DE2315271C3 - L- Norleucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes Mittel - Google Patents
L- Norleucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes MittelInfo
- Publication number
- DE2315271C3 DE2315271C3 DE2315271A DE2315271A DE2315271C3 DE 2315271 C3 DE2315271 C3 DE 2315271C3 DE 2315271 A DE2315271 A DE 2315271A DE 2315271 A DE2315271 A DE 2315271A DE 2315271 C3 DE2315271 C3 DE 2315271C3
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- tert
- fragment
- amino acids
- butyl ester
- benzyloxycarbonyl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/63—Motilins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
3. Mittel mit Motilinwirkung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an L-Norleucin-13-Motilin
nach Anspruch 1 als wirksame Komponente.
Die Erfindung betrifft unter anderem t-Norleucin-13-Motilin, das sich von dem natürlich vorkommenden
Molitin dadurch unterscheidet, daß es als 13. von insgesamt 22 die Polypeptidkette aufbauenden Aminosäuren statt eines L-Methioninrestes der Formel
— NH — CH — CO —
CH,
einen L-Norleucinrest der Formel
— NH — CH — CO —
enthält.
H.
CH,
CH,
CH.
Motilin ist bekanntlich ein die motorische Ak hitäl
sowohl in den Antrum- als auch in den Funaus-Drüsenarealen des Magens stimulierendes Polypeptid, das
aus der Duodenalschleimhaut des Dünndarms von
Schweinen isoliert wurde (verwiesen sei z. B. auf »Can.
J. Physiol. Pharmacol.«, Bd. 49, 1971, S. 399 bis 405, und »Gastroenterology«, Bd. 62, 1V72, S. 401 bis 404),
die Pepsinausschüttung ohne eine Änderung dei H+-Sekretion stimuliert, und sich sowohl chemisch
als auch physiologisch von den inzwischen aufgeklärten gastrointestinalen Hormonen unterscheidet.
Motilin kommt daher sowohl als Therapeutikum als auch als Diagnostikum eine besondere Bedeutung zu.
Wie bei allen Naturstoffen besteht jedoch das Problem,
daß die Isolierung aus beispielsweise tierischen Organen unerhört zeit- und kostenaufwendig ist und nur in
minimalen Ausbeuten gelingt.
Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel und Wege anzugeben, die die Möglichkeit bieten, eine Verbindung mti
Motilinwirkung auch in großem Maßstab synthetisch erstellen und verwenden zu können.
Der Erfindung Hegt die Erkenntnis zugrunde, daC
die angegebene Aufgabe dadurch lösbar ist, daß eine Totalsyiithete des Motilins durchgeführt wird untei
Ersatz des in 13-Stellung befindlichen L-Methioninrestes durch einen L-Norleucinrest, aus der Überlegung heraus, daß nach dem heutigen Stand dei
Peptidsynthese die mittelständige Arginyl-methionyl-
23 Ii 271
Bindung (Aminosäuren 12 ond 13 des Motflins) prakfisch kaum synbar ist, andererseits jedoch das
dem Moöün entsprechende Norleocin-lS-Dokosapeptid auf synheischem Wege leichter zugänglich ist,
eine vergleichsweise rasche Strukturermittlung ge
währleistet and wichtige Aufschhlsse aber die biologlsche Wirkungsspezifität des Methionins zu geben
vermag.
Gegenstand der Erfindung ist L-Norleucm-13-Motflin der Kurzfonnel
H-I%e-Va^-PΓO-Ite-Phe-Tlu·-Tyr^ly-Ghl-Leu-Gm^
O) (2) (3) (4) (5) (6) (7) C8) (9)
worin die in Klammern angegebenen Zahlen die von
bis 22 durchnumerierten Aminosäurereste alte Aminosäuren in !--Konfiguration bezeichnen.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren
zur Herstellung des i^Norleucin-13-Motilins, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
(a) die miteinander verknüpfbaren Teilsequenzen
Fragment I, bestehend aus ArgjnyHhydrobromid)-asparaginyl-Ne-tert-butyloxycarbonyl-lysyl-glycyl-glutamin-terL-butylester (Aminosäuren 18
1,J5 22)
nyl-glutamyHy-tert-butykster)-glutamyl-(y-tert.-
butylesteO-Nc-tert-butyloxycsTbonyl-Iysyl-glut-
aminsäure-γ- tert. -butylester (Aminosäuren 14
bis 17)
bonyl-Ni.Nm-di-benzyloxycarbonyl-arginyl-nor
leucin (Aminosäuren 12 und 13),
nyl-glutamyl-iy-tert-butylesteO-leucyl-glutamin
(AmUiosäuren9 bis 11)
Fragment VI,bestehend ausNa-tert.-Butyloxycarbonyl-phenyUdanyl-valyl-prolyl-isoleucyl-phenyl-
polyfunktionellen Aminosäuren acidolytisch leicht abspaltbare Schutzgruppen auf tert. Alkohol-Basis tragen und die komplexe Funktion des
Arginins teils durch ΝΛ,ω-Diacylierung und teils
durch eine durch Salztildung mit Bromwasserstoff bewirkte Protonierung maskiert ist,
(b) die Fragmente I bis VI mit Hilfe des bekannten N.N'-Dfeyclohexylcarbodiimid-N.Hydroxysuccinimid-Verfahrens oder einer literaturbekannten
Modifikation desselben miteinander verknüpft,
(C) aus dem erhaltenen, allseits maskierten" die Gesamtsequenz der Aminosäuren 1 bis 22 aufweisenden Polypeptid alle Schutzgruppen mit
Hilfe von Trifluoressigsäure abspaltet und danach die gebildeten Trifluoroacetat· und Bromidionen
reinig^
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Mittel mit Motilinwirkung, das gekennzeichnet ist durch einen
Gehalt an L-Norleucin-13-Motilin als wirksame Kornponente.
Durch die Erfindung wird erreicht, daß eine Verbindung zur Verfügung steht, die in hohen Ausbeuten
vollsynthetisch herstellbar ist und nach Reinigung an
Ionenaustauschern eine Aktivität von über 90% des
natürlich vorkommenden Motilins aufweist, was als Indiz dafür anzusehen ist, daß der Sequenzplatz des
Methionins auch von Norleucin eingenommen werden kann. Dieser Befund ist insofern überraschend, als
der Ersatz von Methionin durch Norleucin in natürlich vorkommendem Human-Gastrin I zu einem Synthese-
führt>
das nur etwa 10% Gastrin-Aktivität
ao ,Die Erfindung wird durch die Zeichnung naher
erläutert, in der darstellt
F ι g. 1 das Syntheseschema zur Herstellung des
Fragments I,
Fig. 2 das Syntheseschema zur Herstellung des
a5 Fragmenten,
„ F»* 3 ^f Syntheseschema zur Herstellung des
Fragments VI,
F i g. 4 das Syntheseschema zur Herstellung des
Fragments,III sowie zur Verknüpfung der Fragmente
IV mit (I bis lip, VI mit V, und (I bis I V) mit (V bis VI),
F i g 6diesäulenchrornatographische Elutionskurve
J»n ^m Norleucin-13-Moühn an einem stark
basischen Aruonenaustauscher und
. F ^- 7 diesäulenchromatographische Elutionskurve
J* Fraktion B1 der F, g. 6 an einem stark sauren
Kationenaustauscher.
