DE2521814A1

DE2521814A1 - Verfahren zum hydrolysieren von proteinen

Info

Publication number: DE2521814A1
Application number: DE19752521814
Authority: DE
Inventors: Fulvio Perini
Original assignee: Syntex USA LLC
Current assignee: Syntex USA LLC
Priority date: 1974-05-24
Filing date: 1975-05-16
Publication date: 1975-12-11
Also published as: NO751038L; RO72881A; FR2272173A1; US3928630A; SE7505716L; BE829400A; NL7506035A; JPS50157540A; FI751298A; RO72881B; DK228975A; FR2272173B1; AU7912275A; DD117980A5

Description

PATENTANWÄLTE Z O 2 I 8 1

DipWng. P. WIRTH ■ Dr. V. SCHMIED-KOWARZiK CHpl.-!ng. G. DANNENBERG · Dr. P. WEINHOLD · Dr. D. GUDEL

_^, 281134 6 FRANKFURT AM MAIN

TELEFON C0611)

2870M GR. ESCHENHEIMER STRASSE 39

SK/ΞΚ

CasB PA 666

Syntax (U.S.A.) Inc.

3401 Hillvieuj Avenue

Palo Alto, Ca. 94304 / USA

l/erfahren zum Hydrolysieren von Proteinen

Die vorliegende Erfin'dung bezieht sich auf Verfahren zum Hydrolysieren von Proteinen in Proteinhydrolysate. Sie bezieht sich u/eiterhin auf verbesserte enzymatisch^ Uerfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysaten mit verbesserter Einnehmbarkeit. Außerdem bezieht sie sich auf ein enzymatisches Uerfahren zur Herstellung von Proteinhydrolysaten, das die Reinigung des Produktes erleichtert. Außerdem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf alkali-aktive Enzymverfahren zum Hydrolysieren von Protein, bei welchen mährend der Hydrolyse basische Bedingungen durch kontrollierte Zugabe von Calciumhydroxid aufrechterhalten werden und nach beendeter Hydrolyse die Reaktionsmischung durch Zugabe von Phosphorsäure zur Bildung eines Calciumphosphatniederschlages neutralisiert wird.

509850/0690

Bisher sind viele Verfahren zur Umwandlung ästhetisch unerwünschter Proteine, wie Fischproteinkonzentrat, tierische Abfälle aus dem Schlachthaus, Tierblut, in nahrhafte Produkte vorgeschlagen morden, vgl. z.B. die Verfahren der US-PSen 2 098 923, 2 180 637, 2 958 630, 3 697 285 und 3 761 353. Eines der erfolgreichsten bekannten Verfahren ist die enzymatische Hydrolyse, bei welcher eine Proteinquelle mit einem proteolytischen Enzymkomplex (z.B. Pancreatin) zur Bildung eines als Nahrungsmittel verwendbaren Proteinhydrolysates, vorherrschend eine Mischung aus Aminosäuren und Peptiden behandelt wird. Es wurde nun ein Verfahren zur Verbesserung des proteolytischen Enzymverfahrens gefunden, durch welches die Produktgewinnungs- und Reinigungszeit und -kosten verringert und gleichzeitig ein besser sinnehmbares Produkt erhalten

als Nebenprodukt wird, wobei man weiterhin/einen Abfallsrückstand erhält, der zurückführbar oder wirtschaftlich verwendbar ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß cnan ein Proteinsubstrat mit einem proteolytischen Alkalienzymkomplex, wie Pancreatin, behandelt und während der Hydrolyse durch Zugabe von Calciumhydroxid alkalische Bedingungen aufrechterhält und nach beendeter Hydrolyse die Reaktionsmischung durch Zugabe von Phosphorsäure auf einen pH-Wert von etwa 7 einstellt, um eine Mischung aus mono- und di-basischem Calciumphosphat auszufällen. Dann läßt sich die Reaktionsmischung leicht filtrieren, wobei der Calciumphosphatniedacschlag als geschmacksvermindernde und entfärbende Filterhilfe dient, wodurch ein Filtrat von verbesserter Reinheit erhalten wird.

