DE2457044C3 - Überwachung und Regelung von Anlagen der kontinuierlichen Kultur von Mikroorganismen - Google Patents
Überwachung und Regelung von Anlagen der kontinuierlichen Kultur von MikroorganismenInfo
- Publication number
- DE2457044C3 DE2457044C3 DE2457044A DE2457044A DE2457044C3 DE 2457044 C3 DE2457044 C3 DE 2457044C3 DE 2457044 A DE2457044 A DE 2457044A DE 2457044 A DE2457044 A DE 2457044A DE 2457044 C3 DE2457044 C3 DE 2457044C3
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- culture
- microorganisms
- monitoring
- regulation
- continuous culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/44—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of volume or liquid level
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/12—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
- C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
- C12M41/40—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pressure
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01D—MEASURING NOT SPECIALLY ADAPTED FOR A SPECIFIC VARIABLE; ARRANGEMENTS FOR MEASURING TWO OR MORE VARIABLES NOT COVERED IN A SINGLE OTHER SUBCLASS; TARIFF METERING APPARATUS; MEASURING OR TESTING NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- G01D9/00—Recording measured values
- G01D9/02—Producing one or more recordings of the values of a single variable
- G01D9/10—Producing one or more recordings of the values of a single variable the recording element, e.g. stylus, being controlled in accordance with the variable, and the recording medium, e.g. paper roll, being controlled in accordance with time
- G01D9/16—Producing one or more recordings of the values of a single variable the recording element, e.g. stylus, being controlled in accordance with the variable, and the recording medium, e.g. paper roll, being controlled in accordance with time recording occurring at separated intervals, e.g. by chopper bar
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Thermal Sciences (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überwa chung und Regelung von Anlagen zur kontinuierli
chen Kultur von Mikroorganismen, wobei als Bezugs größen für die Regelung der Substratzufuhr solche
Meßwerte verwendet werden, die Veränderungen de . Kulturmilieus auf Grund des Stoffwechsels der Orga
nismen betreffen.
Bei der Kultur von Mikroorganismen in geschlosse nen Gefäßen ändern sich die Kulturbedingungen mi:
zunehmender Organismenzahl und abnehmenden' Nährstoffangebot ständig. Zur Kultur von Mikroor
ganismen unter gleichbleibenden Bedingungen übe · lang re Zeit sind zwei kontinuierliche Kulturmetho ■
den bekannt.
Im sogenannten »Chemostaten« wird einer Kultu ■
in einem Kulturgefäß mit konstanter Zuflußrate fri ■ sches Substrat zugeführt und in gleichem Maße Organismensuspension
entnommen. In der Kultur stellt sich ein Fließgleichgewicht ein, das abhängig ist von
den Außenbedingungen und der vom Experimentato · vorgegebenen Zuflußrate. Im sogenannten »Turbidostaten«
wird die im Kulturgefäß vorhandene Anzahl von Organismen pro Volumeneinheit als optisch·:
Dichte der Kultur ständig überwacht und bei Erhöhung der optischen Dichte durch Zugabe frischen
Substrates eine vorgegebene Organismendichte aufrechterhalten. Bei der Messung der optischen Dicht .·
im Turbidostaten kann jedoch nicht zwischen lebenden und toten Organismen unterschieden werden. Das
Verfahren ist also bei einer Veränderung von Kultur bedingungen in Bereiche, die durch erhöhte Absterberaten
gekennzeichnet sind, nicht anwendbar.
Eine Selektion und Anreicherung von Mutanten i> t
mit diesen beiden kontinuierlichen Verfahren offensichtlich nicht erreichbar, so daß für derartige Zweck;
immer noch das diskontinuierliche Schalenverfahrer, also das Umsetzen der Kulturen in verschiedene Schalen
unterschiedlicher Bedingungen, üblich ist.
Aufgabe der Erfindung ist es deshalb, das bekannt;
Verfahren zur Überwachung und Regelung von Anlagen zur kontinuierlichen Kultur von Mikroorganismen,
wobei als Bezugsgrößen für die Regelung der Substratzufuhr solche Meßwerte verwendet werder,
die Veränderungen des Kulturmilieus auf Grund des Stoffwechsels der Organismen betreffen, derart weite r
auszugestalten, daß damit eine schnelle und wirkungsvolle Selektion Und Anreicherung von Mutanten heibeigeführt
werden kann. Nach der Erfindung wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß die Regelungsmerkmale in Verbindung mit graduellen Veränderungen
von Kulturbedingungen, mit oder ohne zusätzlicher Regelung der Gradientenanstiege durch die
Meßwerte, verwendet werden.
