-
Teststreifen zum Nachweis von Biiirubin
-
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes diagnostisches
Mittel in Form eines Teststreifens zum schnellen und weitgehend spezifischen Nachweis
von Bilirubin in Körperflüssigkeiten, vorzugsweise in Urin.
-
Der Nachweis von Bilirubin in Serum bzw. Urin wird seit langer Zeit
zur Diagnostik der Leber- und Gallenerkrankungen verwendet.
-
In der alten Form des Nachweises hat man die Reaktion der Diazobenzolsulfonsäure
mit Bilirubin zu dem farbjgen "Azobilirubin" ausgenutzt. In neueren Veröffentlichungen
werden als Reagenzien aber auch verschieden substituierte Benzoldiazoniumsalze,
z.B. diazotierte 2,4- oder 2,5-Dichloraniline verwendet (DT-PS 2 110 658), die entweder
einen höheren molaren Extinktionskoeffizienten oder eine größere Farbstabilität
als Diazobenzolsulfonsäure aufweisen.
-
Als diagnostische Mittel haben Scnelltests eine immer größere Bedeutung
in der medizinischen Diagnostik gewonnen. Es ist ein Test beschrieben worden (DT-PS
1 102 444), bei dem einA Tablette, die die für die Reaktion nötigen Reagenzien enthält,
auf einer Spezialunterlage mit der zu untersuchenden Flüssigkeit versetzt wird.
Das Vorliegen von Bilirubin wird dann durch Erscheinen eines blauen Fleckes oder
Ringes angezeigt.
-
Vor einiger Zeit sind auch Testpapiere beschrieben worden (DT-AS
2 007 013, DT-OS 2 240 471, DT-OS 2 364 844, DT-OS 2 240 357, DT-OS 2 432 754),
die es gestatten, durch Eintauchen des Papiers in die Untersuchungsflüssigkeit und
anschliessenden Vergleich des Farbumschlages mit einer Farbskala den Gehalt an Bilirubin
in Serum oder Urin qualitativ abzulesen.
-
Diese Testpapiere stellen gegenüber den Küvettentests bei Serum-und
Urinuntersuchungen eine erhebliche Vereinfachung dar, weil häufig die semiquantitativen
Angaben, die man mit den Teststreifen erhält, für eine Diagnose bzw. eine Screening-Untersuchung
genügen. Erst mit Hilfe der Teststreifen ist die Untersuchung breiter Bevölkerungsschichten
möglich geworden, da die Untersuchungen entweder mit Hilfe nicht ausgebildeter Kräfte
oder auch von den Untersuchungspersonen selbst durchgeführt werden können.
-
Die herkömmlichen Teststreifen besitzen jedoch für eine breite Anwendung
entscheidende Nachteile. So zeigen mit den bisher bekannten Teststreifen die natürlichen
Harninhaltsstoffe Indoxylessigsäure bzw. Indoxylsulfat im Normalbereich und insbesondere
im angrenzenden Verdachtsbereich rote bis braunrote Färbungen, die das Vorhandensein
von Bilirubin vortäuschen bzw. überdecken können. Außerdem bedingt die natürliche
Gelbfärbung des Urins eine Herabsetzung der Empfindlichkeit, da die mit Bilirubin
gebildeten blauen (DT-PS 2 240 471) bis violetten Färbungen hierdurch nach den Gesetzen
der Farbenlehre abgeschwächt werden. Die Vorteile der einfachen Handhabung der Teststreifen
gegenüber den spezifischen Küvettentests werden somit vermindert, wenn nicht gar
aufgehoben.
-
Ziel der Erfindung ist daher ein Teststreifen zur Bestimmung von Bilirubin
in Urin bzw. Serum, der weitgehend spezifisch ist, d.h. dessen Anzeige durch die
natürlichen Harninhaltsstoffe Indoxylessigsäure bzw. Indoxylsulfat nicht gestört
wird.