509850/0690

- 3 - 25218U

Erfindungsgemäß wird ein unlösliches, nicht-funktionelles, in einem flüssigen Medium, wie Wasser, suspendiertes Proteinsubstrat mit

einem alkali— aktiven proteolytischen Enzym unter Bildung

eines löslichen Proteinhydrolysates, das vorherrschend lösliche Peptide und geringere Mengen an löslichen Aminosäuren enthält, behandelt, ujobei sin Rückstand an unlöslichen Proteinen oder Peptiden, Kohlehydraten und Mineralverunreinigungen erhalten ujird. Diese Behandlung erfolgt gewöhnlich bei Temperaturen zwischen etoia 35-6ü°C, vorzugsweise etwa 40-5D⁰C, für etwa 12-24 Stunden. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wird während der Behandlung durch Zugabe von Calciumhydroxid auf etwa 7,2-8,0, vorzugsweise etwa 7,5, eingestellt, weil die Aktivität des Enzyms von diesem pH-Bereich abhängt. Während bei bekannten Verfahren der pH-Wert durch geregelte Zugabe irgendeiner geeigneten Base, gewöhnlich Ammoniumhydroxid oder Natriumhydroxid, aufrechterhalten wurde, ist es erfindungsgemäß notwendig, Calciumhydroxid als Base zu verwenden. Da das anfängliche Substrat gewöhnlich weiterhin leicht sauer oder neutral ist, ist es zweckmäßig, den pH-Wert der anfänglichen Substratmischung im flüssigen Medium durch Zugabe von Calciumhydroxid zwischen etwa 7,5-9,5 zu halten. Obgleich das Enzym am wirksamsten bei einem pH-Wert unter 8, z.B. etwa 7,5, wirkt, wird eine überschüssige Alkalinität schnell durch die durch die Hydrolyse gebildete Säure verbraucht, und tatsächlich ergibt eine überschüssige Alkalinität eine kurze "Schonfrist" bei der Regelung des pH-Wertes innerhalb der vorgeschriebenen Bereiches während der Hydrolyse. Es ist auch zweckmäßig, die Behandlung unter Verwendung eines biostatischen Mittels, wie Chloroform und/oder

509850/0690

Toluol, durchzuführen. Jedes proteolytische Enzym, das die Hydrolyse von Proteinen in Peptide und/oder Aminosäuren unter alkalischen Bedingungen bewirkt, kann verwendet werden» Geu/öhnlich wird eine Mischung von Enzymen, die aus der Pancreas von Rindern oder Schweinen erhalten wird (und gewöhnlich als Pancreatin bezeichnet

werden

wird), verwendet, da damit gute Ergebnisse erzielt/und diese relativ leicht verfügbar und relativ billig ist. Es können auch isolierte proteolytische Enzyme, wie Trypsin, Chymotrypsin, Carboxypeptidasen A und B, Collagenase und verträgliche Mischungen derselben usw., verwendet werden. Geeignete verwendbare Proteinquellen umfassen unlösliches, nicht-funktionelles Fischproteinkonzentrat, Fischmehle, tierische Schlachthausabfälle und Tierblut. Die Verfahren sind besonders geeignet für Fischproteinkonzentratsubstrate und Tierblutsubstrate. Die verwendete Enzymmenge variiert mit den Reaktionsbedingungen und dem besonderen verwendeten Proteinsubstrat, liegt gewöhnlich jedoch zwischen etwa 0,5-3 g pro 100 g Proteinsubstrat.