Nun war es zwar aus der Zeitschrift »Brauwissenschaft«, Jahrgang 20, Heft 10/1967, Seite 417, bereits
bekannt, bei Anlagen zur kontinuierlichen Vergärung die Durchflußrate durch den Turm an Hand der
Dichte des Bieres zu steuern. Abgesehen davon, daß es dabei nicht um das Überwachen und Regeln der
Kultur von Mikroorganismen geht, vermochte diese Literaturstelle schon deshalb keine Anregung zur Lösung
der der Erfindung zugrundeliegenden Aufgabe zu liefern, weil - wie schon in Verbindung mit dem
sogenannten »Turbidostaten« erwähnt - gerade die Dichtemessung nicht zwischen lebenden und toten
Organismen unterscheiden kann und deshalb nicht für
.•ti Selektiomszwecke geeignet ist.
Verändert man Bedingungen für die Kultur (z. B. die Temperatur) graduell in der Zeit, so wird dies bei
Annäherung der sich verändernden Bedingungen an Extrem- oder Grenzwerte an einer Änderung der
_·■, Stoffwechselaktivitär erkennbar. Erfolgt die Annäherung
an den Grenzwert langsam genug, so werden solche Organismen sich in der Kultur anreichern, die
sich für die geänderten Bedingungen im Selektionsvorteil befinden. Es tritt eine Mutanten-Auslese und
in -Anreicherung in der Kultur ein. Überwacht oder regelt
man den Anstieg des Gradienten mit Bezug auf die Meßwerte für die Stoffwechselaktivität, so wird
im äußersten Fall der Gradient = 0. die Kultur kann aber nicht durch Überschreitung des Grenzwertes ab-
ii getötet werden. Gradienten von Substanzen sind interessant
für Selektionen wir Resistenz gegen erhöhte Abbaufähigkeit, Anhäufung von bestimmten Stoffwechsel-|zwischen)-Produkten,
Veränderung bisher inert erscheinender Substanzen (Umweltschutz) und
«■ι dergleichen. Besonders gute Resultate sind zu erwarten,
wenn die betreffende Bezugssubstanz selbst direkt mil einem Meßwertaufnehmer oder durch
schnelle Analysenmethoden bestimmt und als Bezugsgröße für die Regelung verwendet werden kann.
,, Bestrahlungen im Kulturgefäß (punktförmige Strahlenquellen)
oder Zugabe von mutationsauslösenden Substanzen können gegebenenfalls den Gradienten
zur Selektion eine Erhöhung der Mutationsrate parallel gehetii lassen.
,„ Bei Konstanz der Kulturbedingu.igen resultiert
eine gleichbleibende Stoffwechselaktivität der Kultur
mit Bezug auf den Meßwert für die Regelung (z.B. COj-Bildung pr»>
Zeiteinheit). Dadurch können Einflüsse von Außenbedingungen oder Substanzen auf
,-, den »steady state« einer Kultur untersucht werden.
Bei der Einwirkung von Gift- oder Hemmstoffen ist die Möglichkeit gegeben, durch einmalige Zugabe und
Registrierung über längere Zeit auch Erholungsphasen und -zeiten sowie die Wirkung von vermuteten
h„ Antagonismen /u untersuchen. Durch Kontrolle des
Aktivitatiäverlaufs einer Kultur bei Ablauf eines Kon·
zentratiohsgradieiiten bezüglich des Substrates öder
einzelner Substratbestandteile können Aussagen über optimale Konzentrationen in bezug auf eine ge-
b-, wünschte Optimierung der Bildung von z. B. Stoffwechsel-Zwischen-
oder -Endprodukten erhalten werden.
Je nach Meßwertaufnehmer und meßtechnischem
Aufwand können geringste Stoffwechselaktivitäten als Ist-Werte zur Regelung der Kulturanlage erfaßt
werden. Bei Verwendung spezifischer Meßwertaufnehmer oder schneller Analysenmethoden besteht diie
Möglichkeit, die Regelung in bezug auf einen spezifischen Stoffwechselvorgang auszurichten. Die technische
Ausgestaltung der Kulturgefäße (Glas, Metall. Kunststoff, offen, druckdicht etc.), der Zugabe und
Abgabeteile (Pumpen, Dosierpumpen, Regelventile etc.) sowie der Meß- und Regelverschaltungen kann
den jeweiligen speziellen Problemen angepaßt werden.