,pe folgenden Beispiele sollendie Erfindung näher
ff utern. In den Figuren und Beispielen werfen die
folgenden m der Peptidchemie üblichen Abkürzungen
und Symbole verwendet:
. Arninosaureabkurzungen, gebUdet aus 3 Buchstaben,
^1^11 ej ?lch in dcr Reßel um die 3 AnfangAuchhandelt. Qt(,„„„„ inn„P
Zahlenangaben in Klammern, die die SteUung inner-
^b der. Polypeptidkette wiedergegeben und die
k,ein,f.n weiteren Zusatz erhalten, wenn die betreffende
Verbindung nich t.n Form eines weiteren Der,vatsnoch
male auftntt, d« jedoc*forttouf«id mit dem Zuwte^
h'.c A usw: versehen werden wenn von a ausgegangen
w.rd und we.terc Denvate hergestellt werden,
BOC für den tert.-Butyloxycarbonylrest (verwiesen
sei z. B. auf M c K a y et al in »J. Am. Chem. Soc.«, Bd. 79,1957, S. 4686 ff., und A η d e rs ο η et al in »J. Am. Chem. Soc«, Bd. 79,
1957, S. 6180 ff.),
(verwiesen sei z. B. auf S h e e h a η et al in
»J. Am. Chem. Soc.«, Bd. 77,1955, S. 1067 ff.),
SU | für den N-Hydroxysuccinimidrest, | Beispiel 1 |
NP | für den p-Nitrophenylrest, | |
tBu | für den tert.Butylrest, | |
DBSI | für Dibenzolsulfimid als Salzbildner, | |
Me | für den Methylrest, | |
TFE | für Trifluoroessigsäure, | |
i.V. | für »im Vakuum«, | |
F. | für »Fließpunkt« und | |
(Z) | nach der Fließpunktsangabe für »unter Zer | |
setzung«. | ||
HOSU succinimid-Verfahren (verwiesen sei z. B. auf Methanol/Diäthyläther resullbrten Kristalle von
W ü η se h et al in »Berichte d. Deutschen F. = 135 bis 1360C; [«]? = + 10,78° (c -- 1,0; in
Chem. Ges.«, Bd. 99, 1966, S. 110 ff., und Methanol). Ausbeute = 146 g (97% der Theorie).
W e y g a η d et al in »Zeitschr. f. Natur- „ _. ,.,,,,
forschg.« Bd. 216, 1966, S. 426 ff., sowie 5 B. Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-glutamin-
König et al in »Berichte d. Deutschen tert.-butylester
Chem. Ges.«, Bd. 103,1970, S. 788 ff.), 115 g L-Glutamin-tert.-butylester-dibenzolsulfimid-
DCCD/ für das Dicyclohexylcarbodiimid-Hydroxy- salz, suspendiert in 800 ml Dichiormethan, wurden mit
HOBt benzotriazol-Verfahren (verwiesen sei z.B. 32,3 ml Triäthylamin und danach mit 70,5 g Benzyl-
auf K ö η i g et al in »Ber. d. Dtsch. Chem. io oiycarbonyl-glycin-N-hydroxysuccinimidester unter
Ges.«, Bd. 103, 1970, S. 788 ff.), Rühren versetzt. 24 Std. Rühren bei Raumtemperatur,
PAM für die Phosphorazo-Methode (verwiesen sei Einengen i.V., Aufnehmen des Öls in Essigester,
z.B. auf Goldschmidt in »Angew. Chem.«, Waschen dieser Lösung wie üblich mit Zitronensäure-,
Bd. 62,1950, S. 538 ff., und Goldschmidt Kaliumhydrogencarbonatlösung und Wassir, Trock-
et al in »Liebigs Ann.«, Bd. 580,1953, S. 68 ff.), 15 nen über Natriumsulfat und Eindampfen i.V. führte
zu einem öl. Ausbeute = 87 g (93% der Theorie).
C. Glycyl-L-ghitamintert.-butyles'er-dibenzolsulfimidsalz
20 80 g Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester
(gemäß B) in 9COmI MeinenM wurden wis
unter A beschrieben hydrogenolytisch entacyliert (60 g Dibenzolsulfimid) und aufgearbeitet. Es resultierte
ein öliger Rückstand, der beim Verreiben mit
25 Petrolätherkristallisierte;F.= 920C(Z);[«]?= -8,5°
(c = 1,0; in Methanol). Ausbeute = HOg (98% der Theorie).
Herstellung des Fragments I (Teilsequenz 18 bis 22) d. Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl
H-GIn-OtBu (22b), aus Z-GIn-OH (22a) durch Ver- 30 Νε-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin
esterung mit Essigsäure-tert.-butylester unter Schwefel- 51 g Νε-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin wurden in
säure-Katalyse und nachfolgender hydrogenolytischer üblicher bekannter Weise in das Benzyltriäthylammo-Entfernung
der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe zu- niumsalz übergeführt und danach in 700 ml Dimethylgänglich,
wurde mit Z-GIy-OSU (21) zum Benzyloxy- formamid mit 81 g BenzyloxycarbonyJ-L-asparagincarbonyl-Dipeptidester
(21-22a) verknüpft; der nach 35 4-nitrophenylester unter Zugabe von 1 Aquiv. Pyridin
hydrogenolytischer Entfernung der N-Schutzgruppe 48 Std. lang bei 20° C gerührt. Der Vakuumverdamperhaltene
H-GIy-GIn-OtBu (21-22b) wurde mit Z-Asn- fungsrückstand wurde mit Essigester und Kalium-Lys(BOC)-OH
(19-20) nach dem angegebenen, von hydrogensulfatlösung gleichzeitig behandelt; der ge-Wünsch
und Weygand in der genannten bildete dicke Niederschlag wurde abfiltriert und dann
Literaturstelle beschriebenen Carbodiimid-N-Hydroxy- 40 aus Äthanol/Petroläther umkristallisiert F. = 174
succinimid-Verfahren oder nach dessen von Geiger bis 175°C (Z); [«]? = + 13,8° (c = 1,0; in Pyridin).
in der angegebenen Literaturstelle beschriebenen Ausbeute = 70 g (71 % der Theorie).
