DE68909997T2 - Vorrichtung zur Kultur von tierischen Zellen, Kulturmethode und Mittel zum Nachweis der Kultur. - Google Patents

Description

• Diese Erfindung betrifft die Kultivierung tierischer Zellen und insbesondere eine Vorrichtung zur Kultivierung tierischer Zellen, die die Messung und Diagnose des Aktivierungszustandes von tierischen Zellen bei der Kultivierung ermöglicht, während die physiologischen Bedingungen der tierischen Zellen beibehalten werden, ein Kultivierungsverfahren und eine Diagnose der Kultur.
• Die Herstellung neuer medizinischer Arzneimittel durch die Kultivierung tierischer Zellen ergibt einen Ausstoß von nicht mehr als ungefähr ng-ug/10&sup6; Zellen pro Tag. Die Verbesserung der Arzmeitmittelproduktivität erfordert (1) eine hohe Verdichtung von Zellen und eine Entwicklung einer Vorrichtung mit hoher Kapazität und (2) eine Erzielung hoher sekretorischer Aktivität der Zellen. Um das oben genannte (2) zu erreichen, ist es notwendig, Aktivitäten der Zellen in einem Kultivierungsmedium (Überleben, Teilung, Sekretion etc. unter der Bedingung zu untersuchen, daß die physiologischen Bedingungen der Zellen beibehalten werden und das System geschlossen ist. Gegenwärtig ist es jedoch allgemein üblich, Anteile von lebenden und toten Zellen nach einem Färbungsverfahren zu bestimmen, bei dem ein Zellfärbungsmittel in ein einem Kultivierungsbehälter entnommenen Kultivierungsmedium eingeführt wird.
• Bei dem oben genannten Färbungsverfahren wird ein Färbungsmittel eingeführt etc., d.h., die Messung kann nicht unter der Bedingung durchgeführt werden, daß die physiologischen Bedingungen der Zellen beibehalten werden, und es ist daher nicht möglich, das Kultivierungsmedium dem Kultivierungsbehälter wieder zuzuführen. Demzufolge ist das Meßsystem ein offenes System, und es ist nicht möglich, die Infizierung verschiedenartiger Mikroorganismen etc. zu verhindern. Die Wachstumsgeschwindigkeit von tierischen Zellen beträgt nicht mehr als 1/100 der der Mikroorganismen. Somit bedeutet der Einschluß eines Mikroorganismus in das Kultivierungssytem das Ende der neuen Arzneimittelherstellung.
• Weiterhin wird für Zellen, die in einem mikroskopisch untersuchbaren Behälter, wie einer Mikroplatte, einer Schale oder einem Kultivierungsflasche, kultiviert werden, ein Verfahren vorgeschlagen, durch welches der Zustand von lebenden oder toten Zellen durch Bildverarbeitung [Japanisches Patent Kokai (offengelegt) Nr. 201332/1987] bestimmt werden kann. Dieses Verfahren ist auf Spezies anwendbar, die unter Verwendung der oben genannten kleinen Behälter kultiviert werden. Es ist jedoch schwierig, das oben genannte Verfahren bei einer Vorrichtung mit einem praktischen Kultivierungsumfang anzuwenden.
• Darüber hinaus wird durch das oben genannte Verfahren lediglich der Zustand "lebend oder tot" der Zellen bestimmt, und es gibt momentan kein industrielles Verfahren zur Bestimmung ihres Aktivitätszustands.
• DE 3139310 beschäftigt sich mit morphologischen Eigenschaften, die bei der Bestimmung des Prozentsatzes von Keimzellen verwendet werden, die zur Steuerung des Gärungsprozesses dienen. Das Dokument betrifft speziell Hefe- oder Bakterienzellen und nicht tierische Zellen. Es ist zu beachten, daß Hefe und Bakterien eine extrem schnelle Wachstumsgeschwindigkeit haben und einfach zu kultivieren sind.
• DE 3516529 offenbart eine Trübungsmessung von mikroorganischen Kulturen wie Zell-, bakteriologische, Hefe- und Algenkulturen, bei der eine Strömungsmeßzelle verwendet wird.
• Eine Zellgrößenverteilung wird nicht gemessen. Darüber hinaus offenbart die Erfindung nicht speziell die Messung von tierischen Zellen.
• JP 62201332 betrifft eine Messung der Zellanzahl durch Digitalisierung des Bildes von kultivierten Zellen in einer Vorrichtung, eine Verarbeitung desselben durch Verwendung eines Raumfilters und eine Messung des Zustandes der kultivierten Zellen.
• Bei diesem Verfahren wird die Anzahl der lebenden und der toten Zellen direkt gemessen.
• Bei diesem Verfahren erfolgt somit keine Bestimmung der Zellgrößenverteilung.
• JP 60031888 offenbart eine automatische Erfassung der Anzahl des Auftretens von Fasermikroorganismen durch Analysierung der Informationen eines mikroskopischen Bildes.
• EP 0 336 974 schließlich betrifft eine Zellvermehrungsvorrichtung, bei der die Zellkultur durch Färben der Zellen untersucht wird.
• Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Diagnostizieren der Aktivität und des Kultivierungszustands von Zellen, die für die Diagnose als Probe genommen werden, wobei die physiologischen Bedingungen der Zellen beibehalten werden, und ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Kultivieren von Zellen, die es ermöglicht, den Aktivitätszustand der Zellen zu diagnostizieren, ohne das Kultivierungssystem zu schädigen, und eine Vorrichtung für die Ausführung des obigen Verfahrens zu schaffen.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird dieses Ziel durch die in den Ansprüchen 1 bzw. 2 und die in Anspruch 4 beschriebene Vorrichtung erreicht.
• Diese Erfindung kann für die Kultivierung tierischer Zellstämme, wie menschlicher Lymphoblasten (IM-9:U.S. A.T.C.C.), Leberzellen von Ratten JTC-1, Maus-Maus Hybridoma (STK-1: U.S. A.T.C.C.) etc. angewendet werden.
• Es versteht sich von selbst, daß diese Erfindung für die Kultivierung beliebiger Zellen anwendbar ist, die eine Zellgrößenverteilung zeigen, wie sie in Fig. 1 gezeigt ist, die später diskutiert wird.
• Fig. 1 zeigt experimentelle Daten der Größen- und Verteilungszustände tierischer Zellen. Fig. 2 zeigt ein Modell für Zustände des Wachstums, der Teilung und des Todes tierischer Zellen. Fig. 3 bis 5 sind schematische Ansichten, die eine Vorrichtung zur Diagnose der Zellaktivität dieser Erfindung zeigen. Fig. 6 und 7 sind schematische Ansichten, die die Diagnose der Zellaktivität und das Steuersystem des Kultivierungsbehälters dieser Erfindung zeigen. Fig. 8 bis 9 zeigen typische Ansichten eines Verfahrens zum Verarbeiten von Bildern von Zellen, die kultiviert werden. Fig. 10 zeigt ein Beispiel der resultierenden Zelldurchmesserverteilung. Fig. 11 zeigt eine Vorrichtung zur Diagnose der Zellaktivität als eine Ausführungsform dieser Erfindung. Fig. 12 zeigt eine Vorrichtung zur Steuerung der Diagnose der Zellaktivität als eine Ausführungsform dieser Erfindung. Fig. 13 und 14 zeigen schematisch perspektivische Ansichten einer Zelle zur Diagnose von Zellen als eine Ausführungsform der Erfindung.
• Anhand von Fig. 1 wird die Beurteilung des Zustands "lebend oder tot" der Zellen beschrieben.
• Fig. 1 zeigt ein Beispiel der Zellgrößenverteilungen, die durch mikroskopische Untersuchung von etwa 100 Zellen anhand des Färbungsverfahrens von Leberzellen von Ratten JTC-1 in einem beständigen Zustand während eines Kultivierungsprozesses festgestellt wurden. In der Fig. zeigt der schraffierte Teil der Verteilung lebende Zellen und der unausgefüllte Teil der Verteilung tote Zellen. Die Zellgrößen liegen in einem Bereich von ungefähr 10 um bis ungefähr 40 um. Die lebenden Zellen sind auf der Seite der kleineren Zahlen verteilt, tote Zellen sind auf der Seite der größeren Zahlen verteilt. Die obige Verteilung besteht aus
• 1 einem Bereich von nur lebenden Zellen,
• 2 einem Bereich von lebenden und toten Zellen und
• 3 einem Bereich von nur toten Zellen.
• Auf der Grundlage der obigen charakteristischen Verteilungsstruktur ist es möglich, Anteile von lebenden Zellen, toten Zellen und Zellen mit Teilungspotentialen zu bestimmen. Das Verhältnis lebende Zellen/tote Zellen in dem obigen Bereich von lebenden und toten Zellen beträgt 1:1, und die lebenden Zellen in dem Bereich von lebenden und toten Zellen haben überhaupt kein Teilungspotential. Die in dem obigen Bereich 1 verteilten lebenden Zellen haben ein Teilungspotential.
• Die obige Zellgrößenverteilung stimmt mit der fortschreitenden Erscheinung des Wachstums, der Teilung und des Todes von Zellen überein, wie es typischerweise in Fig. 2 gezeigt ist. Wenn eine Zelle auf eine bestimmte Größe (zweidimensionale Größe ihre Fläche wird als 1 angenommen) anwächst, erfährt die Zelle statistisch eine Teilung, und ihre Fläche nach der Teilung beträgt physikalisch 0,64 der Fläche, die die Zelle vor der Teilung einnahm. Wenn reproduzierte Zellen auf eine Größe mit einer Fläche von 1 anwachsen, erfahren die Zellen eine Teilung. Die Flächen der Zellen mit Teilungspotential betragen zwischen 0,64 und 1. Eine Zelle, die keine Teilung mehr erfährt, wächst dann bis zu ihrem endgülgigen Tod auf eine Fläche von über 1 an.