Zur Erläuterung der Erfindung werden nachfolgend noch einige Beispiele angegeben,
a) Bildung von CO2 als Stoffwechselendprodukt.
a) Bildung von CO2 als Stoffwechselendprodukt.
Messung der gebildeten CO2-Menge, z. B. als
Druckanstieg bis zu einem Maximum-Schaltpunkt am Druckaufnehmer. Hier Abgabe von etwas Organismensuspension
(Überfluß) und dem gebildeten CO;,-Da
durch Druckabnahme bis zum Minimum-Schaltpunkt, hier Zugage von frischem Substrat in der
Menge des »Überflusses« (also Kulturvolumen konstant). Weitere CO,-Bildung mit Druckanstieg bis
zum Maximum-Schaltpunkt usw. Das Kulturgefäß ist in diesem Fall druckdicht, der Abgangsstutzen seitlich,
so daß seine Höhe über Boden das Kulturvolumen bestimmt. Die Abgabe erfolgt durch Schlauchpumpe,
die Zugabe mittels Dosierpumpe. Messung mit Differenzdruck-Druckaufnehmer gegen ein steriles Vergleichsgefäß
in Größe des Kulturgefäßes zum Ausgleich von Temperaturschwankungen ist zweckmäßig,
b) Säurebildung während des Stoffwechselablaufes.
Erfassung der Säurebildung durch pH-Messung von einem Ausgangs-Schaltpunkt (bestimmt durch pH-Wert
des sterilen Substrates) bis zu einem festgesetzten End-Schaltpunkt am pH-Meßgerät. Bei dessen
Erreichen Rücktitration auf Ausgangs-Punkt und/ oder gekoppelt mit der Titration Zugabe von frischem
Substrat.
Das Kulturgefäß hat nur Sterilabschluß, das KuI-turvolumen
ist wie unter a) festgelegt. Rücktitration tropfenweise durch impulsgesteuertes Magnetventil,
Substratzügabc mit Dosierpumpe. /-,Überfluß» fließt
von selbst auf Grund des fixierten Kulturvolumens ab.
Claims (1)
- 24 1M 044Patentanspruch:Verfahren zur Überwachung und Regelung von Anlagen zur kontinuierlichen Kultur von Mikroorganismen, wobei als Bezugsgrößen für die Regelung der Substratzufuhr solche Meßwerte verwendet werden, die Veränderungen des KuI-turmilieus auf Grund des Stoffwechsels der Organismen betreffen, dadurch gekennzeichnet daß zum Zwecke der Selektion und Anreicherung von Mutanten die Regelungsmerkmale in Verbindung mit graduellen Veränderungen von Kulturbedingungen, mit oder ohne zusätzlicher Regelung der Gradientenanstiege durch die Meßwerte, verwendet werden.
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2457044A DE2457044C3 (de) | 1974-12-03 | 1974-12-03 | Überwachung und Regelung von Anlagen der kontinuierlichen Kultur von Mikroorganismen |
ZA757515A ZA757515B (en) | 1974-12-03 | 1975-11-28 | Continuous process for the culture of micro-organisms and apparatuses for its execution |
CH1550875A CH618736A5 (en) | 1974-12-03 | 1975-11-28 | Continuous process for the cultivation of microorganisms and apparatus for carrying it out. |
IT29932/75A IT1051027B (it) | 1974-12-03 | 1975-12-02 | Procedimento continuo per la coltura di microrganismi e dispositivi per la realizzazione pratica del medisimo |
ES443149A ES443149A1 (es) | 1974-12-03 | 1975-12-02 | Procedimiento continuo para el cultivo de microorganismos y dispositivos para su realizacion. |
FR7537001A FR2293488A1 (fr) | 1974-12-03 | 1975-12-03 | Procede continu de culture de micro-organismes et dispositif pour son execution |
DE2554393A DE2554393C3 (de) | 1974-12-03 | 1975-12-03 | Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE2457044A DE2457044C3 (de) | 1974-12-03 | 1974-12-03 | Überwachung und Regelung von Anlagen der kontinuierlichen Kultur von Mikroorganismen |
DE2554393A DE2554393C3 (de) | 1974-12-03 | 1975-12-03 | Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2457044A1 DE2457044A1 (de) | 1976-10-28 |
DE2457044B2 DE2457044B2 (de) | 1979-04-05 |
DE2457044C3 true DE2457044C3 (de) | 1979-11-22 |
Family
ID=33419422
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2457044A Expired DE2457044C3 (de) | 1974-12-03 | 1974-12-03 | Überwachung und Regelung von Anlagen der kontinuierlichen Kultur von Mikroorganismen |
DE2554393A Expired DE2554393C3 (de) | 1974-12-03 | 1975-12-03 | Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2554393A Expired DE2554393C3 (de) | 1974-12-03 | 1975-12-03 | Vorrichtung zur Kultivierung von Mikroorganismen |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (2) | DE2457044C3 (de) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4371619A (en) * | 1980-06-23 | 1983-02-01 | Union Carbide Corporation | Acetic acid by fermentation |
WO1993003178A1 (en) * | 1991-08-02 | 1993-02-18 | Unilever Plc | Microorganism growth |
-
1974
- 1974-12-03 DE DE2457044A patent/DE2457044C3/de not_active Expired
-
1975
- 1975-12-03 DE DE2554393A patent/DE2554393C3/de not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE2457044B2 (de) | 1979-04-05 |
DE2554393C3 (de) | 1980-03-27 |
DE2457044A1 (de) | 1976-10-28 |
DE2554393A1 (de) | 1977-06-08 |
DE2554393B2 (de) | 1979-07-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Buchanan et al. | Physiology and Biochemistry of Bacteria... | |
EP2057459B1 (de) | Verfahren und vorrichtung zur detektion lebender phytoplanktonzellen in wasser | |
DE3811097A1 (de) | Verfahren zur steuerung biologischer klaerstufen | |
DE69207767T2 (de) | Vorrichtung zur bestimmung der entstehung von ablagerungen und des wachstums von mikroorganismen auf oberflächen | |
DE68909997T2 (de) | Vorrichtung zur Kultur von tierischen Zellen, Kulturmethode und Mittel zum Nachweis der Kultur. | |
DE2457044C3 (de) | Überwachung und Regelung von Anlagen der kontinuierlichen Kultur von Mikroorganismen | |
DE2155060A1 (de) | Verfahren zur kontinuierlichen bestimmung der toxizitaet von wasser, abwasser und anderen fluessigkeiten unter verwendung von mikroorganismen und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens | |
CH618736A5 (en) | Continuous process for the cultivation of microorganisms and apparatus for carrying it out. | |
AT396999B (de) | Anlage zur turbidimetrischen messung und regelung von mikroorganismen | |
DE3927856A1 (de) | Verfahren zur prozessfuehrung mindestens eines bioreaktors fuer pflanzliche zellkulturen | |
DE3820196C2 (de) | ||
DE2431918A1 (de) | Verfahren und vorrichtung zur kontinuierlichen bestimmung und auswertung der humantoxizitaet von fluessigkeiten | |
DE4234109C1 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur Züchtung von Zellen | |
EP0008725B1 (de) | Verfahren und Messgerät zur Bestimmung des Sauerstoffeintrags in einen mit einem durchmischten fluiden Medium gefüllten Reaktor | |
DE2636109A1 (de) | Verfahren und vorrichtung zur ermittlung giftiger substanzen im abwasser | |
DD143792A1 (de) | Vorrichtung zur automatischen qualitaetskontrolle von luft und wasser durch mikroalgen | |
EP0889950B1 (de) | Verfahren zur analyse von eigenschaften eines biologischen systems | |
DD142823A3 (de) | Verfahren und vorrichtung zur automatischen analyse der umweltbelastung von luft,trink-,brauch-und abwasser | |
DE4236614A1 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur Analyse und/oder Steuerung einer Kultur von Mikroorganismen | |
DE19605753A1 (de) | Verfahren und Vorrichtung zur Detektion von stoffwechselaktiven, unlädierten, ungestressten Mikroorganismen - quantitativ und qualitativ im "Sub-ppb-Bereich" innerhalb von Minuten | |
EP0078268B1 (de) | Prüfanlage für die vorausbestimmung des wirkungsgrades der böden von destillier- und/oder absorptionskolonnen | |
DE1906587A1 (de) | Verfahren zur kontinuierlichen und unmittelbaren Messung des in einer Fluessigkeit enthaltenen Gehaltes an biologisch abbaubaren Substanzen | |
AT330687B (de) | Verfahren zur kontinuierlichen messung der toxizitat von wasserigen flussigkeiten, insbesondere von abwassern, unter verwendung von mikroorganismen und vorrichtung zur durchfuhrung des verfahrens | |
WO2022165541A1 (de) | Vorrichtung und verfahren zum regeln eines mikroorganismen-gehalts | |
DE2651896A1 (de) | Verfahren zum bestimmen der toxizitaet von waessrigen fluessigkeiten |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OI | Miscellaneous see part 1 | ||
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |