DE2515513A1 - Verfahren und anordnung zur messung von substanzmengen in lichtdurchlaessigen proben - Google Patents

Description

FIRMA CARL ZEISS, 7920 HEIDEtTHEIM (BRENZ)

Verfahren und Anordnung
Messung von Substanzmengen in lichtdurchlässigen Proben

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Anordnung zum Messen von Substanzmengen in lichtdurchlässigen Proben, die nach einem Rasterverfahren abgetastet werden.

Bei den bekannten Verfahren zur quantitativen Bildanalyse wird beispielsweise ein mikroskopisch erzeugtes Bild mittels eines punktförmigen Strahles rasterförmig abgetastet, wobei ein Lichtoder Elektronenstrahl verwendet werden kann. Meist wird der Abtaststrahl einea Eernseh-Aufnahme-Systems verwendet, da hier die Signalgtvrinnung außerordentlich schnell vor sich geht. Die so gewonnenen Abtastsignale, das sogenannte Bildsignal, werden dann einem Diskriminator zugeführt, der die auszuwertenden Objekte nach einstellbaren Kriterien auswählt. Der Diskriminator liefert binäre Signale, deren Lange dem Weg des AbtastStrahles innerhalb der ausgewählten Objekte entspricht. Diese Signale werden schließlich einer Auswerteeinheit zugeführt, welche daraus die gesuchten Größen, beispielsweise die Anzahl der Objekte, ihre Fläche oder ihre Ausdehnung in einer vorgegebenen Richtung bestimmt.

Bei verschiedenen Anwendungen der quantitativen Bildanalyse, beispielsweise bei der Auswertung von biologischen Proben hat sich die Aufgabe ergeben, auch die Substanzmengen der untersuchten Proben zu messen. Dies ist möglich durch Messen der Lichtdurchlässigkeit bzw. der Lichtabsorption der Proben, da nach dem

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Lambert-Beer'sehen Gesetz bei Verwendung von monochromatischem Licht die Substanzmenge proportional dem Logarithmus der Lichtabsorption ist.

Die Anwendung dieser Gesetzmäßigkeit führt jedoch bei den in üblicher Weise vorliegenden Proben mit ungleichmäßiger Verteilung der Substanz zu großen Schwierigkeiten. Wegen des logarithmischen Zusammenhangs zwischen Lichtsignal und.Substanzmenge ist bei solchen Proben eine Logarithmierung des Meßsignals für jeden Bildpurikt einzeln erforderlich und es darf zur Substanzmengenbestimmung erst nach dieser Logarithmierung integriert werden. Diese Notwendigkeit führt gerätemaßig zu einem sehr großen Aufwand, da der Logarithmierer bei Fernsehabtastung nach der in Deutschland verwendeten Norm mit 5 MHz arbeiten müßte.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren und eine Anordnung zum Messen von Substanzmengen in lichtdurchlässigen Proben, die nach einem Rasterverfahren abgetastet werden, zu schaffen, die eine verlässliche Messung mit geringem gerätetechnischen Aufwand ermöglichen.

Das Verfahren nach der Erfindung zeichnet sich dadurch aus, daß in aufeinanderfolgenden Schritten die auszuwertende Probe vollständig aus einzelnen Flächenbereichen zusammengesetzt wird,. wobei innerhalb jedes Flächenbereichs die Lichtabsorption zwischen vorgewählten Grenzen liegt und daß die Fläche jedes Bereichs gemessen, mit einem zugeordneten Eichwert multipliziert und die den Flächenbereichen entsprechenden Produkte aufsummiert werden.

Bei dem neuen Verfahren wird also zunächst die Fläche einzelner Probenbereiche gemessen, die durch Linien gleicher Dichte, sogenannte Äquidensiten gegeneinander abgegrenzt sind. Jedem Flächenbereich ist eine vorbestimmte Dichte, die.sich in einer bestimmten Lichtabsorption äußert zugewiesen. Erst nach erfolgter

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Flächenmessung werden die gewonnenen Werte logarithmiert. Die Logarithmierung des Signals von jedem Bildpunkt ist hier also durch die Logarithmierung von Bereichsignalen ersetzt. Solche Bereichsignale werden niederfrequent, "beispielsweise "bei der Fernsehabtastung mit der Bildwechselfrequenz erzeugt, so daß ein einfacher Logarithmierer Verwendung finden kann, während die übrige Schaltung aus den bei der quantitativen Bildanalyse üblicherweise verwendeten Schaltelementen aufgebaut werden kann.

Wählt man die Unterschiede zwischen der Lichtabsorption aufeinanderfolgender Flächenbereiche dem jeweiligen Meßproblem angepaßt, so wird die gesuchte Substanzmenge mit hoher Genauigkeit gemessen, obwohl die Meßanordnung relativ einfach aufgebaut ist.

Wenn die Proben so beschaffen sind, daß das Lambert-Beer'sehe Gesetz gilt, so wird für jeden Flächenbereich der Logarithmus der zugeordneten mittleren Lichtabsorption als Eichwert verwendet .

Das neue Verfahren ist jedoch nicht auf solche Proben beschränkt, da es auch die Verwendung anderer als logarithmischer Bewertungsfunktionen ermöglicht. Eine solche Bewertungs- oder Eichfunktion kann von Anwendungsfall zu Anwendungsfall neu festgelegt und eingegeben werden, ohne daß eine Änderung der elektronischen Schaltung erforderlich ist.

Bei dem neuen Verfahren wird die Probe rasterförmig abgetastet und das resultierende Bildsignal wird einer schrittweise um gleiche Beträge in Richtung auf höhere Grauwerte zunehmenden Diskriminierung unterworfen, wobei zu jedem Schritt die dem durchgelassenen Signal entsprechende Fläche gemessen und von der beim vorhergehenden Schritt gemessenen Fläche abgezogen wird.

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Es wird also ab einem vorgewählten Grauwert die Fläche aller Bereiche gemessen, die mindestens diesen Grauwert aufweisen. In den darauffolgenden Schritten wird durch Erhöhen des Grauwertes die gemessene Fläche immer kleiner, wobei durch Differenzbildung Flächenbereiche entstehen, denen jeweils ein gewisser vorgewählter Grauwe:ctbereich zugeordnet ist. Die so gemessenen Teilflächen werden dann mit einem Eichwert, beispielsweise mit dem Logarithmus der zugeordneten mittleren Lichtabsorptxon multipliziert, die gewonnenen Tei!produkte werden summiert und das Summensignal wird als Meßsignal ausgegeben.

Die Diskriminierung des Bidlsignals erfolgt mit Hilfe eines Diskriminators, dessen Schwellwert nach einem vorgegebenen Programm schrittweise um vorgewählte Beträge verstellt wird. Das so diskriminierte Signal wird einem Integrator zugeführt. Dessen .Ausgangssignal gelangt zu einer Auswerteeinheit, die alle notwendigen weiteren Differenz-, Produkt- und Summenbildung en durchführt und die im übrigen auch die Schwellwertverstellung des Diskriminators steuert.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Figuren 1-6 der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Im einzelnen zeigen:

Fig. 1 ein Ausführungsbeispiel einer Anordnung nach der Erfindung, bei dem das gesamte Bildfeld ausgewertet wird;

Fig. 2 ein mit Hilfe dieser Anordnung ausgewertetes Bildfeld;

Fig. 3 ein auszuwertendes Partikel im Abtastfeld;

Fig. 4· das bei der Abtastung des Partikels nach Fig. 3 entstehende Bildsignal;

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]?ig. 5 ©in anderes Ausführungs"beispiel einer Anordnung nach der Erfindung, "bei dem einzelne Partikel eines Bildfeldes zur Auswertung angewählt werden können;

H¹Ig. 6 ein mit Hilfe dieser Anordnung avsgawertetes Bildfeld.

