Äthylhexanol oder anderen lipophil trocknenden Alkoholen, die ihrerseits löslich

ÖL.

sind in Pflanzenölen, wie Baumwollsaat Die erhaltene Lösung dient dann als einstufiges Vernetzungsbad für die Albuminteilchen.

Andere Vernetzungsmittel für Proteine sind bekannt und können ebenfalls angewandt werden, wie:

*eingebracht

709816/1050

Vernetzungsmittel Löslich- reagiert primär

keit mit folgenden Gruppen des Proteins

3,6-Bi s (mercurime thyl)-dioxan

Sulfhydryl-

.0-CH

Hg-CH^

N,N'-(1,3-Phenylen)-bismaleinsäureimid

nein Sulfhydryl-

N,N'-Äthylen-bis-(jodacetamid) 0

Sulfhydryl-

1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol

^F"^>-C^^N02 F-^CnO₂

ρ,ρ'-Difluor-m,m'-dinitrodiphenylsulfon

NO,

F ' nein Imino-, Tyrosin-

Dimethyladipimxdat

⁺NH^ "
CH

,)—CH₂-C 2 OCH. nein Imino-, Phenol-

Amino-

C j B 1 6 / 1 0 5

Vernetzungsmittel

Löslichkeit

reagiert primär mit folgenden Gruppen des Proteins

Pnenol-2,4—disulfonylchlorid

Hexamethylendiisocyanat O=C=N-GH₀- (CH₀ ).. -CH₀-N=C=O

Amino-

nein Amino-

Woodward's Reagens £

"CH¹

0
,N⁺-CH₂-CH₃ bindet Carboxyl- und Aminogruppen

Bisdiazobenzidin

Tyrosin-, Histidin-

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2 R 4 5 5 5 3

Obige wasserunlöslichen Mittel lassen sich direkt in dem hydrophoben Öl unter Rühren lösen und können so als Vernetzungsmittel für die Albuminkügelchen dienen. Die wasserlöslichen Vernetzungsmittel werden direkt in die Albuminlösung gebracht oder in Alkohol gelöst, der als Entwässerungsmittel in dem öl dient.

Man kann natürlich auch die Wärmebehandlung und die chemische Behandlung für die Vernetzung kombinieren.

Die Erfindung wird an folgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1_

(A) - (Durch Wärmevernetzen)

0,9999 g Human-Serum—Albumin (Sigma, Fraktion V, Charge 246-16318) wurden in 2 cnr entionisiertem Wasser unter Rühren mit einem Magnetrührer gelöst. In die Albuminlösung wurden 0,1057 S des Antitumormitteis 5-^luoruracil (5-iTJ) (Sigma, Charge 23C-2850) eingebracht und noch weitere 15 niin gerührt. Da sich 5-FU nicht vollständig in der Albuminlösung löste, wurde das wäßrige Gemisch in eine übliche Gewebemühle (10 cm·^) gegeben und bis zur sicheren homogenen Verteilung dispergiert.

Das Gemisch wurde unmittelbar eingebracht in 500 cnr Baumwollsaatöl in einem 600 cm^-Behälter aus korrosionsbeständigem Stahl bei Raumtemperatur unter Rühren von etwa 2300 UpM mit einem Propellerrührer, 0 38 mm. Die Rührgeschwindigkeit bestimmt in merklichem Ausmaß die Teilchengrößenverteilung des Granulats. Es wurde gerührt, während das Ölbad mit einem Tauchsieder, 500 Watt, innerhalb von 15 min auf 140⁰C erwärmt wurde; das Bad wurde 1 h unter Rühren bei 2300 UpM auf dieser Temperatur gehalten.

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Danach wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und die Mikrokügelchen unter Vakuum abfiltriert. Die Reste an Öl wurden mehrere Male mit aliquoten Teilen von 300 cm Heptan abgewaschen. In dem erhaltenen Granulat der Human-Serum-Albuminkügelchen (HSA) waren 9,6 Gew.-% Antitumormittel 5-^IuOruracil enthalten. Das Granulat war nicht agglomeriert, freifließend und hellbraun, die Teilchengröße lag zwischen 10 und 60/Um.

(B) - (chemische Vernetzung;)

0,999 g Human—Serum-Albumin wurden in 2 cnr entionisiertem Wasser durch Rühren mit einem Magnetrührer gelöst und der Lösung dann 0,15 g L-Epinephrin (freie Base,Sigma) sowie 0,0725 g L(+)Ascorbinsäure (Sigma) zugefügt und noch 15 min gerührt.