Modifikation zum Benzyloxycarbonyltetrapeptid-tert- „n . , . - ■ v, » _ . ^ ,
butylester (19-22a) verknüpft. Die Kopfkomponente E· Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-Ne-tert.-butyl-(19-20)
konnte durch Aminoacylierung von H-Lys- 45 oxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert-butylester
(BOC)-OH (20) mit Z-Asn-ONP (19) unter üblichen 61,5 g Glycyl-L-glutamin-tert.-butylester-dibenzol-
Bedingungen gewonnen werden. sulfimidsalz und 54,5 g Benzyloxycarbonyl-L-aspara-
Entfernung der Benzyloxy-carbonyl-Schutzgruppe ginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin in 700 ml Diaus
Z-Asn-Lys(BOC)-GIy-GIn-OtBu (19-22a) mittels methylformaroid wurden unter Rühren bei 0°C zukatalytisch
erregtem Wasserstoff führte zum Tetra- 50 nächst mit 15,5 ml Triäthylamin und nach 15 Min. mit
peptid-Ester-Derivat (19-22 b), das mit Z-Arg(r5,cü-Z2)- 13 g N-Hydroxysuccinimid sowie 23 g N,N'-Dicyclo-ONP
(18) zum Z-A^(O5O)-Zj)-ASn-LyS(BOC)-GIy-GIn- hexylcarbodiimid versetzt. Nach 3 Std. wurde weitere
OtBu (18-22a) vereinigt wurde. 24 Std. bei Raumtemperatur nachgerührt. Das Filtrat
Die experimentelle Durchführung war wie folgt: vom Ν,Ν'-Dicyclohexylharnstoff wurde i.V. einge-
^, . 55 dampft; der Rückstand kristallisieit beim Behandeln
ν ^'^L*?'™ -a 1 mi* Essigester. Umfaistaffisieit vrwäe aus Meffianol/
terL-butylester^ibenzoisulfirnKbak Wasser und Isopropanol/Bssigester. P. = 155 bis
103 g B inzyloxycaftönyl-glutaajin-teit.-butylester, 156°C; Ia]W = —20,8° {c = 1,0; in ÄÖanol). Auserhalen
nachdem von Schnabel et al in »Liebigs beute = 63 g (78% der Theorie).
Ann.«, Bd. 68$, 1965, S. 229«^ beschriebenen Ver- 60 Am!ira^„rf M tert ω_ ,_ . , lxma
ί toe 1 io 21 Methaeoi wnrdea nnter Zetropfen von F· L-Aφaragmyi-Nε-teΓL-lϊII^ylox3r«^onyi-I--IysyI-91
% iDibenZölsuffiffiM to 500 ml Methanol bei pH = 3,5 ^y^^^uianuB-teit.^i^ester-liydiocfllorKi
in üblicher bekannte? Weise katalytisch (Palladium- 47,5 g Benz^oxycarbonyl-L-aspar^flyl-Nc-tert.-
schw jrz) hydriert. butyloxycaibonyl-i.^ysvl^ycyl-i.ighitasm-tert.-iiutyl-
Das Filtrat wurde i. V. eingedampft, zum Schlau 65 ester (gemäß E) in 800 ml Methanol wurden unter
unter azeotroper Destillation mit Benzol; ans der pH-Stat-Bedingungen wie üblich iiydriert (pH = 5^5;
Essigesteriöstmg des öligen Röckstandes trat beim 25,2 mi 2^ Q-Chiorwasserstofflcisuag M Methanol).
"Versetzen mit Diäthyläther Kristallisation ein. Aas Des i. V. eingedampfte FStrat ergdj em Öl; farbloses
ZD 10 έ / 1
7 8
[«]» = + 9,5° (c = l.Oin Methanol). Ausbeute = 40 g lieh Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-OH
(97 % der Theorie). (14-17a) erhalten.
^ „,.„.—., . . ι -ι Die experimentelle Durchführung erfolgte in ana-
31,9 g L-Asparaginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl- [<x]f = -9,8 ± 1° bzw. [<x]g, = -12,3° (c = 1 in
(gemäß F) und 33,68 g Να,Νί,Νω-Tris-benzyloxy- io hexan/Chloroform/Eisessig 45: 45:10.
carbonyl-L-arginin-N-hydroxysuccinimidester in 11 Di- Analyse·
methylformamid wurden bei 00C mit 7 ml Triäthyl- Berechnet ... C 59,02, H 7,86, N 7,48;
amin versetzt; nach 24stündigem Rühren bei Raum- gefunden C 58 70 H 8 04 N 7 72
temperatur, Eindampfen i.V., Umfallen des Rück- e ' ' '
sieren aus Methanol resultierte ein farbloses Pulver; u .. „ .. ,, ,.,.
[*]f = -7,6° (c = 1,0; in Eisessig). Ausbeute = 46,5 g Herstellung des Fragments III (Teilsequenz 12 und 13)
(80% der Theorie). Die Herstellung des Fragments III, nämlich Z-Arg-
„ . . „. . . .. · 1 χι . . («S.o-Z^-Nle-OH (12-13), konnte in 86 %iger Ausbeute
butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutomm-tert.-butyl- Ζ-ΑτΒ(δ,ω.Ζ^·ΟΙ U (12) bewerkstelligt werden.
ester-hydrobromid-dihydrat Die experimenteUe Durchführung erfolgte in analo-
45,5 g Na.No.Nej-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl- ger Weise wie in Beispiel 1 beschrieben.
thylformamid/Methanol (2:1) wurden unter pH-Stat- rein in n-Heptan/tert.-Butanol/Eisessig 5:1:1 und
stoffsäure) Eindampfen des Filtrate i. V und Umfallen Berechnet ... C 62,69, H 6,28, N 10,15;
des Ruckstandes aus AthanoVDiathylather führte zu 30 funden c ^45 H 6 2g N 10 16
einem amorphen Pulver: [α]? = —4,8 (c = 1,0; in
80%iger Essigsäure). Ausbeute = 37 g (98 % der B e i s ρ i e 1 4
±1° bzw. [*]£6=-9,4° (c = l in Essigsäure); Bd. 104, 1971, S. 2430 ff., beschriebenen Verfahren
chromatographisch rein in n-ButanoI/Eisessig/Wasser synthetisierte Dipeptid H-Leu-Gln-OH wurde als
3:1:1 und n-Heptan/tert.-Butanol/Eisessig 5:1:1. Sequenzteilstück (10-11) verwendet. Aufknüpfung von
gefunden ... C 57,70, H 6,56, N 13,29, O 22,45. Z-G u(OtBu)-Leu-Gln-OH (9-11).
6 Die experimentelle Durchfuhrung erfolgte in analo-
carbonyl-Maskierungen durch katalytische Hydro- F. = 146 bis 148°C; [*]? = -31,6 ± 1° bzw.
genolyse unter Zusatz von zwei Äquivalenten Brom- 45 HS6 = —38,1° (c = 1 in Methanol); chromato-
wasserstoff wurde die gewünschte Fraktion I, nämlich graphisch rein inn-Heptan/tert.-Butanol/Eisessig5:1:1
(18-22b), erhalten. Analyse-
M& = -6,05 (c = 1 in 80%iger Essigsaure); 50 gefunden ... C 58,05, H 7,24, N 9,48.
chromatographisch rein in n-Butanol/Eisessig/Was-
ser 3:1:1 und tert.-Amylalkohol/Pyridin/Wasser Beispiel 5
35: 35: 30. Herstellung des Fragments V (Teilsequenz 6 bis 8)
ifi7?- S5 Das nach dem in »Zeitedir. f. PhysM, Oie».«,
... C 40,46, H 6^3, N 15,89, Br 16,51. syHtiietisiErte uipep^ H-Ty^i^Gfy^ti
Bök (78) d Vk
v _ ,...,_ H-Tyi<t»iH^-OH (7-β) ttat Z-Tbr(tBn)OSU (6)
Z-Lys(BOCVOSU (16) nnd H-GIa(OtBu)-OMe (17) durch katalytische EatbenzytexycarfeonyheroBii das
Seßen sich säS got zum Benzyloxy- ä^RÄVSBdltT^^Kre^l
^^^ 7) s lklih
g yy
doj^^pepes a«-17a) veraasen; alkalische GIy-OH (6-*b| &&&.
Ew und aitschüeSende fca*aJytische Ent- Dk experimentelle fhfülaag erfolgte in amacyBeraag fShrte aber das Dtpeptid-Derivat (16-17b) 65 loger Weise me in Beispiel I besetefebem.
m H4.ys(BOC)-GIu(OlBuK>H 0€-l?c). In zwei- Ausbeute: etwa 81 % über beide Stafen, feezogen
öialigeffl «u Anbauverrahren am Hufe von auf eingesetztes Dipeptid (7-8); F. = 126 bis 127"C:
Methanol); chromatographisch rein in tert.-Amyl- matographisch rein in n-Butanol/Eisessig/Wasser
alkohol/Pyridin/Wasser 35: 35 : 30. 3:1:1 und n-Heptan/tert.-Butanol/Eisessig 3:2:1
gefunden ... C 60,69, H 8,31, N 8,91, 5 020,92, Br 3,48;
ßbezogen auf ein Dipeptid mit Vi Mol Kristall-Essig- gefunden ... C 45,24, H 7,27, N 12,62,
ester. 0 20,97, Br 3,20.
ίο auf das Undecapeptid-Derivat (12-22a) führte zur EntHerstellung des Fragments VI (Teilsequenz 1 bis 5) fernung der drei Benzyloxycarbonyl-Schutzgrur pen;
nach Neutralisation der frei gewordenen Guanido-
Nach dem angegebenen Carbodiimid-Verfahren Funktion mit Bromwasserstoffsäure (während der
wurde Z-IIe-OH (4) mit H-Phe-OtBu (5) verknüpft. Hydrierung vorgenommen) wurde H-Arg(HBr)-Nle-Durch anschließende katalytische Entacylierung des 15 GIu(OtBu) - GIu(OtBu) - Lys(BOC) - GIu(OtBu) - Argintermediären Benzyloxycarbonyl-Dipeptid-Esters (HBr)-Asn-Lys(BOC)-Gly-Gln-OtBu(12-22b) in Form
(4-5 a) konnte H-Ile-Phe-OtBu (4-5 b) in über 90%iger des Hydrobromids gewonnen.
Ausbeute isoliert werden. Auf kondensation des Fragments IV (9-11) ai f den
Gleichzeitig wurde BOC-VaI-OH (2a) und Η-Pro- Undecapeptid-tert.-butylester (12-22b) verließ räch
OMe (3a) nach der angegebenen Phosphorazo-Me- ao dem angegebenen Dicyclohexylcarbodi.mid-N-Hythode zum tert.-Butyloxycarbonyl-Dipeptid -Ester droxybenzotriazol-Verfahren erfolgreich.
(2-3a) vereinigt; nachfolgende alkalische Esterver- Aus dem Verknüpfungsprodukt, dem Tetra-deca-
seifung ergab in über 70%iger Ausbeute BOC-VaI- peptid-Derivat (9-22a) konnte nach hyirogenolytischer
Pro-OH (2-3b). Einfacher und in hoher Ausbeute Abspaltung der Benzyloxycarbonvl-Schutzgnirpe
(83%) verlief die Herstellung von 2-3 b) durch Um- »5 H-Glu(OtBu)-Leu-Gln-Arg(HBr)-Ne-Glii(otBu) Gusetzung von BOC-VaI-OSU (2b) mit zwei Äquivalenten (OtBu) - Lys(BOC) - GIu(OtBu) - Arg(Hbr) - Asn - Lys-Prolin (3 b). (BOC)-GIy-GIn-OtBu (9-22 b), wiederum in Form des
Beide Dipeptid-Derivate ließen sich mit Hilfe der Hydrobromids und als Tetrahydrat, rein isoliert
angLgebenen Carbodiimid-Methode zum BOC-VaI- werden.
Pro-Ile-Phe-OtBu (2-5a) verknüpfen; Trifluoressig- 30 Ausbeute über beide Stufen 77%; [*]? = -6,3 ±1°
säure-Einwirkung auf (2-5a) führte zum freien Tetra- bzw. [«]& — —8,3° (c — 0,7 in Methanol); chromapeptid H-Val-Pro-Ile-Phe-OH (2-5b), an das in tographisch rein in n-Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1.
üblicher bekannter Weise BOC-Phe-OSU (1) zum Analyse
angebaut wurde. 35 gcfunden ... C47.81, H 7,28, N 13,69.
Die experimentelle Durchführung erfolgte in analoger Weise wie in Beipiel 1 beschrieben. Aminosäure-Analyse: Lys 1,99 Arg 1,98 Asp 1,03
Ausbeute 63% über die letzten drei Stufen, bezo- GIu 6,30 GIy 0,98 Leu 0,97 Nie 1,01.
gen auf (4-5b); F. = 218°C; [a]f = 64,2 ± 1° bzw. Während des Ablaufs vorstehend beschriebener
WTn — —75,82° (c=l in Essigsäure); chromato- 40 Teilstück-Kondensationen wurden die Fragmente V
graphisch rein in n-Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1 (6-8 a) und VI (1-5 a), nach dessen Überführung in den
und tert.-Amylalkohol/Pyridin/Wasser 35: 35: 30. (N-Hydroxysuccinimid)-ester (l-5b) vereinigt; es ge
.»f»nH»n r&ATi η 7 7« NOS1 4S zu gewinnen. Auf Grund der Aminosaureanalyse-Werte
gerunaen ... L. w,u, η /,/υ, in v,oi. waf daj, Octapeptid-Derivat mit etwa 10% (1-5a oder
. Gemisches verliefen ohne Erfolg. Das erhaltene »rohe«
(Gesamtsequenz 1 bis 22) 5<J mit dem Xetradecapeptid-Derivat (9-22 b) aus den
wurde mit Hilfe des angegebenen Dicyclohexyl- Dicyclohexylcarbodiimid - N - Hydroxysuccinimid-
carbodiimid-N-Hydioxysuccinimid-Verfahrens das Verfahren zum BOC-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr(tBu)-
der erhaltene N-Benzyloxycarbonyl-noiiapeptki-tert.- 55 (OtBu)-GIu(OtBu)-LyS(BOQ-GIa(OtBB)-Arg(HBr)-
featyfesier (14-2ZaJBeB ach dmcfc tartaiyliselie Hydro- Asn-Lys(BOC)-Giy-Gta-OtBn (l-22a) veAnfi]prt;
genolyse uiei in H-GIu(OtBo)-GIn(OtBu)- nach Abspakimg aller Schutzgrappea mittels wasser-
otentsni auf vorstehendes Nonapepödester-Derivat 60 austauschchromatographie an ämm unter der Be-
(14-22b) gelang wiederaja nrit Hflfe des genanntenVer- zeichnung »Dowex 44* bekannten scfewaeJi basischen,
fafirens eswandirei unter Bildung von Z-AIg(O^u-Z1)- das Kondensatisasprodokt ans EpicMoifcydrin mit
(HBr)-AOTiV^BOC)-GIy-GIn-OtBD(Il-ZZa), das in tertiären aliphatischen Aminogruppen {Acetat-Form)
der erwünschten Remheit isoriert werden kOTnte. «5 wurde era »Roh-Norleadn-13-Moffim (l-22b) er-
auf das t Fisgment I; %φ = —4,9 ±1° Teästück (1-8) ηώ einer »Fehl-Seqaenz« benaftet sein
|a]»i — —6$° (c = 0,7 in MethanoO; chro- mußte.