In I^?ig. 1 ist mit 1 eine Fernsehkamera bezeichnet, die dazu dient5 eine lichtdurchlässige Probe, beispielsweise das mikroskopisch erzeugte Bild einer biologischen Probe abzutasten. Das von dieser Kamera erzeugte Bildsignal wird einem Verstärker 2 zugeführt und gelangt von dort zu einem Diskriminator 3· Dieser erzeugt an seinem Ausgang ein logisches H-Signal, wenn das Video-Signal einen über die Leitung 4 vorgegebenen Schwellwert unterschreitet und ein logisches L-Signal wenn das Video-Signal oberhalb dieser Schwelle liegt. Die Länge des vom Diskriminator erzeugten H-Signals entspricht dem Weg des Ab bastsbrahles der Kamera 1 innerhalb der ausgewählten Bildobjekte. Das diskriminierte Signal xvird einem Monitor 5 zugeführt, auf dessen Bildschirm also die ausgewählten Objekte mit gleichmäßigem Grauton erscheinen. Vom Diskriminator 3 gelangt das Signal z\igleich zu einem Integrator 6, der alle Η-Signale für jede Bildabtastung aufsummiert. Das der Gesamtfläche der vom Diskriminator 3 ausgewählten Objekte entsprechende Summensignal gelangt vom Integrator 6 zu einer digitalen Auswerteeinheit 7* Dort wird das Signal in noch zu beschreibender Weise weiterverarbeitet und gelangt schließlich zur Meßwertanzeige 8.

Die digitale Auswerteeinheit 7 steuert über einen Digital-Analog-Wandler 9 und die Leitung 4 die Lage des Schwellwertes des Diskriminators 3- Die Lage des Schwellwertes bei Meßbeginn und der Abstand zweier aufeinanderfolgender Schwellwerte wird bei 10 der digitalen Auswerteeinheit 7 vorgegeben. -

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Die ¥irkungsweise der Anordnung nach Fig. 1 wird im folgenden anhand der Figuren 3 und 4- näher erläutert. Fig. 3 zeigt ein auszuwertendes Partikel in einem Abtastfeld, das hier aus Gründen der Vereinfachung durch nur sechs Abtastzeilen a, b, c, d, e, f angedeutet ist«, Ferner ist angenommen, daß es sich in Fig. ο um ein einziges Partikel im gesamten Bildfeld handelt. Das "bei der Abtastung dieses Partikels entstehende Bildsignal ist in Fig. 4· dargestellt.

Zunächst erfolgt eine Bildabtastimg, bei welcher entsprechend der bei 10 vorgenommenen Eingabe die digitale Ausxverteeinheit 7 über den Digital~Analog-Wandler 9 den Schwellwert des Di'skriminators 3 entsprechend der in Fig. 4 mit 11 bezeichneten Linie eingestellt hat. Alle tmterhalb der Linie 11 liegenden Signalanteile liefern hinter dem Diskriminator 3 ein logisches Η-Signal. Auf dem Bildschirm des Monitors 5 wird also ein Partikel beobachtet, das durch die Linie 12 (Fig. 3) begrenzt ist, während der digitalen Auswerteeinheit 7 "vom Integrator 6 ein Signal zugeführt wird, welches der Fläche des durch die Linie 12 begrenzten Partikels entspricht. Als nächsten Schritt wird von der Auswer te einheit 7 über den Wandler 9 die Lage der Diskriminatorschwelle so verstellt, wie dies in Fig. 4- durch die Linie 13 dargestellt ist. Auf dem Bildschirm des Monitors 5 erscheint jetzt ein Partikel, welches durch die Linie 14- begrenzt ist und die Fläche dieses Partikels entspricht dem jetzt der Auswerteeinheit 7 zugeführten Summensignal.

Die Auswerteeinheit 7 bildet die Differenz zwischen dem ersten und dem zweiten Flächen signal, d.h. sie bestimmt die Fläche, welche zwischen den Berandungen (Äquidensiten) 12 und 14- in Fig. 3 gelegen ist. Zugleich wird die Fläche dieses Bereiches mit dem Logarithmus der Lichtabsorption multipliziert, welcher dem Mittelwert zwischen den Schwellen 11 und 13 entspricht. Anstelle dieses logarithmischen Wertes kann auch ein anderer Eichwert zur Multiplikation dienen, welcher in dem bei 20 in die Auswerteeinheit 7 eingegebenen Programm enthalten ist.

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Das Produkt des von den Äquidensiten 12, 14- berandeten Bereiches mit dem zugeordneten Eichwert wird in der Auswerteeinheit 7 Gespeichert. Als nächsten Schritt verstellt diese über den Wandler 9 die Lage der Diskriminatorschwelle entsprechend der Linie 15 in Fig. 4. Auf dem Sichtschirm des Monitors 5 erscheint jetzt ein Partikel, welches von der Linie 16 berandet ist. Zugleich bildet die Auswerteeinheit 7 das Produkt aus der Fläche des den Äquidensiten 14 und 16 berandeten Bereiches mit dem zugeordneten Eichwert. Als nächsten Schritt verstellt die Auswerteeinheit 7 die Diskriminatorschwelle entsprechend der Linie 17 in Fig. 4. Das jetzt bei 5 dargestellte Partikel ist durch die Linie 18 berandet. Nach Bildung des Produktes aus der Fläche des von den Äquidensiten 16 und 10 berandeten Bereiches und dem zugeordneten Eichwert bestimmt die Auswerteeinheit noch das Produkt aus der Fläche des durch Äquidensite 18 berandeten Partikels mit dem zugeordneten Eichwert. Die so gebildeten und gespeicherten Produkte werden schließlich aufsummiert und das Summensignal wird bei 8 zur Anzeige gebracht. Dieses Summensignal gibt direkt digital die gesuchte Substanzmenge innerhalb des in Fig. 3 dargestellten Partikels an.

Fig. 2 zeigt ein, mehrere Partikel 21, 22, 23, enthaltenes Bildfeld, während der Auswertung durch die Anordnung gemäß Fig.1. Man erkennt die verschiedenen Äquidensiten, vrelche den Linien 12, 14-, 16, 18 der Fig. 3 entsprechen und welche im Verlauf des Meßvorganges gebildet werden. Im dargestellten Beispiel zeigt die Meßwertanzeige 8 direkt die gesamte Substanzmenge der im Bildfeld enthaltenen Partikel 21, 22, 23 an.

Fig. 5 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer Anordnung, welche es ermöglicht, einzelne Partikel in einem Bildfeld auszuwählen. Ein solches Bildfeld ist beispielsweise in Fig. 6 dargestellt. Die Anordnung nach Fig. 5 enthält einen zusätzlichen Diskriminator 25» dessen Schwellwert bei 24 einstellbar ist. Das Aus-

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gangssignal des "Verstärkers 3 wird sowohl dem Diskriminator als auch dem Diskriminator 3 zugeführt. Der Diskriminator 25 dient dazu, eine "bestimmte Menge von Partikeln aus einem Bildfeld auszuwählen, deren Grauwert den bei 24 eingestellten Schwellwert übersteigt.

Mit 26 ist ein Markierfeldgenerator bezeichnet, dessen Spannung einer Einrichtung 27 zugeführt--wird. Diese v/eist einen Steuerknüppel 28 auf, mit dem ein Impulsfeld dessen Breite und Höhe mittels der Knöpfe 29 und 30 einstellbar ist, über das gesamte Bildfeld bewegt werden kann. Das so erzeugte Impulsfeld, welches im Monitor 5 als hellgetastetes Rechteck erscheint, wird einer Anwahllogik 31 zugeführt, deren Aufbau im einzelnen in der Patentanmeldung P 24 03 502.7-53 der Anmelderin beschrieben und dargestellt ist. Die Ausgangsspannung der Anwahllogik 31 und die Ausgangsspannung des Diskriminators 3 wird einem HTÜD-Glied zugeführt. Dieses läßt Signale zum Monitor 5 und zum Integrator 6 durch, sobald diese die Schwellwerte der Diskriminatoren 3 und 25 überschreiten und zugleich über 26, 27, 31 angewählt sind.

Pig. 6 zeigt ein Bildfeld, das mittels der Anordnung nach Pig. auszuwerten ist. Zunächst wird bei 24 der Schwellwert des Diskriminators 25 so eingestellt, daß nur noch Partikel im Bildfeld enthalten sind, deren Grauwert den voreingestellten Wert überschreitet. Eines dieser Partikel ist mit 34- bezeichnet. Die Äquidensite, welche dem Schwellwert des Diskriminators 25 entspricht ist mit 36 bezeichnet. Mittels der digitalen Auswerteeinheit 7 und des Digital-Analog-Wandlers 9 werden, wie schon anhand der Pig. 1 näher beschrieben nacheinander die Äquidensiten 37, 38, 39 gebildet. Die Auswertung des Partikels 34 erfolgt, sobald das bei 26, 27 erzeugte Impulsfeld 35 das Partikel 34 anschneidet. In diesem Pail liefert das UND-Glied 32 Signale zum Integrator 6, welche genauso ausgewertet werden, wie dies anhand der Pig. 1 beschrieben ist.

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Nach Auswertung des Partikels 34- in Fig. 6 wird beispielsweise das Impulsfeld mittels der Knöpfe 29 und 30 in Länge und Breite verstellt und mittels des Steuerknüppels 28 so verschoben, daß es das Partikel 4-1 anschneidet. Dieses Partikel wird jetzt ausgewertet, wobei die entsprechenden Iquidensiten in Fig. 6 dargestellt sind. Die Anwahl des Partikels 4-3 erfolgt mittels des Impulsfeldes 42, so daß schließlich alle drei im Bildfeld der Pig. 6 enthaltenen Partikel einzeln ausgewertet sind. Bei 8 werden die Substanzmengen der Partikel 34-, 4-1, 4-3 nacheinander zur Anzeige gebracht.

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Claims (8)

Patentansprüche

1.j Verfahren zur Messung von Substanzmengen in lichtdurchlässigen Proben, die nach einem Easterverfahren abgetastet werden, dadurch gekennzeichnet, daß in aufeinanderfolgenden Schritten die auszuwertende Probe vollständig aus einzelnen Flächenbereichen zusammengesetzt wird."," wobei innerhalb Jedes Flächenbereiches die Lichtabsorption zwisehen vorgewählten Grenzen liegt, und daß die Fläche jedes Bereichs gemessen, mit einem zugeordneten Eichwert multipliziert und die den Flächenbereichen entsprechenden Produkte aufsummiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß für jeden Flächenbereich der Logarithmus der zugeordneten mittleren Lichtabsorption als Eichwert verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem eine lichtdurchlässige Probe fernsehmäßig abgetastet wird, dadurch gekennzeichnet, daß das resultierende Bildsignal einer schrittweise um gleiche Beträge in Richtung auf höhere Grauwerte zunehmenden Diskriminierung unterworfen wird, und daß zu jedem Schritt die dem durchgelassenen Signal entsprechende Fläche gemessen und von der beim vorhergehenden Schritt gemessenen Fläche abgezogen wird.

4-, Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, bei der eine lichtdurchlässige Probe mittels einer Fernsehkamera abgetastet wird, gekennzeichnet durch einen mit dem Signalausgang der Kamera (1) verbundenen Diskriminator (3) einen Integrator (6) für das diskriminierte Signal, und eine digitale Auswerteeinheit (7) der das integrierte Signal zugeführt ist, die über einen Digital-Analog-Wandler (9) den Schwellwert des Diskriminators (3) schrittweise in

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Richtung auf höhere Grauwerte verstellt und zugleich das integrierte Signal verarbeitet und einer digitalen Meß-"-· wertanzeige (8) zuführt.

5- Anordnung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die digitale Auswerteeinheit (7) einen Eingang (10) zur Eingabe eines Signals auf v/eist, das-den Abstand zweier aufeinanderfolgender Diskriminator-Schwellwerte festlegt.

6. Anordnung nach Anspruch 4- und 5, dadurch gekennzeichnet, daß mit dem Ausgang des Diskriminators (3) ein Sichtgerät (5) verbunden ist.

7. Anordnung nach Anspruch 4- - 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie Mittel (26,27,31?32) zur Anwahl eines auszuwertenden Partikels (3*0 aus einem Bildfeld enthält.

8. Anordnung nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß sie die Parallelschaltung zweier Diskriminatoren (25,3) enthält, wobei der Schwellwert des ersten (25) fest einstellbar und der Schwellwert des zweiten (3) über die Auswerte einheit (7) schrittweise veränderbar ist.

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