DE2515513C3 - Verfahren zur Messung von Substanzmengen in lichtdurchlässigen Proben - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Bei bekannten Verfahren zur quantitativen Bildanalyse wird beispielsweise ein mikroskopisch erzeugtes Bild mittels eines punktförmigen Strahles rasterförmig abgetastet, wobei ein Licht- oder Elektronenstrahl verwendet werden kann. Meist wird der Abtaststrahl eines Fernseh-Aufnahme-Systems verwendet, da hier die Signalgewinnung außerordentlich schnell vor sich geht. Die so gewonnenen Abtastsignale, das sogenannte Bildsignal, weiden dann einem Diskriminator zugeführt, der die auszuwertenden Objekte nach einstellbaren Kriterien auswählt. Der Diskriminator liefert binäre Signale, deren Länge dem Weg des Abraststrahles innerhalb der ausgewählten Objekte entspricht. Diese Signale werden schließlich einer Auswerteeinheil zugeführt, welche daraus die gesuchten Größen, beispielsweise die Anzahl der Objekte, ihre Fläche oder ihre Ausdehnung in einer vorgegebenen Richtung bestimmt.

Es ist bekannt, eine auszuwertende Probe durch entsprechende Einstellungen des Diskriminator-Schwellwertes in einzelne Grauwertbereiche zu unterteilen, um die jeweiligen Flächen dieser einzelnen Grauwertbereiche zu bestimmen. Die jeweils durch Schwellwerte der Lichtdurchlässigkeit getrennten Bereiche ergeben in ihrer Gesamtheit die Oberfläche der Probe, vgl. Leitz Mitteilungen für Wissenschaft und Technik, Sonderheft betreffend »Leitz Classimat« 1970, S. 1-24.

Bei verschiedenen Anwendungen der quantitativen Bildanalyse, beispielsweise bei der Auswertung von biologischen Proben hat sich nun die Aufgabe ergeben, auch die Substanzmengen der untersuchten Proben zu messen. Dies ist möglich durch Messen der Lichtdurchlässigkeit bzw. der Lichtabsorption der Proben, da nach dem Lambert-Beerschen Gesetz bei Verwendung von monochromatischem Licht die Substanzmenge proportional dem Logarithmus der Lichtabsorption ist.

Die Anwendung dieser Gesetzmäßigkeit führt jedoch bei den in üblicher Weise vorliegenden Proben mit ungleichmäßiger Verteilung der Substanz zu großen Schwierigkeiten. Wegen des logarithmischen Zusammenhangs zwischen Lichtsignal und Substanzmenge ist bei solchen Proben eine Logarithmierung des Meßsignals für jeden Bildpunkt einzeln erforderlich und es darf zur Substanzmengenbestimmung erst nach dieser Logarithmierung integriert werden. Ein bekanntes, nach diesem Prinzip arbeitendes Gerät erfordert einen sehr großen Aufwand, da der Logarithmierer bei Fernsehabtastung nach der in Deutschlang verwendeten Norm mit 5 M Hz arbeiten muß, vgl. DT-OS 22 17 281.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Messung von Substanzmengen in lichtdurchlässigen Proben zu schaffen, das eine zuverläßliche, von Störeinflüssc-n freie Messung mit geringem gerätetechnischen Aufwand ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch die im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Maßnahmen gelöst.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird also die gesamte Fläche einer auszuwertenden Probe dadurch ermittelt, daß der Reihe nach die Flächen zwischen aufeinanderfolgenden Grauwertschwellen ermittelt werden. Dies geschieht, indem jeweils die von einer Schwellwertstufe begrenzte Probenfläche von der von der vorhergehenden Schwellwertstufe begrenzten Probenfläche subtrahiert wird. Durch eine solche Reihenfolge bei der Ermittlung der einzelnen Flächen ist gewährleistet, daß Fehler, die auf einer Drift von Geräteparametern beruhen, eliminiert werden.

Erst nach erfolgter Flächenmessung werden die gewonnenen Werte logarithmiert. Die Logarithmierung des Signals von jedem Bildpunkt ist hier also durch die Logarithmierung von Bereichsignalen ersetzt. Solche Bereichsignale werden niederfrequent, beispielsweise bei der Fernsehabtastung mit der Bildwechselfrequenz erzeugt, so daß ein einfacher Logarithmierer Verwendung finden kann, während die übrige Schallung aus den bei der quantitativen Bildanalyse üblicherweise verwendeten Schaltelementen aufgebaut werden kann.