11 12
Die experimentelle Durchführung der Fragment- Es resultierte L-Arginyl-(hydrobromid)-L-norIeucyl-
kondensation war wie folgt: L - glutamy 1 - (y - tert. - butylester) - l - glutamyl - (y - tert-
. „ . ¥ .... butylestert-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glut-
A. Kondensation I mit II amJ,. (y _'tert . butylest/r). L'_ arginyl - (hydrobromid)-
9,2 g Fragment I (gemäß Beispiel 1 H), 9,36 g Ben- 5 L-asparaginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-
ryloxycarbonyl-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-L)glut- glutamin-tert.-butylester-hydrobromid in Form eines
amyl - (y - tert. - butylester) - Νε- tert. - buty loxycarbonyl- Pulvers.
L-lysyl-L-glutaminsäure-y-tert.-butylester (Fragment11) [<x\f = —21,7° (c = 1,0; in Methanol),
und 1,4 ml Triäthylamin in 200 ml Dimethylformamid Ausbeute = 3,0 g (95 % der Theorie),
wurden bei 00C mit 2,3 g N-Hydroxysuccinimid und io , .
anschließend mit 3,1 g NJN'-Dicyclohexylcarbodiimid C Kondensate (I-Il-III) mit IV
versetzt; die Reaktionsmischung wurde 24 Std. lang 2,7 g Undecapeptid - tert. - butylester - hydrobromid
bei 50C und 4 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt (gemäß B), 1,5 g Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-
und das Filtrat i. V. eingedampft. Der Rückstand (y-tert.-butylester)-L-leucyl-L-glutamin (Fragment IV)
wurde mehrmals mit Wasser digeriert und schließlich 15 und 0,405 g 1-Hadroxybenzotriazol in 200 ml Di-
zweimal aus Methanol/Essigester umgefällt. methylformamid wurden bei 0°C mit 0,182 ml Tri-
Es resultierte Benzyloxycarbonyl-L-giutamyl-(y-tert.- äthylamin und anschließend mit 0,577 g N,N'-Dicyclo-
butylester)-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-Ne-tert.- hexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionsmischung
butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl-(y-tert.-butyl- wurde 24 Std. lang zwischen 0 und +50C und an-
ester)-L-arginyl-(hydrobromid)-L-asparaginyl-Ni-tert.- so schließend weitere 5 Tage lang bei 250C gerührt. Der
butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-glutamin-tert.-butyl- Vakuumverdampfungsrückstand wurde zweimal aus
ester in Form eines amorphen Pulvers. Methanol/Essigester umgefällt, nach Trocknen i. V.
[a]f = —14,6° (c = 1,0; in Dimethylformamid). mit Wasser digeriert und anschließend nochmals aus
Ausbeute = 14,8 g (84% der Theorie). Methanol/Diäthyläther umgefällt. Es resultierte Ben-
12,3 g der erhaltenen Verbindung in 800 ml Metha- 25 zyloxycarbonyl-L-glutamyl-iy-tert.-butylesterJ-L-leu-
nol wurden unter pH-Stat-Bedingungen in üblicher cyl-L-glutaminyl-L-arginyl-ihydrobromidJ-Lnorleu-
bekannter Weise katalytisch hydriert (pH = 5,5; 7 ml cyl-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-glutamyl-(y-tert.-
1 n-Bromwasserstoffsäure). Das Filtrat wurde i.V. butylesterJ-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glut-
eingedampft, der Rückstand aus Äthanol/Essigester amyl - (y - tert. - butylester) - l - arginyl - (hydrobromid)-
zweimal umgefällt. 3° L-asparaginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysylglycyl-
Es resultierte L-Glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-glut- L-glutamin-tert.-butylester-dihydrat in Form eines
amyl - (y - tert. - butylester) - Ne - tert. - butyloxycarbonyl- amorphen Pulvers.
L-lysyl-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-arginyl-(hy- [λ]% — —4,3° (c = 0,7; in Methanol).
drobromidJ-L-asparaginyl-Nc-tert.-butyloxycarbonyl- Ausbeute = 2,7 g (82 °0 der Theorie).
L-lysyl-glycyl-glutamin-tert-butylester-hydrobromid 35 2,0 g des erhaltenen Tetradecapeptid-Derivats in
als das gewünschte Kondensationsprodukt. 800 ml Methanol wurden unter pH-Stat-Bedingungen
fixlf = —21,5" (c = 1,0; in Methanol). in üblicher bekannter Weise katalytisch hydriert
Ausbeute = 11,4 g (96% der Theorie). (pH ~ 4,5; 8 ml 0,1 n-Bromwasserstoffsäure). Das
. . eingedampfte Filtrat hinterließ einen Rückstand, der
B. Kondensation (l-II) mit III <ο aus Methano]/Essjgester umgefällt wurde.
3.4 p Nonapepti i-tert.-butylester (gemäß A) und Es resultierte L-Glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-leu-2,S
g N ι,Να,Νω-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl- cyl-i--glutaminyl-L-arginyl-(hydrobromid)-i.-norleucyl-L-norleuun
(Fragment III) in 200 ml Dimethylform- L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-i-glutamyl-(y-tert.-buamid
und 0,70 g N-Hydroxysuccinimid wurden bei tylesterJ-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl-—
10°C rr it 0,28 πΑ Triäthylamin und danach mit « (y-tert.-butylester)-L-arginyl-(hydrobromid)-L-aspara-0
825 η Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die ginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glut-Mi.chung
wurde 24 Std. lang bei +4°C und 24 Std. amin-tert.-butylester-hydrobromid-tetrahydratinForrn
lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Ent- eines amorphen Pulvers.
ferne η des Dimethylformamids i. V. wurde der Rück- [a]f = —6,3° (c = 0,7; in Methanol),
stand aus Methanol/Essigester umgefällt, dann mit 50 Ausbeute = 1,92 g (94°·„ der Theorie).
Wasser digeriert und nochmals aus Methanol/Essig- ^ ¥, . . ,, ....
ester umgefällt. D· Kondensate V mit Vl
Es resultierte ΝΛ,ΝΑ,Νω-Tris-benzyloxycarbonyl- 21.6 g Fragment VI und 6,9 g N-Hydroxysuccinimid
L-arginyl-L-norleucyl-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)- in 400 ml Dimethylformamid wurden bei — 5°C mit
L-giutamyl-^tert.-tratylesterH^e-tert.-butyloxycarbo- 55 6,3 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt, die Reak-
ayl-L-iysyl-L-glulaniyl-iy-terL-butylesterJ-L-arginyl- tionsmischung wurde 2 Std. lang bei O°C und über
^ydrobromidl-L-asparaginyl-Ne-tejt.-butyloxycarbo- Nacht bei Raumtemperatur gerührt Das Filtrat wurde
ayl-L-lysyl-glycyl-glotenrin-terL-butylester in Form L V. eingedampft; der ölige Rückstand kristallisierte
eines amorphen Pulvers. aus Isopropanol.
|«]f = —4,9° (c = 0,7; in Methanol). 60 Es resultierte terL-Butyloxycarboayl-L-iAenyfafanyl-
Ausbeete = 3,9 g (85 % der Theorie). L-valyl-L-proiyl-L-isoleacyl-L^heaylalanhi-N-fcydFBXy·
3.5 g des erhaltenen Undecapeptid-Derivats in succinimidester.
8Θ0ιη1 Methane! wutden imter ptt^Stat-Bedinguagen F. = 190 bis 192°C; {*]? = +593° {c = 1,0; ii
in äMkher bekannter Weise katalytisch hydriert Dioxan). Aosbeate = 21,3 g (88% der Theorie).
(pH ~ 4,3; 31 ml 0,1 n-Bromwasserstofflösung in 65 12,2 g Fragment V und 3,8 mi Triätfeyiamin ii
Mtibasoil, Der Rückstand aus dem i. V. einge- 400 ml Dimethylformamid wurden mit 14,8 g de:
dampften Filtrat winde ans Methanol/Essigester um- angegebenen tert - Butyloxycarbonylpentapeptid
gefällt N-hydroxysuccinimidesters versetet; die Reafcöons
1684
mischung wurde nach 24stündigem Rühren bei Raumtemperatur L V. eingedampft und der ölige Rückstand
zwischen Essigester und ZiUonensäurelösung verteilt. Die Essigesterphase wurde wie üblich gewaschen, getrocknet
und i. V. van· Trockne gebracht Aus Essigester/Petroläther
wurden farblose Kristallenen erhalten, bestehend aus tert-Butyloxycarbonyl-i-phenylalanyl
- L - valyl - L - prolyl - L - isoleucyl - L - phenylalanyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-0-tert.-butyl-L-tryosyl-gIycin.
{«]? = -44,0° (c = 1,0; in Äthanol).
Ausbeute = 18,2 g (87% der Theorie).
E. Kondensation (I-II-III-IV) mit (V-VI)
1,3 g Tetradecapeptid-tert-butylester-hydrobromid (gemäß C) und 1,17 g tert-Butyloxycarbonyl-oktapeptid
(gemäß D) 0,07 ml Triäthylamin und 0,175 g N-Hydroxysuccinimid
(bzw. in weiteren Versuchen 0,20 g Hydroxybenzotriazol) in 100 ml Dimethylformamid
wurden bei -100C mit 0,257 g N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid
versetzt. Die Mischung wurde 2 Tage lang bei 00C und 3 Tage lang bei Raumtemperatur
gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels i. V. wurde der Rückstand sorgfältig mit heißem Essigester
digeriert, das harzartige Produkt aus Methanol/Essigester umgefällt, nach Verreiben mit Essigester getrocknet
und danach 5 Std. lang erschöpfend mit Wasser behandelt.
Nach Umfallen aus Methanol/Wasser resultierte ein amorphes Pulver (1,1 g), bestehend aus tert-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-prolyl-L-isoIeucyl-L-phenylalanyl-0-tert.-butyJ-L-threonyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-glycyl-L-glutamyl-iy-tert.-butylesterJ-L-Ieucyl-L-gJutaminyl-L-arginyHhydrobromidJ-L-norleucyl-L-glutamyl-(y-tert.-butyIester)-L-glutamyl-(y-tert.-butylesterJ-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-arginyl-(hydrobromid)-L-asparagmyl-Nc-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester.
0,2 g des erhaltenen geschützten Produktes wurden mit 20 ml eiskalter Trifluoressigsäure Übergossen und
2 Std. lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurde überschüssige Trifluoressigsäure i. V. bei
möglichst tiefer Temperatur entfernt, das verbleibende Material in verdünnter Essigsäure aufgenommen, die
erhaltene Lösung zweimal mit 4 g eines schwach basischen Anionenaustauschers in der OH-Form behandelt,
worauf das Austauscher-Eluat lyophilisiert wurde.
Ausbeute = 157 mg.
Beispiel 8
Reindarstellung des synthetischen Produktes
Reindarstellung des synthetischen Produktes
A) In Anlehnung an die mit bestem Erfolg durchgeführte Reinigung von natürlichem Motilin wurde
eine Ionenaustausch-Chromatographie von 25 mg des erhaltenen Roh-Norleucin-13-Motilins an einem in
der Acetatform vorliegenden, unter der Bezeichnung »QAE-Sephadex A-25« bekannten stark basischen
Anionenaustauscherharz auf der Basis eines modifizierten Dextrans mit Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthylresten
als funktionellen Gruppen durchgeführt.
Die experimentellen Bedingungen waren wie folgt:
Säule: 30 y 0,9 cm; 25 mg Rohprodukt gelöst in
2 ml 0,5%igem Ammoniak;
Elutionsmittcl: 0,025 m-Ammoniumacetat-Lösung
(mit verd. Ammoniak auf pH 9,27 eingestellt);
Durchflußgeschwindigkeit: 18ml/Std.; ö-xal-Fraktionen.
Es erfolgte eine Auftrennung in zwei Hauptfraktionen,
wie F i g. 6 zeigt
Die Fraktion B* (etwa 4 mg) erwies sich als die erwartete
Fehlsequenz (1-5/9-22), die Fraktion B1 (etwa
12 mg) als das gesuchte Norieudn-13-Motilki. Das
durch Gefriertrocknung in fester Form erhaltene Dokosapeptid zeigte sich chromatographisch einheitlich
im System n-ButanoI/Eisessig/Wasser/Pyridin
30: 6:24:20 und n-Butanol/Eisessig/Wasser/Pyridiri
30:12:24:20, sowohl nach dem Verfahren der Papier-
als auch der Dünnschichtchromatographie.
Eine Aminosäureanalyse der Fraktionen B1 und B,
wurde nach saurer Hydrolyse (6n-HCL 20 St i.) durchgeführt,
wobei sich zeigte, daß bei 72 htd. Hydrolysezeit
praktisch dieselben Werte erzielt wurd;n. Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.
Tabe3e I
Fraktion | B, | B1 | Her. Verh. füi | |
1,98 | 2,04 | (N.eIl)-Motilin | ||
a5 Lys | 1,98 | 1,99 | 2 | |
Arg | 1,00 | 2 | ||
Asp | 1,00 | — | 1 | |
Thr | 6,08 | 6,00 | 1 | |
GIu | 0,97 | 0,91 | 6 | |
30 Pro | 1,99 | 1,06 | 1 | |
GIy | 0,94 | 0,88 | 2 | |
VaI | 0,95 | 0,86 | 1 | |
He | 1,00 | 0,99 | 1 | |
Leu | 1,01 | 1,00 | 1 | |
35 Nie | 0,91 | 1 | ||
Tyr | 1,82 | 1,73 | 1 | |
Phe | 2 | |||
Orientierende Versuche ergaben eine biologische Aktivität der gefriergetrockneten Fraktionen B1 von
mindestens 50%.
Enzymatische Abbau-Versuche erbrachten eine weitgehende Bestätigung der vorgeschlagenen Primärstruktur.
B) Die unter (A) angegebene Verfahrensweise wurde wiederholt unter Verwendung folgender experimenteller
Bedingungen:
Säule 80 χ 1,5 cm;
Säule 80 χ 1,5 cm;
235 mg Rohprodukt, gelöst in 15 ml 0,5%igem Ammoniak
wurden auf die mit 0,025 m-Ammoniumacetatlösung (mit verd. Ammoniak auf pH 9,20 eingestellt)
äquilibrierte Säule aufgegeben.
Elutionsmittel: 0,025 m-Ammonium-acetat-Lösung (pH 9,20).
Durchfließgeschwindigkeit: 47ml/Std.;
Durchfließgeschwindigkeit: 47ml/Std.;
23,5-ml-Fraktionen gesammelt, Peptidverteilung bestimmt
durch Messung der Extinktion bei 220 mn. Es erfolgte eine Auftrennung in die Fraktionen B1
(135 mg) und B2 (44 mg), Gewichtsangaben, bezogen auf lyophilisierte Fraktionen.
C) Zur weiteren Reinigung wurden 135 mg der Fraktion B1 an einem in der Ammoniumform vorliegenden,
unter der Bezeichnung »SP-Sephadex C-25« bekannten stark sauren Kationenaustauscherharz auf
Jer Basis eines modifizierten Dextrans mit Sulfopropylresten
als funktionellen Gruppen säulenchromatographisch behandelt. Die experimentellen Bedingungen
waren wie folgt:
Säule: 80 χ 1,5 cm;
135 mg Fraktion B1, gelöst in 10 ml 0,5%iger Essigsäure.
Elutionsmittel: (1) 0,025 m-Ammoniumacetat-Lösung (hergestellt aus 0,025 m-Essigsäure, durch Zusatz
von verd. Ammoniak auf pH 5,0 eingestellt); 24 Std. bei einer DurchfließgefAwindigkeit von llOml/Std.;
(2) 0,025 m-Ammoniumacetat-Lösung (pH 5,38);
Durchfließgeschwindigkeit: llOml/Std.;
37-ml-Fraktionen.
F i g. 7 gibt den nach Wechsel des Elutionsmittels erhaltenen Teil der Elutionskurve wieder. Wie ersichtlich,
wurden zwei Hauptfraktionen, nämlich C1 (57 mg) und C8 (48 mg), erhalten.
Die Fraktion C2 war biologisch inaktiv, die Fraktion
C1 zeigte eine biologische Aktivität von über 90% im Vergleich mit natürlichem Motilin (es sei
verwiesen auf J. C. B r ο w η et al, »Can. J. Physiol. Pharmacol.«, Bd. 49, 1971, S. 399 bis 405, und
»Gastroenterology«, Bd. 62, 1972, S. 401 bis 404).
Die Ergebnisse der durchgeführten Aminosi analysen sind in der folgenden Tabelle Π aufgef
Q | C, | |
Lys | 1,99 | 1,98 |
Arg | 2,03 | 1,96 |
Asp | 1,00 | 1,03 |
Thr | 1,00 | 1,00 |
GIu | 6,08 | 6,14 |
Pro | 0,99 | 1,05 |
GIy | 2,02 | 2,03 |
VaI | 0,95 | 0,91 |
Ue | 0,95 | 0,90 |
Leu | 1,00 | 1,00 |
Nie | 0,99 | 1,00 |
Tyr | 0,91 | 0,91 |
Phe | 1,92 | 1,91 |
Hierzu 6 Blatt Zeichnungen
Claims (2)
- 23 ISPatentansprüche: 1. L-Noricndn-13-Motilin der FormelH-i1ie-Va!4*o-ne-P!ie-Tlff~Tyr^Ο) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10)01)02) 03) O*) 05) OQ (17) (18) (W) (20) (21) (22)
- 2. Verfahren zur Herstellung von L-Norieucin-13-Motilin nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, dafiman(a) die miteinander verknüpf baren Teflsequenzen Fragment I, bestehend aus ArginyHhydrobromid)-asparagjnyl-N£-tert-butyloxycarbo· nyl - lysyl - glycyl - glutamin - tert. - butyiester (Aminosäuren 18 bis 22), Fragment Π, bestehend aus Na-Benzyloxycarbonyl-glutamyl-iy^ert.-butyfester^glutamyl- ao (y-terL-butyJester^NE-tert-butyloxycarbonyllysyl-glutaminsäure-y-tert-butylester (Aminosäuren 14 bis 17),Fragment HI, bestehend aus Noc-Benzyloxytarbonyl-Ni.Ntö-di-benzyloxycarbonyl-arginyl- as norleucin (Aminosäuren 12 und 13), Fragment IV, bestehend aus Not-Benzyloxycarbonyl-glutamyHy-tert.-butylesterHeucyl-. glutamin (Aminosäuren 9 bis 11), Fragment V, bestehend aus O-tert-Butylthreonyl-O-teit-butyl-tyrosyl-glycin (Aminosäuren 6 bis 8) undFragment VI, bestehend aus Na-tert-Butyloxycarbonyl-phenylalaEyl-valyl-prolyl-isoIeucyl-phenylalanin (Aminosäuren 1 bis 5) aufbaut, in denen alle Seitenkettenfunktioaei der polyfunktionellen Aminosäuren acidoly tisch leicht abspaltbare Schutzgroppen au tert Alkohol-Basis tragen und die komplex» Funktion des Arginins teils durch N3,oo-Di acyh'erung und teils durch eine durch Salz bildung mit Bromwasserstoff bewirkte Proto nierung maskiert ist,(b) die Fragmente I bis VI mit Hilfe des bteratur bekannten Dicyclohexylcarbodümid - N - Hy droxysuccinimid-Verfahrens oder einer literaturbekannten Modifikation desselben miteinander verknüpft,(c) aus dem erhaltenen, allseits maskierten, die Gesamtsequenz der Aminosäuren 1 bis 22 aufweisenden Polypeptid alle Schutzgruppen mil Hilfe von Trifluoroessigsäure abspaltet und danach die gebildeten Trifluoroacetat- tnd Bromidionen mit Hilfe eines Anionenauslauscherharzes entfernt und(d) das erhaltene rohe L-Norleucin-13-Motilk isoliert und reinigt.