-
Es ist bekannt (Biologie der Gallenfarbstoffe, T.K. With, Thieme Verlag
1960, S. 148 f), daß für die schnelle Reaktion von Bilirubin mit Diazoniumverbindungen
ein stark saurer pH-Wert von entscheidender Bedeutung ist. Demgemäß werden für die
bekannten Testpapiere Puffergemische mit einem pH-Wert von 1,2 - 1,8 verwendet.
Bei diesen pH-Werten reagieren die natürlichen Harninhaltsstoffe Indoxylsulfat und
Indoxylessigsäure mit der Diazoniumverbindung zu rot bis rotbraun gefärbten Verbindungen.
-
Es wurde nun gefunden, daß die Geschwindigkeit der Reaktion von Diazoniumverbindungen
mit Indoxylsulfat und Indoxylessigsäure in hohem Maße vom pH-Wert abhängig ist.
So gibt es für viele Diazoniumsalze einen pH-Bereich, bei dem mit Indoxylsulfat
bzw. Indoxylessigsäure keine bzw. nur schwach gelbe Färbungen auftreten, während
außerhalb dieses Bereichs rote bis gelb-braune Farbstoffe gebildet werden. Da diese
pH-Bereiche zum Teil deutlich höher liegen als die der bisher verwendeten Puffergemische,
war eine Verschlechterung der Reaktion der Diazoniumverbindungen mit Bilirubin zu
erwarten.
-
Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, daß Teststreifen zum Nachweis
von Bilirubint bestehend aus einem saugfähigen Träger, der mit einer oder mehreren
Diazoniumverbindungen, Puffersubstanzen und ggf. Zusatzstoffen wie z.B. Stabilisatoren,
optischen Aufhellern oder auch Verdickungsmitteln imprägniert ist, dadurch gekennzeichnet,
daß der verwendete Puffer einen pH-Wert aufweist, bei dem die Reaktion der Diazoniumverbindung
mit natürlichen Harninhaltsstoffen vermieden wird bzw. so weit abgeschwacht wird,
daß eine Farbreaktion mit Bilirubin nicht mehr gestört wird, hervorragend zum Nachweis
von Bilirubin brauchbar sind. Trotz der in Biologie der Gallenfarbstoffe" offenbarten
Lehre ist die Reaktionsgeschwindigkeit der Diazoniumverbindungen auch in pH-Gebieten
außerhalb pH 1,2 - 1,8 groß genug, um schnell ansprechende Teststreifen'zu ermöglichten.
Sie weisen darüberhinaus den Vorteil auf, daß das Absorptionsmaximum des Farbstoffes,
der mit Bilirubin gebildet wird, eine hypsochrome Verschiebung (von blau bzw. blauviolett
nach rot) erfährt und die Anzeige somit weniger durch die gelbe Eigenfarbe des Urins
beeinträchtigt wird.
-
Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Testpapiere werden die nachfolgend
beschriebenen Komponenten in einem Lösungsmittel, beispielsweise Wasser, gelöst
und der entsprechende pH-Wert eingestellt. Mit dieser Lösung wird ein geeignetes
Papier getränkt und anschließend getrocknet. Sollte es erforderlich sein, können
die einzelnen Bestandteile auch nacheinander auf
das Papier aufgebracht
werden.
-
Als Diazoniumverbindungen für das erfindungsgemäße Testpapier können
insbesondere die Verbindungen I-V verwendet werden.
-
Jedoch können auch andere Diazoniumverbindungen, die mit Bilirubin
eine Reaktion eingehen, eingesetzt werden.
-
Als Puffersubstanz kommen anorganische und/oder organische feste Säuren
wie z.B. Metaphosphorsäure, Zitronensäure und Oxalsäure infrage, die mit einer Base,
z.B. NaOH auf den entsprechenden pH-Wert eingestellt werden. Der pH-Wert der Puffermischung
ist für jede Diazoniumverbindung im Sinne der Erfindung zu optimieren. Es ist für
den Fachmann jedoch verständlich, daß ein pH-Wert von 5 - 6 nicht überschritten
werden sollte, um noch ausreichend stabile Testpapiere zu erhalten.
-
Stabilisatoren, wie z.B. Naphthalin"1,5-disulfonsäure oder auch andere
aromatische Sulfonsäuren können dem Testpapier ggf. zugesetzt werden.
-
Netzmittel, wie z.B. Dodecylbenzolsulfonsäure, ergeben ein gleichmäßiger
anfärbendes Testpapier und können die Reaktionsgeschwindigkeit beeinflussen.
-
Ggf. können auch noch Verdickungsmittel, z.B. zur Verbesserung des
Ausblutverhaltens, und optische Aufheller zur Anwendung kommen.
-
In den folgenden Beispielen soll die Erfindung erläutert werden, ohne
sie jedoch darauf zu besdiränken.
-
Beispiel 1 Es wird eine Lösung aus 10 g meta-Phosphorsäure 3 g Zitronensäure
7 g Naphthalin-1 ,5-disulfonsäure-Dinatriumsalz 0,5 g Dodecylbenzolsulfonsäure 0,1
g optischer Aufheller 0,4 g 2-Trifluormethyldiazoniumtetrafluoroborat (I) in 90
ml Wasser hergestellt.
-
Der pH-Wert der Grundlösung beträgt 1,3. Durch Versetzen mit 3 % wässriger
Natronlauge werden aus dieser Grundlösung Lösungen mit folgenden pH-Werten hergestellt:
1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5.
-
Papier 2316 der Fa. Schleicher und Schüll wird in diesen Lösungen
getränkt und anschließend getrocknet.
-
Die Reagenzpapiere zeigen mit einer 1 mg Bilirubin / 100 ml enthaltenden
Lösung, einer 2 mg Indoxylessigsäure / 100 ml enthaltenden Lösung und einer 4 mg
Indoxylsulfat / 100 ml enthaltenden Lösung die in der Tabelle 1 gegebenen Farbwerte.
-
Diese Konzentrationen an Indoxylsulfat und Indoxylessigsäure sind
im Urin im Verdachtsbereich enthalten.
-
TABELLE 1
| pH-Wert des Reagenzpapieres: |
| 1,3 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 |
| Reaktions- blaurot blau- blau- rot rot rot rot |
| farbe mit rot rot bis |
| Bilirubin rot - |
| Reaktions- rot rot rot rot b gelb gelb rot-gelb |
| farbe mit gelb |
| Indoxyl- |
| essigsäure |
| Reaktions- rot rot rot rot rot gelb gelb |
| farbe mit |
| Indoxyl- b. |
| sulfat gelb |
| pH-Wert des Reagenzpapiers: |
| 4,5 5,0 5,5 |
| Reaktionsfarbe mit rot rot rot |
| Bilirubin |
| Reaktionsfarbe mit rot rot rot |
| Indox lessi säure |
| Reaktionsfarbe mit gelb gelb gelb |
| Indoxylsulfat |
Der optimaie pH-Wert liegt nach Tabelle 1 bei pH 3,5, da mit beiden Störsubstanzen
nur schwach gelbe Färbungen erhalten werden, die die rote Reaktionsfarbe mit Bilirubin
nicht beeinträchtigen.
-
Beispiel 2 Ähnlich störungsfreie und empfindliche cagenzpapiere erhalt
man, wenn man anstelle der Diazoniumverbindung I in der Grundlösung aus Beispiel
1 gleiche Mengen folgender Diazoniumverbindungen einsetzt und den pH-Wert folgendermassen
einstellt: TABELLE 2 Verbindung optimaler pH-Wert 3,5-Dichlorbenzoldiazoniumtetrafluoroborat
(II) 3,0 3,5-Bis-trifluormethylbenzoldiazoniumtetrafluoroborat (III) 3,0 3, 5-Bis-trifluormethyl-4-chlorbenzoidiazoniumtetrafluoroborat
(IV) 4,0 2-Nitro-4-chlorbenzoldiazoniumchlorid-Zinkchlorid-Addulct (Echtrotsalz
3 GL C.I.
-
Nr. 37040) (VIII) 2,5