• Nach dem Tod einer Zelle fließen Cytoplasmen wie z.B. Mitochondrien etc. aus der Zelle heraus, und die Zelle schwillt an und wird merklich größer. Ihr Nukleus verschwindet, und schließlich dispergiert die Zelle in einem Kultivierungsmedium. In Übereinstimmung zwischen dem Verlauf des Wachstums, der Teilung und des Todes und der in Fig. 1 gezeigten Zellgrößenverteilung, entspricht der Zustand der Fläche mit 1 einer Grenze zwischen den Verteilungen 1 und 2, und der Zustand des Zelltodes entspricht einer Grenze zwischen den Verteilungen 2 und 3. Ein tatsächlicher Verlauf der Zellkultivierung zeigt Größenveränderungen der Zellen, die schließlich sterben, und somit tritt die Verteilung 2 auf. In dem Verhältnis lebende Zellen/tote Zellen in der Verteilung 2 ist der Anteil der lebenden Zellen größer, je kleiner die Zellgrößen sind, und kleiner, je größer die Zellgrößen sind. Das Verhältnis lebende Zellen/tote Zellen in der Verteilung 2 ist nahezu 1:1.
• Wie oben erwähnt, ist es möglich, das Verhältnis lebend/tot und die Teilungsaktivitäten der Zellen zu bestimmen, indem die Zellgrößenverteilungen gemessen werden. Die Messung der Zellgrößenverteilung kann ohne die Zuführung fremder Substanzen in ein Kultivierungssystem durchgeführt werden. Daher können die obigen Zellaktivitäten diagnostiziert werden, ohne die Zellen von ihrem Kultivierungssystem zu isolieren.
BEISPIEL
• Fig. 3 zeigt eine Vorrichtung zur Diagnose von Zellen als eine Ausführungsform dieser Erfindung. Die Vorrichtung weist einen Kultivierungsbehälter 1, einen Beobachtungsabschnitt 2 für ein Kultivierungsmedium, Einrichtungen 3 zum Einführen eines Kultivierungsmediums in den Beobachtungsabschnitt 2, eine Meßvorrichtung 4 zum Messen der Zellgrößen in dem Beobachtungsabschnitt 2, einen Analysator 8 zur Bestimmung eines Anteils der Zellen mit Teilungspotential (oder eines Anteils der Zellen ohne Teilungspotential) oder eines Anteils lebender Zellen (oder eines Anteils toter Zellen) auf der Grundlage einer Zellgrößenverteilung, und Einrichtungen 6 zum Rückführen eines Kultivierungsmediums in den Beobachtungsabschnitt 2 zu einem Kultivierungsmedium in dem Kultivierungsbehälter auf. Die Einrichtungen 3 und 6 und der Beobachtungsabschnitt 2 sind so aufgbebaut, daß das Kultivierungsmedium zurückgeführt werden kann, wenn es von der Außenseite des Kultivierungssystems isoliert ist.
• Das Kultivierungsmedium in dem Kultivierungsbehälter wird dem Beobachtungsabschntitt 2 teilweise zugeführt, und Zellen in dem teilweise zugeführten Kultivierungsmedium werden in dem Beobachtungsabschnitt 2 durch die Meßeinrichtung 4 für eine Bestimmung der Zellgrößenverteilung gemessen. Ein äquivalenter Durchmesser oder eine Fläche können zur Darstellung der Zellgröße verwendet werden. Wenn die Messung beendet ist, wird das Kultivierungsmedium in dem Beobachtungsabschnitt 2 in den Kultivierungsbehälter 1 zurückgeführt. Eine Information über die Zellgröße wird von der Meßeinrichtung 4 an den Analysator 8 übertragen, und der Analysator 8 bestimmt auf der Grundlage der obigen Informationen die Aktivität der Zellen (Teilungsaktivität, Lebenserhaltungsaktivität), um das Ergebnis anzuzeigen.
• Im allgemeinen wird das Kultivierungsmedium von dem Kultivierungsbehälter 1 intermittierend dem Beobachtungsabschnitt 2 zugeführt. Es gibt jedoch einige Arten von Meßeinrichtungen, die die obige Verteilung messen können, während das Kultivierungsmedium kontinuierlich zugeführt wird.
• Fig. 4 zeigt eine Einrichtung zur Diagnose der Zellaktivität in einer Ausführungsform dieser Erfindung, bei der eine Bildverarbeitungsvorrichtung in der obigen Meßeinrichtung 4 verwendet wird. Die Bildverarbeitungsvorrichtung weist eine Bildaufnahmeeinrichtung 4' und eine Bildverarbeitungseinrichtung 5 auf. Ein Bild der Zellen wird von der Bildaufnahmeeinrichtung 4' an die Bildverarbeitungseinrichtung 5 übertragen. Vorzugsweise hat die Bildaufnahmeeinrichtung 4' eine Vergrößerungsfunktion wie z.B. eine mikroskopische Funktion. Der Mengendurchsatz eines Kultivierungsmediums in dem Beobachtungsabschnitt 2 kann etwa ein Präzipitationsdurchsatz von Zellen in einem stationären Kultivierungsmedium sein.
• Fig. 5 zeigt den Aufbau der Bildverarbeitungsvorrichtung 5 und des Analysators 8 im Detail, und ihre Aktivitäten werden nachfolgend erläutert.
• Als erstes werden von der Bildaufnahmeeinrichtung 4' erhaltene Bildsignale an einen A/D-Wandler 51 der Bildverarbeitungsvorrichtung 5 übertragen. Der A/D-Wandler 51 wandelt analoge Bildsignale in digitale Signale um. Das heißt, das Bild wird nicht nur vertikal und horizontal in kleine Pixel unterteilt, sondern es werden auch analog- digital gewandelte Bildsignale zu einem Multielementebild aufgebaut, in dem die Pixel digitale Helligkeitswerte haben. Zum Beispiel wird ein Bild vertikal und horizontal in 256 x 256 Pixel unterteilt und mit einer Auflösung von 128 Helligkeitsstufen digitalisiert. Die analog-digital gewandelten Bildsignale werden in einem 51M-Bildspeicher gespeichert. Das in dem 51M-Bildspeicher gespeicherte Multielementebild wird an eine Zellbild- Erkennungsschaltung 60 übertragen. Die Zellbild-Erkennungsschaltung 60 erkennt alle lebenden oder toten Zellen, berechnet ihre Anzahl und Größe und ihre Partikeldurchmesserverteilung. Die berechneten Ergebnisse werden an den Analysator 8 übertragen, und der Analysator berechnet auf der Grundlage der obigen berechneten Ergebnisse die Anzahl der lebenden und toten Zellen und die Anzahl der Zellen mit Teilungspotential. Gleichzeitig diagnostiziert er den Aktivitätszustand der Zellgruppen auf der Grundlage dieser berechneten Ergebnisse.
