FI77875C - Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara peptider. - Google Patents

Description

77875

Menetelmä uusien terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien valmistamiseksi

Keksintö koskee uusien peptidien valmistusta, joilla 5 on hemopoieesia inhiboiva vaikutus.

Monissa tehokkaimmista syövän hoitomenetelmistä käytetään hyväksi soluille myrkyllisiä lääkeaineita, jotka hyökkäävät syöpäsoluja vastaan mitoosin ja S-vaiheen aikana. Normaaleihin kudossoluihin, joissa tapahtuu solun jalo kautumista, vaikutetaan tavallisesti samanaikaisesti, mutta pääosa tällaisista soluista on lepäävää eikä siten hyökkäyksen vaikutuksesta herkästi vioittuva. On kuitenkin havaittu, että tällaiset soluille myrkylliset lääkkeet eivät ainoastaan hyökkää lisääntyviä kudossoluja vastaan, vaan 15 pyrkivät työntämään suuren osan normaalisti lepäävistä he-mopoieettisista luuytimen kantasoluista solukiertoon tehden ne siten herkiksi hyökkäykselle.

Luuydinsolut ovat peräisin monitehoisista kanta-soluista, jotka kypsyvät muodostaen monimutkaisen popu-20 laation morfologisesti erilaisia soluja, nimittäin mega-karyosyyttejä, erytrosyyttejä, granulosyyttejä ja lymfosyyttejä. Ainoastaan 10 % monitehoisista kantasoluista pystyy jakautumaan jatkuvasti. Kypsymisen alkuvaiheessa jokainen lisääntyvistä kantasoluista tulee "saatetuksi" 25 johonkin spesifiseen morfologisesti erilliseen muotoon, joka mahdollisesti johtaa johonkin edellä esitetyistä neljästä kypsästä solutyypistä. Kun solut lisääntyvät, ne asteittain menettävät edelleen lisääntymisvoimansa ja kypsät solut, esimerkiksi erytrosyytit tai granulosyytit, 30 eivät voi enää jakautua. Koska kypsät solut täten jatkuvasti kuolevat, on olennaista, että vähemmän kypsien solujen ja erityisesti monitehoisten kantasolujen lisäänty-miskyky ylläpidetään.

Nyt on keksitty tiettyjä peptidejä, jotka pystyvät 35 selektiivisesti estämään lepääviä kantasoluja joutumasta 2 77875 kiertoon. Peptidien uskotaan olevan luonnossa esiintyvän granulolopsieesin estotekijän analogeja. Tätä estoteki-jää on löydetty pienissä määrissä luuydinuutteista.

Keksinnön kohteena on menetelmä kaavan (I) mukais-5 ten terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien ja niiden fysiologisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, HN-CH-CONH-CH-CONH—CH—CONH—CH—CO(NH—R —CO) NHCH-COX2 1 J 4H2>2 iH2 fH2 " <^B2> 4 10 ° COX1 C00H SH ÄH2 (I) jossa NH-R^-CO on glysiini tai D-alaniini ja kaikki muut 1 2 aminohappotähteet ovat L-muodossa, X ja X , jotka voi-15 vat olla samanlaisia tai erilaisia, ovat OH- tai NH2~ ryhmiä ja n on 0 tai 1.

Keksinnön mukaisten peptidien fysiologisesti hyväksyttävät suolat käsittävät happoadditiosuoloja, kuten hydroklorideja, hydrobromideja, sulfaatteja jne, samoin 20 kuin suoloja emästen kanssa, kuten alkalimetallisuoloja, esim. natrium- tai kaliumsuoloja.

Aminohappotäde, joka sijaitsee toisessa asemassa N-päästä katsottuna, näyttää olevan ratkaiseva, koska peptidi pyroGlu-Asp-Asp-Cys-LysOH, joka oli oletettu luonnos-25 sa esiintyväksi granulopoieesia estäväksi tekijäksi, osoittautui olevan inaktiivinen. Johtuen erittäin pienistä määristä käytettävissä olevaa luonnon granulopoieesitekijää luonnossa esiintyvän aineen rakennetta ei ole määritetty. Sitä ei ole koskaan saatu kiteisessä tai täydellisen puh-30 taassa muodossa eikä tiedetä, voitaisiinko tähän päästä käyttäen pelkästään luonnossa esiintyvää materiaalia. Vastakohtana tälle voidaan keksinnön mukaiset peptidit saada kiteisessä muodossa, joka on sopiva farmaseuttista käyttöä varten ja suhteellisen suurissa määrissä, vapaina saastut-35 tavista luonnollista alkuperää olevista peptideistä ja proteiineista.

3 77875

Keksinnön mukaiset edulliset yhdisteet ovat: 1. L-pyroGlutamyyli-L-glutamyyli-L-aspartyyli-L-kysteinyy-li-L-lysiini; 2. L-pyroGlutamyyli-L-glutamyyli-L-aspartyyli-L-kysteinyy- 5 li-glysyyli-L-lysiini; 3. L-pyroGlutamyyli-L-glutaminyyli-L-aspartyyli-L-kystei-nyyli-L-lysiini; 4. L-pyroGlutamyyli-L-glutamyyli-L-aspartyyli-L-kysteinyy-li-D-alanyyli-L-lysiini; ja 10 5. L-pyroGlutamyyli-L-glutamyyli-L-aspartyyli-L-kysteinyy- li-L-lysiiniamidi.