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2315271A DE2315271C3 (de) | 1973-03-27 | 1973-03-27 | L- Norleucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes Mittel |
GB1308774A GB1464774A (en) | 1973-03-27 | 1974-03-25 | 13-l-norleucine-14-desamido-motilin a method for preparing it and a therapeutic containing it |
CH415774A CH602598A5 (de) | 1973-03-27 | 1974-03-26 | |
JP3318074A JPS5324074B2 (de) | 1973-03-27 | 1974-03-26 | |
FR7410229A FR2223020B1 (de) | 1973-03-27 | 1974-03-26 | |
SU2013928A SU562193A3 (ru) | 1973-03-27 | 1974-03-27 | Способ получени -норлейцин13-мотилина |
US05/455,396 US3978035A (en) | 1973-03-27 | 1974-03-27 | 13-Norleucine-14-desamido motilin, a method for preparing it and an agent containing it |
IT82207/74A IT1051204B (it) | 1973-03-27 | 1974-03-27 | L.norleucina 13 motilina,procedimento per la sua preparazione e prodotto contenente la stessa |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2315271A DE2315271C3 (de) | 1973-03-27 | 1973-03-27 | L- Norleucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes Mittel |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2315271A1 DE2315271A1 (de) | 1974-10-17 |
DE2315271B2 DE2315271B2 (de) | 1975-01-30 |
DE2315271C3 true DE2315271C3 (de) | 1975-09-11 |
Family
ID=5876092
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2315271A Expired DE2315271C3 (de) | 1973-03-27 | 1973-03-27 | L- Norleucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes Mittel |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3978035A (de) |
JP (1) | JPS5324074B2 (de) |
CH (1) | CH602598A5 (de) |
DE (1) | DE2315271C3 (de) |
FR (1) | FR2223020B1 (de) |
GB (1) | GB1464774A (de) |
IT (1) | IT1051204B (de) |
SU (1) | SU562193A3 (de) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2296427A1 (fr) * | 1974-12-31 | 1976-07-30 | Choay Sa | Agent peptidique de regulation de la glycemie |
US4232008A (en) * | 1978-11-17 | 1980-11-04 | Ortho Pharmaceutical Corporation | Tetrapeptides and methods |
US4356119A (en) * | 1978-09-28 | 1982-10-26 | Nordisk Insulinlaboratorium | Therapeutically active polypeptides or acid addition salts and a process for producing such compounds |
US5420113A (en) * | 1986-09-12 | 1995-05-30 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | [Leu13]motilin, DNAs coding for same and methods for producing same |
US5599690A (en) * | 1988-02-01 | 1997-02-04 | Amgen Inc. | Control of norleucine incorporation into recombinant proteins |
US5006469A (en) * | 1988-02-09 | 1991-04-09 | Oregon Health Sciences University | Vectors and host cells expressing prepromotilin and motilin-associated peptide (MAP) |
US5698418A (en) * | 1988-02-17 | 1997-12-16 | Pharmacia & Upjohn Company | Fermentation media and methods for controlling norleucine in polypeptides |
JPH0742319B2 (ja) * | 1989-01-06 | 1995-05-10 | 株式会社三和化学研究所 | モチリン様活性を有するポリペプチド及びその用途 |
US6291653B1 (en) * | 1997-03-24 | 2001-09-18 | Zymogenetics, Inc. | Antibodies to motilin homologs |
US6380158B1 (en) * | 1997-03-24 | 2002-04-30 | Zymogenetics, Inc. | Motilin homologs |
US6072075A (en) * | 1997-05-22 | 2000-06-06 | The Regents Of The University Of California | Guanidinylation reagents |
AU1925701A (en) * | 1999-11-22 | 2001-06-04 | Zymogenetics Inc. | Method of forming a peptide-receptor complex with zsig33 |
US6897286B2 (en) * | 2000-05-11 | 2005-05-24 | Zymogenetics, Inc. | Zsig33-like peptides |
-
1973
- 1973-03-27 DE DE2315271A patent/DE2315271C3/de not_active Expired
-
1974
- 1974-03-25 GB GB1308774A patent/GB1464774A/en not_active Expired
- 1974-03-26 FR FR7410229A patent/FR2223020B1/fr not_active Expired
- 1974-03-26 JP JP3318074A patent/JPS5324074B2/ja not_active Expired
- 1974-03-26 CH CH415774A patent/CH602598A5/xx not_active IP Right Cessation
- 1974-03-27 IT IT82207/74A patent/IT1051204B/it active
- 1974-03-27 US US05/455,396 patent/US3978035A/en not_active Expired - Lifetime
- 1974-03-27 SU SU2013928A patent/SU562193A3/ru active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB1464774A (en) | 1977-02-16 |
FR2223020A1 (de) | 1974-10-25 |
FR2223020B1 (de) | 1978-07-28 |
CH602598A5 (de) | 1978-07-31 |
JPS49135964A (de) | 1974-12-27 |
US3978035A (en) | 1976-08-31 |
SU562193A3 (ru) | 1977-06-15 |
IT1051204B (it) | 1981-04-21 |
DE2315271A1 (de) | 1974-10-17 |
DE2315271B2 (de) | 1975-01-30 |
JPS5324074B2 (de) | 1978-07-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2616399C2 (de) | Desamino-1,7-dicarbacalcitonine und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE2435027C2 (de) | Nonapeptidamide und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE3428942C2 (de) | (h-pth)-peptidderivate | |
DE2315271C3 (de) | L- Norleucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes Mittel | |
DE2540780A1 (de) | Verfahren zum herstellen von peptiden mit einer disulfidringstruktur | |
DE2256445A1 (de) | Neue heptapeptide mit gastrinwirkung | |
DE1196666B (de) | Verfahren zur Herstellung neuer adrenocorticotrop wirksamer Tetracosapeptide | |
DE69225597T2 (de) | Peptide mit einer lanthionin-brücke | |
DE2544348C3 (de) | L-Leucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes Mittel | |
EP0056951A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin oder dessen Derivaten aus Schweineinsulin oder dessen Derivaten | |
DE2528935C2 (de) | Verfahren zur Herstellung Arginylreste enthaltender Peptide und hierbei eingesetzte Zwischenprodukte | |
DE2463205C2 (de) | Octapeptid und Verfahren zu dessen Herstellung | |
DE2112553C3 (de) | 1 -alpha-Aminolsobuttersäurecorticotropinpeptide, deren Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe sowie Arzneipräparate | |
DE3209184A1 (de) | Verfahren zur umwandlung von praeproinsulinanaloga zu insulinen | |
CH633566A5 (en) | Process for the preparation of a novel polypeptide which reduces the levels of serum calcium | |
DE2346147A1 (de) | Verfahren zur selektiven abspaltung von aminoschutzgruppen | |
CH640510A5 (de) | Verfahren zur herstellung und reinigung von sekretin. | |
DE3876022T2 (de) | Calcitonin-derivate und deren salze. | |
CH640217A5 (en) | Polypeptides, their preparation and pharmaceutical preparations | |
DE2628006C2 (de) | Tridecapeptid, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung | |
EP0095557B1 (de) | Polypeptide mit antagonistischen Eigenschaften gegenüber der Substanz P, Verfahren zu ihrer Herstellung, deren Verwendung und Verfahren zum Reinigen von Polypeptiden | |
DE1205546B (de) | Verfahren zur Herstellung neuer Dekapeptide | |
DE1643496C3 (de) | Verfahren zur Herstellung von menschlichem Corticotropin bzw. analoger Verbindungen | |
DE2341798C2 (de) | Das Octapeptid Xenopsin und Verfahren zu seiner Gewinnung | |
DE1941511C2 (de) | Calcitonin-Analoga und ihre &alpha;-Desamino- und N&uarr;&alpha;&uarr;-Acylaminoderivate, diese Peptide enthaltende pharmazeutische Präparate, und synthetische Verfahren zu ihrer Herstellung sowie zur Herstellung von Calcitonin M |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
E77 | Valid patent as to the heymanns-index 1977 | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |