DE2459087B2 - Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Serumtriglyceriden - Google Patents

Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von Serumtriglyceriden

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Serumtriglyceriden durch enzymatische Hydrolyse und Dehydrierung des gebildeten Glycerins mit Hilfe eines Enzym-Coenzym-Reagenz, das Lipoproteinlipase (LPL), die aus einer Kühlflüssigkeit von Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum erhalten wurde, Glycerindehydrogenase (GDH) und Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) enthält, und kolorimetrische Bestimmung der Färbung, die bei Zugabe einer wäßrigen Lösung eines Gemisches einer Tetrazoliumverbindung mit Phenazinmethosulfat durch Reduktion der Tetrazoliumverbindung zu dem Formazan entwikkelt wird. Die Erfindung betrifft außerdem ein zur Durchführung dieses Verfahrens geeignetes Reagenz.
Die Bestimmung der Triglyceride ist als einer der Lipidtests auf Hyperlipidämie allgemein bekannt, und die klinische Bedeutung dieser Bestimmung steigt ständig an. Einige bekannte Bestimmungsmethoden erfordern jedoch komplizierte und schwierige Verfahrensschritte und sind daher als übliche Testmethoden ungeeignet. So werden beispielsweise bei dem Acetylacetonverfahren, das zur Zeit häufig angewendet wird, die Triglyceride zuerst durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel isoliert, weil die Neutralfette nicht durch Phospholipide oder Saccharide beeinflußt werden dürfen, die in dem Serum vorliegen. Dieses Verfahren ist äußerst kompliziert. Dann werden die so extrahierten Triglyceride mil einem Alkali hydrolysiert, und das durch Hydrolyse gebildete Glycerin wird mit einem Oxydationsmittel, wie Natriummetaperjodat, oxydiert, der dabei gebildete Formaldehyd wird mit Acetylaceton kondensiert, und die entwickelte Färbung wird durch Kolorimetrie bestimmt. Dieses Verfahren umfaßt somit mehrere Stufen. Das vorstehend beschriebene Acetylacetonverfahren wird beispielsweise von M. J. Fletcher, »A colorimetric method for estimating serum triglycerides«, Clinica Chimica Acta 22 (1968), 393 - 397, erläutert.
Außerdem wurde bereits über die Bestimmung von Serumtriglyceriden mit Lipoproteinlipase-Glycerindehydrogenase berichtet (K. O η ο b u, »Study of enzymatic analysis in clinical chemistry«. Report 12 [Nihon Yakugaku-Kai 93 nen-Kai] [1973]). Nach diesen
is Verfahren, bei denen eine enzymatische Reaktion angewendet wird, können die bei der Acetylacetonmethode erforderlichen Stufen der Extraktion und Adsorption weggelassen werden. Speziell die zuletzt genannte Hydrolyse von Triglyceriden mit Lipoprotinlipase ist vorteilhaft zur Bestimmung von Serumtriglyceriden, weil sie selektiv wirksam für Chylomikronen und mit Lipoprotein kombinierende Neutralfette ist. Die Reaktion der Dehydrierung von Glycerin ist jedoch nachteilig im Hinblick auf einfache und rasche Durchführung, weil spezielle Verfahrensrnaßnahmen erforderlich sind, da das Reaktionsgleichgewicht auf die Seite der NAD-Bildung verschoben ist und zur Bestimmung von NADH Wellenlängen im Ultraviolettbereich angewendet werden. So ist beispielsweise bei
jo der enzymatischen Analyse nach K. O η ο b u et al. das Gleichgewicht der enzymatischen Dehydrierungsreaktion von Glycerin mit GDH auf die Seite der NAD-Büdung verschoben, und das durch die Reaktion gebildete Dihydroxyaceton muß daher aus dem
j5 Reaktionsgemisch entfernt werden, um die Reaktion zu beschleunigen. Die Dehydrierungsreaktion wird durch Zugabe von Hydrazin zu dem Reaktionsgemisch durchgeführt, um Dihydroxyaceton in das Hydrazon überzuführen. Die Bestimmung umfaßt daher zwei Stufen. Darüber hinaus beeinflußt bei der Bestimmung des gebildeten NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm das im Blut vorliegende Bilirubin die Absorption bei der Wellenlänge von 340 nm, und zur Korrektur des Wertes ist daher eine Serumblindprobe unerläßlich.
In der US-PS 37 03 591 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem Triglyceride mit Hilfe einer Kombination von Lipase und Protease enzymatisch zersetzt werden und das so erhaltene Glycerin durch eine Änderung der Konzentration an NADH bestimmt wird. Bei diesem
so Verfahren kann als Lipase eine mikrobielle Lipase, wie aus Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum verwendet werden. Die bei diesem Verfahren geeignete Glycerindehydrogenase ist ein von Enterobacter aerogenes gebildetes Enzym. Gemäß einer Ausführungsform dieses Verfahrens wird dann das gebildete NADH durch Zugabe einer Tetrazoliumverbindung und Phenazinmethosulfat (PMS) kolorimetrisch bestimmt.
Aus der DE-OS 20 20 506 ist ferner ein Farbreagenz zur Bestimmung der Serumtriglyceride bekannt, bei dem die Triglyceride in einer ersten Stufe mit Hilfe einer beliebigen Methode gespalten werden und danach das gebildete Glycerin in Gegenwart von Glycerindehydrogenase, Nicotinamidadenindinucleotid und einer Tetrazoliumverbindung und Phenazinmethosulfat bestimmt
b5 wird. Bei der Bestimmung von Triglyceriden im Serum treten jedoch Schwierigkeiten wegen der im Serum vorhandenen reduzierenden Verbindungen, wie Ascorbinsäure und Harnsäure, auf. Diese Verbindungen
beeinflussen bei der kolorimetrischen Bestimmung mit Hilfe von Tetrazoliumsalzen und Phenazinmethosulfat die Farbreaktion störend, da sie in bestimmten pH-Bereichen eine Reduktion der Tetrazoliumsalze bewirken. Versucht man diese Störungen bei den bekannten Verfahren durch genaue Einstellung des pH-Bereiches zu vermeiden, so wird die Aktivität der bekanntermaßen verwendeten Bakterienenzyme vermindert.
Der Erfindung liegt demgegenüber die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und ein Reagenz zur Verfügung zu stellen, das die zuverlässige und genaue Bestimmung von Serumtriglyceriden mit Lipoproteinlipase-Glycerindehydrogenase ermöglicht, ohne daß Störungen durch andere Serumbestandteile auftreten.
Dieses Verfahren soll eine kolorimetrische Ablesung bei einer Wellenlänge im sichtbaren Bereich ermöglichen und in einer einzigen Stufe durchführbar sein.
Es hat sich gezeigt, daß diese Aufgabe gelöst werden kann, indem bei der eingangs beschriebenen TriglyceridbestimmungalsGDH ein Enzym verwendet wird, das aus einer Kulturflüssigkeit von Bacillus megatherium erhalten wurde, und daß man sowohl die enzymatische Hydrolyse der Triglyceride als auch die Dehydrierungsreaktion des gebildeten Glycerins in Gegenwart der vorher zugesetzten Tetrazoliumverbindung und des Phenazinmethosulfats und bei einem pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 9,5 vornimmt.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Reagenz zur Bestimmung von Serumtriglyceriden, enthaltend eine Lipase, GDH, NAD, eine Tetrazoliumverbindung
ίο und Phenazinmethosulfat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es als Lipase eine Lipoproteinlipase (LPL), die aus einer Kulturflüssigkeit von Chromobaceterium viscosum var. paralipolyticum erhalten wurde, und als GDH ein Enzym, das aus einer Kulturflüssigkeit von Bacillus megatherium erhalten wurde, aufweist und daß es auf einen pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 9,5 gepuffert ist.
Der Mechanismus der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und in dem erfindungsgemäßen Reagenz stattfindenden enzymatischen Reaktion kann folgendermaßen dargestellt werden:
Triglyceride
LPL
Fettsäure +
GDH
Glyceriii
Dihydroxyaceton
/PMSH\ /Tetrazolium
^Formazan
In den vorstehend angegebenen enzymatischen Reaktionen verläuft die Reaktion der Hydrolyse von Triglyceriden zu Fettsäure und Glycerin unter der Einwirkung des Enzyms LPL in Richtung des Pfeils, während die Dehydrierungsreaktion des so gebildeten Glycerins unter Bildung von Dihydroxyaceton unter Einwirkung von GDH in Gegenwart von Coenzym NAD ein Gleichgewicht zeigt, das in Richtung der Bildung von NAD verschoben ist. Die Dehydrierungsreaktion des Glycerins kann nun zwangsweise in Pfeilrichtung verschoben werden, indem vorher Phenazinmethosulfat und eine Tetrazoliumverbindung zusätzlich zu dem Coenzym NAD dem Reaktionsmedium zugegeben werden.
Die Hydrolysereaktion des Triglycerids und die Dehydrierungsreaktion von Glycerin mit Hilfe der angegebenen Enzyme werden daher in einer Stufe durchgeführt, und gleichzeitig wird die Färbung, die durch Reduktion der Tetrazoliumverbindung zu dem Formazan entwickelt wird, kolorimetrisch bei einer Wellenlänge im sichtbaren Wellenlängenbereich be- to stimmt, wobei der Anteil der Triglyceride erhalten wird.
Wie vorstehend veranschaulicht wurde, reduziert das quantitativ durch das Triglycerid gebildete NADH die Tetrazoliumverbindung quantitativ zu dem Formazan über eine Verfahrensstufe, in der PMS in PMSH b5 umgewandelt wird. Der Grad der Farbentwicklung der Reaktionsflüssigkeit im sichtbaren Wellenlängenbereich ist proportional der Menge des Triglycerids, und auf diese Weise wird die Bestimmung des Triglycerids nach dem beschriebenen Verfahren ermöglicht.
Die Reaktionen werden gewöhnlich bei einer Temperatur von beispielsweise 37°C während 20 Minuten durchgeführt, und danach wird der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch Zugabe von 0,1 n-HCl-Lösung vermindert, um die Reaktion zu beenden.
LPL wird aus einer Kulturflüssigkeit von Chromobakterium Viscosum var. Paralipolyticum erhalten. GDH wird aus einer Kulturflüssigkeit von Bacillus megatherium erhalten.
Ein zur erfindungsgemäßen Verwendung geeignetes Enzym-Coenzym-Reagenz kann hergestellt werden, indem LPL, GDH und NAD in einer Pufferlösung gelöst werden und die erhaltene Lösung gefriergetrocknet wird. Die Pufferlösung unterliegt keiner besonderen Beschränkung, mit der Ausnahme, daß die Lösung eine Pufferwirkung im pH-Bereich von 7,0 bis 9,5 zeigen sollte. Eine bevorzugte Pufferlösung ist eine 0,1 m-Phosphatpuffer!ösung(pH 7,6).
Phenazinmethosulfat (PMS), das als sehr instabil angtrehen wurde, kann während langer Dauer stabil aufbewahrt werden, indem es in Form einer wäßrigen Lösung oder eines Gemisches einer solchen Lösung mit einer Tetrazoliumverbindung in einer braunen PoIyäthylenreagenzflasche an einem kalten, dunklen Ort aufbewahrt wird.
Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Beispiels näher erläutert.
In dem Beispiel bedeutet die Einheit von GDH eine Tabelle
solche Menge an GDH, die zur Isolierung von I
Micromol NADH bei 25°C während einer Minute Serum Nr.
befähigt ist, wenn Glycerin als Substrat und als Coenzym NAD verwendet werden. Eine Einheit LPL r> bedeutet das 2,5fache der internationalen Einheit, die
mit Hilfe der PVA-Emulsionsmethode gemessen wird.
In der Zeichnung zeigt Fig. 1 die enge Übereinstimmung zwischen der üblichen Acetylacetonmethode und der erfindungsgemäßen Methode zur Trioleinanalyse, ι ο Auf diese Zeichnung wird in dem nachstehenden Beispiel ebenfalls Bezug genommen.
Triolein mg/dl
Acetylaceton-Methode
erfindungsgemäße
Methode
Beispiel
I. Herstellung der Reagenzien
(1) Erster Ansatz (Enzym-Coenzym-Reagenz):
LPL
GDH
NAD
20 000 Einheiten
1 000 Einheiten
500 mg
Die vorstehend angegebene Stoffzusammensetzung wird in 100 ml einer 0,1 m-Phosphatpufferlösung (pH 7,6) gelöst, und 5,0 ml Anteile der Lösung werden gefriergetrocknet.
(2) Zweiter Ansatz:
Nitrotetrazoliumblau
Phenazinmethosulfat
50 mg
10 mg
Den vorstehend genannten Bestandteilen wird gereinigtes Wasser zugesetzt, so daß die Gesamtmenge 100 ml beträgt.
II. Verfahren
Der Inhalt (5,0 ml) des vorstehend angegebenen Enzym-Coenzym-Ansalzes (1) wird in 5,0 ml des Ansatzes (2) gelöst, wobei die Reaktionslösung erhalten wird. 0,5 ml der Reaktionslösung (die 100 Einheiten LPL und 50 Einheiten GDH enthält) wird in ein Reagenzglas gegeben und mit 0,02 ml einer Serumprobe versetzt. Die Reaktion wird bei 37°C genau 20 Minuten vorgenommen. Unmittelbar danach wird die Reaktion durch Zugabe von 5,0 ml einer 0,1 HCI-Lösung beendet, wobei der pH-Wert vermindert wird. 5 bis 90 Minuten nach Beendigung der Reaktion erfolgt die kolorimetrische Bestimmung in üblicher Weise bei einer Wellenlänge von 570 bis 600 nm im Vergleich mit einer Blindprobe des Reagenz als Kontrollprobe. Gesondert davon wird das gleiche Verfahren unter Verwendung eines Standards (gefriergetrocknetes Serum, das eine vorbestimmte Menge an Triglycerid enthält) wiederholt, um eine Eichkurve zu erhalten. Aus dem Ergebnis der Bestimmung wird die Menge des Triglycerids in der Probe berechnet.
Die Reaktionsdauer muß streng kontrolliert werden, während die Konzentration der Reagenzien, die Reakiionstemperatur und der pH-Wert verändert werden können, solange sie das Ergebnis der Bestimmung nicht beeinflussen.
Die Ergebnisse der Trioleinanalysc, die nach dem beschriebenen Beispiel durchgeführt wurde, sind in Tabelle I gezeigt. Die Scrumprobcn in der Tabelle werden hergestellt, indem Blut bestimmter einzelner Personen in üblicher Weise zentrifugiert wird.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1040
990
735
505
463
340
290
190
106
70
1090 975
735
525
445 340 260 203 110 73
Die Trioleinanalyse wurde unter Verwendung von 70 Proben nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, das in dem vorstehenden Beispiel beschrieben wurde, und nach dem üblichen Acetylacetonverfahren durchgeführt. Wie in F i g. 1 gezeigt ist, wurde gute enge
Übereinstimmung erreicht.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Reagenz und Verfahrens werden folgende Vorteile erzielt:
Selbst eine sehr geringe Menge einer Probe kann in einer Stufe analysiert werden; mit Lipoproteinen kombinierende Triglyceride können bestimmt werden, ohne daß sie durch andere Bestandteile des Blutes beeinflußt werden; ein weiterer Zusatzstoff, wie Hydrazin, zum Beschleunigen der Reaktion ist nicht erforderlich, die Bestimmung kann bei einer Wellenlänge im sichtbaren Bereich durchgeführt werden, und es ist keine Serumblindprobe erforderlich. Die Bestimmung erfordert daher nur kurze Zeit, das Verfahren ist einfach, und es kann eine einfache Vorrichtung für die Kolorimetrie eingesetzt werden.
40 Vergleichsversuch
Der beschriebene Versuch zeigt, daß in dem erfindungsgemäß angewendeten optimalen pH-Bereich von 7,0 bis 9,5 bei Verwendung des LPL-GDH-Formazan-Systems ermöglicht wird, die Aktivität der beiden speziellen Bakterienenzyme LPL und GDH optimal zu erreichen. In diesem Versuch wurde die Aktivität der GDH nach der üblichen Methode durch die Erhöhung der Absorption bei 340 nm (25° C) pro Minute gemessen. Für den Versuch wurde eine 0,5 m-Phosphat, Glycin und NaOH enthaltende Pufferlösung, die 2 m-Glycerin als Substrat sowie NAD und Rinderalbumin enthiel (0,1 m-Glycerin wurde zugesetzt, um die Pufferwirkung auf den Bereich von 7,0 bis 10,0 auszudehnen), verwendet.
Die bei diesem Versuch erhaltene Fig. 2 zeigt deutlich, daß das erfindungsgemäß eingesetzte GDH von Bacillus megatherium ein Aktivitätsmaximum bei
bo einem pH-Wert von 9,0 hat und eine relativ hohe Aktivität innerhalb eines breiten pH-Bereiches von etwa 7,5 bis 9 aufweist, während das bekanntermaßen eingesetzte GDH erst bei einem pH-Wert von etwa 9,5 ihr Aktivitätsmaximum zeigt und unterhalb diese
b5 Bereiches stark verminderte Aktivität hat.
Ferner wurde ein Vergleichsvcrsuch unter Verwendung des erfindungsgemäß eingesetzten GDH und des bekanntermaßen verwendeten GDH nach der einstuft-
gen Verfahrensweise gemäß der Erfindung zur Bestimmung eines Serumtriglycerids durchgeführt (Menge des Triglycerids: 510 mg/dl). Dieser Versuch wurde in gleicher Weise wie das anmeldungsgemäße Beispiel vorgenommen, mit der Abänderung, daß anstelle eines 0,1 m-Phosphatpuffers der vorstehend angegebene Puffer verwendet wurde. Die so erzielten Ergebnisse sind in der Fig.3 als Zusammenhang zwischen der Absorption und dem pH-Wert angegeben. Bei dem erfindungsgemäßen einstufigen Verfahren unter Verwendung der speziellen Glycerindehydrogenase wird der Absorptionsverlauf in einem pH-Bereich von etwa 7,5 bis 9 konstant, so daß das Meßergebnis in diesem Bereich nicht durch den pH-Wert beeinflußt wird (bei dem erfindungsgemäßen Beispiel wurde ein pH-Wert von 7,6 eingestellt).
Wenn der pH-Wert jedoch 9,5 überschreitet, so tritt eine nichtenzymatische Reduktion von Tetrazoliumsalzen durch die im Serum vorliegenden reduzierenden Verbindungen ein.
Wenn andererseits jedoch die Glycerindehydrogenase gemäß US-PS 37 03 591 verwendet wird, bewirkt eine leichte Veränderung des pH-Wertes während der Reaktion eine starke Änderung der Absorption, so daß das Meßergebnis verfälscht wird. Außerdem ist bei Verwendung des bekannten Enzyms in diesem pH-Bereich die Reaktionsaktivität so gering, daß die Reaktion nicht ausreichend fortschreitet.
Um bei dem bekannten Verfahren ausreichende
ο Reaktionsaktivität zu erreichen und um Störungen durch eine pH-Änderung auszuschalten, muß bekanntermaßen ein pH-Wert von mehr als 9,5 angewendet werden. Bei hohen pH-Werten herrscht jedoch die nichtenzymatische Reduktion von Tetrazoliumsalzen
ίο durch im Serum vorliegende reduzierende Verbindungen vor. Darüber hinaus wird die von vornherein auftretende Färbung der Tetrazoliumsalze stärker. Die so entwickelte Färbung ist durch eine Erhöhung des Blindwertes im Verlauf der Zeit ersichtlich, so daß keine exakte Bestimmung der Triglyceride durchgeführt werden kann.
Um diese erwähnten Nachteile zu umgehen und trotzdem eine exakte Messung durchführen zu können, muß bei dem bekannten Verfahren und unter Verwendung der bekannten GDH die Bestimmung der Serumtriglyceride in mindestens zwei Stufen vorgenommen werden, wobei zuerst die enzymatische Reaktion bei einem pH-Wert von 9,5 oder darüber und danach die Farbreaktion bei einem pH-Wert von vorzugsweise 8,5 oder weniger durchgeführt wird.
Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Bestimmung von Serumtriglyceriden durch enzymatische Hydrolyse und Dehydrierung des gebildeten Glycerins mit Hilfe eines Enzym-Coenzym-Reagenz, das Lippproteinlipase (LPL), die aus einer Kulturflüssigkeit vcn Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum erhalten wurde, Glycerindehydrogenase (GDH) und Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) enthält, und kolorimetrische Bestimmung der Färbung, die bei Zugabe einer wäßrigen Lösung eines Gemisches einer Tetrazoliumverbindung mit Phenazininethosulfat durch Reduktion der Tetrazolium verbindung zu dem Formazan entwickelt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als GDH ein Enzym verwendet, das aus einer Kulturflüssigkeit von Bacillus megatherium erhalten wurde, und daß man sowohl die enzymatische Hydrolyse der Triglyceride als auch die Dehydrierungsreaktion des gebildeten Glycerins in Gegenwart der vorher zugesetzten Tetrazoliumverbindung und des Phenazinmethosulfats und bei einem pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 9,5 vornimmt.
2. Reagenz zur Bestimmung von Serumtriglyceriden, enthaltend eine Lipase, GDH, NAD, eine Tetrazoliumverbindung und Phenazinmethosulfat, dadurch gekennzeichnet, daß es als Lipase eine Lipoproteinlipase (LPL\ die aus einer Kühlflüssigkeit von Chromobacterium viscosum var. paralipolyticum erhalten wurde, und als GDH ein Enzym, das aus einer Kulturflüssigkeit von Bacillus megatherium erhalten wurde, aufweist und daß es auf einen pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 9,5 gepuffert ist.
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