Edellä esitetyn kaavan mukaisilla yhdisteillä on taipumusta monimutkaiseen aktiivisuusmalliin, joka ilmeisesti on annoksesta riippuva. Erityisesti yhdiste (1) , kun 15 sitä injektoidaan hiiriin suhteellisen matalalla annosta-solla, estää selektiivisesti myelopoieettista systeemiä, nimittäin morfologisesti tunnistettavia soluja ja lajimää-rättyjä kantasoluja, kun taas muihin solulinjoihin, jotka ovat peräisin monitehoisista kantasoluista, ei vaikuteta.

_7 20 Väkevyydessä 10 M solun ulkopuolisessa nesteessä tapahtuu merkittävä vähennys ääreisgranulosyyteissä, joka vähennys on suurin kypsissä soluissa. Yhden injektion jälkeen väkevyydessä 10 ^ M näyttää päävaikutus kohdistuvan lajimäärättyihin kantasoluihin. Suuremmilla annoksilla, 5 25 esim. injektiolla väkevyydessä 10 M kuutena peräkäisenä päivänä tapahtuu vielä voimakasta vähenemistä lajimäärät-tyjen kantasolujen populaatiossa, mutta myös monitehoiset kantasolut ja erytrosyyttien tuotanto alenevat. Väkevyydellä 10^ M kolmen viikon aikana havaitaan koko verenmuo-30 dostussysteemin voimakasta stimuloitumista imusolujen tuotanto mukaan lukien. Samanlaisia tuloksia antavat yhdisteet (2)-(5), vaikkakin lievästi erilaisilla tehokkuusta-soilla.

On huomattava, että mitään estovaikutusta ei ha-35 väitä muiden kudosten soluilla ja erityisesti kasvainso- 77875 4 luilla, jotka liittyvät ei-myelopoieettisiin kudoksiin.

Ne suojaavat siten myelopoieettisen systeemin selektiivisesti. Peptideillä on kuitenkin suojaava vaikutus syöpä-soluihin, jotka liittyvät myelopoieettiseen systeemiin, 5 esimerkiksi myeloleukemiasoluihin, eikä niitä voida käyttää selektiivisesti tällaisten syöpien hoitoon.

Nämä peptidit eivät ole merkittävästi myrkyllisiä. Lisäksi kaikki havaitut hematologiset vaikutukset olivat palautuvia eikä mitään makroskooppisia muutoksia havaittu 10 muissa elimissä eläimillä, joihin oli injektoitu peptidiä.

Kuten edellä esitettiin, pyrkii hemopoieesin ja erityisesti granulopoieesin estäminen estämään lepäävien solujen jakautumista ja siten niiden muuttumista herkäksi solumyrkyllisten syövänvastaisten lääkkeiden, esimerkiksi 15 sytosiini-arabinosidin vaikutukselle.

On huomattu, että käsiteltäessä soluja keksinnön mukaisilla peptidillä, kuten yhdisteellä (1), estovaikutus myelopoieettisiin soluihin ei ole pelkästään palautuva, vaan itseasiassa tällaisten solujen tuotanto lisään-20 tyy hetkellisesti epänormaalisti, niin että normaali solu-populaatio palautuu hyvin nopeasti ja itse asiassa ylittyy tilapäisesti.

Edellä esitetyn suojaavan vaikutuksen lisäksi solu-. . myrkkyterapiassa voidaan keksinnön mukaisia peptidejä 25 käyttää myös sellaisten syöpäsolujen lisääntymisen pysäyttämiseen, jotka liittyvät myelopoieettiseen systeemiin, esimerkiksi hoidettaessa myeloleukemiaa. Näitä peptidejä voidaan käyttää missä tahansa kliinisessä tilanteessa, jossa halutaan muuttaa hemopoieesia. Joissakin tapauksis-30 sa keksinnön mukaisia peptidejä voidaan käyttää myös suhteellisen suurina annoksina stimuloimaan myelopoieettista systeemiä, kun tämä on riittämättömän aktiivinen.

5 77875

Koska peptidien on havaittu panevan liikkeelle tietyn vaikutuksen samansukuisiin ei-myeloidi-soluihin, kuten lymfopoieesiin, niitä voidaan käyttää myös solun lisääntymisen selektiiviseen modifiointiin muissa elimissä.

5 Yleensä suojaavan vaikutuksen aikaansaamiseksi so luille myrkyllisiä lääkkeitä vastaan annetaan keksinnön mukaisia peptidejä ihmispotilaille injektoimalla annos alueella 1-10 mg, esimerkiksi 4-5 mg/70 kg kehon painoa/ päivä. Jos antaminen tapahtuu tiputtamalla tai vastaavilla 10 menetelmillä, voi annos olla väliltä 3-300 mg/70 kg kehon painoa, esimerkiksi noin 100 mg, kuuden päivän ajan. Periaatteessa on toivottavaa aikaansaada peptidin väkevyys -9 -4 noin 10 M - 10 M potilaan solun ulkopuolisessa nesteessä.

Yleensä yhdistetty hoito solumyrkyllisten lääkkei-15 den, kuten sytosiini-arabinosidin, kanssa vaatii huolellisen ajoituksen sen varmistamiseksi, että myelopoieettinen systeeni on suojattu niin kauan kuin solumyrkyllistä lääkettä on vielä läsnä.