Nach Beendigung der gewünschten Hydrolyse wird der-pH-Wert der Reaktion durch Zugabe von Phosphorsäure auf etwa 7 gesenkt. Dies führt zur Bildung eines Niederschlages aus Calciumphosphat, gewöhnlich einer Mischung aus monobasischem Calciumphosphat (CaHPO₄) und dibasischem Calciumphosphat (CaH-PO^)«. Dann wird die Reaktionsmischung unter Verwendung des ausgefallenen Calciumphosphates als einzige Filterhilfe filtriert, wodurch die Notwendigkeit einer zusätzlichen Filterhilfe vermieden wird. Erfindungsgemäß wurde weiter festgestellt, daß im Vergleich zu bekannten Verfahren, z.B. unter Verwendung von Ammonium- oder Natrium-

509850/0690

hydroxid als pH regelnde Base und einer zusätzlichen Filterhilfe, u/ie Diatomeenerde, das erfindungsgemäße Verfahren ein reineres Filtrat liefert und zum Filtrieren weniger Zeit erfordert. Da dar Calciumphosphatniederschlag weiterhin ein vorn Nährwert her annehmbares Material ist, kann der Filterkuchen direkt als Tierfutterzusatz verwendet oder zurückgeführt werden, während die mit zusätzlichen Filterhilfen erhaltenen Filterkuchen zusätzlichen Behandlungen zur Entfernung der Filterhilfe unterworfen werden müssen, um für den Verbrauch durch das Tier annehmbar zu sein. Obgleich der Grund, weshalb das erfindungsgemäße Verfahren ein reineres Produkt als die bekannten Verfahren unter Verwendung

(zusätzlichen)
βϊπβγ äußerlichen/Filterhilfe liefert, nicht ganz verstanden wird, wird vermutet, daß unerwünschte Aromamittel und gewisse Färbemittel im Niederschlag während seiner Bildung eingeschlossen u/erden und/oder daß der Calciumphosphatniederschlag Molekularsiebeigenschaften hat, die geschmacksbildende und gewisse färbende Mittel absorbieren können. Das erfindungsgemäße Verfahren erleichtert auch die Entfernung unerwünschter metallischer Verunreinigungen, wie Quecksilber im Fall von Fischproteinen und Eisen im Fall von Tierproteinen sowie Fluoriden. Die Eisenverunreinigungen und Fluoridionen werden als Eisenphosphat bzw. Calciumfluorid ausgefällt und mit dem Calciumphosphatniederschlag entfernt. Auch die Quecksilberverunreinigungen werden in unerwarteter Weise mit dem Calciumphosphatniederschlag als unlösliche Salze

(Zinschluß)

oder durch Absorption oder Mitführung/im Calciumphosphatniederschlag entfernt. Viο unannehmbare Mengen toxischer Komponenten mit dBm CalciumphosphatniedBrschlag zurückgewonnen werden, kann

509850/0690

der erhaltene Filterkuchen selbstverständlich nicht direkt als Tierfutterzusatz verwendet werden.

Gegebenenfalls können die erhaltenen, an Proteinhydrolysat, u/ie Peptid und Aminosäuren, reichen Produktfiltrate mit fein zerteilter aktivierter Tierkohle gemischt und zur Entfernung verbleibender Farbverunreinigungen dann filtriert werden. Anschließend kann das Proteinhydrolysat als praktisch weißes Pulver nach üblichen Verfahren, z.B. Verdampfen, Gefriertrocknen, Sprühtrocknen usw., aus dem Filtrat gewonnen werden. Das erhaltene Produkt ist leicht in Wasser löslich und bildet eine praktisch geschmack- und farblose Lösung im Vergleich zu den bekannten Produkten, die gewöhnlich einen unerwünschten Geschmack und/oder Farbe, die für das besondere verwendete Proteinsubstrat, z.B. Fischgeschmack oder Blutgeschmack und/oder -farbe charakteristisch war, aufweisen. Daher kann das erfindungsgemäß hergestellte Produkt leicht als Proteinzusatz in einer schmackhaften Lösung zur oralen Verwendung oder als Proteinzusatz in Getränken, wie Fruchtsäfte, alkoholfreie Brausegetränke, Bier usw., sowie in typischen Nahrungsmitteln, wie Suppen, Frühstücksprodukte usw., verwendet werden. Weiterhin kann das Produkt auch als Tierfutterzusatz verwendet und zweckmäßig in Lösungsform auf das gewünschte Tierfutter, z.B. Schweinefutter, Futter für Wiederkäuer^ Pferde, Geflügel usw., gesprüht werden.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken.

509350/0690

- 7 - ■ 25218H

Beispiel 1

1,5 g Pancreatin 4 χ N.F. (National Formulary - Standardnomenklatur) wurde zu einer wässrigen Suspension aus 50 g Fischproteinkonzentrct in 500 ecm Wasser zugefügt. Der pH-Wert der erhaltenen Mischung wurde durch Zugabe einer wässrigen Calciumhydroxidsuspansion (etwa β g Calciumhydroxid sind erforderlich) auf 8,0 eingestellt. Die Mischung wurds 22 Stunden bei 40⁰C. gerührt. Während dieser Zeit wurde der pH-Wert des wässrigen Mediums ständig überwacht, und je nach Erfordernis wurde Calciumhydroxid zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes bei 8 zugefügt. Dann wurde der pH-Wert der Mischung durch Zugabe von etwa 0,5 ecm konz. Phosphorsäure auf 7 eingestellt, was zur Bildung eines gelartigen Niederschlagen aus Calciumphosphat führte. Anschließend wurde die Mischung durch einen Filterpapiertrichter filtriert. Dann wurden dem Filtrat 10 g aktiviertes Tierkohlepulver ("Oarco KB") zugefügt. Nach Filtrieren und Gefriertrocknen erhielt man ein weißes kristallines Pulver mit einem ganz leicht gelben Ton. Anschließend wurde eine 2,5 gew.-^ige wässrige Lösung aus Proteinhydrolysat hergestellt; sie war klar, praktisch farblos und hatte wenig oder keinen feststellbaren Geschmack.

Dann wurde das l/erfahren mit Ammoniumhydroxid anstelle von Calciumhydroxid zur Einstellung des pH-Wertes wiederholt. In diesem· Fall wurde in der ersten Filtrationsstufe eine Filterhilfe, d.h. Diatomeenerde, verwendet. Das endgültige Proteinhydrolysatprodukt war ein praktisch weißes kristallines Pulver, eine 2,5 gew.-^ige wässrige Lösung desselben war klar, jedoch leicht gelb und hatte einen etwas bitteren Geschmack.

509850/0690

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt das erfindungsgemäße Verfahren im großtechnischen Betrieb sowie die Verbesserung in der Filtrationsgeschwindigkeit im Vergleich zu einem bekannten Verfahren unter Verwendung eines zusätzlichen üblichen Filterhilfe.

In diesem Beispiel u/urden 210 kg Fischproteinkonzentrat in 2090 kg de-ionisiertes Wasser bei einer Temperatur von etwa 45 C. eingemischt. Der pH-Wert der Mischung wurde durch geregelte Zugabe von Calciumhydroxid auf etwa 8,5 + 0,2 eingestellt, ujozu etiua 2,27 kg erforderlich waren. Dann wurden zur Mischung als biostatische Mittel je 2 1/4 1 Toluol und Chloroform zugefügt und die erhaltene Mischung auf etwa 43⁰C. erhitzt, u/orauf 6,3 kg Pancreatin 4 χ I\1.F. (National Formulary XII- Monograph 287) zugefügt wurden. Nach Aufnahme des Fischproteins nahm der pH-Wert der Reaktionsmischung ab und wurde durch Zugabe von Calciumhydroxid in halbstündigen Abständen etwa 4-5 Stunden auf etwa 7,7 + 0,3 gehalten. Dazu waren etwa 6,8-9 kg Calciumhydroxid notwendig. Die Digerierung wurde weitere 14-15 Stunden fortdauern gelassen, wonach der pH-Wert auf etwa 7,4 + 0,2 gefallen war. Dann wurde er durch Zugabe von 85 gew.-/öigen wässriger Phosphorsäure auf 7,0 +0,1 eingestellt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend 30 Minuten zum Deaktivieren des Pancreatinenzymkomplexes auf 62 C. erhitzt und dann durch eine Filterpresse gepumpt, und zwar mit einer Geschwindigkeit von 95-152 l/min unter Verwendung nur des nach Zugabe der Phosphorsäure gebildeten basischen CaI-ciumphosphatniederschlages als Filterhilfe. Das Filtrat wurde gewonnen und mit 27,2 kg pulverisierter aktivierter Tierkohle Minuten lang gemischt und dann zur Entfernung der Tierkohle

509850/0690

filtriert. Der Tierkohlefilterkuchen wurde mit 380 1 heißem Wasser (etiua 65°C.) gewaschen und mit dem Filtrat kombiniert. Kombiniertes Filtrat und Waschmaterial wurden erhitzt und durch V/erdampfen auf einen Feststoffgehalt von etwa 10 % kondensiert. Das Konzentrat wurde auf 5⁰C. abgekühlt und lieferte nach Sprühtrocknung etwa 118 kg Proteinhydrolysat als praktisch weißes Pulver. Dann wurde eine Probe des Produktes in Wasser gelöst und bildete eine praktisch farblose klare Lösung ohne irgendeinen merklichen Geschmack.

Dann wurde das obige !/erfahren unter Verwendung von Ammoniumhydroxid anstelle von Calciumhydroxid und etwa 118 kg Diatomeenerde als Filterhilfe während des anfänglichen Filtrationsverfahrens wiederholt. In diesem Fall betrug die maximale erzielbare Filtrationsgeschwindigkeit etwa -J9 l/min; eine Probe aus dem erhaltenen Produkt bildete eine wässrige Lösung mit einem deutlichen gelben Ton und einem brackigen, merkwürdigen Geschmack.

509850/0690

Claims

Patentansprüche

- Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse unlöslicher, nicht-funktioneller, aus einer Fisch- oder Tierquelle hergeleiteter Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine flüssige Suspension des Protein bildet;

b) den pH-Wert dieser Suspension durch Zugabe von Calciumhydroxid auf etiua 7,5-9,5 einstellt,;

c) das Protein mit einem alkalischen aktiven proteolytischen Enzym in Berührung bringt und die Temperatur der Suspension zwischen etwa 35-6O⁰C. und den pH-Wert zwischen etwa 7,2-8 für 12-24 Stunden durch Zugabe von Calciumhydroxid aufrechterhält, u/odurch das Protein hydrolysiert und ein fein zerteilter Wiederschlag aus Calciumphosphat gebildet wird; und

d) die Produktmischung aus Stufe c) unter Verwendung das Calciumphosphatniederschlages als Filterhilfe filtriert, wodurch man ein an Proteinhydrolysat reiches Filtrat und einen Filterkuchen aus unlöslichen Proteinen, Kohlehydraten und diesem Niederschlag erhält.

2.- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Calciumphosphatniederschlag als einzige Fi'lterhilfe in der Filtrationsstufe d) verwendet wird.

3,- Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die flüssige Suspension aus Stufe a) eine wässrige Suspension ist.

509850/0690

bis 3
4,- Verfahren nach Anspruch 1/, dadurch gekennzeichnet, daß das

Filtratprodukt aus Stufe d) mit Tierkohlepulver zur Entfernung von Farbverunreinigungen in Berührung gebracht uiird.

5«- Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Protein ein Fischproteinkonzentrat oder eine Blutproteinmischung verwendet tuird.

6.- Verfahran nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym Pancreatin, Trypsin, Chymotrypsin, Carboxypeptidase A, Carboxypeptidase B oder Collagenase verwendet mird.

Der Patentanwalt:

509850/0690