• Fig. 6 zeigt eine Ausführungsform von Multiwertbilddaten, die in dem 51M-Bildspeicher gespeichert sind. Das Multielementebild ist ein Bild mit unterschiedlich hellen Pixeln, wie zuvor beschrieben. Es gibt kleine und große Zellen. In Fig. 6 stellen Zellen mit kleinen Partikeldurchmessern lebende Zellen und Zellen mit großen Partikeldurchmessern tote Zellen dar. Zellen mit dazwischenliegenden Durchmessern stellen Zellen in einem Zustand mit gleichzeitig vorhandenen lebenden und toten Zellen dar. Das Bild in Fig. 6 wird an die Zellbild-Erkennungsschaltung 60 übertragen, die alle lebenden und toten Zellen erkennt und die Anzahl, Größe, Form und Helligkeit der Zellen etc. berechnet. Dieses Beispiel erläutert eine Berechnung der Größe und der Anzahl.
• Eine Vorverarbeitungsschaltung 61 führt die Vorverarbeitung durch, um die Zellen von dem Mulitelementebild aus dem 51M-Bildspeicher zu erkennen. Beispiele der Vorverarbeitung sind unter anderem Glättung, Helligkeitshervorhebung, Konturenhervorhebung etc. Eine Zellerkennung ist jedoch nicht hinreichend genau, wenn nur eine Raumfilterbehandlung durchgeführt wird, und eine Helligkeitshervorhebungsbehandlung vor der Raumfilterbehandlung ist besonders effektiv. Die maximale Helligkeitshervorhebungsbehandlung ist eine Art von nicht linearer Umgebungsberechnung, und ihre speziellen Details werden anhand von Fig. 7 beschrieben. In einem Bereich von 3 x 3 Pixeln (bei dem die Helligkeiten durch k&sub1; bis k&sub9; angegeben werden), der, wie in Fig. 7 gezeigt, ein Pixel der Helligkeit k&sub5; in der Mitte aufweist, wird die maximale Helligkeit in dem Bereich neu an die Stelle des Bildelements der Helligkeit k&sub5; gesetzt. Die Berechnungsformel lautet wie folgt:
• k&sub5; = MAX [k&sub1; k&sub9;] ..... (1)
• Wenn beispielsweise k&sub1; die stärkste Helligkeit von k&sub1; bis k&sub9; ist, d.h. MAX [k&sub1; k&sub9;] = k&sub1;, so verändert sich die Helligkeit des Pixel mit einer Helligkeit von k&sub5; in k&sub1;. Alle Bildelemente werden auf die hier beschriebene Weise behandelt, um neue Multiwertbilddaten zu erhalten. Diese Behandlung hat die Funktion, die Helligkeit des mittleren Abschnitts einer Zelle hervorzuheben, da der mittlere Abschnitt sehr hell ist.
• Außerdem gibt es eine Funktion, die dunklen Abschnitte einer Zellkontur zu löschen. Darüber hinaus ist es in der Vorverarbeitungsschaltung 61 weiterhin effektiv, eine Raumfilterbehandlung durchzuführen, um die hellen Abschnitte durch Verwendung eines in Fig. 8 gezeigten Maskenmusters hervorzuheben. In Fig. 8 stellen die p's positive Werte und die m's negative Werte dar. Die Behandlung ermöglicht eine selektive Hervorhebung einzelner Zellen.
• Eine Binärisierungsschaltung 62 führt eine Binärisierung durch, bei der Abschnitte mit höherer Helligkeit als die gegebene Helligkeit ka "1" und die anderen Abschnitte "0" gesetzt werden. Fig. 9 zeigt ein durch diese Binärisierung erhaltenes Bild des Bildes von Fig. 6. In Fig. 9 zeigen durch schräge Linien dargestellte Abschnitte den Hintergrund, und unausgefüllte Abschnitte zeigen Zellen. Wenn Zellen groß sind und das Innere der Zellen als Lücke binärisiert ist, wird eine Behandlung zum Ausfüllen der Lücke durchgeführt, die hier jedoch nicht erläutert werden soll. Durch die obigen Verfahren ist die selektive Erkennung einzelner Zellen möglich. Die Parameter m, p, ka, etc., die für die Vorverarbeitung und Binärisierung erforderlich sind, werden durch eine Konditionierungsschaltung 66 festgelegt.
• Bei einem durch die Binärisierungsschaltung 62 binärisierten Bild vergibt eine Markierungsschaltung 63 Zahlen an die darin befindlichen Zellen und zählt ihre Zahlen, und jede Zelle erfährt die folgende Behandlung. Das heißt, eine nächste Flächenberechnungsschaltung 64 berechnet die Fläche jeder Zelle. Dann berechnet eine Schaltung 5 zur Berechnung einer Zelldurchmesserverteilung einen Durchmesser durch Klassifizierung von Zellflächen. Z.B. wird die Klassifizierung alle 1 um durchgeführt. In diesem Fall kann ein einem Kreis äquivalenter Durchmesser etc. als ein typischer Zelldurchmesser verwendet werden. Die berechnete Zelldurchmesserverteilung wird zum Analysator 8 übertragen.