Keksinnön mukaisista yhdisteistä voidaan formuloi-20 da farmaseuttisia yhdistelmiä, jotka aktiivisena aineosana sisältävät ainakin yhden kaavan (I) mukaisen yhdisteen, tai sen fysiologisesti yhteensopivan suolan, yhdessä farmaseuttisen kantajan tai apuaineen kanssa. Keksinnön mukaisia yhdistelmiä voidaan antaa esimerkiksi suun kautta, 25 nenän kautta tai ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta tai peräsuolen kautta.

Keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää myös eläinlääketieteessä.

Keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan antaa tavan-30 omaisissa farmakologisissa antomuodoissa, kuten tabletteina, päällystettyinä tabletteina, nenäsuihkeena, liuoksina, emulsioina, jauheena, kapseleina tai jatkuvissa va-pautumismuodoissa. Tavanomaisia farmaseuttisia apuaineita sekä myös tavallisia valmistusmenetelmiä voidaan käyttää 6 77875 näiden muotojen valmistukseen. Tabletteja voidaan valmistaa esimerkiksi sekoittamalla aktiivinen aineosa tai aineosat tunnettujen apuaineiden, kuten esimerkiksi ]aimennusaineiden, kuten kalsiumkarbonaatin, kalsiumfos-5 faatin tai laktoosin, hajotusaineiden, kuten maissitärkke-lyksen tai algiinihapon, sideaineiden, kuten tärkkelyksen tai gelatiinin, liukuaineiden, kuten magnesiumstearaa-tin tai talkin, ja/tai aineiden kanssa jatkuvan vapautumisen saamiseksi, kuten karboksipolymetyleenin, karboksime-10 tyyliselluloosan, selluloosa-asetaattiftalaatin tai poly-vinyyliasetaatin kanssa.

Tabletit voivat haluttaessa koostua useasta kerroksesta. Päällystettyjä tabletteja voidaan valmistaa päällystämällä ytimiä, jotka on saatu samalla tavalla kuin tab-15 letit, aineilla, joita tavallisesti käytetään tabletin päällystykseen, esimerkiksi polyvinyylipyrrolidonilla tai sellakalla, arabikumilla, talkilla, titaanidioksidilla tai sokerilla. Jatkuvan vapautumisen saavuttamiseksi tai yhteensopimattomuuksien välttämiseksi voi myös ydin koos-20 tua useasta kerroksesta. Tabletin päällyste voi myös koostua useista kerroksista jatkuvan vapautumisen aikaansaamiseksi, jossa tapauksessa voidaan käyttää edellä tableteille mainittuja apuaineita.

Injektioliuoksia valmistetaan esimerkiksi tavalli-25 seen tapaan, kuten lisäämällä säilöntäaineita, kuten p- hydroksibentsoaatteja, tai stabiloimisaineita, kuten EDTA. Liuokset täytetään sitten injektiopulloihin tai ampulleihin.

Nenäsuihkeet voidaan muodostaa samalla tavalla vesipitoisessa liuoksessa ja pakata suihkesäiliöihin joko 30 aerosoli-ponneaineen kanssa tai varustettuna laitteella käsin puristamista varten. Kapselit, jotka sisältävät yhden tai useampia aktiivisia aineosia, voidaan valmistaa esimerkiksi sekoittamalla aktiiviset aineosat inerttien kanti-mien, kuten laktoosin tai sorbitolin kanssa ja täyttämällä 35 seos gelatiinikapseleihin.

7 77875

Sopivia peräpuikkoja voidaan valmistaa esimerkiksi sekoittamalla aktiivinen aineosa tai aktiiviset aine-osayhdistelmät tavanomaisten kantajien kanssa, joita tavallisesti käytetään tähän tarkoitukseen, kuten luonnon 5 rasvojen tai polyetyleeniglykolin tai niiden johdannaisten kanssa.

Annosyksiköt, jotka sisältävät tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä, sisältävät edullisesti 1-10 mg, esimerkiksi 4,5 mg kaavan (I) peptidiä.

10 Keksinnön mukaisia uusia peptidejä voidaan myös käyttää immunologisissa analyysimenetelmissä. Peptidi liitetään silloin kovalenttisesti sopivaan suurmolekyy-liseen kantajaan, kuten albumiiniin, polysiiniin tai po-lyproliiniin ruiskutettavaksi vasta-ainetta tuottaviin 15 eläimiin (esim. kaniineihin, marsuihin tai vuohiin).

Erittäin spesifisiä vastaseerumeita saadaan käyttämällä hyvin tunnettuja absoptio-menetelmiä suurmolekyylistä kantajaa käyttäen. Liittämällä peptidimolekyyliin radioaktiivinen isotooppi (3H, 14C, ^N) voidaan helposti 20 suunnitella radioimmunoanalyysi ja käyttää tätä peptidin määrittämiseen erilaisissa biologisissa nesteissä, kuten seerumissa (plasma), virtsassa ja aivo-selkäydinnesteessä.

Kaavan (I) mukaisia peptidejä valmistetaan siten, että kaavan (II) mukaisesta suojatusta yhdisteestä, 30 R2N-CH-CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-CO(NH-R1-CO)n~NH-CH-COR7 «k>2 <Jh2 ch2 <ch2)4 COR3 COR4 SR5 NHR6 (II) 77875 β 2 6 jossa R ja R ovat amiiniryhmien suojaryhmiä tai vetyato- 3 4.7 ...

meja, R , R ja R ovat NH--ryhmia, suojattuja aminoryh- Δ 5 mia tai karboksyyliryhmiä tai OH-ryhmiä ja R on tioliryh-raän suojaryhmä, poistetaan suojaryhmät, edullisesti happo-5 hydrolyysillä, ja tuote muutetaan haluttaessa fysiologisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

Läsnäolevat reaktiokykyiset ryhmät (amino, tioli ja/tai karboksyyli) suojataan kokonaissynteesin aikana ja viimeisenä vaiheena on siten suojauksen purkaminen suojalo tusta kaavan (I) mukaisesta johdannaisesta. Normaalisti kaikki -COOH-ryhmät, kaikki -Nl^-ryhmät, pyroglutamyyli-tähteen -NH-ryhmä ja kysteinyyli-tähteen -SH-ryhmä suojataan.

Tunnetaan laaja valikoima suojaryhmiä aminohappoja varten ja niistä ovat esittäneet esimerkkejä Schröder, 15 E. ja Lubke, K., The Peptides, niteet 1 ja 2, Academic Press, New York, Lontoo, 1965 ja 1966; Pettit, G.R.,

Synthetic Peptides, niteet 1-4, Van Nostrand, Reinhold,

New York 1970, 1971, 1975 ja 1976, Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Synthese von Peptiden, nide 15, 20 Gerog Thiene Verlag, Stuttgart 1974; ja Amino Acids, Peptides and Proteins, niteet 4-8, The Chemical Society, Lontoo 1972, 1974, 1975 ja 1976.

Käyttökelpoisia amiinisuojaryhmiä ovat esim. kar-bobentsoksi-, (jota tämän jälkeen myös merkitään Z:lla) 25 trityyli, t-butoksikarbonyyli (jota tämän jälkeen merkitään myös Boc:llä) sekä asyyliryhmät, kuten esimerkiksi asetyyli-ryhmä tai formyyliryhmä.

Karboksyylisuojaryhmiä, joita voidaan käyttää, ovat esimerkiksi helposti lohkaistavat esteriryhmät, kuten bents-30 yyli (jota tämän jälkeen merkitään myös Bz:lla), p-nitro-bentsyyli- tai t-butyyliryhmät.

Tiolisuojaryhmiä ovat p-metoksibentsyyli- ja sulfo-etyyliryhmät.

On selvää, että on olemassa laaja alue muita tällai-35 siä ryhmiä, kuten esimerkiksi edellä mainituissa kirjaili- s 77875 suusviitteissä yksityiskohtaisesti esitetyt, ja kaikkien tällaisten ryhmien käyttö edellä kuvatuissa menetelmissä kuuluu tämän keksinnön piiriin.

Karboksyy]i-suojaryhmät voidaan liittää tavanomaisin 5 menetelmin, esim. reaktiolla sopivan esteröimisreagenssin, esimerkiksi alkoholin, kuten bentsyyli- tai p-nitrobentsyy-lialkoholin kanssa hapon, esim. p-tolueenisulfonihapon läsnäollessa .

Amiini-suojaryhmät voidaan liittää tavanomaisin mene-10 telmin, esim. reaktiolla sopivien happohalogenidien kuten karbobentsoksikloridin tai pivaloyylikloridin, tai happo-anhydridien, kuten etikkahapon anhydridin kanssa.

Tioli-suojaryhmät voidaan liittää reaktiolla sopivien S-eetteröimisaineiden, kuten p-metoksibentsyylikloridin tai 15 sulfoetyylibromidin kanssa.

Amiini- ja karboksyyli-suojaryhmien poistamiseksi on olemassa suuri joukko menetelmiä. Siten esimerkiksi amiini-suojaryhmä voidaan poistaa asidolyysillä, hydroge-nolyysillä, käsittelemällä laimealla ammoniumhydroksidilla, 20 käsittelemällä natriumilla, käsittelemällä natriumamidilla, käsittelemällä hydratsiinilla tai entsymaattisella hydrolyy-sillä, esimerkiksi leusiiniamino-peptidaasilla. Menetelmät, jotka ovat kiinnostavia, käsittävät myös käsittelyn vedettömällä bromivedyllä, esimerkiksi jääetikassa, käsit-25 telyn trifluorietikkahapolla, käsittelyn nestemäisellä fluorivedyllä ja katalyyttisen hydrauksen.

Karbobentsoksi- ja t-butoksikarbonyyliryhmät voidaan poistaa käyttäen esimerkiksi vedetöntä bromi-vetyä, sopivasti jääetikan läsnäollessa, tai käyttämällä 30 trifluorietikkahappoa. Asyyli-ryhmät voidaan poistaa esimerkiksi tavanomaisella hydrolyysillä hapon kanssa tai entsymaattisella hydrolyysillä kuten edellä selostettiin.

Karboksyyli-suojaryhmien poistaminen voidaan suorittaa esimerkiksi saippuoimalla, asidolyysillä, hydrogeno-35 lyysillä tai entsymaattisella hydrolyysillä. Siten, esimerkiksi, saippuoiminen voidaan toteuttaa alkalimetallihydrok- 10 77875 sidilla sopivasti veden, alkoholin ja/tai asetonin läsnäollessa. Asidolyysi voidaan toteuttaa esimerkiksi käyttämällä vedetöntä bromivetyä tai trifluorietikkahappoa ja hydrogenolyysi toteutetaan esimerkiksi katalyyttisellä 5 hydrauksella esim. käyttämällä palladium/hiiltä, sopivasti 10-%:sta palladium/hiiltä. Entsymaattinen hydrolyysi toteutetaan esimerkiksi käyttämällä leusiiniaminopepti-daasia. Bentsyyli- ja p-nitrobentsyyliryhmät voidaan poistaa esim. hydrogenolyysillä ja t-butyyliryhmät voidaan 10 poistaa esim. happohydrolyysillä.

Amiini-, hydroksyyli- ja karboksyylisuojarynmät voidaan poistaa esimerkiksi samanaikaisesti asidolyysillä, emäksisellä hydrolyysillä, hydrogenolyysillä, käsittelemällä natriumilla tai natriumamidilla tai entsymaattisella 15 hydrolyysillä. Tällaiset menetelmät käsittävät käsittelyn bromivedyllä, sopivasti jääetikan läsnäollessa, sekä käsittelyn alkoholilla, joka sopivasti sisältää liuotettuna kuivaa kloorivetyä.

Tioli-suojaryhmät, kuten p-metoksibentsyyliryhmät, 20 poistetaan käyttäen fluorivetyä alhaisessa lämpötilassa, esim. Q°C:ssa, edullisesti happoa poistavan aineen kuten merkaptoetanolin, kysteiinin tai metioniinin läsnäollessa. Tämä menetelmä pystyy poistamaan amino-, karboksyyli- ja tioli-suojaryhmät samanaikaisesti.

25 Eräs selektiivinen suojauksen purkumenetelmä on esimerkiksi katalyyttinen hydraus, sopivasti käyttäen esimerkiksi palladium/hiiltä katalyyttinä ja sopivasti liuottimen esim. veden, metanolin, dioksaanin, etikkahapon tai t-butanolin läsnäollessa. Tämä menetelmä poistaa, esi-30 merkiksi, karbobentsoksiryhmän, mutta jättää t-butoksikar-bonyyli- tai asyyliryhmän koskemattomaksi.

Yleensä kaavan (I) yhdisteiden suojattuja johdannaisia voidaan valmistaa menetelmien avulla, jotka ovat sopivia peptidisynteesiä varten. Voidaan lähteä C-terminaalises-35 ta päästä lysiinin sopivasti suojatun johdannaisen reaktiolla li 77875 kysteiinin sopivasti suojatun johdannaisen kanssa, kun n = 1, yhdisteen NI^R^COOH, kanssa. Lysiinijohdannaisessa on vapaa d-aminoryhmä, kun taas toisessa reagoivassa aineessa on joko vapaa tai aktivoitu karboksyyliryhmä ja 5 suojattu aminoryhmä. Kytkemisen jälkeen välituote puhdistetaan, esimerkiksi kromatografisesti, ja puretaan sitten N-suojaus selektiivisesti sallimaan uuden aminohappotähteen liittäminen. Tämä menettely toistetaan kunnes haluttu aminohapposekvenssi on täydellinen. N-suojauksen purkaminen ta-10 pahtuu normaalisti lievällä asidolyysillä; happoylimäärä neutraloidaan normaalisti ennen seuraavaa kytkentävaihet-ta, esim. käyttäen emästä kuten trietyyliamiinia.

Vaihtoehtoisesti on mahdollista lähteä N-päästä ja saattaa sopivasti suojattu g.1 utamiini- tai pyroglutamii-15 nihappojohdannainen, jossa edullisesti on aktivoitu karboksyyliryhmä, reagoimaan sopivasti suojatun glutamiiniha-pon johdannaisen tai glutamiinin kanssa. Kytkemisen jälkeen tuote voidaan puhdistaa esim. kromatografiällä ja purkaa suojaus pääte--karboksyyliryhmästä ja jos halutaan 20 aktivoida ennen seuraavaa kytkemisvaihetta. Tämä vaihesar-ja toistetaan, kunnes haluttu peptidi on täydellinen.

Karboksyylihappoa aktivoivia substituentteja, joita voidaan käyttää, ovat esimerkiksi seka-anhydridit, atsidit tai aktivoidut esterit, kuten esimerkiksi p-nitrofenyy]i-25 esteri, 2,4,5-trikloorifenyyliesteri, N-hydroksibentsotri-atsoliesteri tai N-hydroksisukkiini-imidyyliesteri.

Yleensä on edullista toteuttaa kytkemisreaktiot alhaisissa lämpötiloissa, esimerkiksi lämpötiloissa -20°C:sta ympäristön lämpötilaan, edullisesti sopivassa liuotinjär-30 jestelmässä, esimerkiksi tetrahydrofuraanissa, dioksaanis-sa, dimetyyliformamidissa, metyleenikloridissa tai näiden liuottimien seoksessa.

Vapaan amino-ry liman ja karboksyyli-ryhmän kytkeminen voidaan toteuttaa käyttäen esimerkiksi disykloheksyyli-35 karbodi-imidiä (DCC). Toinen kytkentäaine, jota voidaan käyttää on esimerkiksi N-etoksikarbonyyli-2-etoksi-l,2-di-hydrokinoliini.

12 77875

Sopivampaa saattaa olla toteuttaa synteesi kiinto-faasi-hartsikantajalla. Kloorimetyloitu polystyreeni (silloitettu 1 %:lla divinyylibentseeniä) on eräs käyttökelpoinen kantajatyyppi; tässä tapayksessa synteesi 5 alkaa C-päästä kytkemällä N-suojattu lysiini kantajaan.

2

Kun X :n on oltava NH2, on edullista käyttää hartsikanta-jaa, jossa on bentshydryyliamiiniryhmiä; nämä kytketään aluksi ]ysiinikarboksyyliryhmään ja lopullinen lohkaisu, esim. HF:lla, antaa halutun amidin.

10 Seuraavat esimerkit annetaan pelkästään valaise maan keksintöä.

Liuottimet tislattiin uudelleen kaupallisesta aineksesta ja varastoitiin seuraavalla tavalla: dimetyyli-formamidi (DMF) molekyyliseulal1 a 4A, dikloorimetaani (DCM) 15 CaCl2:lla, trietyyliamiini (TEA) Na/-Pb-lejeeringillä (Baker) ja trifluorietikkahappo (TFA) molekyy1iseulalla 4A.

Esimerkki 1 L-pyroglutamyyli-L-glutamyyli-L-aspartyyli-L-kyste- inyyli-L-lysiini: yhdiste (1) 20 0 -bentsyylioksikarbonyyli-lysiini-bentsyyliesteri- hydrokloridia (406 mg) liuotetaan 3 ml:aan DMF ja TEA lisätään kunnes vapaata TEA voidaan havaita höyrytaasissa kostutetulla palasella pH-indikaattoripaperia. Tähän liuokseen lisätään t-Boc-(S-p-metoksibentsyvli)-L-kysteiini-25 N-hydroksisukkiini-imidiesteriä (491 mg) liuotettuna 3 ml: aan DMF. Sopivin aikavälien lisätään TEA:n annoksia liuoksen lievän alkalisuuden ylläpitämiseksi. Seoksen annetaan seistä yli yön huoneen lämpötilassa ja negatiivisen nin-hydriini-reaktion tarkistamisen jälkeen se pannaan suo-30 raan 2,5 x 75 cm:n Sephadex® LH-20-pylvääseen, joka on tasapainotettu DMF:11a ja kalibroitu standardireaktanteilla (esim. annetussa esimerkissä t-Boc- ('l^bentsyyli)-L-glu-tamiinihappo-p-nitrofenyyliesterillä ja p-nitrofenolilla). Kolonnivirtaus ylläpidetään painovoimavirtauksel]a ja pois-35 tovirtausta tarkkaillaan 280 nm:ssa ennen kokoamista noin i 13 77875 10 ml:n jakeissa. Tuote voidaan tunnistaa jokaisen jakeen ohutlevykromatografiällä, jolloin vastaavat jakeet yhdistetään ja haihdutetaan tyhjössä; saanto: 700 mg (100 %) öljymäistä tuotetta, homogeeninen ohutlevykromatografiällä 5 (kloroformi/asetoni (9/])), = 0,64.

b. t-Boc-(/S-bentsyyli)-L-aspartyyli-(S-p-metoksi-bentsyyli)-L-kysteinyyli-(£ -bentsyylioksikarbo-nyyli)-L-lysiini-bentsyyliesteri (II) 700 mg suljettua ja suojattua dipeptidiä (I) liuo-10 tetaan 25 ml:aan vedetöntä DCM ja lisätään 25 ml vedetöntä TFA. 30 minuutin kuluttua happo ja liuotin poistetaan tyhjössä. Jäännös liuotetaan DCM:ään ja haihdutetaan uudelleen. Jäännöksen liuokseen DMFrssa (3 ml), joka on tehty lievästi emäksiseksi TEA:11a, lisätään t-Boc-(^8 -bentsyyli)-L-15 asparagiinihappo-p-nitrofenyyliesterin (488 mg) liuosta 3 ml:ssa DMF. Emäksisyys tulisi tarkistaa usein ja ylläpitää lisäämällä pieniä määriä TEA. Senjälkeen kun ninhydrii-nireaktio oli muuttunut negatiiviseksi (noin 2 tunnin kuluttua) reaktioseos pannaan SephadesP^ LH-20-pylvääseen 20 (2,5 x 75 cm) ja puhdistetaan kuten edellä selostettiin.

Saanto haihduttamisen jälkeen tyhjössä; noin 900 mg (100 %) kiteistä tuotetta, homogeeninen ohutlevykromatografiällä (kloroformi/asetoni (9/1)), = 0,70.

c. t-Boc-( ^-bentsyyli)-L-glutamyyli-(/&-bentsyy- 25 li)-L-aspartyyli-(S-p-metoksibentsyyli)-L-kyste- inyyli-(S-bentsyylioksikarbonyyli)-L-lysiinibent-syyliesteri (III) 900 mg:sta suljettua tripeptidi-johdannaista II puretaan sulku TFA:11a kuten edellä selostettiin, liuotetaan 30 3 ml:aan DMF ja tehdään lievästi emäksiseksi TEA:11a. Tähän liuokseen lisätään 504 mg t-Boc-O^-bentsyyli)-L-glutamiini-happo-p-nitrofenyyliesteriä (3 ml:ssa DMF). Noin 2,5 tunnin kuluttua ninhydriini-reaktio on tullut negatiiviseksi ja (S) seos pannaan Sephadex^ LH-20-pylvääseen puhdistamista var- 1 ten kuten edellä selostettiin. Komponenttien erottaminen 14 77875 tästä reaktioseoksesta ja sen tarkkaileminen ohutlevy-kromatografiällä suoritetaan kuten edellä. Sopivat jakeet (tässä tapauksessa 9-15) yhdistetään, haihdutetaan ja kuivataan. Saanto: noin 1140 mg (100 %) vaaleankeller-5 tävää öljyä, homogeeninen onutlevykromatografiällä (kloroformi/asetoni (9/1)), = 0,53.

d. Bentsyylioksikarbonyyli-L-pyriglutamyyli-( Ϋ'-bentsyyli)-L-glutamyyli-(β -bentsyyli)-L-aspart-yyli-(S-p-metoksibentsyyli)-L-kysteinyyli-(£ - 10 bentsyyli-oksikarbonyyli)-L-lysiini-bentsyyli- esteri (IV) 1140 mg:sta tetrapeptidi-johdannaista III puretaan sulku TFA:11a DCM:ssä kuten I:lle kuvattiin ja liuotetaan 3 m):aan DMF. Liuos tehdään lievästi emäksiseksi TEA:11a 15 ja lisätään 423 mg bentsyylioksikarbonyyli-L-pyroglutamii-nihappo-p-nitrofenyyliesteriä liuoksena 3 ml:ssa DMF. Reaktioseoksen emäksisyys tulisi toistuvasti tarkistaa ja jos on tarpeen palauttaa ennalleen lisäämällä TEA. Noin 3 tunnin jälkeen ninhydriini-testi tulee negatiiviseksi 20 ja pentapeptidi-johdannainen IV voidaan puhdistaa kuten edellä selostettiin. Saanto noin 1230 mg (96 %), vaalean-kellertävä öljy, homogeeninen ohutlevykromatografiällä (kloroformi/asetoni (9/11)), R^ = 0,44 (muodostaen häntiä).

e. L-pyroglutamyyli-L-glutamyyli-L-aspartyyli-L- 25 kysteinyyli-L-lysiini 50 mg suojattua pentapeptidi-johdannaista IV liuotetaan 50 ml:aan nestemäistä fluorivetyä 0°C:ssa lisäten 500 mg metioniinia happoa poistavaksi aineeksi ja annetaan seistä yksi tunti. Fluorivety haihdutetaan sitten 30 tyhjössä kuiviin 0°C:ssa ja jäännöstä sekoitetaan etyyliasetaatin kanssa. Etyyliasetaatti-pesuneste dekantoidaan ja hylätään. Jäljelle jäänyt aines liuotetaan laimeaan etik-kahappoon ja lyofiloidaan.

Lyofiloitu aines (2 mg) voidaan puhdistaa käänteis-35 faasi-HPLC: .1 la käyttäen Cl8-py.lvästä .10 mm x 10 cm virtaus- 15 77875 nopeudella 2,8 ml/min käyttäen gradienttieluointia liuoksella A: 0,1 % vesipitoista trifluorietikkahappoa, ja liuoksella 3: 0,1 % trifluorietikkahappoa asetonitrii-lissä; jolloin 0,10 % liuosta B lisätään 30 minuutin ai-5 kana. Detektio suoritetaan käyttäen ultraviolettiab-sorptiota 214 nmrssä tai pyridiinidisulfidi-reagenssia (SH-ryhmiä varten) .

Samaa menetelmää voidaan käyttää edellä mainittujen yhdisteiden (2)-(5) valmistamiseksi. Synteesit on seu-10 raavassa esitetty kaavamaisessa muodossa ja tuotteiden tunnusluvut on annettu taulukossa. Käytetään seuraavia lyhennyksiä:

Boc = t-butoksikarbonyyli

Bz = bentsyyli 15 Z = bentsyylioksikarbonyyli (karbobentsoksi) pMB = p-metoksibentsyyli

Su = N-hydroksisukkinimyyli pNP = p-nitrofenyyli 16

Yhdiste 1 77875 pGlu Glu Asp Cys Lys

SpMB Z

Boc- OSu H— i-OBz

^SpMB Z

Boc— ^ UOBz

OBz ^SpMB Z

Boc — «^-OpNP h- --OBz

• OBz ^SpMB Z

Boc-— 4. —OBz

., OBz OBz .SpMB JL

Boc-^—-OpNP H — ^-^CBz

.· OBz OBZ ✓SpMB ,Z

Boc- — — " ·-—— ......... '—' —OBz

✓OBz .OBz SpMB .Z

Z--OpNB H*-----—OBz

✓ OBz -OBz SpMB -Z

Z--- —OBz H --:---Loh

Yhdiste 2 pGlu Glu Asp Cys Gly Lys I Lz

Boc--OH H - - OB z

>Z

Boc— ————— * OBz

SpMB Z

Boc-^OSu H— ^OBz

SpMB Z

BOC-·^ — - 1 ^OBz

OBz SpMB Z

Boc-^OpNP H ^- — - OBz

jOBz SpMB Z

Boc- —" -r .......... ............ — fcQBz

OBz OBz SpMB Z

Boc-^OpNP H— -—--.......— ^OB /.

OBz OBz SpMB Z

Boc — .................... .......- — t-OBz

.OBz OBz SpMB Z

Z OpNP H- -^-—- ----------—- -OB7.

OBz OBz SpMB Z

z__--^^--Crn-r.

H ---- ' OH

17 )

Yhdiste 3 77875 pGlu Gin Asp Cys Lys f

s SpMB Z

BOC— OSU H--OBz

SpMB Z

Boc — — —OB?.

