DE2550992C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft aus Hypophysenhinterlappen von Rindern isolierte Peptide mit einer wertvollen Wirkung auf die glatte Muskulatur des gastrointestinalen Trakts und anderer Gewebe. Insbesondere betrifft die Erfindung bestimmte niedermolekulare Peptide, die aufgrund ihrer stabilisierenden Wirkung auf die Darmtätigkeit bei Säugetieren wertvolle Wirkstoffe zur Behandlung von Ileitis, Colitis, spastischer Obstipation, spastischer Diarrhoea, Diverticulitis, spastischem Ulcus und anderen Konditionen, bei denen Unregelmäßigkeiten der peristaltischen Funktion beteiligt sind, darstellen.

In Science 178 (Seiten 419-421, 1972) ist eine Coherinverbindung beschrieben, die eine Einwirkung auf die Motilität des intestinalen Trakts ausübt. Diese Coherinverbindung wird heute mit Coherin C bezeichnet. Es ist wünschenswert, daß zur besseren Behandlung von Arryhthmien des Darmtraktes die genannte pharmakologische Wirkung noch erhöht wird.

Ein Gegenstand der Erfindung ist ein Peptid (Coherin A) mit einem Gehalt an Asparaginsäure, Serin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Alanin, Leucin und Tyrosin, das in Wasser löslich, in wasserfreiem Ethanol schwach löslich und in Aceton unlöslich ist, sowie Salzen dieses Peptides, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es im UV-Spektrum bei einem pH von 1 Maxima bei 274 nm und bei einem pH von 11 bei 240 und 290 nm zeigt, die entsprechenden Minima bei 248, 233 bzw. 272 nm liegen und einen R _f -Wert von 0,7 in einer Mischung aus n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser mit einem Volumenverhältnis von 60:40:12:48 und von 0,33 in einer Mischung aus n-Butanol/Essigsäure/Wasser mit einem Volumenverhältnis von 4:1:5 aufweist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Peptid (Coherin B) mit einem Gehalt an Asparaginsäure, Serin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Alanin, Leucin, Phenylalanin, Lysin und Arginin, das in Wasser löslich, in wasserfreiem Ethanol schwach löslich und in Aceton unlöslich ist, sowie die Salze desselben, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es im UV-Spektrum bei einem pH von 1 Maxima bei 276 nm und bei einem pH von 11 bei 239 und 290 nm zeigt, die entsprechenden Minima bei 253 sowie 236 und 276 nm liegen und einen R _f -Wert von 0,03 in einer Mischung aus n-Butanol/Essigsäure/Wasser mit einem Volumenverhältnis von 4:1:5 aufweist.

Die erfindungsgemäßen Wirkstoffe eignen sich zur Behandlung der vorgenannten Erkrankungen und von anderen Konditionen, bei denen eine Arrhythmie des Darmtrakts auftritt.

Ein Peptid der Erfindung weist neben seiner kontrollierenden Wirkung auf die Darmtätigkeit auch eine hohe vasokonstriktorische Wirkung auf. Dieses Produkt und seine pharmakologisch verträglichen Salze eignen sich deshalb auch zur Schockbehandlung und zur Behandlung von anderen Konditionen, bei denen eine Kontraktion der Kapillaren und Arterien notwendig oder wünschenswert ist.

Die Verbindungen der Erfindung werden mit Coherin A und B bezeichnet, die beide eine ausgeprägte stabilisierende Wirkung auf die Darmtätigkeit ausüben. Ferner weisen sowohl Coherin A als auch Coherin B eine vasokonstriktorische Wirkung auf, wenngleich auch die Wirkung von Coherin A relativ gering ist.

Das im folgenden geschilderte Verfahren beschreibt die Isolierung der erfindungsgemäßen Verbindungen.

In Stufe 1 werden 50 g Acetontrockenpulver von Hypophysenhinterlappen von Rindern 5 Minuten in einem Eisbad in 2 × 125 ml 0,2 m Ammoniumacetatlösung vom pH-Wert 5,6 homogenisiert. Nach 40minütigem Zentrifugieren bei 18 000 g und 5°C wird der Überstand durch 3 g Diatomenerde-Filterhilfe filtriert. In Stufe 2 wird das Filtrat auf eine mit Diäthylaminoäthylcellulose (DEAE) beschickte Säule der Abmessungen 50 × 610 mm, die vorher mit 0,2 m Ammoniumacetatlösung äquilibriert worden ist, aufgesetzt. Die DEAE-Säule wird mit 0,5 m Ammoniumacetatlösung vom pH-Wert 5,6 eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen abgenommen. Die Fraktionen werden auf ihre Aktivität untersucht, wozu bei Hunden mit Roux-en-Y-Fisteln die Hemmung der Darmkontraktion und die zusammenhängende Kontraktion in den dem Darm benachbarten Abschnitten gemessen wird.

Das Material mit dem Hauptteil der biologischen Aktivität wird von der DEAE-Cellulose in einer Fraktion eluiert, die einem Elutionsvolumen von 1825 bis 3965 ml entspricht (Gesamtvolumen 2140 ml; ΣA₂₈₀/ml = 4608).

Die erhaltene Fraktion mit der biologischen Aktivität wird lyophilisiert, 2 g des erhaltenen Feststoffs werden in 10 ml 0,02 m Ammoniumacetatlösung vom pH-Wert 5,6 gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf eine mit handelsüblichem, vernetztem Dextrangel (Sephadex® G-50 Superfein) beschickte Säule der Abmessungen 50 × 610 mm aufgesetzt.

In Stufe 3 wird die vorgenannte Säule mit 0,02 m Ammoniumacetatlösung vom pH-Wert 5,6 eluiert. Die Fraktion mit biologischer Aktivität entspricht einem Elutionsvolumen von 1460 bis 2580 ml (Ve/Vo = 3,08).

Diese Fraktion wird lyophilisiert. Man erhält 2,1 g Produkt, das in 5 ml 0,02 m Ammoniumacetatlösung gelöst wird. Die Lösung wird in Stufe 4 gemäß dem vorstehenden Elutionsschritt auf eine mit handelsüblichen, vernetztem Dextrangel (Sephadex® G-25 Superfein) beschickte Säule der Abmessungen 50 × 1090 mm aufgesetzt. Die Elution wird gemäß dem vorangehenden Elutionsvorgang durchgeführt. Der aktive Bestandteil befindet sich in den Fraktionen, die einem Elutionsvolumen von 1460 bis 2580 ml entsprechen (Ve/Vo = 2,33).

Auf analoge Weise wird diese Fraktion lyophilisiert. Sodann löst man in 4 ml 0,1 m Essigsäure und setzt die erhaltene Lösung in Stufe 5 auf eine mit handelsüblichem, hoch-vernetztem Dextrangel (Sephadex® G-10) beschickte Säule der Abmessungen 10 × 1050 mm auf, die vorher mit dem gleichen Lösungsmittel äquilibriert worden ist.

Das in Stufe 5 isolierte Coherin scheint als Komplex vorzuliegen, der entweder durch elektrostatische oder van der Waals-Kräfte gebunden ist. Man erhält diesen Komplex durch Elution der vorgenannten, mit Sephadex® G-10 beschickten Säule mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 0,5 ml pro Minute in den einem Elutionsvolumen von 248 bis 363 ml entsprechenden Fraktionen (Ve/Vo = 1,47). Die Reinigung von gebundenem Coherin erreicht man durch Auflösen von 78 mg des in Stufe 5 erhaltenen Produkts in 19 ml 0,2 m Essigsäure. Die Lösung wird 3× mit je 10 ml der oberen, nicht wäßrigen Phase eines Gemisches aus Butanol, Essigsäure und Wasser im Verhältnis von 4:1:5 extrahiert. Die nicht wäßrigen Extrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck zu einem weißen Feststoff eingedampft. Der Feststoff wird in 10 ml 95prozentigem Äthanol gelöst. Nach 48stündigem Stehen bei 5°C bilden sich feine weiße Kristalle.

Der Coherin-Komplex bleibt auch nach wiederholter Chromatographie an Sephadex® G-10 mit 0,1 m Essigsäure gebunden.

Der in Stufe 5 isolierte Coherin-Komplex unterliegt bei wiederholter kontinuierlicher Durchflußelektrophorese bei den pH-Werten 2,8 und 3,5 einer Dissoziation in Coherin A, B und C. Dazu wird ein Elektrophorese-Gerät mit kontinuierlichem Durchfluß verwendet. Der in Stufe 5 erhaltene Coherin-Komplex (ΣA₂₈₀ = 175) wird in 0,2 m Essigsäure vom pH-Wert 2,75 in einer solchen Konzentration gelöst, daß sich eine Extinktion von A₂₈₀ = 4,0 ergibt. Diese Lösung wird an einem +75 mm von der vertikalen Mittellinie entfernten Stelle in einer Geschwindigkeit von 0,42 ml pro Stunde aufgesetzt (18 V/cm; 0,83 mA/cm). Als Elektrolyt wird 0,2 m Essigsäure verwendet. Die Elutionsgeschwindigkeit beträgt 1,3 ml pro Röhrchen pro Stunde.

Coherin A befindet sich in den Fraktionen 13 bis 19, die den Abtropfspitzen in 95 mm Entfernung in Kathodenrichtung zur Aufsetzstelle entsprechen. Der nach dem Vereinigen und Lyophilisieren dieser Fraktionen erhaltene Feststoff wird 3× mit je 3 ml Isopropanol extrahiert und zentrifugiert.

Unter diesen Bedingungen (pH-Wert 2,8) wird Coherin B in den Fraktionen 5 bis 9, 150 mm in Kathodenrichtung von der Aufsetzstelle entfernt, und Coherin C in den Fraktionen 17 bis 19, 16 mm in Kathodenrichtung von der Aufsetzstelle entfernt, eluiert.

Die Coherin A, B bzw. C enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, lyophilisiert und so lange kontinuierlichen Durchflußelektrophorese bei den pH-Werten 2,8 und 3,5 unterworfen, bis sich die Produkte als elektrophoretisch homogen erweisen. Als Elektrolyt für den pH-Wert 3,5 wird 0,2 m Ammoniumacetatlösung, die 0,02 m an Essigsäure ist, verwendet. Bei wiederholter Elektrophorese beim pH-Wert 3,5 findet sich Coherin A in den Fraktionen 19 bis 21, Coherin B in den Fraktionen 15 bis 19 und Coherin C in den Fraktionen 23 bis 25. Da die Fraktionsnummern beim Beckmann-Spinco-Modell CP sich nicht verändern, geben sie die relative Position zur Anode und Kathode wieder. Die Fraktionsnummern von der Kathode zur Anode gehen von 1 bis 32.

Nach wiederholter Durchführung der kontinuierlichen Durchflußelektrophorese bei den pH-Werten 2,8 und 3,5 unter nachfolgender Extraktion mit Äthanol zur Entfernung von Spuren an anderen Peptiden und freien Aminosäuren, werden Coherin A, B und C isoliert.

Coherin A ist ein Peptid und enthält zumindest Glycin als Aminosäure. Coherin B ist ebenfalls ein Peptid, das aber im Vergleich zu Coherin A ein etwas höheres Molekulargewicht aufweist. Auch Coherin B enthält Glycin und als zusätzliche Aminosäuren mindestens Glutaminsäure und Serin. Beide Peptide sind löslich in Wasser, schwach löslich in wasserfreiem Äthanol und unlöslich in Aceton und Diäthyläther. Die physikalischen und chemischen Eigenschaften von Coherin A und B sind in Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I

Eigenschaften von Coherin A und B

Anmerkungen:

• (a) UV-Messungen wurden an einem Cary-Spektrophotometer, Modell 11 durchgeführt. Als Lösungsmittel für den pH-Wert 1 wurde 0,1 n HCl und für den pH-Wert 11 0,1 n NaOH verwendet.
• (b) Die elektrophoretischen Untersuchungen wurden an einem Research Specialities Co.-Gerät unter Verwendung von Whatman 3 MM-Papier und folgenden Elektrolytpuffern durchgeführt:
  pH-Wert 2: Ameisensäure, Essigsäure (14,2 V/cm, 0,85 mA/cm)
  pH-Wert 3,5: Pyridin, Essigsäure (14,6 V/cm, 0,85 mA/cm)
  pH-Wert 8,5: 0,05 m Barbitalpuffer (8,13 V/cm, 1,25 mA/cm) Δ Ms ist der Unterschied in mm in der Wanderung zwischen Bromphenolblau und der Probe, während M _BPB die Wanderung von Bromphenolblau ist.
• (c) Unter Verwendung des in (b) verwendeten Elektrophoresegeräts wurde der isoelektrische Punkt als der pH-Wert bestimmt, bei dem das Produkt nicht von der Aufsetzstelle wandert.
• (d) Die R _f -Werte wurden dünnschichtchromatographisch an mit Kieselgel (Merck, Silicagel G) beschichteten Glasplatten bestimmt. Als Laufmittel dienten:
  • (1) n-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser im Verhältnis von 60:40:12:48
  • (2) n-Butanol, Essigsäure und Wasser im Verhältnis von 4:1:5.
• (e) Die Schmelzpunkte sind unkorrigiert und wurden an einem Kofler-Mikroschmelzpunktgerät in der heißen Stufe bestimmt.
• (f) Das Molekulargewicht wurde dünnschichtchromatographisch an Dextran (Sephadex® G-50) überschlägig bestimmt.
• (g) Während sämtlicher der vorgenannten Stufen wurden die Hauptfraktionen routinemäßig auf ihre biologische Aktivität untersucht. Dazu wurden Hunde auf chirurgischem Wege mit Roux-en-Y-Fisteln versehen, die eine Überwachung von Darmkontraktionen durch Drucküberträger im Lumen eines Ileumsegments erlauben. Die Coherin-Aktivität wurde sowohl auf mechanischem als auch auf elektrischem Wege bestimmt. Als Zeichen für eine Aktivität der Fraktionen ergab sich eine deutliche Hemmung der Darmkontraktion innerhalb von 30 Sekunden nach einer intravenösen Injektion von Coherin. Die zu untersuchenden Fraktionen wurden routinemäßig in 1-normaler Kochsalzlösung gelöst.

Die Verbindungen der Erfindung haben amphoteren Charakter und können deshalb Salze mit Basen, insbesondere Metallsalze, und Salze mit Säuren bilden. Wie bereits erwähnt, sind auch diese Salze wertvolle Arzneistoffe. Typische Salze leiten sich von den Alkali- und Erdalkalimetallen ab. Beispiele dafür sind Calcium-, Natrium- und Kaliumsalze sowie Ammonium- und Aminsalze, wie Salze mit Cyclohexylamin und Piperidin. Salze mit organischen und anorganischen Säuren leiten sich beispielsweise von Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Milchsäure, Citronensäure, Weinsäure, Oxalsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure und Gluconsäure ab. Die Verbindungen können nach herkömmlichen Verfahren in ihre Salze überführt werden, beispielsweise durch Titration von wäßrigen Lösungen der Verbindungen mit einer Säure oder einer Base und anschließendem Entfernen des Wassers durch Gefriertrocknen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Verbindungen in Wasser aufzunehmen, die entsprechende Säure oder Base zuzugeben und durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren Nichtlösungsmittels, wie Aceton, das Salz auszufällen.

Die Verbindungen der Erfindung können direkt ohne Zusätze verabfolgt werden. Im allgemeinen werden sie aber zusammen mit pharmakologisch verträglichen, nicht toxischen Trägern verabfolgt. Die Menge des Trägers bestimmt sich nach den Eigenschaften und der chemischen Natur des jeweiligen Trägers, der gewählten Verabfolgungsweise und üblichen pharmazeutischen Kriterien. Beispielsweise können die Arzneimittel der Erfindung auf oralem Wege in Form von Tabletten oder Kapseln, die als Träger beispielsweise Stärke, Milchzucker oder bestimmte Tone enthalten, verwendet werden. In der Regel werden sie mit einem sich im Darm auflösenden Überzug versehen, so daß sie gegenüber der Säure und den Verdauungsenzymen des Magens beständiger sind. Da jedoch die Wirkstoffe der Erfindung ein relativ niederes Molekulargewicht aufweisen, können sie vor der Hydrolyse durch proteolytische Enzyme des Magens resorbiert werden. Zur intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Verabfolgung können die Wirkstoffe zu sterilen Lösungen zusammen mit anderen gelösten Stoffen, beispielsweise eine entsprechende Menge Kochsalz oder Glucose, um die Lösung isotonisch zu machen, konfektioniert werden.

Die Dosierung ist vom Arzt bzw. Tierarzt von Fall zu Fall zu bestimmen. Sie hängt u. a. vom Alter und Körpergewicht des Patienten, der Kondition des Patienten und der gewählten Verabreichungsart ab. Aufgrund des hohen Wirkungsgrads der Verbindungen der Erfindung sind geringe Dosen von 0,5 bis 10 µg geeignet. Eine Dosis von 1 bis µg/kg Körpergewicht führt zu zufriedenstellenden Erfolgen.

Claims (4)

1. Peptid (Coherin A) mit einem Gehalt an Asparaginsäure, Serin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Alanin, Leucin und Tyrosin, das in Wasser löslich, in wasserfreiem Ethanol schwach löslich und in Aceton unlöslich ist, sowie Salze dieses Peptides, dadurch gekennzeichnet, daß es im UV-Spektrum bei einem pH von 1 Maxima bei 274 nm und bei einem pH von 11 bei 240 und 290 nm zeigt, die entsprechenden Minima bei 248, 233 bzw. 272 nm liegen, und einen R _f -Wert von 0,7 in einer Mischung aus n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser mit einem Volumenverhältnis von 60:40:12:48 und von 0,33 in einer Mischung aus n-Butanol/Essigsäure/Wasser mit einem Volumenverhältnis von 4:1:5 aufweist.

2. Peptid (Coherin B) mit einem Gehalt an Asparaginsäure, Serin, Glutaminsäure, Pyrolin, Glycin, Alanin, Leucin Phenylalanin, Lysin und Arginin, das in Wasser löslich, in wasserfreiem Ethanol schwach löslich und in Aceton unlöslich ist, sowie die Salze desselben, dadurch gekennzeichnet, daß es im UV-Spektrum bei einem pH von 1 Maxima bei 276 nm und bei einem pH von 11 bei 239 und 290 nm zeigt, die entsprechenden Minima bei 253 sowie 236 und 276 nm liegen, und einen R _f -Wert von 0,03 in einer Mischung aus n-Butanol/Essigsäure/Wasser mit einem Volumenverhältnis von 4:1:5 aufweist.

3. Arzneimittel, enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 1.

4. Arzneimittel, enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 2.