• Der Analysator 8 erhält Werte der Zellgrößenverteilung und diagnostiziert vollständige Aktivitäten der Zellgruppen. Ein Beispiel der resultierenden Zelldurchmesserverteilung ist in Fig. 10 gezeigt. Dieses Prinzip wird erreicht, indem ein Modell einer Beziehung zwischen dem Wachstum (Vergrößerung des Zelldurchmesssers) und der Durchmesserverteilung der Zellen gebildet wird. D.h., in dem Analysator 8 berechnen eine Schaltung 81A zur Berechnung lebender Zellen, eine Schaltung 81E zur Berechnung toter Zellen bzw. eine Schaltung 81C zur Berechnung gleichzeitig vorhandener lebender und toter Zellen die Anzahl der Zellgruppen. Mit anderen Worten werden eine Formel für lebende Zellen (2), eine Formel für tote Zellen (3) und eine Formel für gleichzeitig vorhandene lebende und tote Zellen (4) in Modellen mit unterschiedlichen Durchmesserverteilungen erstellt. Vorausgesetzt, die an den Grenzen der Zellgruppen vorhandenen Zelldurchmesser sind dam und dme, wie es in Fig. 10 gezeigt ist, so ist
• lebende Zellen d ≤ dam : N(da) = Fa(d) ..... (2)
• tote Zellen d > dme : N(de) = Fe(d) ... (3)
• gleichzeitiges Vorhandensein dam < d &le; dme : N(dm) = Fm(d) ... (4)
• Gesamtanzahl der Zellen : Nt(d) = N(da) + N(de) + N(dm) ..... (5)
• In den obigen Formeln stellen da, de und dm jeweils nur Zelldurchmesser von lebenden Zellen, toten Zellen bzw. gleichzeitig vorhandenen lebenden und toten Zellen dar, und N(da) N(de) und N(dm) stellen jeweils die Anzahl solcher Zellen dar. Darüber hinaus sind Fa(d), Fe(d) und Fm(d) Funktionen von Zelldurchmesserverteilungen, und Fa(d) ist eine normale Verteilung, Fm(d) ist eine homogene Verteilung und Fe(d) ist eine gleichförmige abnehmende Verteilung (z.B. Exponentialverteilung). Wie hier erwähnt, führen die Schaltung 81A zur Berechnung lebender Zellen, die Schaltung 81B zur Berechnung toter Zellen und die Schaltung 81C zur Berechnung gleichzeitig vorhandener lebender und toter Zellen Berechnungen durch, um modellbildende Partikeldurchmesserverteilungen auf die Zellpartikeldurchmesserverteilung anzuwenden, die von der Zellbilderkennungsschaltung 60 übertragen worden ist, um dadurch die Zelldurchmesser dam und dme zu bestimmen, die die Grenzen der einzelnen Verteilungen bilden. Wenn die Grenzzelldurchmesser dam und dme bestimmt sind, können N(da), N(de) und N(dm) einfach aus der von der Zellbilderkennungsschaltung 60 übertragenen Zelldurchmesserverteilung ermittelt werden. Die obigen N(da), N(de) und N(dm) können auch ermittelt werden, indem dam und dme durch die Konditionierungsschaltung 82 in den beständigen Zustand gebracht werden.
• Die Anzahl der Zellen in jeder der Verteilungen kann wie oben beschrieben berechnet werden. Daher können verschiedene Aktivitäten der Zellgruppen als Ganzes diagnostiziert werden. Diagnosen werden nachstehend im einzelnen diskutiert.
• Eine Aktivitätsberechnungsschaltung 83 berechnet z.B. eine Zellüberlebensrate &epsi; in der folgenden Formel.
• Bei der Aktivitätsberechnungsschaltung 83 wird ein Verhältnis der Zellen mit Teilungspotential in der folgenden Formel berechnet.
• Ähnlich wird in einer Aktivitätsberechnungsschaltung 83 ein Verhältnis Re toter Zellen in der folgenden Formeln berechnet.
• Zusätzlich zu dem oben genannten werden in der Aktivitätsberechnungsschaltung 83 temporäre Veränderungen lebener Zellen { N(da) + 1/2N(dm)} und toter Zellen { N(de) + 1/2N(de)} berechnet, d.h., in den folgenden Formeln werden eine Wachstumsrate und eine Todesrate berechnet.
• Wachstumsrate = d{N(da) + ½ N(dm)} / dt ..... (9)
• Todesrate = d{N(de) + ½ N(dm)} / dt ..... (10)
• Auf der Grundlage dieser Formeln werden Zellen auf das Wachstum, die Aktivitätsabnahme oder den Todeszustand hin diagnostiziert. Selbst wenn Re z.B. groß ist, weist die größere Wachstumsrate auf das größere Wachstumspotential und die Aktivität der Zellen hin. Selbst wenn Re klein ist, weist die größere Todesrate richt nur auf schnellen Zelltod, sondern auch auf die geringere Zellenaktivität hin. Die Aktivitäten der Zellgruppen werden wie oben beschrieben diagnostiziert.
• Diese Diagnoseergebnisse werden einem Inferenzmotor 95 zugeführt. Auch Werte, die von einem Temperatursensor, einem pH-Sensor, einem Sensor mit gelöstem Sauerstoff (DO) und einem Sensor mit gelöstem Kohlendioxidgas (DCO&sub2;) gemessen werden, werden dem Inferenzmotor als Zellkultivierungs-Umgebungsfaktoren zugeführt. Daneben sind sortierte experimentelle und theoretische Daten des Wachstums und des Stoffwechsels der Zellen in einer Datenbank 90 gespeichert. Der Inferenzmotor 95 leitet den Zellzustand aus den Informationen der Datenbank, den gemessenen Werten der Kultivierungsumgebung und den diagnostizierten Ergebnissen der Bildmessung der Zellgruppen ab und gibt einem Computer einen Befehl, der notwendig ist, um das Kultivierungsmedium zu steuern. Wenn z.B. DO abnimmt, um die Wachstumsrate der Zellen zu verringern, leitet der Inferenzmotor 95 daraus eine DO-Knappheit ab und erhöht die Rate der Bläschengeneration durch einen Kompressor, um DO zu erhöhen. Wenn der pH-Wert abnimmt, um die Todesrate zu erhöhen, leitet der Inferenzmotor 95 daraus ab, daß der pH-Wert zu niedrig ist, und erhöht den pH-Wert, indem ein Alkalimittel zugeführt wird, so daß der Teildruck des Kohlendioxidgases oder dergleichen angepaßt wird.
• Fig. 11 zeigt eine Vorrichtung zur Diagnose der Zellaktivität als eine Ausführungsform dieser Erfindung. Diese Vorrichtung ist eine einstückige Anordnung aus dem Kultivierungsbehälter 1 und dem Beobachtungsabschnitt 2, wie es in Fig. 4 gezeigt ist, bei der ein Kultivierungsmedium in dem Kultivierungsbehälter dem Beobachtungsabschnitt 2 teilweise durch eine Schleuderströmung in dem Kultivierungsbehälter zugeführt wird und das Kultivierungsmedium von dem Beobachtungsabschnitt 2 in den Kultivierungsbehälter zurückgeführt wird.
• Fig. 12 zeigt eine Vorrichtung zur Steuerung der Diagnose der Zellaktivität als eine Ausführungsform dieser Erfindung. Diese Vorrichtung weist einen Kultivierungsbehälter 1 mit Einrichtungen (1', 1", 1"' etc.) zur Einstellung von Umgebungsfaktoren an ein Kultivierungsmedium in dem Kultivierungsbehälter (Konzentration des Nahrungsgehalts, Konzentration von gelöstem Sauerstoff, Konzentration von Abfallproduktin wie Ammoniak, Milchsäure oder dergleichen, Zellalter, Produktkonzentration etc.), einen Beobachtungsabschnitt 2, eine Einführungsvorrichtung 3 zum Einführen eines Kultivierungsmediums in den Beobachtungsabschnitt 2, eine Meßeinrichtung 4 zum Messen einer Zellgrößenverteilung in dem Beobachtungsabschnitt 2, einen Analysator 8 zur Bestimmung eines Anteils der Zellen mit Teilungspotential (oder eines Anteils der Zellen ohne Teilungspotential) oder eines Anteils lebender Zellen (oder eines Anteils toter Zellen) auf der Grundlage einer Zeilgrößenverteilung, und Einrichtungen 6 zum Rückführen eines Kultivierungsmediums in den Beobachtungsabschnitt 2 in ein Kultivierungsmedium in dem Kultivierungsbehälter auf. Die obigen Einrichtungen 3 und 6 und der Beobachtungsabschnitt 2 sind so aufgbebaut, daß das Kultivierungsmedium, wenn es von der Außenseite des Kultivierungssystems abgeschnitten ist, zurückgeführt wird.
• Das Kultivierungsmedium in dem Kultivierungsbehälter wird dem Beobachtungsabschnitt 2 teilweise zugeführt, und Zellen in dem zugeführten Kultivierungsmedium werden durch die Meßeinrichtung 4 für eine Verteilung ihrer Größen gemessen. Nenndurchmesser, Flächen etc. können zur Darstellung der Zellgröße verwendet werden. Das für die Messung in dem Beobachtungsabschnitt 2 verwendete Kultivierungsmedium wird in den Kultivierungsbehälter 1 zurückgeführt. Eine Information über eine Zellgrößenverteilung wird von der Meßeinrichtung 4 zu dem Analysator 8 übertragen, der auf der Grundlage der obigen Informationen die Zellaktivität (Teilungsaktivität, Überlebensaktivität) bestimmt. Darüber hinaus stellt der Analysator 8 die Umgebungsbedingungen für das Kultivierungsmedium in dem Kultivierungsbehälter richtig ein, indem die obigen Einstelleinrichtungen 1', 1", 1"' etc. auf der Grundlage der resultierenden Zellaktivitäten gesteuert werden.
• Das Verfahren der Steuerung der Umgebungsbedingungen für das Kultivierungsmedium in dem Kultivierungsbehälter wird nachfolgend erläutert.
• Durch Verwendung eines Anteils &eta; von Zellen mit Teilungspotential (= Anzahl der Zellen mit Teilungspotential/Anzahl lebender Zellen) und eines Anteils &epsi; lebender Zellen (= Anzahl lebender Zellen/Anzahl der gesamten Zellen), kann die Anzahl N während t Stunden Zeit registrierter lebender Zellen durch die folgende Formel dargestellt werden.
• wenn (n + 1) T > t &ge; nT, dann t/T = n
• In der obigen Formel stellt NO eine Anzahl der gesamten Zellen dar, wenn t=0, und T ist ein Zellzyklus und n ist gleich 0 oder eine positive ganze Zahl.
• D.h., es ist möglich, die Anzahl der während t Stunden Zeit lebenden Zellen zu simulieren, indem die Formel (11) verwendet wird. Auf der Grundlage des Ergebnisses der obigen Simulation ist es auch möglich, die Umgebungsbedingungen zu untersuchen, denen das Kulitvierungsmedium in dem Kultivierungsbehälter ausgesetzt ist. Zusätzlich zu der Konzentration von gelöstem Sauerstoff, der Konzentration des Nahrungsgehalts und der Konzentration des Abfallgehalts in dem Kultivierungsmedium enthalten die obigen Umgebungsbedingungen die folgenden Werte P und Q.
• P = Zellkonzentration x Aufenthaltszeit ..... (12)
• Q = Zellkonzentration x Aufenthaltszeit / schwimmende Substanzkonzentration in zugeführter Flüssigkeit mit Nahrungsgehalt ..... (13)
• Wenn die obigen Werte P oder Q so gesteuert werden, daß sie sich bei Beachtung der obengenannten Umgebungsbedinungen in einem bestimmten Bereich befinden, ist es möglich, verschiedene Zellaktivitäten (Atmungsaktivität, Wachstumsaktivität, sekretorische Aktivität, endogene Atmungsaktivität etc.) zu steuern. D.h., es ist möglich, die Aktivitäten wahlweise zu steuern; z.B. kann die Wachstumsaktivität stärker als die anderen Aktivitäten gesteigert werden, die sekretorische Aktivität kann stärker als die anderen Aktivitäten gesteigert werden und dergleichen.
• Im folgenden wird eine Meßvorrichtungszelle zur Messung der Zellgrößen in dieser Erfindung erläutert.
• Fig. 13 ist eine perspektivische Ansicht, die eine Ausführungsform der Zelle zeigt. Fig. 14 ist eine typische perspektivische Ansicht eines Zellabschnitts, in dem ein Kultivierungsmedium aus Zellen strömt.
• Die Beobachtungsabschnittszelle 2 hat einen Aufbau wie er in Fig. 14 gezeigt ist, der dadurch gebildet wird, daß als ein Abstandselement 11 eine Polytetraethylenschicht (mit einer Dicke von etwa 100 um) mit einem sechseckigen Fenster verwendet wird, und daß die Schicht zwischen zwei Glasplatten 12 und 13 plaziert wird. Die beiden Glasplatten sind durch zwei Metallträgerrahmen 16 und 17 und Schrauben (nicht gezeigt) befestigt. Die Zelle ist mit einem Einlaßrohr 14 für das Zellkutlivierungsmedium und einem Auslaßrohr 15 für dieses versehen. Darüber hinaus kann die Beobachtungsabschnittszelle einer Sterilisierungsbehandlung unter Wärme (120ºC) ausgesetzt werden.
• Darüber hinaus ist die obige Zelle auf einer Plattform 18 plaziert, die in der Richtung X-Y frei bewegbar ist, und mit einem Aufbau versehen, der eine Messung durch die über der Zelle plazierte Meßeinrichtung 4 mittels einer in dem unteren Abschnitt der Plattform plazierten Lichtquelle (nicht gezeigt) emittiertes Licht ermöglicht.
• Ein Kultivierungsmedium wird von einer mit dem Kultivierungsbehälter verbundenen Umlaufleitung (nicht gezeigt) durch das Einlaßrohr 14 in die Zelle eingeführt, und die Plattform und eine Beobachtungsvorrichtung werden so bedient, daß sie die Größen tierischer Zellen beobachten. Bei der Diagnose des Aktivierungszustands von Zellen wird ein Zellbild, das von einer an der Meßvorrichtung 4 angebrachten Bildaufnahmevorrichtung (in Fig. 4 als 4' bezeichnet) aufgenommen wird, von einer Bildverarbeitungseinrichtung (in Fig. 4 als 5 bezeichnet) verarbeitet, und die resultierenden Daten werden von einer Analyseeinrichtung (in Fig. 4 als 8 bezeichnet) diagnostiziert.
• Das die gemessenen Zellen enthaltende Kultivierungsmedium wird durch das Auslaßrohr 15 zu dem Kultivierungsbehälter zurückgeführt.
• Wie oben erwähnt, besteht weder eine Gefahr der Infizierung verschiedenartiger Mikroorgansimen, noch gibt es einen Verlust von Produkten wie eines Kultivierungsmedium etc., da diese Ausführungsform die Diagnose des Aktivierungszustands von Zellen in dem Zustand ermöglicht, in dem das Kultivierungssystem und das Diagnosesystem von der Außenseite des Vorrichtungssystems abgeschnitten sind.
• Wie oben beschrieben wurde, sind das Kultivierungssystem und das Diagnosesystem von der Außenseite des Vorrichtungssystems abgeschnitten. Daher gibt es keine Infizierung verschiedenartiger Mikroorganismen etc., und nützliche Zellen und Produkte werden nicht zerstört. Da es darüber hinaus möglich ist, ohne weiteres Daten über den Anteil von Zellen mit Teilungspotential und über den Anteil lebender Zellen zu erhalten, ist eine einfache und sofortige Steuerung der Umgebungsfaktoren auf der Gundlage der Daten möglich, denen der Kultivierungsbehälter ausgesetzt ist. Daher kann die Kultivierungseffizienz gesteigert werden.

Claims (5)

1. Verfahren zum Diagnostizieren des Aktivitätszustandes tierischer Zellen während des Kultivierens der Zellen mit folgenden Schritten:

Entnehmen eines Teils einer die tierischen Zellen enthaltenden Kultivierungsflüssigkeit aus einem Kultivierungsbehälter (1);

Aufnehmen eines optischen Bildes des Teils der Kultivierungsflüssigkeit durch ein optisches Gerät;

Umwandeln des optischen Bildes in elektrische Signale;

Messen der Größe tierischer Zellen in dem Teil der Kultivierungsflüssigkeit auf der Basis der Signale durch Bildverarbeitung;

Berechnen der Zellgrößenverteilung der tierischen Zellen zum Erhalten von Zellendurchmessern innerhalb Grenzen in Gruppen eingeteilter Zellen in der Verteilung; und

Diagnostizieren des Aktivitätszustandes der tierischen Zellen aus den so erhaltenen Grenz-Zelldurchmessern, wobei die gleichen physiologischen Bedingungen des entnommenen Teils der Kultivierungsflüssigkeit wie im Kultivierungsbehälter beibehalten werden, während sich der entnommene Teil der Kultivierungsflüssigkeit ausserhalb des Kultivierungsbehälters befindet.

2. Verfahren zum Kultivieren tierischer Zellen mit folgenden Schritten:

Entnehmen eines Teils einer die tierischen Zellen enthaltenden Kultivierungsflüssigkeit aus einem Kultivierungsbehälter (1), der von der Atmosphäre isoliert ist;

Aufnehmen eines optischen Bildes des Teils der Kultivierungsflüssigkeit durch ein optisches Gerät;

Umwandeln des optischen Bildes in elektrische Signale; Messen der Größe der tierischen Zellen in der Kultivierungsflüssigkeit durch Bildverarbeitung auf der Basis der elektrischen Signale;

Berechnen der Zellgrößenverteilung der tierischen Zellen

auf der Basis der Zellgrößen, zum Erhalten von Zellendurchmessern innerhalb Grenzen in Gruppen eingeteilter Zellen in der Verteilung;

Diagnostizieren des Aktivitätszustandes der tierischen Zellen aus den so erhaltenen Grenz-Zelldurchmessern; und

Rückführen des entnommenen Teils der Flüssigkeit in den Kultivierungsbehälter (1),

wobei der entnommene Teil der Kultivierungsflüssigkeit von der Atmosphäre isoliert wird und wobei die gleichen physiologischen Bedingungen des entnommenen Teils der Kultivierungsflüssigkeit wie im Kultivierungsbehälter beibehalten werden, während sich der entnommene Teil der Kultivierungsflüssigkeit außerhalb des Kultivierungsbehälters (1) befindet.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Zellgrößenverteilung in drei Teile unterteilt wird, einen ersten mit normaler Verteilung wie bei einem Bereich aus lebenden Zellen, einen zweiten mit homogener Verteilung bei Gegenwart eines Bereichs aus lebenden und toten Zellen und einen dritten, der einen Bereich aus toten Zellen darstellt.

4. Vorrichtung zum Kultivieren tierischer Zellen mit einem Kultivierungsbehälter (1) zur Aufnahme einer tierische Zellen enthaltenden Kultivierungsflüssigkeit und zur Kultivation tierischer Zellen in demselben; einer Einrichtung zum Zuführen frischen Kultivierungsmediums zur Kultivierungsflüssigkeit im Kultivierungsbehälter (1);

Einrichtungen zum Entnehmen eines Teils der tierische Zellen enthaltenden Kultivierungsflüssigkeit aus dem Kultivierungsbehälter (1) und zum Rückführen des Teils der Kultivierungsflüssigkeit zum Kultivierungsbehälter;

Einrichtungen zum Aufnehmen eines optischen Bildes der tierischen Zellen in dem Teil der aus dem Kultivierungsbehälter entnommenen Kultivierungsflüssigkeit und zum Umwandeln des optischen Bildes in elektrische Signale;

einer Einrichtung (8) zum Verarbeiten der elektrischen Signale zum Ermitteln der Zellgrößenverteilung und darauf Ermitteln der in Grenzen in Gruppen unterteilter Zellen gegenwärtigen Zellendurchmesser in der Verteilung und

Einrichtungen zum Ausgeben verarbeiteter Information, einschließlich der so ermittelten Grenz-Zelldurchmesser, wobei

eine Steuereinrichtung (95) vorgesehen ist, so daß bis zur Rückführung der Kultivierungsflüssigkeit in den Kultivierungsbehälter die gleichen physiologischen Bedingungen der Kultivierungsflüssigkeit außerhalb des Kultivierungsbehälters wie bei der Kultivierungsflüssigkeit in dem Kultivierungsbehälter beibehalten werden.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Kultivierungsflüssigkeit während der gesamten Kultivation von der Atmosphäre isoliert ist.