Wählt man die Unterschiede zwischen der Lichtabsorption aufeinanderfolgender Flächen dem jeweiligen Meßproblem angepaßt, so wird die gesuchte Substanzmenge mit hoher Genauigkeit gemessen, obwohl die Meßanordnung relativ einfach aufgebaut ist.

Wenn die Proben so beschaffen sind, daß das Lambert-Beersche Gesetz gilt, so wird für jede Fläche der Logarithmus der zugeordneten mittleren Lichtabsorption als Eichwert verwendet.

Das neue Verfahren ist jedoch nicht auf solche Proben beschränkt, da es auch die Verwendung anderer als logarithniischer Bewertungsfunktionen ermöglicht. Eine solche Bewertungs- oder Eichfunktion kann von Anwendungsfall zu Anwendungsfall neu festgelegt und eingegeben werden, ohne daß eine Änderung der elektronischen Schaltung erforderlich ist.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Fig. 1 bis 6 der Zeichnungen näher erläutert. Im einzelnen zeigt

Fig. 1 ein Ausführungsbeispiel einer Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem das gesamte Bildfeld ausgewertet wird;

F i g. 2 ein mit Hilfe dieser Anordnung ausgewertetes Bildfeld;

F i g. 3 ein auszuwertendes Partikel im Abtastfeld;

Fig. 4 das bei der Abtastung des Partikels nach F i g. 3 entstehende Bildsignal;

Fig. 5 ein anderes Ausführungsbeispiel einer Anordnung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem einzelne Partikel eines Bildfeldes zur Auswertung angewählt werden können;

F i g. b ein mil Hilfe dieser Anordnung ausgewertetes Bildfeld.

In Fi g. I ist mit 1 eine Fernsehkamera bezeichnet, die dazu dient, eine lichtdurchlässige Probe, beispielsweise das mikroskopisch erzeugte Bild einer biologischen Probe abzutasten. Das von dieser Kamera erzeugte Bildsignal wird einem Verstärker 2 zugeführt und gelangt von dort zu einem Diskriminator 3. Dieser erzeugt an seinem Ausgang ein logisches H-Signal, wenn das Video-Signal einen über die Leitung 4 vorgegebenen Schwellwert unterschreitet und ein logisches ^-Signal wenn das Video-Signal oberhalb dieser Schwelle liegt. Die Länge des vom Diskriminator erzeugten Η-Signals entspricht dem Weg des Abtaststrahles der Kamera 1 innerhalb der ausgewählten Bildobjekte. Das diskriminierte Signal wird e Jn-Jm jo Monitor 5 zugeführt, auf dessen Bildschirm also die ausgewählten Objekte mit gleichmäßigem Grauton erscheinen. Vom Diskriminator 3 gelangt das Signal zugleich zu einem Integrator 6, der alle W-Signale für jede Bildabtastung aufsummiert. Das der Gesamtfläche der vom Diskriminator 3 ausgewählten Objekte entsprechende Sumn.uisignal gelangt vom Integ ator 6 zu einer digitalen Auswerteeinheit 7. Dort wu J das Signal in noch zu beschreibender Weise weiterverarbeilet und gelangt schließlich zur Meßwertanzeige 8.

Die digitale Auswerteeinheit 7 steuert über einen Üigital-Analog-Wandler 9 und die Leitung 4 die Lage des Schwellwertes des Diskriminators 3. Die Lage des Schwellwertes bei Meßbeginn und der Abstand zweier aufeinanderfolgender Schwellwerte wird bei 10 der digitalen Auswerteeinheit 7 vorgegeben.

Die Wirkungsweise der Anordnung nach F i g. 1 wird im folgenden anhand der F i g. 3 und 4 näher erläuten. F i g. 3 zeigt ein auszuwertendes Partikel in einem Abtaslfeld, das hier aus Gründen der Vereinfachung durch nur sechs Abtastzeilen a, b, c. d e. /"angedeutet ist. Ferner ist angenommen, daß es sich in F i g. 3 um ein einziges Partikel im gesamten Bildfeld handelt. Das bei der Abtastung dieses Partikels entstehende Bildsignal ist in Fig. 4 dargestellt.

Zunächst erfolgt eine Bildabtastung, bei welcher entsprechend der bei 10 vorgenommenen Eingabe die digitale Auswerteoinheit 7 über den Digital-Analog-Wandler 9 den Schwellwert des Diskriminators 3 entsprechend der in Fig. 4 mit 11 bezeichneten Linie eingestellt hat. Alle unterhalb der Linie 11 liegenden Signalanteile liefern hinter dem Diskriminator 3 ein logisches W-Signal. Auf dem Bildschirm des Monitors 5 wird also ein Partikel beobachtet, das durch die Linie 12 (Fig. 3) begrenzt ist, während der digitalen Auswerteeinheit 7 vom Integrator 6 ein Signal zugeführt wird, welches der Fläche des durch die Linie 12 begrenzten Partikels entspricht. Als nächsten Schritt wird von der Auswerteeinheit 7 über den Wandler 9 die Lage der Diskiminatorschwelle so verstellt, wie dies in Fig.4 durch die Linie 13 dargestellt ist. Auf dem Bildschirm des Monitors 5 erscheint jetzt ein Partikel, welches durch die Linie 14 begrenzt ist und die Fläche dieses Partikels entspricht dem jetzt der Auswerteeinheit 7 zugeführten Summensignal.

Die Auswerteeinheit 7 bildet die Differenz zwischen dem ersten und dem /weiten Flächensignal, d. h. sie bestimmt die Hache, /welche zwischen den Berandungen (Äquidensiten) 12 und 14 in F i g. 3 gelegen ist. Zugleich wird die Fläche dieses Bereiches mit dem Logarithmus der Lichtabsorption multipliziert, welcher dem Mittelwert zwischen den Schwellen 11 und 13 entsprichi. Anstelle dieses logarithrnischen Wertes kann auch ein anderer Eichwert zur Multiplikation dienen, welcher in dem bei 20 in die Auswerteeinheit 7 eingegebenen Programm enthalten ist.

Das Produkt des von den Äquidensiten 12, 14 berandeten Bereiches mit dem zugeordneten Eichwert wird in der Auswertetinheit 7 gespeichert. Als nächsten Schritt verstellt diese über den Wandler 9 die Lage der Diskriminatorschwelle entsprechend der Linie 15 in Fig.4. Auf dem Sichtschirm des Monitors 5 erscheint jetzt ein Partikel, welches von der Linie 16 berandet ist. Zuglt.ch bildet die A.uswerteeinheit 7 das Produkt aus der Fläche des den Äquidensiten 14 und 16 berandeten Bereiches mit dem zugeordneten Eichwen. Als nächsten Schritt verstellt die Auswerteeinheit 7 die Diskriminatorschwelle entsprechend der Linie 17 in F. g. 4. Das jetzt bei 5 dargestellte Partikel ist durch die Linie j8 berandet. Nach Bildung des Produktes aus der Fläche des von den Äquidensiten 16 und 18 berandeten Bereiches und dem zugeordneten Eichwert bestimmt die Auswerteeinheit noch das Produkt aus der fläche des durch Äquidensite 18 berandeten Partikels mit dem zugeordneten Eichwert. Die so gebildeten und gespeicherten Produkte werden schließlich aufsummiert und das Summensignal wird bei 8 zur Anzeige gebracht. Dieses Summensignal gibt direkt digital die gesuchte .Substanzmenge innerhalb des in F i g. 3 dargestellten Partikels an.

Fig. 2 zeigt ein, mehrere Partikeln 21, 22, 23 enthaltenes Bildfeld, wahrend der Auswertung durch die Anordnung gemäß Fig. 1. Man erkennt die verschiedenen Äquidensiten, welche den Linien 12, 14, 16, 18 der Fig. 3 entsprechen und welche im Verlauf des Meßvorganges gebildet werden. Im dargestellten Beispiel zeigt die Meßwertanzeige 8 duckt die gesamte Substanzmenge der im Bildfeld enthaltenen Partikeln 21,22,23 an.

Fig. 5 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer Anordnung, welche es ermöglicht, einzelne Partikel in einem Bildfeld auszuwählen. Ein solches Bildfeld ist beispielsweise in F i g. 6 dargestellt. Die Anordnung nach F i g. 5 enthält einen zusätzlichen Diskriminator 25, dessen Schwellwert bei 24 einstellbar ist. Das Ausgangssignal des Verstärkers 3 wird sowohl dem Diskriminator 25 als auch dem Diskriminator 3 zugeführt. Der Diskriminator 25 dient dazu, eine bestimmte Menge von Partikeln aus einem Bildfeld auszuwählen, deren Grauwert den bei 24 eingestellten Schwellwert übersteigt.

Mit 26 ist ein Markierfeldgenerator bezeichnet, dessen Spannung einer Einrichtung 27 zugeführt wird. Diese weist einen Steuerknüppel 28 auf, mit dem ein Impulsfeld dessen Breite und Höhe mittels der Knöpfe 29 und 30 einstellbar ist, über das gesamte Bildfeld bewegt werden kann. Das so erzeugte Impulsfeld, welches im Monitor 5 als hellgetastetes Rechteck erscheint, wird einer Anwahllogik 31 zugeführt, deren Aufbau im einzelnen in der Patentanmeldung P 24 03 5027-53 der Anmelderin beschrieben und dargestellt ist. Die Ausgangsspannung der Anwahllogik 31 und d> Ausgangsspannung des Diskriminators 3 wird einem UND-Glied zugeführt. Dieses läßt Signale zum Monitor 5 und zum Integrator 6 durch, sobald diese die Schwellwerte der Diskriminatoren 3 und 25 überschrei ten und zugleich über 26,27,31 angewählt sind.

I'i g. b zeigt ein Bildfeld, das mittels der Anordnung nach I'ig. 5 auszuwerten ist. Zunächst wird bei 24 der Schwellwert des Diskriminators 25 so eingestellt, daß nur noch Partikeln im Bildfeld enthalten sind, deren Grauwert den voreingcstellien Wert überschreitet. 1-jnes dieser Partikel ist mit 34 bezeichnet. Die Äquidensite, welche dem Schwellwert des Diskriminators 25 entspricht ist mit 36 bezeichnet. Mittels der digitalen Auswerteeinheit 7 und des Digital-Analog-Wandlers 9 werden, wie scho" anhand der F i g. 1 näher beschrieben nacheinander d.e Äquidcnsiten 37, 38, 39 gebildet. Die Auswertung des Partikels 34 erfolgt, sobald das bei 26, 27 erzeugte Impulsfeld 35 das Partikel 34 ansehneidet. In diesem Fall liefert das UND-Glied 32 Signale /um Integrator 6. welche genauso ausgewerte werden, wie dies anhand der l·' i g. 1 beschrieben ist.

Nach Auswertung des Parlikels 34 in F'i g. 6 wire beispielsweise das linpulsfeld mittels der Knöpfe 29 unc 30 in Länge und Breite verstellt und mittels de Steuerknüppels 28 so verschoben, daß es das Partikel 4 anschneidet. Dieses Partikel wird jetzt ausgewertet wobei die entsprechenden Äquidcnsiten in F i g. ( dargestellt sind. Die Anwyhl des Parlikels 4} erfolg mittels des Inipulsfeldes 42. so daß schließlich alle drc im liildfeld der Fig. b enthaltenen Partikel cin/cli ausgewertet sind. Bei 8 werden die .Substanzmengen de Partikeln 34,41,43 nacheinander zur Anzeige gebracht.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Messung von Substanzmengen in lichtdurchlässigen Proben, bei dem die Lichtdurchlässigkeit der Probe in Abhängigkeit vom Ort im wesentlichen über die gesamte Fläche der Probe bestimmt wird und bei dem die Flächen von in ihrer Gesamtheit die Oberfläche der Probe ergebenden und jeweils durch Schwellwerte der Lichtdurchlässigkeit getrennten Bereichen ermittelt werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Flächen jeweils durch Subtraktion des über ihren: oberen Schwellwert liegenden Flächenanteils der Probe von dem über ihrem unteren Schwellwert liegenden Flächenanieil der Probe in einer Reihenfolge ermittelt werden, die durch die Aufeinanderfolge der Schwellwerte vorgegeben ist, daß jede Fläche mit einem die Lichtdurchlässigkeit in dem betreffenden Bereich mit der Substanzmenge verknüpfenden Eichfaktor multipliziert wird und daß die so gewonnenen Produkte aufsummiert werden.

2. Verfahren nach Anspruch I. dadurch gekennzeichnet, daß für jede Fläche der Logarithmus der zugeordneten mittleren Lichtabsorption als Eichfaktor verwendet wird.