Das Gemisch wurde unmittelbar eingebracht in ein Bad,- ent-

-z. χ -z

haltend 5 cm Baumwollsaatöl, 13 cnr n-Butanol und 2,0 cnr 25%iger Glutarsäurealdehydlösung. Das Bad wurde in einem Behälter( 600 cm j korrosionsbeständiger Stahl)bei Raumtemperatur mit obigem Propeilerrührer mit etwa 1200 UpM gerührt. Es wurde 4· h gerührt, während dem die Vernetzung des Albumins und die Entwässerung durch den Alkohol stattfanden.

Die erhaltenen Kügelchen wurden im Vakuum abfiltriert land restliches Öl mit drei Portionen zu 100 cnr Heptan abgewaschen.

Das erhaltene Granulat hatte trocken folgende Zusammensetzung: HSA 81,8 %; L-Epinephrin 12,3 %; L(+)Ascorbinsäure 5,9 %· Es war freifließend, nicht agglomeriert und gelb-orange bei einer Körnchengröße von 10 bis 80/um.

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Beispiel 2

Die Freisetzung des Medikaments aus dem Albumingranulat wurde in vitro nach der dynamischen Art in einer Strömungszelle ermittelt. Die Strömungszelle bestand aus einem 12,7 x 5>O mm zylindrischen Rohr, enthaltend an einem Ende eine Sinterglasfritte (Corning D, 10 bis 20/tun Porengröße). Eine Klammer und ein Dichtungsring gestatteten ein leichtes Füllen und Entleeren der Zelle mit dem Granulat. Etwa 10 mg Granulat wurden in einen Teil der auseinandergenommenen Zelle eingebracht und diese dann zusammengefügt. Ein Ende der Zelle war verbunden mit einem Teflon-Eohr, (3,175 mm Außendurchmesser, 2,16 mm 'mix einer Dosierpumpe (ISCO Modell 310),mit deren Hilfe eine auf pH-Wert 7,4 mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (137 mMol HaCl, 27 mMol KCl, 8mMol UaHPO^, ImMoI KH₂PO₄) mit konstanter Geschwindigkeit - im allgemeinen 30 ciir/h - gedrückt wurde. Der medikamenthaltige Ablauf aus der Zelle gelangte in eine Küvette in einem UV (oder sichtbares Licht ) verwendenden Spektralanalysator, abhängig von den spektrophotometrischen Absorptionseigenschaften des Medikaments, der versehen war mit einem Ausdrucker,mit dessen Hilfe die Medikamentkonzentration in Abhängigkeit von der Zeit anhand der optischen Dichte ermittelt werden kann. Die Strömungszelle verblieb immer in einem Wasserbad von 37°C·

Der gesamte Ablauf eines Versuchs wurde in einem Meßzylinder aufgefangen und in einem Beckman DK-2A-Spektrophotometer analysiert, so daß aufgrund des Beer¹sehen Gesetzes die Bestimmung der Gesamtmenge an freigesetztem Medikament aus dem Granulat während der Versuchszeit möglich war. Aus dieser aufgezeichneten Kurve kann man nun die prozentuale Menge des aus dem Granulat freigesetzten Medikaments als Funktion der Zeit ablesen.

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Dieses Beispiel zeigt nun, wie man durch. Variieren der Bedingungen des Vernetzens durch Wärme oder ein chemisches Mittel die Freisetzungsgeschwindigkeit von Bronchien erweiterndem Epinephrin aus dem Albumingranulat einstellen kann. Die Freisetzungsgeschwindigkeit des Medikaments wurde nach obiger Methode bestimmt.

Konzentration der anfänglichen wäßrigen Albuminlösung:

50 % (Gew./Vol.).

Zusammensetzung des Granulats: 3,1 % L(+)-Ascorbinsäure,

88,1 % HSA, 8,8 % Epinephrin (als freie Base).

Vernetzungsbedingungen: 115°C in Baumwollsaatöl innerhalb 1 h.

Albuminkonzentration: 50 %.

Granulatzusammensetzung: 87,5 % HSA, 8,9 % Epinephrin, 3,6 %

7 0 B 8 1 6 / 1 0 5 0

% Medikament frei	0	% Medikament festge
gesetzt	4,3	halten
11,0	100
23,4	95,7
34,6	89,0
38,1	76,6
51,5	65,4
56,7	61,9
60,8	48,5
65,5	43,3
68,6	39,2
74,5	34,5
78,5	31,4
81,4	25,5 '
86,4	21,5
89,3	18,6
94,7	13,6
10,7
5,3

L(+)Ascorbinsäure.

Vernetzungsbedingungen: 120 G 6 Ii in Baumwollsaatöl.

% Medikament frei	% Medikament festge
gesetzt	halten
0	100
	92,5
17,1	82,9
25,5	74,5
34,3	65,7
41,3	58,7
47,4	52,6
52,2	47,8
• 59,1	40,9
64,2	35,8
69,2	30,8
73,6	26,4
76,0	24,0
78,9	21,1
81,6	18,4

Albuminkonzentration: 50 %.

Granulatzusammensetzung: 86,9 % HSA, 8,7 % Epinephrin, 4,4 % L(+)Ascorbinsäure.

Vernetzungsbedingungen: 130⁰C 6 h in Baumwollsaatöl.

% Medikament frei	0	% Medikament festge
gesetzt	7,8	halten
18,0	100
26,2	92,2
33,2	82,0
38,4	73,8
66,8
61,6

709816/10S0

18 42,1 57,9

21 45,8 54,2

27 51,2 43,8

33 56,2 43,8

48 63,5 36,5

66 70,8 29,2

Albuminkonzentration: 50 %\

Granulatzusammens et zung: 87,5 % HSA, 8,8 ^c/b Epinephrin,

3,7 °/° L(+)Ascorbinsäure.

Vernetzungsbedingungen: 145°G 6 h in Baumwollsaatöl.

% Medikament frei	% Medikament fest
gesetzt	gehalten
0	100
■ 2,4	97,6
6,1	93,9
10,2	89,8
13,9	86,1
16,4	83,6
20,8	79,2
25,0	75,0
30,7	69,3

Albuminkonzentration: 50 %; Granulatzusammensetzung: 87,8 % HSA, 8,9 % Epinephrin, 3,3 % L(+)Ascorbinsäure.

Vernetzungsbedingungen: 165°O 6 h in Baumwollsaatöl.

709816/1050

15 18 21 27 48 78 158

- .2* -	2645553
% Medikament frei	% Medikament fest
gesetzt	gehalten
O	100
1,0	99,0
2,3	■ 97,7
4,0	96,0
5,2	94,8
6,3	93,7
7,6	92,4
8,2	91,8
9,5	90,5
12,4	87,6
14,8	85,2
17,7	82,3

Arbuminkonzentration: 50 %; Granulatzusammensetzung: 81,8 %, 12,3 % Epinephrin, 5,9 % L(+)Ascorbinsäure.

Vernetzungsbedingungen: 4h in 500 ml Baumwollsaatöl, enthaltend 13 ml n-Butanol und 2,0 ml 25 % Glutaraldehyd.

% Medikament frei	% Medikament fest
gesetzt	gehalten
0	100
2,6	97,4
6,5	93,5 .
11,2	88,8
13,6	86,4
,16,0	84,0
18,0	82,0
19,3	80,7
21,0	79,0
26,7	73,3
29,3	70,7
30,1	69,9
32,8	67,2

0 3 8 16/1050

Wie man den Proben (A) bis (E) entnehmen kann, sinkt mit steigender Temperatur und Zeit der Vernetzung in der Wärme sowohl die Geschwindigkeit, mit der Epinephrin freigesetzt wird, als auch die Gesamtmenge an freigesetztem Medikament durch einfache Diffusion. Das restliche Medikament in dem Granulat wird voraussichtlich freigesetzt durch Abbau des Granulats im Körper. Probe (A) hat beispielsweise fast 50 % Medikament in 1 h freigesetzt, während die Probe (E),die schärfer vernetzt wurde, in 3 h weniger als 20 % frei gab. Diese Proben zeigen, wie man durch Wahl von Temperatur und Zeit der Vernetzungsbedingungen ein Granulat erhalten kann, welches das eingeschlossene Medikament in vorbestimmter Geschwindigkeit und Menge freizusetzen vermag.

Es wird noch auf Probe (F) hingewiesen, da 4 h Glutarsäurealdehyd als Vernetzungsmittel etwa äquivalent ist einer Wärmebehandlung von 6 h bei 140 bis ⁰

Die Freisetzungswerte der Proben (A) bis (F) wurden mathematisch analysiert zur Bestimmung der Geschwindigkeitskonstante (K) für das freigesetzte Medikament und der Halbwertszeit.

Nimmt man an, daß die Freisetzungsgeschwindigkeit des Medikaments

und aus dem Granulat erster Ordnung ist damit proportional der

Konzentration des Medikaments verbleibend im Granulat, so ergibt sich die Geschwindigkeitskonstante aus

zä£. = Kc , dt

worin c die Konzentration des im Granulat bei der Zeit t verbliebenen Medikaments, K die Geschwindigkeitskonstante für die Medikamentfreisetzung, t die Zeit und c_Q die Anfangskonzentration des Medikaments bei t = 0 ist.

709816/1050

Von dieser Gleichung läßt sich die Gleichung für die Be stimmung der Freisetzungskonstante K erster Ordnung ableiten:

(2) räc f_K._dt

^Jc? oJ

(5) In c - lnc_Q =-K.t

(4-) ln(c/c₀) =-K.t oder

-K.t c = ce

Beide Seiten der Gleichung werden mit 100multipliziert, um den Bruch des restlichen Medikaments c/ in eine Prozentan gabe zu bringen. °

(5) 10Oc
^co

Nimmt man von beiden Seiten der Gleichung den natürlichen Logarithmus

(6) In (100c/ ) = In (% restl. Medikament im ·

ο Granulat)

= -K.t + In 100 = -K.t + B

(7) In (100c/ ) = -K.t +B

^co

-B ist eine Konstante— t so
beobachtet man ein Freisetzungsverhalten erster Ordnung in dem

7 09816/1050

System» erhält man in einem Diagramm In (c/ ) oder In

(100c/ ) gegen die Zeit einer Gerade mit der Neigung -K ^co

Bei c = 0,5 c wird

In (CZc₀) = In (0,5c_Q/c_o) = 0,5 = -£.

so daß die Halbwertszeit t. /~ ⁼ -In 0,5 _ 0,69$ wird.

K K

Es ist also möglich, sowohl die Freisetzungskonstante K als auch die Halbwertszeit aus einem entsprechenden Diagramm des Logarithmus c/c gegen die Zeit zu erhalten.

Trägt man in ein solches Diagramm die Daten der Proben A bis F ein, so sieht man, daß die ersten 30 bis 50 min jeder Kurve fast linear sind und wiedergegeben werden können durch die Gleichung ln(c/c_Q) = -K.t (Bruch des verbleibenden Medikaments im Granulat) oder durch ln(i00c/c_Q) = -K.t + B (% Medikament in dem Granulat).

Stehen genügend Daten zur Verfügung, so können die letzten Teile dieser Kurven durch eine andere gerade Linie mit anderer Neigung wiedergegeben werden. Die Kurvgiln(c/c ) oder ln(i00c/c_Q) gegen Zeit<im Mittelteil*zeigendem Verschieben in den Freisetzungseigenschaften von schnell zu langsam mit fortschreitendem Freisetzen des Medikaments aus dem Granulat.

Die Freisetzungswerte der Proben A bis F wurden nach der Gleichung (7) analysiert unter Verwendung des Verfahrens der kleinsten Quadrate; es wurden die (am besten passendsten) geraden Linien durch Anfang- und Endteile der Kurven ermittelt. Die Werte K und twp wurden ebenfalls aus den Anfangs- und Endbereichen der Kurven ermittelt. Die bestpassenden Parameter B,

K-Werte und Halbwertszeiten für die Proben A bis F sind in folgender Tabelle zusammengestellt:

709816/10S0

Probe K (anfänglich)

Halbwertszeit (anf ängl.)

B (anffängl,)

K (am Ende)

Halbwertszeit (am
Ende)

B (am Ende)

A 37,94x10~³min"¹

32,67x10~³min~¹ 18,3 min 4,63 6,07xi0~⁵min"¹
21,2 min 4,59 3,18xiO"⁵min"¹

114,2 min

217,9 min

2,92
3,39

25,37x10

3,92x1O""⁵min~¹

ί¹ 9,7Ox1O""⁵min"¹

27,3 min 4,55 ungenügende Daten ungenügende Daten

76,2 min 4,60

dto.

176,7 min 4,60 O,55xiO~⁵min"'¹

71,4 min 4,61 0,4ixi0~⁵min~'¹

dto.

1271,6 min
1686,1 min

4,49:3
» ι

4,28

Beispiel \

Serumalbumingranulate, enthaltend das Antitumormittel

5-Fluoruracil (5-FU)₁ wurden hergestellt und die Freisetzung

nach Beispiel 2 ermittelt,

Probe A

Albuminkonzentration >: 50 %;

Granulat zusammensetzung: 90,9 % HSA, 9,1 % 5-5¹U; Vernetzungsbedingungen: 1 h, 100⁰C, Baumwollsaatöl.

min	% Medikament frei	% Medikament fest
	gesetzt	gehalten
0	0	100
1	4,4	95,6
4	25,2	76,8
7	42,7	57,5
10	54,7	45,5
15	65,4	56,6
16	70,1	29,9
19	75,9	24,1
25	85,4	16,6
51	88,5	11,7
Probe B

Albuminkonzentration : 50 %\

GranulatZusammensetzung: 90,4 % HSA, 9,6 % 5-FU; Vernetzungsbedingungen: 1 h, 140⁰C, Baumwollsaatöl.

709816/105Q

	e 1	- 2&>-	4	2645553

min	% Medikament	% Medikament
	freigesetzt	festgehalten
O	0	100
2	2,3	97,7
Ui	9,0	91,0
8	15,5	84,5
11	20,0	80,0
14	22,5	77,^>
17	24,2	75,8
20		74,5
100	31,4	68,6
B e i s ρ i

Dieses Beispiel zeigt die Freisetzung des Antitumormittels 6-Mercaptopurin (6-MP) aus einem Human-Serum-Albumin-Granulat nach der Methode des Beispiels 2.
Arbuminkonzentration: 50 %\

Granulatzusammensetzung: 83,4 % HSA, 16,6 % 6-MP; Ve rne t zung st) e dingung en 1 h, 140 C, Baumwollsaatöl.

min	% Medikament	% Medikament
	freigesetzt	festgehalten
0	0	100
4	2,1	97,9
7	5,8	94,2
10	9,6	90,4
13	12,3	87,7
16	14,8	85,2
19	16,7	83,3
25	20,3	79,7
40	26,6	73,4
55	31,4	68,6
70	34,8	65,2
100	39,5	60,5
130	41,6	58,4
148	44,4	55,6

709816/1050

Beispiel ^

Dieses Beispiel zeigt die Freisetzung von Antitumormittel 6-Thioguanin aus Human-Serum-Albumin-Granulat nach Beispiel 2.

Albuminkonzentration: 50 %;

Granulatzusammensetzung: 82,2 % HSA, 17,8 % 6-Thioguanin;

Vernetzungsbedingungen: 1 h, 123°C, Baumwollsaatöl.

min	% Medikament	6	% Medikament
	freigesetzt		festgehalten
0	O	100
7	1,2	98,8
10	2,3	97,7
13	3,3	96,7
16	4,6	95,4
19	6,5	93,5
22	7,7	92,3
25	9,1	90,9
28	10,4	89,6
34	13,0	87,0
40	15,2	84,8
55	20,3	79,7
85	29,7	70,3
115	37,7	62,3
145	43,0	57,0
175	47,9	52,1 ■
412	55,0	45,0
Beispiel
Antitumormittel

Eine Analyse der Kinetik erster Ordnung der Freisetzungswerte der Beispiele 3 bis 5 wurden im Sinne des Beispiels durchgeführt. Die Geschwindigkeitsparameter sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:

709816/1050

Beispiel

K (anfänglich)

Halbwertszeit (anfänglich)

B (anfäng lich

K (am Ende)

Halbwertszeit (am Ende)

B (am Ende)

3A (10O⁰C, 1 h) 76,64xiO~⁵min~¹

9,0 min 4,61

60,17 x iO~⁵min~¹

11,5 min 4,32

⁰C

3B (140⁰C, 1 h) i

35,5 min 4,61 1,13 x 10~⁵min"¹

615 min 4,34

(140⁰C, 1 h) 9,

' 7Λ,7 min 4,61 ■ 2,13 x 10"⁵min"¹

325 min 4,33

(123⁰C, 1 h) 4,27xiO"⁵min~¹ 162,3 min 4,62 0,78 χ 10~³min"¹

886 min 4,13

cn cn co

Vergleicht man die Werte für die Konstante unidie Halbwertszeit der Beispiele 3A und 3B, so zeigten die Albuminteilchen, enthaltend 5-S¹U, die 1 h bei 100⁰C gehalten wurden, nur ein sehr geringes zweistufiges Verhalten, wogegen solche, die bei 140⁰G vernetzt wurden, stark zweistufigen Charakter hatten. Die anfängliche Halbwertszeit und der Endwert sind weitgehend erhöht mit höherer Vernetzungstemperatur.

Sowohl 6-MP als auch 6-Thioguanin in Albumingranulaten (Beispiele 4 und 5) zeigten zweistufiges Verhalten. Die anfänglichen und Endhalbwertszeiten für 6-MP sind schneller als die entsprechenden Werte für 6-Thioguanin, trotzdem 6-MP bei 140°C und 6-Thioguanin bei 123°C vernetzt wurden. Die längeren Halbwertszeiten von 6-Thioguanin zeigen ohne Zweifel die geringere Wasserlöslichkeit gegenüber 6-MP.

Folgende Beispiele zeigen, daß das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren des Granulats nicht die Aktivität der eingeschlossenen Medikamente beeinflußt.

Beispiel 7

Etwa 20 bis 25 mg Human-Serum-Albumin-Granulat, erhalten aus 50%iger HSA-Lösung mit Epinephrin als Bronchien erweiterndes Mittel, wurden in 10 cnr einer wäßrigen Kochsalzlösung (pH 3) dispergiert und 1 h zur Freisetzung · nennenswerter Mengen an eingeschlossenem Medikament gerührt. Das Granulat wurde zentrifugiert, von überstehender Flüssigkeit befreit und spektroskopisch die Konzentration an freigesetztem Medikament ermittelt. Diese Proben aus der überstehenden Flüssigkeit wurden in vitro auf die Wirksamkeit in einem Meerschweinchen-Tracheal-Gewebe-Test untersucht. Dazu wurde Luftröhrengewebe von Meerschweinchen

709816/1050

in einer Krebs-Lösung bei 38⁰C suspendiert und könnte äquilibrieren. Das Gewebe wurde verbunden mit einem Spannungs-Wandler (strain gauge transducer) und einem Schreiber derart, daß Änderungen in der Länge des Gewebes aufgrund Kontraktion oder Relaxation gemessen werden konnten. Die Zugabe geringer .Anteile eines Agonists, wie Histamin ( etwa 2 /Ug/cnr),bewirkte eine starke Kontraktion des Gewebes. Die Zugabe von reinem Epinephrin oder der überstehenden Lösungen, enthaltend Epinephrin aus dem Albumingranulat _f führte zu einer Relaxation des Gewebes. Die Konzentration von freigesetztem Epinephrin (in/Ug/cm^) für diese Relaxation von histaminkontrahierten Luftröhrengeweben wurde bestimmt und mit einem Standard ähnlicher Art verglichen, um die Aktivität des freigesetzten Epinephrine sichtbar zu machen.

Medikament aus Dosis , % Relaxation

Probe ( /Ug/ciir)

A reines 1-Epinephrin 0,1-0,2 100

(Vergleich)

B HSA = 78 %, Epinephrin
(epi) = 12,5 %, L(+)-Ascorbinsäure = 9,5 %
(68⁰C, 2,5 h) 0,1 100

C HSA = 73,8 %, epi =
21,2 %, L.(+)Ascorbinsäure = 5,0 %
(1OO°C, 1 h) 0,1 100

D HSA = 86,9 %, epi = 8,7% °»°1 25 L(+)Ascorbinsäure =

4,4 % 0,02 75

(100⁰C, 6 h) 0,03 100

E HSA = 87,3 %, epi = 8,8%,O,O1 27

L(+)Ascorbinsäure = 0,02 53

3,9 % 0»°3 73

(110⁰C, 1 h) 0,05 82

0,10 100

709816/1050

HSA =87,7 %, epi =8,8 L(+)Ascorbinsäure =

(11O°C, 4 h)

G HSA = 88,1 %, epi = 8,8 %, L(+)Ascorbinsäure = 5,1 %
(115°C, 1 h)

H HSA = 87,5 %, epi = 8,8 %, L(+)Ascorbinsäure =

(12O°C, 6 h)

HSA = 86,9 %, epi = 8,7 %, L(+)Ascorbinsäure = 4,4 %
(13O°C, 6 h)

J HSA = 87,5 %, epi = 8,8 %, L(+)Ascorbinsäure = 5,7 $

	2645553
0,01	6
0,02	51
0,05	55
0,05	71
0,10	100
0,01	52
0,02	72
0,05	84
0,05	91
0,10	100
0,01	25
0,02	75
0,05	92
0,05	100
0,01	O
0,02	7
0,05	22
0,04	57
0,10	67
0,20	100
0,01	O
0,05	7
0,04	11
0,05	19
0,10	55
0,20	67
0,50	89 ·
0,40	100
0,01	O
0,04	10
0,10	50
0,20	50
0,50	60 ·
0,40	80
0,50	100

K HSA = 87,8 %, epi = 8,9 %, L(+)Ascorbinsäure = 5,5 %
(165⁰O, 6 h)

HSA = 81,8 %, epi = 12,5 % 0,1 100

L(+)Ascorbinsäure =

5,9 % ,

(4 h in 500 cm^ Baumwoll-^ saatöl, enthaltend^ 5 cm-³ n-Butanol +2,0 cm^ 25 % Glutaraldehyd; 25⁰C

709816/1050

• sr.

M HSA = 67,3 %, epi = 20,2 %, 1,4 "0 L(+)Ascorbinsäure = 2,8 O

12,5 %

(4 h in 500 cnr Baumwoll·=
saatöl, enthaltend 13 .cm*
n-Butanol und 2,0 cm3 37 %
Formaldehyd, 25°C

Aus obiger Aufstellung ergibt sich, daß die Aktivität des Epinephrins etwas abnimmt mit steigender Vernetzungstemperatur. Ke in nennenswert er Aktivitätsverlust gegenüber dem Vergleichsversuch zeigt sich bis zu Vernetzungstemperaturen von 13O⁰C. Überraschenderweise selbst nach Vernetzen bei 165°G während 6 h verbleibt eine merkliche Epinephrinaktivität. Selbst bei hoher Temperatur vernetztes Granulat ist wirksam und eignet sieb für die parenterale Injektion bei Menschen.

Epinephrin in HSA-Granulaten, vernetzt mit Glutaraldehyd, behält im wesentlichen seine gesamte Aktivität. In Beispiel 2 wurde gezeigt, daß die Vernetzung mit Glutaraldehyd in 4 h etwa äquivalent ist dem Vernetzen in der Wärme während 6 h bei 140 bis 15O°C. Da dies wenig erscheint, wenn irgend ein Aktivitätsverlust mit Glutaraldehydvernetzung stattfindet (gegenüber einem gelingen Aktivitätsverlust bei 140 bis 150⁰G), so wird möglicherweise die chemische Vernetzung für Epinephrin bevorzugt, wenn höher vernetzte Granulate angestrebt werden.

Formaldehyd ist nicht das Vernetzungsmittel der Wahl bei epinephrinhaltigen Granulaten.

Beispiel 8

Die Maßnahmen des Beispiels 7 wurden wiederholt, jedoch in diesem Fall als Medikament ein bronchienerweiterndes Salbutamol eingesetzt.

70S 8 1 6/1050

Medikament aus
Probe

Dosis

Relaxation

A Salbutamol (Vergl.) 0,1

B HSA=88,5 %, Sal- 0,1

butamol 6,5 % L(+)Ascorbinsäure =

(115⁶⁰C, 1 h)

C HSA=86,1%, Sal- 1,0 butamol = 7,9 % L(+)Ascorbinsäure = 6,0 %; -, (4 h in 500 cm^ Baumwollsaatöl^ enthaltend 15 cm^ n-Butanol und 2 cm3 25 % Glutaraldehyd; 25⁰C.

100 100

100

Ein Vernetzen in der Wärme in 1 h bei 115 C scheint die Aktivität von Salbutamol nicht zu beeinflussen, während Glutaraldehyd die Aktivität herabsetzt.

Beispiel 2.

Die Maßnahmen des Beispiels 7 wurden mit Terburalin als die Bronchien erweiterndes Mittel wiederholt.

Medikament aus
Probe

Dosis

A reines Terbutalin (Vergl.)

B HSA=78,7 %,

Terbutalin = 11,7 % I/(+)Ascorbinsäure = 9,6 %
(68⁰C, 2,5 h)

0,1 - 1,0

0,1 - 1,0 %
Relaxation

100 100

709816/1050

0 HSA=82,9 % 0,1 - 1,0 ' 100

Terbutalin = 12,5 % L(%)Ascorbinsäure = 4,6 % (105⁰C, 1 h)

D HSA=81,5 %, 0,1 - 1,0 100

Terbutalin = 12,3 % (L(+)Ascorbinsäure = 6,2 % (4 h in 500 cm3 Baumwoll^ saatöl, enthaltend 13 cm^ n-Butanol und 2 cm3 25 % Glutaraldehyd, 25⁰C

Daraus entnimmt man, daß weder die Vernetzung in der Wärme, noch mit einem chemischen Mittel einen nachteiligen Einfluß auf die Aktivität von Terbutalin hat.

Beispiel IjO

Es wurde nun die Aktivität von HSA-Granulat, enthaltend

5-i'luoruracil

test geprüft.

5-i'luoruracil als Antitumormittel in einem Mäuse-L-Zellen-

L-676 Mäuseembryo-Fibroplaste wurden gezüchtet und in flüssigen Schüttelkulturen von Swims-67G-Medium,verstärkt durch Zugabe von 5 % fötalem Kalbsserum, ergänzt durch 1 % 200 mm Glutamin gehalten.

Die freien Medikamente ohne Trägermaterial dienten zum ' Vergleich und wurden gelöst entweder in sterilem destilliertem Wasser oder Aceton und dann dem Wachstumsmedium zugesetzt. Wenn Aceton angewandt wird, sollte die Konzentration immer gering genug sein, daß sie nicht-toxisch ist für das Wachstumsmedium.

Das Medikament enthaltende Granulat wurde im Wachstumsmedium suspendiert; ein beschallies Wasserbad wurde zur Unterstützung der Suspension angewandt. Die mikroskopische Unter-

709816/1050

suchung zeigte keine Zerstörung der Kügelchen.

Ein 10 % (Vol./Vol.) Inoculum von L-Zellen wurde in einem Endvolumen von 20 cnr des Wachstumsmediums verwendet, enthaltend suspendiert das Granulat bzw. zum Vergleich das Medikament. Die Ergebnisse wurden ausgezählt nach Inkubation auf einem Schüttelgerät 200 UpM bei 37°C 3 Tage und in % Wachstumshemmung gegenüber von nichtbehandelten Vergleichszellkulturen ausgedrückt. Es wurdenjeweils Parallelversuche durchgeführt.

% Hemmung des L-Zellenwachstums nach 72 h

Konzentration des Medikaments in der L-Zellensuspension ( /Ug*

Antitumormittel _J 10 30 100

reines 5-Fluoruracil

(Vergleich) 67 % 88 % 93 % 93

5-FU-Konzentration % /Ug/cm5 in der Hemmung

Zellkultur

Probe A

Granulatzusammensetzung: 0,3 39

99 % HSA, 1 % 5-FU; 3,0 99

24 h in 500 cm5 Baumwoll^
saatöl, enthaltend 13 Cm^
n-Butanol und 2,0 cm^ 37 %
Formaldehyd; 25⁰C

Probe B

Granulatzusammensetzung: 4,0 98

86.6 % HSA, 13*4 % 5-FU
24 h in 500 cbP Baumwollsaatöl, enthaltend 13 cm^
n-Butanol und 2.0 cm^ 37 %
formaldehyd; 25 C

Probe C

Granulatzusammensetzung: 0,4 47

98.7 % HSA, 1,3 % 5-I¹U 3,9 95 140⁰C in Baumwollsaatölbad

für 2 h

70981 6/1050

Probe Ώ _ -- ~ ^ _ug/_cm3 %

Granulat zusammensetzung: 3,9 86,9 % HSA, 13,1 % 5-FU

(höh. Konzentration als in

Beispiel C) ·

14-0⁰C in Baumwollsaat ölbad für 2 h

Probe E

Granul at zu sammensetzung: 5,1 83,1 % HSA, 16,9 % 5-MJ

5,5 ii in 500 cm* Baumwollsaatöl, enthaltend 13 chk

n-Butanol und 2,0 cm3

37 % Formaldehyd, 25 C

Diese Ergebnisse zeigen, daß die hohe Aktivität von 5-FU in dem erfindungsgemäßen Granulat sowohl bei Härtung durch warme als auch durch Chemikalien aufrechterhalten wird.

Beispiele 11 bis

Nach Beispiel 10 wurde ein Granulat mit weiteren Antitumormitteln hinsichtlich der Beibehaltung der Aktivität untersucht und die Ergebnisse in folgender Tabelle zusammengefaßt:

70981 6/1050

CD CO OO

σ cn ο

Beispiel Nr.

Granulatzusammensetzung

11 Chlorambucil

12

Hydrocortisonacetat

13 Colchicin

a) 95,5 % HSA

4,5 % Chlorambucil . 24 h in 500 cm 3 Baumwollsaatöl, enthaltend 13 cm3 n-Butanol und 2,0 cm3 37% Formaldehyd

b) Chlorambucil (Vergleich)

a) 83,9 % HSA

16,1 % Hydrocortisonacetat 120°C, 1 h in Baumwollsaatöl

b) Hydrocortisonacetat (Vergleich)

a) 83,1 % HSA, 16,9 % Colchicin

14-3⁰C, 1 h in Baumwollsaatöl

b) 83,4 % HSA

16,6 % Colchicin 5,5 h in 500 cdk Baumwollsaatöl, enthaltend 13 cm* n-Butanol und 2 cm3 25 % Glutaraldehyd

c) Colchicin (Vergleich)

Konzentration

( /Ug/cm⁵
Zellkultur)

Hemmung

1,35
13,5

4,8

1,0
10,0
50,0

100,0
5,1

5,0

1,0
10,0

28 89

68 97 88

0 0

73 88

99

93

91 99

Ports, zu TABELLE:

cn cn cn

ο cn ο

Forts, zu TABELLE:

14 Hydroxyharnstoff

15 6-Thioguanin

16 Busulfan

17 6-Mercaptopurin

a) 86,4 % HSA

16,6 % Hydroxyharnstoff
125°C, 1 h in Baumwollsaatöl

b) Hydroxyharnstoff (Vergleich)

a) 82,2 % HSA

17,8 % 6-Thioguanin

123⁰O, 1 h in Baumwollsaatöl

"b) 6-Thioguanin (Vergleich)

a) 83,2 % HSA
16,8 % Busulfan

115°^c, 1 h in Baumwollsaatöl

b) Busulfan (Vergleich)

a) 83,0 % HSA,

17,0 % 6-Mercaptopurin
130⁰C, 1 h in Baumwollsaatöl

b) 6-Mercaptopurin (Vergleich)

/Ug/cnr
5,0

1,0
10,0

5,3

1,0
10,0
50,0

25,0

25,0
50

50

JL 25

22

96

65 88 92

56

69

95

cn cn cn co

Claims

Patentansprüche

(f) Granulat aus Serumalbumin für die parenterale, insbesondere intravasculäre Verabreichung, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Granulat von vernetztem Aluminium 2 bis 70 Gew.-% nicht-radioaktives organisches Medikament homogen eingeschlossen sind, welches zumindest zu 0,01 % in Wasser von 37⁰C löslich ist und aus dem Granulat in zwei Phasen unterschiedlicher Geschwindigkeit freigesetzt wird.
2. Verfahren zur Herstellung des Granulats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man das ausgefällte Granulat auf 110 bis 180⁰C während zumindest 20 min erwärmt oder ein oder mehrere Vernetzungsmittel einwirken läßto
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man für die chemische Vernetzung eine wäßrige Lösung des Albumins, enthaltend ein Medikament dispergiert oder gelöst, einrührt in ein Pflanzenöl, enthaltend einen lipophilen trocknenden Alkohol und Glutarsäurealdehyd oder Formaldehyd.

8188

709816/1050