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Verfahren zum Nachweis und zur Bestimmung
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eines Partners einer immunologischen Reaktion Die Erfindung betrifft
ein Verfahren. zum Nachweis und zur Bestimmung eines Partners einer immunologischen
Reaktion unter Ausnutzung der bekannten Affinität von Antikö--pern und Antigenen
zueinander. Sie betrifft insbesondere ein empfindliches Verfahren zum Nachweis und
zur Bestimmung einer im weitesten Sinne als Antigen zu bezeichnenden Substanz.
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Dabei wird Gebrauch gemacht von der Kenntnis, daß derartige Reaktionen
mit Hilfe von bestimmten Identifizierungsmerkmalen deutlicher registrierbar gemacht
werden können.
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In der immunologischen Reaktion mit derartigen, markierten Reaktionspartnern
werden grundsätzlich folgende Methoden unterschieden: der direkte Test und die indirekten
Techniken.
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Beim direkten Test wird der erste -Reaktionspartner, meist das Antigen,
kenntlich gemacht durch Inkubation mit einem spezifisch gegen ihn gerichteten und
markierten zweiten Reaktionspartner, meist einem Antikörper.
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Bei den indirekten Techniken wird der erste Reaktionspartner mit einem
spezifisch gegen ihn gerichteten zweiten Reaktionspartner inkubiert und nach Abtrennung
und Entfernuny der nicht gebundenen Menge des zweiten Reaktionspartners das Retionsgemisch
mit einem spezifisch gegen den zweiten Reaktionspartner gerichteten dritten, meist
markierten Reaktionspartner, inkubiert und die nicht gebundene Menge des dritten
Reaktionspartners abgetrennt.
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Es ist dem Fachmann bekannt, daß sich der direkte Test auszeichnet
durch eine hohe Spezifität. Sein Nachteil ist die geringe Sensitivität. Andererseits
sind die indirekten Techniken bekannt für ihre große Sensitivität, jedoch für geringe
Spezifität Als eine der wesentlichen Ursachen, die bei dem direkten Test als auch
bei den indirekten Techniken-die Spezifität einschränken, ist die unspezifische
Bindung der in den unterschiedlichen Methoden eingesetzten Antikörper an die übrigen
Reaktionspartner und die sie umgebenden Strukturen anzusehen.
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Die unspezifische Bindung wird auch bei hoch spezifischen Antikörpern
hauptsächlich verursacht durch das sog. Fc-Teil des Antikörper (= Immunglobulin)
-Moleküls.
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Dessen Bindungsaktivität zu verschiedenen, in der Literatur als Fc-Receptoren
umschriebene Strukturen von Zellen oder Geweben wird verstärkt, wenn sich im Antikörpermolekül
eine Konformationsänderung vollzieht. Diese tritt auf bei der spontanen Aggregation
von Antikörpermolekülen in Antikörperpräparationen oder bei der Bindung von Antikörpern
an ein Antigen oder bei der Adsorption von Antikörpermolekülen an künstliche Flächen,
z.B. Latexpartikeln.
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Bislang wurden verschiedene Methoden zur Verminderung der unspezifischen
Bindung angewandt: z.B. Elimination von Aggregaten aus Antikörperpräparationen durch
die Ultrazentrifugation,
Zugabe von Albumin zu den Antikörperpräparationen
zur Proteinstabilisierung und Verhinderung von Aggregatbildungen.
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In dem direkten Test wurde zusätzlich erfolgreich eine Antikörperpräparation
benutzt, deren Fc-Teil durch bekannte Methoden abgespalten worden war ohne die immunologische
Reaktionsweise des Restfragments (F(ab)l (Synonym: Fab) oder F(ab) ) wesentlich
zu beeinträchtigen.
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2 Diese Methoden waren bislang jedoch nicht befriedigend genug.
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Mit vorliegender Erfindung werden nun die indirekten Techniken zur
Immunreaktion mit markierten Reaktionspartnern derartig verändert, daß die bekanntermaßen
hohe Sensitivität voll erhalten bleibt, während die bekanntermaßen hohe Unspezifität
auf ein Minimum reduziert wird.
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Der Erfindung liegt der Gedanke zugrunde, daß in den indirekten Techniken
eine Fc-vermittelte unspezifische Bindung vermieden werden kann, wenn alle an der
Reaktion beteiligten Antikörper frei von Fc sind, sofern im Test das Fc-Teil des
eingesetzten Antikörpers zur Bindung von Komplement nicht erforderlich ist.
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Ist ein Reaktionspartner, der nicht zur Bindung von Komplement nötig
ist, ein nativer Antikörper, so kann dessen Fc-bedingte unspezifische Bindungsstärke
größer sein als die spezifische Bindung eines der Glieder in der Antikörperreihe.
Das kann eine Abspaltung des Komplexes an der immunologisch spezifischen Bindungsstelle
vom ersten Reaktionspartner und eine unspezifische Bindung über das Fc-Teil an Fc-Receptor-ähnliche
Strukturen zur Folge haben.
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Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zum Nachweis und
zur Bestimmung eines Partners einer immunologischen Reaktion in einer indirekten
Technik dadurch gekennzeichnet, daß statt
Antikörpermolekülen Antikörperfragmente
ohne Fc-Teil,insbesondere und F(ab)2-Fragmente verwendet werden, sofern im Test
das Fc-Teil des eingesetzten Antikörpers zur Bindung von Komplemerit nicht erforderlich
ist. Ggf. kann nach Abtrennung des überschüssigen letzten (zweiten) Antikörpers
die Umsetzung mit weiteren, ggf.
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markierten F(ab)1 oder F(ab)2-Fragmenten von Antikörpern, die jeweils
spezifisch gegen den zuletzt eingesetzten Antikörper gerichtet sind, wiederholt
werden.
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Als indirekte Technik im Sinne der Erfindung gelten alle Teste, bei
welche-der gesuchte Reaktionspartner durch mehr als nur einen weiteren Reaktionspartner
twachgewiesen wird; Zu indirekten Techniken im Sinne der Erfindung zählen somit
der Antiglobulintest, der indirekte Test mit Komplement und der Sandwichtest.
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Diese Methoden sind ausführlich in J.H. Humphrey, R.F. Seite: Kurzes
Lehrbuch der Immunologie; Thieme Verlag 1971, Stuttgart, Seite 257-260, in D.M.
Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell, Oxford 1973, page 18.14 -
18.16 und von G. Wick in "Wiener klinische'Wochenschrift", 84:1, Seite 2-7 (1972)
unter Zugrundelegung von Fluoreszenzfarbstoffen als Identifizierungsmerkmale beschrieben.
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Die Methodik der indirekten Technik kann derart erweitert werden,
daß alle außer dem gesuchten Reaktionspartner eingesetzten Reaktionspartner markiert
sind und/oder daß zusätzlich zu einem dritten Reaktionspartner weitere, spezifisch
gegen den vorhergehenden Reaktionspartner gerichtete Reaktionspartner benutzt werden.
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Ferner ist demnach Gegenstand der Erfindung ein Verfahren, wonach
die Inkubation mit markierten F(ab)l- oder F(ab)2-Fragmenten mehrmals durchgeführt
wird. Im Falle, daß bei den
Umsetzungen stöchiometrische Mengen
der Reaktionspartner beachtet werden, ist ein Überschuß der betreffenden Fragmente
nicht erforderlich, so daß auf eine-Abtrennung und Waschung der Reaktionsprodukte
verzichtet werden kann.
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Es ist bekannt, daß Antikörper-Moleküle (Immunglobulin-Mcleküle) durch
proteolytische Enzyme in eine Anzahl von Fragmenten zerlegt werden; so spalten die
Proteinasen Plasmin oder Papain das Immunglobulin-MoleküI'in zwei F(ab)l-Fragmente
und ein Fc-Fragment. Pepsin greift das Molekül an einer anderen Stelle an und führt
danach- zu einem bivalenten, sog. F(ab)2-Fragment und zu zwei weiteren kleineren
Peptiden. Die als F(ab)l- und F(ab)2-Fragmente bezeichneten Antikörper fragmente
des Antikörper-Moleküls sind im Sinne der Erfindung einsetzbar. Als optimal hat
sich jedoch die Verwendung von F(ab)2-Fragmenten erwiesen.
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Ein Beispiel der F(ab)2-Herstellung findet sich in Reid, K.B.Ch.
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(1971), Immunology 20, 649, der F(ab)l-Herstellung bei Porter, R.P.
(1959), Biochem. J. 73, 119.
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Im Sinne der Erfindung kann als Identifizierungsmerkmal ein fluoreszierender
oder phosphoreszierender Farbstoff, vorzugsweise die Fluoresceinabkömmlinge, vor
allem das Fluoresceinisothiocyanat (FITC) verwendet werden.
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Diese Farbstoffe werden im alkalischen Milieu durch eine Thiocarbamidbindung
an Proteine gebunden und ihr Emissionsspektrum hat den Gipfel im Grün, d.h. im Bereich
der maximalen Empfindlichkeit der menschlichen Retina. Ferner werden mit Vorteil
eingesetzt Rhodaminderivate, wie Tetramethylrhodaminisothiocyanat und Lissamin Rhodamin
B 200 Sulfonalchlorid (RB 200 SC), wenn sie auch nicht so häufig in die entsprechenden
Techniken Eingang gefunden haben wie die Fluoreszeinfarbstoffe.
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Die Koppelung der Rhodaminderivate an Proteine erfolgt über eine Thiocarbamid
oder Sulfonylchlorid-Amin Bindung. Rhodamine
fluor-eszieren im Rot-Orange-Bereich
und ihre Konjugate werden hauptsächlich zusammen mit fluoreszeinmarkierten Immunglobulin.-lösungen
für die gleichzeitige Darstellung zweier verschiedener Antigene in demselben Präparat
verwendet. Sowohl die yrüne Fluoreszenz des Fluoreszeins als auch die rot-orange
Fluoreszenz der Rhodaminverbindungen kontrastieren deutlich mit der meist bläulichen
Eigenfluoreszenz bestimmter Gewebe bei deren Betrachtung im Fluoreszenzmikroskop.
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Statt der verwendeten auf fluoreszierende Strahlung abgestellten Identifizierungsmerkmale
steht es dem Fachmann selbstverständlich frei, im Rahmen der vorliegenden Erfindung
die ihm bekannten anderen Identifizierungsmerkmale zu verwenden, wie beispielsweise
die radioaktive Markierung oder die Enzym--Markierung, um nur einige Beispiele zu
nennen.
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Insbesondere wird bei der Markierung mit radioaktiven Substanzen eine
geringere, durch die Markierung bedingte Beeinträchtigung des biochemischen Verhaltens
des F(ab)1- bzw. F(ab)2-Fragmentes beobachtet als bei Markierung mit fluoreszierender
Substanzen wie z.B. FITC oder TRITC.
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Die erfindungsgemäße Anwendung von Immunglobulin-Fra gmenten in indirekten
Techniken ist im folgenden kurz für die Antiglobulintechnik, fiir die Sandwichtechnik
und für den indirekten Test mit Komplement beispielhaft beschrieben: Bei der Antiglobulintechnik
wird das antigene Substrat zunächst mit einem unmarkierten Antikörper in Kontakt
gebracht. Hierbei kommt es zur Bindung der Antikörper -an das homologe Antigen.
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Die auf diese Weise fixierten Immunglobuline-können nun ihrerseits
als Antigen für ein mit einem Identifizierungsmerkmal versehenen Antikörper dienen.
Damit wird das ursprünglich in Frage stehende Antigen indirekt nachyewiesen. Da
darüber hinaus stets mehr als ein Antikörper-Molekül pro Antigen-Molekül in Reaktion
tritt, ist die Antiglobulin-Methode empfindlicher als der di3:&te Test.
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Beim Nachweis, bzw. der Bestimmung eines Antigens in der Antiglobulintechnik
gemäß der Erfindung bringt man die unbekannte Probe oder eine Verdünnungsserie davon
mit einer bekannten Menge des markierten Antikörperfragmentes, das spezifisch gegen
das Antigen gerichtet ist, in Kontakt und läßt danach das Gemisch 20 Minuten bis
20 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bei einer Temperatur zwischen 4 - 300C, vorzugsweise
etwa 200C in Wasserdampf-gesättigter Atmosphäre stehen.
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Nichtgebundene Antikörper werden durch mehrmaliges Waschen (in der
Regel 2 - 6 x) des Reaktionsgemisches, vorzugsweise mit einer polyionischen isotonischen
wässrigen Lösung vom Reaktionsgemisch abgetrennt. Nachfolgend wird das Reaktionsgemisch
in Kontakt gebracht mit einer bekannten Menge eines markierten Antikörperfragments,
das spezifisch gegen das erste Antikörperftagment gerichtet ist und daraufhin inkubiert
und gewaschen unter Bedingungen, wie für das zuerst verwendete Antikörper fragment
beschrieben.
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Anschließend wird je nach Art des verwendeten Antigens das Reaktionsgemisch
auf einen Objektträger aufgestrichen (z.B.
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Zellsuspension) , sofern es nicht auf einem Träger bereits fixiert
ist (z.B. Histologischer Schnitt).
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Bei der Sandwichtechnik wird der erste Reaktionspartner, ein Antikörper
mit einem zweiten Reaktionspartner, einem Antigen, gegen das der erste Reaktionspartner
immunologisch spezifisch gerichtet ist, inkubiert. Gegebenenfalls nach Abtrennung
und Entfernung der nicht gebundenen Menge des zweiten Reaktionspartners wird das
Reaktionsgemisch mit einem spezifisch gegen den zweiten Reaktionspartner gerichteten
dritten Reaktionspartner, einem ein Identifizierungsmerkmal tragenden Antikörper
inkubiert und nachfolgend die nicht gebundene Menge des dritten Reaktionspartners
abgetrennt. Inkubationszeiten, Inkubationsbedingungen, Waschungen und weitere Aufarbeitung
für die
Messung des Identifizierungsmerkmales entsprechen den dem
Fachmann bekannten Bedingungen.
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Beim indirekten Test mit Komplement ist der erste Reaktionspartner
ein komplementbindendes Antigen oder aber ein Antigen, das mit einem komplementbindenden
spezifisch gegen das Antigen gerichteten Antikörper verbunden ist. Der zweite Reaktionspartner
ist Komplement, welches sich mit dem Antigen oder aber mit dem am Antigen haftenden
.Antikörper verbindet. Der dritte Reaktionspartner ist in beiden Fällen ein markierter
Antikörper, spezifisch gerichten gegen Komplement.
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Bei der indirekten Technik mit Komplementzusatz wird das Antigen somit
entweder in Kontakt gebracht mit Komplement, inkubiert und nachfolgend die nichtgebundene
Menge Komplement gegebenenfalls durch Waschung abgetrennt oder aber das Antigen
wird mit einem spezifisch gegen ihn gerichteten komplementbindenden Antikörper in
Kontakt gebracht, inkubiert, die nichtgebundene Menge des Antikörpers durch Waschung
entfernt und das Reaktionsgemisch mit Komplement in Kontakt gebracht, inkubiert
und nachfolgend die nicht gebundene Menge des Komplements durch Waschung abgetrennt.
Nachfolgend wird in beiden Variationen das Reaktionsgemisch mit einem, ein Identifizierungsmerkmal
tragenden Antikörper spezifisch gerichtet gegen Komplement, inkubiert und anschließend
die nicht gebundene Menge des Antikörpers abgetrennt.
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Inubationszeiten, Inkubationsbedingungen, Waschungen und weitere Aufarbeitung
für die Messung des Identifizierungsmerkmales entsprechen den dem Fachmann bekannten
Bedingungen.
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Die Untersuchung erfolgt mit Hilfe von dem Fachmann bekannten und
von einschlägigen Firmen angebotenen qualitativen und quantitativen Meß- und Beobachtungsgeräten,
wie Fluoreszenzmikroskopen mit AuElicht- oder Durchlidhtanregung und Fluoreszenzphotometern,
Photometern oder Strahlungsmeßgeräten.
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Als Antigene kommen in Frage z.B. virale Antigene (z.B. Röteln-Antigen,
Masern-Antigen, Hepatitis-Antigen), bakterielle Antigene (z.B. Salmonella-Antigene,
Escherichia coli-Antigene, Staphylokokken-Antigene), Kohlenhydrat-Antigene (z.B.
Blutgruppensubstanzen), Protein-Antigene (z.B. Plasmaproteine, wie Immunglobuline,
Komplementfaktoren), Glykoprotein-Antigene (z.B.
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« l-Antitrypsin,coeruloplasmin) und Lipoprotein-Antigene (z.B.
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-Lipoprotein) .
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Sie können isoliert,gelöst, suspendiert,an einen Träger, beispielsweise
an ein wasserunlösliches Polymeres wie chemisch quervernetzte Kohlehydrate gebunden
sein oder in bzw. auf Zellen vorkommen oder in histologischen Gewebsschnitten vorhanden
sein.
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Die für die Herstellung der F(ab)-Fragmente erforderlichen Immunglobuline
werden in an sich bekannter Weise durch Immunisierung von Tieren, vorzugsweise Wirbeltieren,
mit einem Antigen, die diese als fremd erkennen, hergestellt. Bei Vorliegen einer
ausreichenden Zahl von Antikörpern im Serum der Tiere wird das Blut, bzw. das Serum
gewonnen und daraus zunächst die Antikörper und schließlich die F(ab)l- bzw. F(ab)2-Fragmente
nach bekannten Verfahren hergestellt.
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Die Verminderung der unspezifischen Bindung bei erhaltener Empfindlichkeit
durch erfindungsgemäße Verwendung von Fragmenten von spezifischen Antikörpern in
der indirekten Technik verdeutlichen folgende Versuche am Beispiel einer Antiglobulintechnik,deren
Ergebnisse tabellarisch zusammengestellt sind.
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Die Versuchsanordnung ist sinngemäß nach Beispiel 1 gewählt, wobei
nach dem Stand der Technik durchgeführte Bestimmungen mit denen verglichen werden,
die durch Verwendung von F(ab)2-Fragmenten bzw. F(ab)-Fragmenten vorgenommen wurden.
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Wie die Tabelle 1 deutlich zeigt, ist bei Verwendung von F(ab)2-Fragmenten
eine deutliche Verminderung der unspezifischen, Fc-bedingten Bindung von Kaninchen-
«-Globulin' und Ziegen-γ-Globulin festzustellen, während die entsprechenden
nativen Antikörperpräparationen eine hohe unspezifische Bindung an die Zellmembranen
aufweisen (I und II in Tabelle 1).
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Eine hohe unspezifische Bindung beeinflußt die Analysenergebnisse
mit spezifischen Antikörpern (s. III in Tabelle 1).
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Dieser Effekt der Verminderung der unspezifischen Bindung kann nicht
beobachtet werden, wenn einer der verwendeten Antikörper ein natives Immunglobulin
ist.
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Werden Gefrierschnitte verschiedener Organe, z.B. Leber oder Niere
von Maus, Ratte, Kaninchen oder Mensch, auf Glasobjektträger nach bekannter Methodik
auEgezogen und jeweils mit etwa 0,1 ml nativen FITC-markierten Ziege-8 -Globulin
oder Kaninchen-γ-Globulin überschichtet, in einer feuchten Kammer 30 Minuten
bei 200C inkubiert, nachfolgend ausgiebig - mindestens 5 x -in isotonischer Salzlösung
gewaschen und dann mit etwa 0,1 ml eines nativen FITC-markierten Kaninchen-Antiziege-Ig-Antikörpers
bzw. eines nativen FITC-markierten Ziegen-Antikanillchen-Ig-Antikörpers überchichtet,
wiederum in einer feuchten Kammer 30 Minuten bei 200C inkubiert und nachfolgend
ausgiebig - mindestens 5 x - gewaschen, sodann unter dem Fluoreszenzmikroskop beurteilt,
so ergibt sich auch hier eine größere unspezifische Fluoreszenz als bei Verwendung
von FITC-markierten F(ab)l oder F(ab)2-Antikörperfragmenten der entsprechenden Antikörperfraktionen.
Tabelle
@ Verminderung der unspezifischen Bindung von normalen Kaninchen -#-Globulin, normalen
Ziegen-#-Globulin oder von einem Ziegenantihuman -Ig-Antikörper in der indirekten
(Doppel)-Antikörper-Methode an Raji-Zellen, RPMI 1788-Zellen oder humanen peripheren
Lymphozyten durch Verwendung von F (ab)2-Fragmenten.
| IKaninchen-#- II Ziegen-# III Ziegen-Antihuman-Ig |
| Globulin Globulin |
| native F(ab)2 native F(ab)22 native F(ab)2 |
| Zellen Ig Ig Ig |
| Raji I) 1 19 2) 0 5 0 17 9 |
| 4 11 0 1 0 10 3 |
| 16 5 0 0 0 3 0 |
| 64 0 0 0 0 0 0 |
| RPMI 1 27 0 25 0 25 18 |
| 1788 4 21 0 31 0 19 12 |
| 16 16 0 22 0 14 4 |
| 64 7 0 7 0 8 0 |
| 256 1 0 0 0 0 0 |
| Spender A 1 3,1 # 1α 0 12,8 # 1,9 0 22,8 # 2,2 27,6 #
2 |
| Lympho- 4 0 0 2,6 # 1,2 0 5,9 # 1,4 5,8 # 1,8 |
| zyten 16 0 0 0 0 1,9 # 0,7 3,9 # 1,3 |
| Spender B 1 19,4 # 1,8 0 9,2 # 1,0 0 37,8 # 1,1 8,0 # 0,7 |
| Lympho- 4 1,9 # 0,7 0 1,3 # 0,5 0 6,9 # 0,7 1,4 # 0,5 |
| zyten 16 0 0 0 0 1,3 # 0,7 0 |
1) Reziproker Titer der Verdünnung des ersten Antikörpers, I, II, III 2) Ergebnisse
gefärbter Lymphozyten in Prozent α) m # s von 10 unabhängigen Bestimmungen
Werden
Objektträger z.B. solche aus Glas oder Kunststoff ähnlich wie die histologischen
Schnitte mit FITC-konjugiertem Kaninchen- # -Globulin oder FITC-konjugiertem Ziege-
b -Globulin inkubiert, gewaschen und nachfolgend mit FITC-konjugiertem Antikaninchen-Ig-Antikörpern
von der Ziege bzw. Antiziegen-Ig-Antikörpern vom Kaninchen inkubiert und gewaschen,
so ergbit sich alternativ zur Verwendung von FITC-konjugierten F(ab) 2-Fragmenten
der jeweiligen Antikörper folgendes Ergebnis: Quantitative Messungen mit Hilfe eines
Auflichtfluoreszensmikroskops mit Einrichtung zur quantitativen Immunfluoreszens
zeigen eine eindeutige unspezifische Bindung nativer Antikörper an die Objektträger,
während F(ab)2-Fragmente dieser Antikörper sich nicht oder nur geringfügig binden
(s. Tabelle 2).
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Tabelle 2 Verminderung der unspezifischen Bindung von Antikörpern
und deren Kaninchen- # -Globulin bzw. Ziegen-#-Globulin an Objektträger durch Verwendung
von F (ab) 2-Fragmenten.
| Träger |
| beschichtet native F (ab) 2-Fragmente |
| mit Antikörper |
| 1) 2) 2) |
| Kaninchen-#- 1 32 25,5 |
| globulin (+Ziegen- 4 32 26,5 |
| antikaninchen-Ig 16 30,5 26,o |
| 1:4o verdünnt) |
| Ziege-#-Globulin 1 35 25,5 |
| (+ Kaninchen-1 24 25,5 |
| Antiziege-Ig 4 34 25,5 |
| 1:40 verdünnt 16 30,5 25,5 |
| Träger |
| unbehandelt 26 25 |
-,Reziproker Titer der Verdünnung des ersten Antikörpers 2) Fluoreszensintensität
verglichen mit einem Uranylazetat -Standard (Meßzeit 1/25 Sek)
Das
erfindungemäße Verfahren ist aufgrund des vorher Gesagten besonders geeignet zum
Nachweis von cytoplasmatischen Zellmembran oder Zellkern-Antigenen oder auch von
Antikörpern, die über ein Antigen an einen Träger gebunden sind. Diese Anwendung
stellt im lDeso-lderen Maße Gegenstand der vorliegenden Anmeldung dar.
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Die Erfindung wird im nachfolgenden Beispiel des Nachweises von zellmembrangebundenen
Immunglobulinen auf Lymphozyten näher erläutert:
Beispiel: Humane
periphere Lymphozyten,nach bekannter Methode aus venösem Vollblut isoliert, werden
2 x in einer isotonischen Kochsalzlösung gewaschen und sedimentiert. Ein Sediment
von 2 x 106 derartigen Zellen wird mit 0,1 ml eines Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugierten
Ziegen-Anti-Human-Ig-F(ab)2-Fragments (1%ige Proteinlösung) resuspendiert und 30
Minuten bei 20°C inkubiert.
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Machfolgend werden die Zellen in einer isotonischen Kochsalzlösung
3 x gewaschen. Das Sediment wird mit 0,05 ml eines Anti-Ziegen-Ig-f(ab)2-Fragments
vom Kaninchen resuspendiert (1%ige Proteinlösung), für 30 Minuten bei 200C inkubiert
und nachfolgend 3 x gewaschen in einer isotonischen Kochsalzlösung.
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Das Sediment wird in 0,05 ml Rinderserumalbuminlösung (2 % W/v) resuspendiert
und die Suspension auf einen Objektträger ausgestrichen, luftgetrocknet, nach bekannter
Art mit Glycerin eingebettet.
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Mit Hilfe eines Fluoreszenznikroskops wird der Anteil fluoreszierender
Zellen an den Gesamtzellen ausgezählt und in Prozent angegeben.
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Ergebnis: Die Anzahl fluoreszierender Zellen ist aus Tabelle 1, III.
rechte Spalte, Spender A, zu ersehen.
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Entsprechendes kann gefunden werden, wenn statt humaner peripherer
Lymphzyten humane lymphoblatoide Zellen des Stammes RPMI 1788 verwendet werden,
die als Zellen mit Ig, Fc- und Komplementreceptoren gelten.