OBz SpMB Z

Boc—^OpNP H - ^ i^OBz

OBz SpMB Z

Boc — ^-·· ...... << ^OBz

OBz SpMB Z

Boc— — OpNP H- ‘ 03z

OBz SpMB Z

BOC- -............ ^....... — r ^OBZ

OBz SpMB Z

Z--OpNP H·* —............— ^........... ..... ^OBz

- OBz SpMB Z

Z- - ............... ......... ii. ^..... ........ 1^··,.—^OBz

H—li n .1-....1 I ,.-.-.,,..,.1,. . . ...... I. OH

Yhdiste 4 pGlu Glu Asp Cys D-Ala Lys V7 BOC--OH H-^OBz

Boc— ——i ^OB z

SpMB Z

BOC- ^OSu H.............— * OBz

SpMB Z

Boc - f i — OBz

OBz SpMB Z

Boc-^OpNP H— .................... ............— ^OBz OBz SpMB .1

Boc- ^-S ---------— ' - OBz

OBz OBZ SpMB Z

Boc-^ OpNP H-^'...................f ............ m . £ OBz

OBz OBz SpMB Z

Boc- <m x................ ^ ► OBz OBz OBz SpMB 7> Z--OpNP H- .— rfT................................................. ............—OBz

OBZ OBZ SpMB Z

Z--£-ii-- ----, έOB z n· ,1 ..... ......—......-1.-. . ....... ....... .........L— o; i

Yhdiste 5 18

V

77875 pGlu Glu Asp Cys Lys

SpMB Z

Boc— " OSu H- - NH2

SpMB Z

Boc- ......— ^NH2

OBz SpMB Z

Boc — ^pNP H — ’ ..........'^NH2

OBz SpMB Z

Boc Y ....... Y . - Ynh2

OBz OBz SpMB Z

Boc-^OpNP —— ^ ' ' ' »NH2

OBz OBz SpMB Z

Boc - S' - -r — — —NH2

.OBz OBz SpMB Z

Z — OpNP H- -----------S ...............- ^NH2

OBz OBz SpMB Z

Z— ...... ............... ......... Γ*** ........ faNHp H—». .......... JL ...........i. — M i-tflL' 77875 19 m ^ o r-~ oo o o

^ --H M O 00 00 O

• · I · · I · . o

Q) OO *H *H O *H i-H

4J II II

CO U-l U-l r.

^ os k « (Noo <-h o n· σ\ σν m oio o o σ\ oo o · · · · · · l · · co

OO ιΗ H Μ O ,Η rH

(U » Il +> VW Ph

CO oi « CP

3 rq moo o Γ' o oo oo *“I O O 00 (Ti o · 0) · * I · · I · · 00 P o O r—I <—I o o

w II II

3 VW U-l Ph

2 Ä « S

o 00 OrHooocn p- -ho o σ\ o en o O) · l..... vo

U OO »H i—I O O »H rH

w II II

O VW UH Ph

g « « S

Ή l~* O 00 CO ^3* p~ 1-1 (NO o o o o . 2

m · · l · · l m U

n OO rH rH OH M O

07 ' Il II CC

£) Ή Ή Ph O

21 « « S dP

Si

CM

S’ ^ ··

f ST I

h 1 i I s, :s

8 § » f I

§ y ä δ

& ^ -h s «n e »S

S s S % e ^ $ 5 •P C M H -3 ro ij e-HPEcQOoo h -h " ·· :d ·· Q E *3· ε m <#> cno M S Q *] 'ri ,Λ ‘3 rH CO rH rH >, >, r-n K1 N ·· 2 # £ Ώ Jg C < U O U O «U .. 5 E o P J ^ h (Vvn Π oo n O m oo Joooo r-. — ArHCJrH«»*«r£,Hn P £ K O Q &< < CQ <j

Claims (2)

20 77875

1. Menetelmä kaavan (I) mukaisten terapeuttisesti käyttökelpoisten peptidien ja niiden fysiologisesti hyväk- 5 syttävien suolojen valmistamiseksi, HN-CH-CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-CO(NH-R^CO)nNHCH-COX2 0<«fH2>2 | 2 ™2 <Ϊη2) 4 COX1 COOH SH NHp 10 (I) jossa NH-R1-CO on glysiini tai D-alaniini ja kaikki muut 1 7 aminohappotähteet ovat L-muodossa, X ja X , jotka voivat olla samanlaisia tai erilaisia, ovat OH- tai NH2~ 15 ryhmiä ja n on 0 tai 1, tunnettu siitä, että kaavan (II) mukaisesta suojatusta yhdisteestä, r2N—CH-CONH-CH-CONH-CH-CONH-CH-CO (NH-R1-CO) -NH--CH-COR7 Il 1 I I v (ch2)2 ch2 ch2 (ch2)4

20 COR3 COR4 SR5 NHR6 (II) 7 fi jossa R ja R” ovat amiiniryhmien suojaryhmiä tai vetyatomeja, R3, R4 ja R7 ovat N!I2-ryhmiä, suojattuja aminoryh-23 miä tai karboksyylisuojaryhmiä tai ΟΗ-ryhmiä ja R^ on tioliryhmän suojaryhmä, poistetaan suojaryhmät, edullisesti happohydrolyysillä, ja tuote muutetaan haluttaessa fysiologisesti hyväksyttäväksi suolaksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-30 n e t t u siitä, että valmistetaan kaavan (I) mukainen yh- 2 diste, jossa X ja X ovat ΟΗ-ryhmiä ja n on 0 ja joka on L-pyroglutamyyli-L-glutamyyli-L-aspartyyli-L-kysteinyyli-L-lysiini.