CH618736A5

CH618736A5 - Continuous process for the cultivation of microorganisms and apparatus for carrying it out.

Info

Publication number: CH618736A5
Application number: CH1550875A
Authority: CH
Inventors: Karl Klemm
Original assignee: Sick Peter
Priority date: 1974-12-03
Filing date: 1975-11-28
Publication date: 1980-08-15
Also published as: FR2293488B1; FR2293488A1; ES443149A1; ZA757515B; IT1051027B

Description

Die Erfindung betrifft ein kontinuierliches Verfahren zur Kultur von Mikroorganismen, bei dem Messungen in bezug auf das Stoffwechselgeschehen durchgeführt werden, sowie eine Vorrichtung zur Durchfuhrung des Verfahrens. The invention relates to a continuous process for the culture of microorganisms, in which measurements relating to the metabolic process are carried out, and to a device for carrying out the process.

Bei der Kultur von Mikroorganismen in sog. «geschlossenen Systemen» oder «Batch-Verfahren», ändern sich die Kulturbedingungen mit zunehmender Organismenzahl und abnehmendem Nährstoffangebot ständig. In the culture of microorganisms in so-called "closed systems" or "batch processes", the culture conditions change constantly with increasing number of organisms and decreasing nutrient supply.

Zur Kultur von Mikroorganismen unter gleichbleibenden Bedingungen über längere Zeit wurden bisher zwei kontinuierliche Verfahren eingesetzt. Im «Chemostaten» wird einer Kultur mit konstanter Zuflussrate frisches Substrat zugeführt und in gleichem Masse Organismensuspension entnommen, wobei sich ein Fliessgleichgewicht einstellt, das abhängig ist von den Aussenbedingungen und der vorgegebenen Zuflussrate. Im «Turbidostaten» wird die vorhandene Anzahl von Organismen pro Volumeneinheit als optische Dichte der Kultur überwacht und bei ihrer Zunahme durch Zugabe frischen Substrates eine vorgegebene Organismendichte aufrechterhalten. Während bei dem erstgenannten Verfahren ein Regeleingriff nicht möglich ist, wird bei der optischen Dichtemessung nicht zwischen lebenden und toten Organismen und/ To date, two continuous processes have been used to culture microorganisms under constant conditions over a long period of time. In the «chemostat», fresh substrate is added to a culture with a constant inflow rate and organism suspension is removed to the same extent, whereby a flow equilibrium is established, which depends on the external conditions and the specified inflow rate. In the “turbidostat”, the number of organisms per unit volume is monitored as the optical density of the culture, and a predetermined organism density is maintained as it increases by adding fresh substrates. While a control intervention is not possible with the first-mentioned method, optical density measurement does not distinguish between living and dead organisms and /

oder anderen Trübungen unterschieden, was besonders in Grenzbereichen der Kulturbedingungen, die durch erhöhte Absterberaten gekennzeichnet sind, eine exakte derartige Dichteregelung unmöglich macht. Ein Verfahren, bei dem der Prozessablauf durch gasanalytische Messdaten geregelt werden soll, hat sich in der Praxis der kontinuierlichen Kulturen offenbar nicht eingebürgert. or other cloudiness, which makes an exact density regulation of this kind impossible, especially in border areas of the culture conditions, which are characterized by increased death rates. A method in which the process flow is to be controlled by gas analytical measurement data has apparently not become common practice in the practice of continuous cultures.

Keines der vorgenannten Verfahren weist spezifische Vorrichtungen zur gezielten, selektiven Züchtung von Mikroorganismen oder der direkten Überwachung und Registrierung der Stoffwechselleistung für eine Langzeitkultur auf. None of the aforementioned methods has specific devices for the targeted, selective cultivation of microorganisms or the direct monitoring and registration of the metabolic activity for a long-term culture.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu dessen Durchführung zu schaffen, mit dem überwachbare und steuerbare Langzeitkulturen auch in Grenzbereichen von Kulturbedingungen durchgeführt werden können, die einerseits eine selektive Anreicherung von Mikroorganismen, andererseits eine Analyse von deren Stoffwechseleigenschaften unter sich verändernden Bedingungen ermöglichen. Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zumindest ein Parameter aus den Kulturbedingungen und/oder Fremdstoffzugaben und/oder Organismeneigenschaften einem Gradienten in Änderungsrichtung auf einen vorgegebenen Wert unterworfen und die Stoffwechselleistung der Kultur fortlaufend ermittelt wird. Dadurch können gradientengesteuerte Langzeitkulturen durchgeführt werden, die neue Aspekte bezüglich einer selektiven Züchtung und der Untersuchungsmöglichkeiten für Mikroorganismen eröffnen. The object of the invention is to provide a method and a device for carrying it out, with which monitorable and controllable long-term cultures can also be carried out in border areas of culture conditions, which on the one hand selectively enrich microorganisms and on the other hand analyze their metabolic properties under changing conditions enable. According to the invention, this object is achieved by a method which is characterized in that at least one parameter from the culture conditions and / or addition of foreign substances and / or organism properties is subjected to a gradient in the direction of change to a predetermined value and the metabolic output of the culture is continuously determined. In this way, gradient-controlled long-term cultures can be carried out, which open up new aspects with regard to selective breeding and the examination possibilities for microorganisms.

Zur gezielten Selektion und/oder Anreicherung von den interessierenden Bedingungen besser angepassten Organismen oder auch Mutanten wird zweckmässigerweise so vorgegan2 This is expediently used for the targeted selection and / or enrichment of organisms or mutants which are better adapted to the conditions of interest2

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gen, dass der Parameter, auf den sich die Selektion bzw. Adaption beziehen soll, asymptotisch einem Grenzwert der Stoffwechselleistung angenähert wird. Dabei wird der Anstieg des Parametergradienten der laufend gemessenen Stoffwechselleistung der Kultur stetig angeglichen. Die dadurch gegebene graduelle Veränderung einer Bedingung in Anstiegsabhängigkeit zur jeweiligen Stoffwechselleistung der Kultur ermöglicht die gezielte Anreicherung besser angepasster Organismen in der Kultur. that the parameter to which the selection or adaptation should relate is asymptotically approximated to a limit value of the metabolic performance. The increase in the parameter gradient of the continuously measured metabolic performance of the culture is constantly adjusted. The resulting gradual change in a condition depending on the increase in the metabolic performance of the culture enables the targeted accumulation of better adapted organisms in the culture.

Zur Analyse des Stoffwechselverhaltens von Kulturen bei z.B. der Einwirkung von Substanzen, kann unter ständiger Registrierung der Stoffwechselleistung der Kultur bei Konstanthalten aller anderen Parameter, die interessierende Grösse verändert werden. Beispielsweise wird eine Substanzmenge einmalig zugegeben. Damit ist es bei längeren Kulturzeiten auch möglich, bei z.B. Giftstoffen die Erholungsphase, bei fördernden Substanzen die Abklingphase nach erfolgter Einwirkung zu erfassen. Durch Kontrolle des Verlaufes der Stoffwechselleistung bei Ablauf eines vorgegebenen Gradienten, - der also jm Gegensatz zur Selektion nicht rückführend gesteuert wird -, etwa bezüglich der Temperatur oder der Konzentration einzelner Substratkomponenten, können Aussagen über z.B. optimale Konzentrationen oder Werte in bezug auf eine interessierende Optimierung des Stoffwechselablaufes erhalten werden. To analyze the metabolic behavior of cultures in e.g. the influence of substances, the constant size of the metabolic performance of the culture can be changed while keeping all other parameters constant. For example, a quantity of substance is added once. It is also possible with longer cultivation times, e.g. Toxins the recovery phase, in the case of promoting substances, the decay phase after exposure. By checking the course of the metabolic activity when a predetermined gradient has elapsed - which, in contrast to the selection, is not controlled in a retrospective manner - for example with regard to the temperature or the concentration of individual substrate components, statements about e.g. optimal concentrations or values with regard to an interesting optimization of the metabolic process can be obtained.

Nach Möglichkeit erfolgt die Messung der Stoffwechselleistung vorzugsweise über manometrische oder gasvolume-trische Daten. Die Messung in der Gasphase erbringt besonders Vorteile bezüglich des einfacheren Messwertabgriffes. Die Auftragung der Messwerte über die Zeit ergibt die Stoffwechselleistung der Kultur. Ebenso können andere Messwerte wie z.B. der pH-Wert oder Daten von schnellen Analysengeräten unter Bezug auf stoffwechselcharakteristische Substanzen zur Ermittlung der Stoffwechselleistung eingesetzt werden. If possible, the metabolic rate is preferably measured using manometric or gas volumetric data. The measurement in the gas phase offers particular advantages with regard to the simpler measurement tap. The plotting of the measured values over time gives the metabolic performance of the culture. Other measured values such as the pH value or data from fast analyzers with reference to substances characteristic of metabolism are used to determine metabolic performance.

Dabei wird vorzugsweise so vorgegangen, dass die Mess-grösse digital als Signale erfasst und über einer analogen, vorzugsweise Zeitskala, fortlaufend registriert wird, worauf immer wieder eine Rückstellung auf den Anfangswert erfolgt. Dabei werden die registrierten Signale oder ihr zeitlicher Abstand zur Auslösung von die Parameter beeinflussenden Vorgängen benutzt. Werden die Kulturvolumina entsprechend erhöht, kann die Messung auch analog - z.B. über Strömungsmesser, IR-Messung oder ähnliches, bei Messwertaufnahme in der Gasphase - erfolgen. In this case, the procedure is preferably such that the measured variable is digitally recorded as signals and continuously recorded on an analog, preferably time scale, which is always reset to the initial value. The registered signals or their time interval are used to trigger processes that influence the parameters. If the culture volumes are increased accordingly, the measurement can also be made analog - e.g. via flow meter, IR measurement or the like, when taking measured values in the gas phase.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beschreibung und in Verbindung mit der Zeichnung näher erläutert. The invention is explained in more detail with reference to the following description and in conjunction with the drawing.

Die Zeichnungen zeigen: The drawings show:

Fig. 1 eine Skizze einer Anordnung der grundsätzlichen Teile, mit deren Hilfe das erfindungsgemässe Verfahren durchgeführt werden kann, und Fig. 1 is a sketch of an arrangement of the basic parts, with the help of which the inventive method can be carried out, and

Fig. 2 eine Skizze eines Registriergerätes zur Aufzeichnung der Stoffwechselleistung in der Koppelung mit einem automatischen Gradienten-Anstiegsregler. Fig. 2 is a sketch of a recording device for recording the metabolism in the coupling with an automatic gradient controller.

Die in Fig. 1 dargestellte Anordnung besteht aus einem Kulturgefäss 10 in Form eines gasdichten Behälters mit Temperiermantel 11, der über einen Umwälzthermostaten 12 temperiert wird. Frisches Medium wird mittels der Zulaufpumpe 14 durch die Leitung 13 aus dem Vorratsbehälter 15 in das Kulturgefäss 10 gepumpt, Überschuss-Kulturmedium und gebildetes Gas werden mittels der Ablaufpumpe 16 entnommen. Eine unten offene Trennwand im Kulturgefäss 10 zwischen Zu- und Ablaufstutzen gewährleistet den Durchlauf zugegebenen frischen Mediums durch das ganze Kulturgefäss. Ein verschliessbarer Stutzen 17 dient der Startbeimpfung und Probenahme. Ein weiterer Zugabeteil dient wechselweise oder in Parallelschaltung gemeinsam der Zugabe 18 von Fremdstoffen, dem Anschluss einer Zugabepumpe 19 für den Gra3 618 736 The arrangement shown in FIG. 1 consists of a culture vessel 10 in the form of a gas-tight container with a temperature jacket 11, which is temperature-controlled via a circulation thermostat 12. Fresh medium is pumped by means of the feed pump 14 through the line 13 from the storage container 15 into the culture vessel 10, excess culture medium and gas formed are removed by means of the drain pump 16. A partition wall open at the bottom in the culture vessel 10 between the inlet and outlet connections ensures that fresh medium which has been added passes through the entire culture vessel. A closable nozzle 17 is used for starting vaccination and sampling. Another addition part is used alternately or in parallel to jointly add 18 foreign substances, to connect an addition pump 19 for the Gra3 618 736

dienten einer gelösten Untersuchungssubstanz oder/und einer Rückstellpumpe 20 zur z.B. Zugabe des Elektrolyten bei einer pH-Steuerung. Die notwendige Homogenität der Kultur wird durch einen Magnetrührer 21 erreicht. Der Messwertaufneh-5 mer 22 gibt Messsignale direkt oder über einen Gradienten-Anstiegsregler 23 zum Steuergerät 24. Dieser gibt die Messsignale weiter an das Registriergerät 25, das mit Hilfe des/der Berührungsschalter 26 entweder direkt oder über den Gradienten-Anstiegsregler 23 Einfluss auf das Steuergerät 24 neh-10 men kann. Das Steuergerät 24 hält die eingestellte Rührerkonstanz aufrecht, betätigt aufgrund der Messsignale die Zu-und Ablaufpumpen 14 bzw. 16 und der Rückstellpumpe 20 und aufgrund der Signale des Gradienten-Anstiegreglers 23 der Zugabepumpe 19 oder den Thermostaten 12. served a dissolved test substance and / or a return pump 20 for e.g. Addition of the electrolyte for pH control. The necessary homogeneity of the culture is achieved by a magnetic stirrer 21. The measurement value sensor 5 outputs measurement signals directly or via a gradient increase controller 23 to the control unit 24. The latter passes the measurement signals on to the registration device 25, which influences the with the help of the touch switch (s) 26 either directly or via the gradient increase controller 23 Control unit 24 can take 10 men. The control unit 24 maintains the set stirrer constancy, actuates the inlet and outlet pumps 14 or 16 and the reset pump 20 on the basis of the measurement signals and the addition pump 19 or the thermostats 12 on the basis of the signals of the gradient increase regulator 23.

15 Je nach Aufgabenstellung und Kulturvolumen kann das Kulturgefäss 10 mit Einrichtung für den Durchlaufzwang aus Glas oder anderen Werkstoffen bestehen und je nach Messwertaufnehmer gasdicht, druckdicht oder nur mit einem einfachen Sterilabschluss ausgeführt sein. Vorzugsweise sollte das 20 Kulturgefäss 10, besonders bei kleinen Kulturvolumina, für Konstanz des Kulturvolumens so eingerichtet sein, dass die Höhe des Ablaufstutzens über dem Boden dieses Volumens bestimmt. Temperierung 11 und 12 ist frei variabel. Die Zulaufpumpe 14, Gradientenzulaufpumpe 19 und je nach Auf-25 gabenstellung Rückstellpumpe 20 müssen eindeutige Dosierungen zulassen, 19 und 20 dazu eine Gradientendosierung. Bei Messung in der Gasphase übernimmt die Ablaufpumpe 16 zweckmässigerweise die Funktion der Rückstellpumpe 20. Ebenso kann es zweckmässig sein, besonders bei kleinen Vo-30 lumina den Gradientenparameter (gelöste Substanz) dem Medium zuzugeben und durch die Zulaufpumpe 14 zugeben zu lassen. Je nach Konstruktion des Kulturgefässes, Kulturvolu-men und Messwertaufnehmer kann auf die Ablaufpumpe 16 verzichtet oder die Zulaufpumpe 14 und gegebenenfalls Ab-35 laufpumpe 16 durch je ein Stellventil ersetzt werden, dies besonders bei grossen Kulturvolumina und z.B. Strömungsmessern oder dergleichen als Messwertaufnehmer. Die Rückstellpumpe 20 kann bei kleinen Kulturvolumina bei z.B. der Zugabe des Elektrolyten bei pH-Regelung durch ein Magnet-40 ventil ersetzt werden. Die notwendige Homogenisierung der Kultur ist frei variabel und den Kulturvolumina anzupassen. Der Messwertaufnehmer 22 ist je nach Aufgabenstellung, Gegebenheiten und Möglichkeiten bezüglich des Stoffwechselablaufes auszubilden als z.B. Kontaktmanometer, Gasvolu-45 menmesser, pH-Meter, ionenselektive Elektroden, schnelle Analysengeräte, spektroskopische Verfahren, bei grossen Volumina auch Strömungsmesser und dergleichen. Der Gradienten-Anstiegsregler 23 ermittelt aus dem Vergleich der Messsignale und/ oder deren zeitlichem Abstand die Stoffwech-50 selleistung der Kultur und gibt diese umgeformt als Signale für den Gradientenanstieg an das Steuergerät 24 weiter. Dieser Gradienten-Anstiegsregler kann alleine oder in Zusammenfassung mit dem Registriergerät 25 und dessen Berührungsschalter 26 ausgeführt sein. Seine Funktion und mögliche 55 technische Ausgestaltung wird eingehend zusammen mit dem Registriergerät 25 in Zusammenhang mit Fig. 2 besprochen. Das Steuergerät 24 beinhaltet die Gradientensteuerungen für die Zugabepumpe 19 und den Thermostaten 12, hält die eingestellte Rührkonstanz aufrecht und wird bei anderen Auf-60 gabenstellungen und Anordnungen je nach Notwendigkeit auch die Einheiten für z.B. eine Belüftung, Antischaumregu-lierung und andere, bereits bekannte, Kontroll- und Regeleinrichtungen beinhalten. 15 Depending on the task and the volume of culture, the culture vessel 10 can be made of glass or other materials with a device for continuous flow and, depending on the sensor, can be gas-tight, pressure-tight or only with a simple sterile seal. Preferably, the culture vessel 10, especially in the case of small culture volumes, should be set up to ensure that the culture volume is constant so that the height of the drainage nozzle above the floor of this volume determines. Temperature control 11 and 12 is freely variable. The feed pump 14, gradient feed pump 19 and, depending on the task position, return pump 20 must allow clear metering, 19 and 20 a gradient metering. When measuring in the gas phase, the drain pump 16 expediently takes over the function of the return pump 20. Likewise, it may be expedient to add the gradient parameter (dissolved substance) to the medium and have it added by the feed pump 14, especially in the case of small volumes of 30 lumens. Depending on the design of the culture vessel, culture volume and transducer, the drain pump 16 can be omitted or the feed pump 14 and, if appropriate, the drain pump 16 can be replaced by a control valve, particularly with large culture volumes and e.g. Flow meters or the like as a measuring sensor. The return pump 20 can be used for small culture volumes e.g. the addition of the electrolyte in pH control can be replaced by a solenoid 40 valve. The necessary homogenization of the culture can be freely varied and adapted to the culture volumes. Depending on the task, circumstances and possibilities with regard to the metabolic process, the measuring sensor 22 is to be designed as e.g. Contact pressure gauges, gas volume meters, pH meters, ion-selective electrodes, fast analysis devices, spectroscopic methods, and with large volumes also flow meters and the like. The gradient increase controller 23 determines the metabolic rate of the culture from the comparison of the measurement signals and / or their time interval and forwards them, converted, as signals for the gradient increase to the control unit 24. This gradient increase controller can be implemented alone or in combination with the registration device 25 and its touch switch 26. Its function and possible technical configuration are discussed in detail together with the registration device 25 in connection with FIG. 2. The control unit 24 contains the gradient controls for the addition pump 19 and the thermostat 12, maintains the set stirring constancy and, in other tasks and arrangements, will also change the units for e.g. include ventilation, anti-foam control and other known control and regulating devices.

Durch Regelung unter Bezug auf Messwerte, die repräsen-65 tativ für die Stoffwechselleistung der Kultur sind, weist diese bei gleichbleibenden Aussenbedingungen pro Volumeneinheit stets gleiche Stoffwechselleistung auf. Damit kann einer derart geregelten Kulturanlage über lange Zeit stets gleichbleibend By regulating with reference to measured values that are representative of the metabolic performance of the culture, this always has the same metabolic performance per unit volume with constant external conditions. This means that such a regulated cultural facility can always remain the same over a long period of time

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stoffwechselaktives Material zur Beimpfung von Folgekulturen entnommen werden. metabolically active material for the inoculation of subsequent cultures are taken.

Verändert man eine Kulturbedingung in der Zeit langsam genug, so werden sich solche Organismen in der Kultur anreichern, die sich unter den jeweiligen gegebenen Bedingun- 5 gen im Selektionsvorteil befinden. Es tritt also eine Selektion besser angepasster Organismen oder Mutanten in der Kultur auf. Wird der Anstieg des Änderungsgradienten der Stoffwechselleistung angepasst, so wird im äussersten Fall der Gradient = 0, die Kultur kann aber nicht durch Überschreiten 10 eines Grenzwertes abgetötet werden. Änderungsgradienten sind interessant z.B. bezüglich der Temperatur, des pH-Wertes oder besonders für Konzentrationen von Substanzen für Selektionen wie: Resistenz gegen, erhöhte Abbaufähigkeit für, Anhäufung bestimmter Stoffwechselprodukte, Veränderung 15 bisher inert erscheinender Substanzen (Umweltschutz) und dergleichen. Besonders gute Resultate sind zu erwarten, wenn die Möglichkeit gegeben ist, die betreffende Bezugssubstanz oder Folgeprodukte direkt mit einem Messwertaufnehmer oder durch eine schnelle automatische Analysenmethode zu 20 bestimmen und für die Regelung des Gradientenanstieges zu verwenden. Bestrahlungen im Reaktionsgefäss durch z.B. punktförmige Quellen oder Zusatz mutationsauslösender Chemikalien können gegebenenfalls dem Gradienten zur Selektion eine Erhöhung der Mutationsrate parallel gehenlassen. 25 Dies gilt selbstverständlich sinngemäss auch für Selektionen aus Mischpopulationen. Bei Konstanthalten der Kulturbedingungen resultiert eine gleichbleibende Stoffwechselleistung der Kultur, ein sog. «Steady State», in bezug auf den Messwert für die Regelung, z.B. die C02-Bildung pro Zeiteinheit. Da- 30 durch können Einwirkungen von Aussenbedingungen wie Temperatur, pH-Wert oder auch von Substanzen auf den «Steady State» einer Kultur untersucht werden. Dabei wird unter ständiger Registrierung der Stoffwechselleistung der Kultur unter Konstanz aller anderen Parameter die interes- 35 sierende Grösse z.B. mit einem steilen Gradienten verändert (im Gegensatz zur Selektion, bei der mit möglichst flachen Gradienten gearbeitet wird). Durch Auswaschung bei weiterer Stoffwechseltätigkeit wird dann diese Substanzkonzentration einem der Stoffwechselleistung proportionalen Gradienten 40 unterworfen. Damit ist es möglich, bei längerer Kulturzeit bei z.B. Giftstoffen die Erholungsphase, bei fördernden Substanzen die Abklingphase zu erfassen. Gemessen wird dabei der Einfluss der Substanz auf die je nach Messwertaufnehmer definierte Stoffwechselleistung. Durch Kontrolle des Verlaufes 45 der Stoffwechselleistung bei Ablauf eines vorgegebenen Gradienten (im Gegensatz zur Selektion ohne Steuerung des Gradientenanstieges), etwa bezüglich der Temperatur oder der Konzentration einzelner Substratkomponenten können Aussagen über z.B. optimale Konzentrationen oder Werte in 50 bezug auf eine interessierende Optimierung des Stoffwechselablaufes erhalten werden. If one changes a culture condition slowly enough, organisms will accumulate in the culture that are in the selection advantage under the given conditions. So there is a selection of better adapted organisms or mutants in the culture. If the increase in the change gradient is adapted to the metabolic output, the gradient = 0 in the extreme case, but the culture cannot be killed by exceeding a limit value 10. Change gradients are interesting e.g. with regard to the temperature, the pH value or especially for concentrations of substances for selections such as: resistance to, increased degradability for, accumulation of certain metabolic products, change of 15 substances which previously appeared to be inert (environmental protection) and the like. Particularly good results can be expected if there is an opportunity to determine the reference substance or derived products in question directly with a sensor or using a fast automatic analysis method and to use them to regulate the gradient increase. Irradiations in the reaction vessel by e.g. punctiform sources or addition of mutation-triggering chemicals can, if necessary, allow the gradient for selection to increase the mutation rate in parallel. 25 Naturally, this also applies to selections from mixed populations. If the culture conditions are kept constant, a constant metabolic output of the culture, a so-called “steady state”, results in relation to the measured value for the control, e.g. the CO 2 formation per unit of time. In this way, the effects of external conditions such as temperature, pH or substances on the steady state of a culture can be investigated. With constant registration of the metabolic performance of the culture under constant constancy of all other parameters, the interesting size e.g. changed with a steep gradient (in contrast to the selection, where the gradient is as flat as possible). By washing out during further metabolic activity, this substance concentration is then subjected to a gradient 40 proportional to the metabolic output. This makes it possible to use e.g. Toxins the recovery phase, with promoting substances the decay phase. The influence of the substance on the metabolic performance defined depending on the sensor is measured. By checking the course 45 of the metabolic output when a predetermined gradient has passed (in contrast to selection without controlling the gradient increase), for example with regard to the temperature or the concentration of individual substrate components, statements about e.g. optimal concentrations or values in relation to an interesting optimization of the metabolic process can be obtained.

Als Beispiel sei die Selektion gärender Hefen in bezug auf eine höhere Verträglichkeit gegenüber einer Substanz X bei manometrischer Messung der C02-Bildung pro Zeiteinheit 55 angegeben: Druckanstieg am Manometer 22 durch die C02-Bildung bis zu einem vorgewählten Maximum, Weitergabe des Maximum-Signals über die Steuereinheit 24 an die Abgabepumpe 16, die in diesem Fall gleichzeitig als Rückstellpumpe arbeitet und dem Kulturgefäss 10 etwas Kulturmedium und 60 C02 entnimmt, bis der eingestellte Minimalwert am Manometer 22 erreicht ist und dieses Minimumsignal die Abgangspumpe 16 stillsetzt. Der Gradientenanstiegsregler 23 hat inzwischen aus der geltenden Stoffwechselaktivität, die aus den Abständen vorausgegangener Maximumsignale ermittelt wur- es de, den darauf bezüglichen Gradientenanstieg ermittelt und an die Steuereinheit 24 weitergegeben. Diese gibt das Signal zur Zugabe einer bestimmten Menge von X an die Zugabepumpe 19, denn der Gradient insgesamt bedeutet die Zunahme von X im Kulturmedium pro Zeiteinheit durch eine jeweils gleiche Zugabemenge von X pro Maximumsignal, sein Anstieg wird durch eine jeweils geringere (oder höhere) Zugabemenge bei einem Maximumsignal, das eine verringerte (oder erhöhte) Stoffwechselleistung anzeigt, verändert (wie später im einzelnen bei der Beschreibung des Registriergeräts und das Gradientenanstiegsreglers anhand von Fig. 2 beschrieben wird). Damit steigt die Konzentration von X in der Kultur in Abhängigkeit von der Stoffwechselleistung - und der Selektion und Vermehrung besser angepasster Organismen langsam im Kulturverlauf bis zu einer Grenze, die in den Organismen zu suchen ist. Es kann also mit einem solchen Verfahren auch die obere Grenze für die Anpassungsfähigkeit in einem gegebenen Zeitraum (Kulturdauer) für die Organismen ermittelt werden. As an example, the selection of fermenting yeasts with regard to a higher tolerance to a substance X given manometric measurement of the CO 2 formation per unit time 55 is given: pressure increase on the pressure gauge 22 through the CO 2 formation up to a preselected maximum, transmission of the maximum signal via the control unit 24 to the dispensing pump 16, which in this case also works as a return pump and takes some culture medium and 60 CO 2 from the culture vessel 10 until the set minimum value on the pressure gauge 22 is reached and this minimum signal stops the outgoing pump 16. In the meantime, the gradient increase controller 23 has determined the relevant gradient increase from the applicable metabolic activity, which was determined from the intervals of previous maximum signals, and passed it on to the control unit 24. This gives the signal for adding a certain amount of X to the addition pump 19, because the gradient overall means the increase of X in the culture medium per unit of time by an equal addition amount of X per maximum signal, its increase is caused by a respectively lower (or higher) The amount added to a maximum signal, which indicates a reduced (or increased) metabolic output, changes (as will be described in more detail later in the description of the recording device and the gradient increase regulator with reference to FIG. 2). The concentration of X in the culture thus increases depending on the metabolic performance - and the selection and propagation of better adapted organisms slowly in the course of the culture up to a limit to be found in the organisms. With such a method, the upper limit for the adaptability for the organisms in a given period (culture period) can also be determined.

Bei der Analyse der Wirkung steigender Konzentrationen der Substanz X auf gärende Hefen bei manometrischer Messung der C02-Bildung pro Zeiteinheit wird bei fortlaufender Messung und Registrierung der Stoffwechselleistung der Gradientenanstiegsregler 23 ausgeschaltet und die Konzentration von X durch die Steuereinheit 24 pro Maximumsignal gleichbleibend oder um ein durch eine Kurve gegebenes Mass erhöht. Bei einem vorgegebenen Grenzwert der Stoffwechselaktivität wird die Zugabe von X endgültig abgeschaltet und der weitere Verlauf der Stoffwechselleistung bis zum Erreichen der ursprünglichen Stoffwechselleistung als Erholungszeit verfolgt. Der Gradient wird dabei zumeist steiler gewählt werden als bei einem Selektionsverfahren. When analyzing the effect of increasing concentrations of substance X on fermenting yeasts with manometric measurement of the CO 2 formation per unit of time, the gradient increase regulator 23 is switched off with continuous measurement and registration of the metabolic output and the concentration of X by the control unit 24 per maximum signal is constant or by one given a curve increased. At a predetermined limit of the metabolic activity, the addition of X is finally switched off and the further course of the metabolic activity is tracked until the original metabolic activity is reached as a recovery time. The gradient will usually be chosen steeper than in a selection process.

Wird dagegen z.B. eine Säurebildung als Messwert erfasst, so sollte das Kulturgefäss 10 zwar steril, nicht aber gasdicht ausgeführt sein. Die Massspanne ist durch die Differenz der pH-Werte zwischen dem des sterilen Substrates und dem festgesetzten pH-Abweichwert durch Einstellung am pH-Meter 22 bestimmt. Die Rückstellung erfolgt als Rücktitration und wird je nach Kulturvolumen über eine Rückstellpumpe oder ein Magnetventil 20 erfolgen. Dabei ist eine Ablaufpumpe in diesem Falle einer pH-Steuerung bei Verwendung eines Kultur-gefässes mit Volumenkonstanz aufgrund der Ablaufstutzen-höhe nicht notwendig, was sinngemäss für alle Messwertaufnehmer gilt, die keine Gas- oder Druckdichtigkeit des Kultur-gefässes voraussetzen. On the other hand, e.g. Acid formation recorded as a measured value, the culture vessel 10 should be sterile, but not gas-tight. The measurement range is determined by the difference in the pH values between that of the sterile substrate and the fixed pH deviation value by adjustment on the pH meter 22. The resetting takes place as a back titration and, depending on the culture volume, is carried out via a resetting pump or a solenoid valve 20. In this case, a drain pump is not necessary in this case of pH control when using a culture vessel with constant volume due to the height of the outlet nozzle, which applies analogously to all measuring sensors that do not require gas or pressure tightness of the culture vessel.

Generell ist es zweckmässig, bei allen genannten Verfahrensmöglichkeiten so vorzugehen, dass die jeweiligen Zugabemengen möglichst klein im Verhältnis zum Gesamtkulturvo-lumen sind (Medium, rückstellende Grösse wie etwa Elektrolyt, und Substanzparameter), was durch erhöhte Konzentrationen besonders von rückstellenden Grössen und Parametersubstanzen erreicht werden kann. Bei kleinen Kulturvolumina und hohen Temperaturschwankungen kann sich die Verwendung von Differenzdruckmanometern in Messung gegen ein steriles Vergleichsgefass in Grösse des Kulturgefässes empfehlen. Dabei sind für Zu- und Abgabe nur Pumpen zweckmässig, die das Kulturgefäss - wie etwa Schlauchpumpen -immer gegen den barometrischen Aussendruck voll abschlies-sen. In general, it is expedient to proceed in all of the above-mentioned process options in such a way that the respective addition amounts are as small as possible in relation to the total culture volume (medium, resetting size such as electrolyte and substance parameters), which is achieved by increasing concentrations, particularly of resetting sizes and parameter substances can. In the case of small culture volumes and high temperature fluctuations, the use of differential pressure gauges in measurement against a sterile comparison vessel the size of the culture vessel can be recommended. Only pumps that always seal the culture vessel - such as peristaltic pumps - against the barometric external pressure are expedient for adding and dispensing.

Die Ermittlung und Registrierung der für die Durchführung des Verfahrens erforderlichen jeweiligen Stoffwechselleistung oder Aktivität der Kultur in bezug auf den jeweils ermittelten Messwert erfolgt — bis aus die Möglichkeiten bei grossen Kulturvolumina-vorzugsweise dadurch, dass zur Regelung die jeweilige Produktionsmenge eines Stoffwechselproduktes oder Veränderung einer Messgrösse zwischen zwei Schaltzuständen an einem Kontakt-Messwertaufnehmer oder dergleichen fortlaufend gemessen und die jeweiligen Veränderungsraten bzw. die «oberen» Schaltzustände vor der Rückstellung über einer analogen Zeitskala aufgetragen werden. The determination and registration of the particular metabolic output or activity of the culture required for the implementation of the method in relation to the respectively determined measured value is carried out - up to the possibilities with large culture volumes - preferably by regulating the respective production quantity of a metabolic product or changing a measurand between Two switching states are continuously measured on a contact sensor or the like and the respective rates of change or the “upper” switching states are plotted against an analog time scale before resetting.

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Mit dieser Produktion oder Veränderung in bezug auf die Messwerte in der Zeit ist die Stoffwechselleistung definiert. With this production or change in relation to the measured values in time, the metabolic performance is defined.

Nach Fig. 2 kann zu diesem Zweck ein Registrierstift 30 mit gleichbleibender Geschwindigkeit aus einer Ausgangslage 31 quer zur Fortbewegungsrichtung (Pfeil) eines sich gleich-mässig vorschiebenden Registrierpapierstreifens 32 bewegt werden, ohne diesen zu berühren. Bei Eintreffen eines Signals druckt er einen Punkt, springt in die Ausgangslage zurück und läuft sofort wieder an, bereit beim Eintreffen eines weiteren Signals zu drucken, zurückzuspringen usf. Man erhält dabei eine für die Stoffwechselleistung charakteristische Punktfolge in einem Abstand von der Ausgangslage, die einerseits dem Zeitmass, andererseits den jeweils gleichbleibenden Abläufen bei Eintreffen eines Signals entspricht (Produktbildungsmenge, damit Substratverbrauch, Zugabe- und Abgabemenge von Substrat bzw. Kulturmedium, Rückstellgrösse, Veränderungsparameter usw.). Dadurch kann der Registrierstreifen entweder im Zeitmass oder dem Mass für eine der gleichbleibenden Grössen beim Eintreffen eines Signals geeicht werden. According to FIG. 2, for this purpose a registration pin 30 can be moved at a constant speed from a starting position 31 transversely to the direction of travel (arrow) of a uniformly advancing registration paper strip 32 without touching it. When a signal arrives, it prints a point, jumps back to the starting position and starts again immediately, ready to print, jump back when another signal arrives, and so on.This gives a sequence of points characteristic of metabolic performance at a distance from the starting position, which on the one hand the time measure, on the other hand corresponds to the respectively constant processes when a signal arrives (product formation quantity, thus substrate consumption, addition and release quantity of substrate or culture medium, reset size, change parameters, etc.). As a result, the registration strip can be calibrated either in terms of time or the measure for one of the constant sizes when a signal arrives.

Da bei dem erfindungsgemässen Verfahren die Stoffwechselleistung, also die Zeit für eine messbare, vorgegebene Produktionsrate eines Stoffwechselproduktes oder die Veränderungsrate einer Messgrösse erfasst werden muss, ist es aus Gründen der Anpassung an verschiedene Aufgaben zweckmässig, für den gleichmässigen Lauf des Registrierstiftes 30 über die Gesamtbreite des Registrierpapierstreifens 32 verschieden einstellbare Durchlaufzeiten am Registriervorschub 36 vorzusehen. Ein Endschalter 33 bewirkt dabei, dass bei grossen Signalabständen, z.B. einer Anlaufphase, der Stift bei Erreichen dieses Endschalters 33 ohne auszudrucken in die Ausgangslage 31 zurückspringt und sofort wieder anläuft, so dass in einem solchen Fall die tatsächlichen Signalabstände auch aus dem Punktabstand in der Fortbewegungsrichtung des Registrierstreifens abgelesen werden können. Auch der Papiervorschub 34 sollte verschiedene Vorschubgeschwindigkeiten zulassen. Zusätzlich ist zur Erhöhung der Empfindlichkeit eine Unterdrückung des Anlaufbeginnes nach erfolgter Rückstellung des Registrierstiftes durch eine-Verzögerungsschaltuhr 35 vorzusehen. Sind z.B. Signalfolgen von 150 sec zu erwarten, sind bei einer Durchlaufzeit von 180 sec und einer Schreibbreite von 60 mm 0,3 mm/sec ablesbar, bei einer Unterdrückungszeit von 120 sec könnte dagegen eine Durchlaufzeit von 60 sec gewählt und eine Ablesung von 1 mm/sec erreicht werden. Since in the method according to the invention the metabolic output, i.e. the time for a measurable, predetermined production rate of a metabolic product or the rate of change of a measurement quantity must be recorded, it is expedient for the adaptation to different tasks for the smooth running of the registration pen 30 over the entire width of the Registration paper strip 32 to provide differently adjustable throughput times on the registration feed 36. A limit switch 33 has the effect that with large signal spacings, e.g. a start-up phase, when the pen reaches this limit switch 33 without printing, it springs back into the starting position 31 and starts again immediately, so that in such a case the actual signal distances can also be read from the point distance in the direction of travel of the registration strip. The paper feed 34 should also allow different feed speeds. In addition, suppression of the start of startup after a reset of the registration pin by a delay timer 35 must be provided to increase the sensitivity. Are e.g. Signal sequences of 150 sec are to be expected with a throughput time of 180 sec and a write width of 60 mm 0.3 mm / sec, with a suppression time of 120 sec, however, a throughput time of 60 sec could be selected and a reading of 1 mm / sec can be achieved.

Bereits auf dem Markt befindliche, sogenannte «Plotter» weisen ähnliche Merkmale auf. Allerdings werden diese in beiden Koordinaten so angesteuert, dass die Signale aus Rechenmaschinen zu Kurven bzw. Zeichnungen verarbeiten, d.h. also in beiden Koordinaten in + und - Richtung. Zudem verarbeiten diese Geräte sehr hohe Signalfolgen pro Zeiteinheit und sind damit wesentlich höher spezifiziert ausgelegt, dabei wird auf einer ruhenden Unterlage aufgezeichnet. Im Unterschied dazu werden bei dem hier beschriebenen Gerät sehr langsame Signalfolgen (max. 2/min) in nur einer Richtung der Ordinate gegen eine analoge - zumeist Zeitskala - bei einem bewegten Registrierpapierstreifen erfasst. So-called “plotters” already on the market have similar characteristics. However, these are controlled in both coordinates in such a way that the signals from computing machines process them into curves or drawings, i.e. So in both coordinates in + and - direction. In addition, these devices process very high signal sequences per unit of time and are therefore designed to be specified much higher, while recording on a stationary surface. In contrast, in the device described here, very slow signal sequences (max. 2 / min) are recorded in only one direction of the ordinate against an analog - usually time scale - with a moving registration paper strip.

Auch das in der erfindungsgemässen Vorrichtung angebrachte Registriergerät kann zur Ansteuerung durch Signale in beiden Richtungen bei ruhender Unterlage ausgebaut werden, was die Registrierung zweier vergleichsweise langsamer Vorgänge in bezug aufeinander erlaubt. Periodische Vorgänge oder auch Langzeit-Abläufe sind gut zu überwachen, wenn die analoge Zeitskala kreisförmig, also in der Art von Fahrtenschreibern, ausgebaut wird. Dies gilt besonders für z.B. Wachstumskurven von «Batch»-Kulturen, wobei die maximal theoretisch mögliche C02-Menge als äusserste Anschlaggrenze angenommen und die Schrittlänge des Registrierstiftes ohne Rücklauf nach jedem Maximum-Signal diesem theoretischen Ma-ximal-Anschlag angepasst wird. The recording device installed in the device according to the invention can also be removed for control by signals in both directions with the base at rest, which allows the registration of two comparatively slow processes in relation to one another. Periodic processes or long-term processes are easy to monitor if the analog time scale is expanded in a circular manner, i.e. in the manner of a tachograph. This applies especially to e.g. Growth curves of “batch” cultures, whereby the maximum theoretically possible amount of C02 is assumed as the extreme limit of attack and the stride length of the registration pen is adjusted to this theoretical maximum attack without return after each maximum signal.

Das erfindungsgemäss verwendbare Registriergerät ist neben der beschriebenen spezifischen Aufgabe, der Überwachung von Langzeitkulturen, sehr vielseitig einsetzbar, da es alle zeitlichen Überwachungen bei der Kontrolle der' Gleichmässigkeit jeglicher Art von Stückzahlproduktionen übernehmen kann. Die Vielseitigkeit dieses Registriergerätes resultiert vor allem daraus, dass keine Messwerte, sondern Schaltzustände erfasst werden, was eine spezielle diesbezügliche Anpassung an die zu überwachenden Systeme überflüssig macht. In addition to the specific task described, the monitoring of long-term cultures, the recording device which can be used according to the invention can be used in a very wide variety of ways, since it can take over all time monitoring when checking the uniformity of any type of number of items produced. The versatility of this recording device results primarily from the fact that no measured values, but rather switching states are recorded, which makes a special adaptation to the systems to be monitored superfluous.

Durch Anordnung von verstellbaren Berührungsschaltern 37 im Wege des Registrierstiftes 30 kann das Gerät auch für die Gradientenanstiegsregelung eingesetzt werden. Da mit der Stoffwechselleistung immer die Bildung einer Stoffwechselproduktrate oder Veränderungsrate einer Messgrösse erfasst werden, gibt der Abstand der Punktfolge von der Ausgangslage 31 des Registrierstiftes 30 gleichzeitig den zeitlichen Abstand für die Änderungsraten an. Setzt man unter gleichbleibenden Normalbedingungen für die Kultur diesen Punktabstand im Zeitmass also 100% der Stoffwechselleistung, so entspricht der halbe Abstand 200%, der doppelte Abstand 50% dieser Stoffwechselleistung, da für die gleiche Änderungsrate die halbe bzw. die doppelte Zeitspanne benötigt wurde. By arranging adjustable touch switches 37 by means of the registration pin 30, the device can also be used for the gradient increase control. Since the metabolic output always records the formation of a metabolic product rate or the rate of change in a measured variable, the distance of the point sequence from the starting position 31 of the registration pen 30 simultaneously indicates the time interval for the rates of change. If, under constant normal conditions for the culture, this point spacing is set to 100% of the metabolic rate in time, half the distance corresponds to 200%, double the distance to 50% of this metabolic rate, since half or twice the time span was required for the same rate of change.

Die Gradientensteuerung kann im einfachsten Falle so erfolgen, dass z.B. das Volumen einer Verdrängungspumpe über eine Kurvenscheibe verändert, oder die Drehzahl eines Pumpenmotors durch Verstellung eines Potentiometers variiert wird. Der Servomotor zum Antrieb der Kurvenscheibe oder eines Potentiometers wird über eine Schaltuhr 38 so reguliert, dass das Programm von 0 bis 100% in einer vorgebbaren Zeit abläuft. In the simplest case, the gradient control can be carried out in such a way that e.g. the volume of a displacement pump is changed via a cam, or the speed of a pump motor is varied by adjusting a potentiometer. The servo motor for driving the cam disc or a potentiometer is regulated via a timer 38 so that the program runs from 0 to 100% in a predefinable time.

Ist ein Signalabstand von 150 sec bei 100% der Stoffwechselleistung nach obiger Definition gegeben und lässt man zur Sicherheit der Kultur einen Rückgang dieser Leistung auf 50% zu, entspricht dies einer möglichen Signalabstandszeit von 225 sec. Bei 60 mm Schreibbreite und einer Unterdrückungszeit von 120 sec ist dann eine Durchlaufzeit von 120 sec, entsprechend 0,5 mm/sec, möglich. Für eine Zugabe von 100 bis 0% einer Substanz, die im Gradienten zugegeben werden soll, stehen also 225 - 150 = 75 sec zur Verfügung, die an der Schaltuhr 38 eingestellt werden. Trifft ein Maximumsignal nach 150 sec ein, werden 100% der entsprechenden Substanzmenge zugegeben. Trifft das Signal infolge gesunkener Stoffwechselleistung erst nach 225 sec ein, erfolgt keine Zugabe, während bei 187,5 sec 50% der entsprechenden Substanzmenge zugegeben werden. Die Gradientenanstiegsregulierung wird in diesem Falle also von den Berührungsschaltern 37 des Registriergerätes aus vorgenommen. Was die Form der Gradienten betrifft, können z.B. verwendete Potentiometer ebenso linear wie logarithmisch gewickelt sein, Kurvenscheiben jeder gewünschten Form verwendet, wie auch der Gradient proportional, umgekehrt proportional oder in anderer Form abhängig von der Stoffwechselleistung geartet sein. If there is a signal interval of 150 sec at 100% of the metabolic rate according to the above definition and if the performance is allowed to decrease to 50% for the safety of the culture, this corresponds to a possible signal interval time of 225 sec. With a 60 mm writing width and a suppression time of 120 sec a throughput time of 120 sec, corresponding to 0.5 mm / sec, is then possible. For an addition of 100 to 0% of a substance that is to be added in the gradient, 225-150 = 75 seconds are available, which are set on the timer 38. If a maximum signal arrives after 150 sec, 100% of the corresponding amount of substance is added. If the signal arrives after 225 seconds as a result of reduced metabolic output, there is no addition, while at 187.5 seconds 50% of the corresponding amount of substance is added. In this case, the gradient increase regulation is carried out by the touch switches 37 of the recording device. As for the shape of the gradients, e.g. The potentiometer used may be wound linearly as well as logarithmically, cam discs of any desired shape may be used, and the gradient may be proportional, inversely proportional or in another form depending on the metabolism.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

V V

2 Blätter Zeichnungen 2 sheets of drawings

Claims

618 736 PATENTANSPRÜCHE618 736 PATENT CLAIMS

1. Kontinuierliches Verfahren zur Kultur von Mikroorganismen, bei dem Messungen in bezug auf das Stoffwechselgeschehen durchgeführt werden, dadurch gekennzeichnet, 1. Continuous process for the culture of microorganisms, in which measurements relating to the metabolic process are carried out, characterized in that

dass zumindest einer der Parameter, die sich aus Kulturbedingungen und/oder Fremdstoffzugaben und/oder Organismeneigenschaften ergeben, fortlaufend einem Gradienten in Änderungsrichtung auf einen vorgegebenen Wert unterworfen und die Stoffwechselleistung der Kultur fortlaufend ermittelt wird. that at least one of the parameters resulting from culture conditions and / or additions of foreign substances and / or organism properties is continuously subjected to a gradient in the direction of change to a predetermined value and the metabolic output of the culture is continuously determined.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur gezielten Selektion und/oder Anreicherung von den interessierenden Bedingungen besser angepassten Organismen bzw. Mutanten der auf die Selektion bzw. Anreicherung bezogene Parameter asymptotisch einem Grenzwert der Stoffwechselleistung angenähert und der jeweilige Messwert der Stoffwechselleistung zur Steuerung des Anstieges des Parametergradienten herangezogen wird. 2. The method according to claim 1, characterized in that for the targeted selection and / or enrichment of organisms or mutants which are better adapted to the conditions of interest, the parameters relating to the selection or enrichment asymptotically approximate a limit value of the metabolic output and the respective measured value of the metabolic output Control of the increase in the parameter gradient is used.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Analyse des Langzeit-Verhaltens von Organismen, insbesondere nach kürzer oder länger andauernder Veränderung einer der Kulturbedingungen und/oder Zugabe von Fremdstoffen, der interessierende Parameter unter Konstanthalten aller anderen Parameter einem Gradienten unterworfen wird und eine fortlaufende automatische Registrierung der Stoffwechselleistung erfolgt. 3. The method according to claim 1, characterized in that for analyzing the long-term behavior of organisms, in particular after a shorter or longer change in one of the culture conditions and / or addition of foreign substances, the parameter of interest is subjected to a gradient while keeping all other parameters constant and There is a continuous automatic registration of metabolic activity.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Messung der Stoffwechselleistung manometrisch oder gasvolumetrisch erfolgt. 4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that the measurement of the metabolic power is carried out manometrically or gas volumetrically.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Messwerte zur Ermittlung der Stoffwechselleistung digital als Signale erfasst und die Signale über einer analogen Skala, vorzugsweise einer Zeitskala, fortlaufend registriert werden. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the measured values for determining the metabolic output are digitally recorded as signals and the signals are continuously recorded on an analog scale, preferably a time scale.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Signale gezählt und gegebenenfalls zu einer Zeitzählung als Quotient in Beziehung gebracht werden. 6. The method according to claim 5, characterized in that the signals are counted and optionally related to a time count as a quotient.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die registrierten Signale oder deren zeitlicher Abstand zur Auslösung von die Parameter beeinflussenden Schaltvorgängen oder zur Steuerung des Anstieges von Gradienten herangezogen werden. 7. The method according to claim 5 or 6, characterized in that the registered signals or their time interval are used to trigger switching operations influencing the parameters or to control the increase of gradients.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass zum Registrieren der Signale der Registrierstift aus einer Endlage mit einstellbarer konstanter Geschwindigkeit quer zur Fortbewegungsrichtung des Registrierpapiers geführt und bei Ankunft eines Signals einen Punkt druckt und schlagartig in seine Endlage zurückgebracht wird, von wo aus er sofort wieder anläuft. 8. The method according to any one of claims 5 to 7, characterized in that for registering the signals, the registration pin is guided transversely to the direction of travel of the registration paper from an end position with an adjustable constant speed and prints a dot upon arrival of a signal and is suddenly returned to its end position, from where it starts up again immediately.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Registrierstift aus der Endlage erst nach einer wählbaren Unterdrückungszeit wieder anläuft. 9. The method according to claim 8, characterized in that the registration pin starts again from the end position after a selectable suppression time.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Weg des Registrierstiftes durch variabel einstellbare Endschalter begrenzt oder an einstellbare Berührungsschalter, von denen Schaltsignale abgenommen werden können, herangeführt wird. 10. The method according to claim 8 or 9, characterized in that the path of the registration pin is limited by variably adjustable limit switches or is brought up to adjustable touch switches, from which switching signals can be taken.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass von den Endschaltern oder Berührungsschaltern Steuersignale für die Anstiegsregelung von Parameter-Gradienten oder andere Parameter-Beeinflussungen ausgelöst werden. 11. The method according to claim 10, characterized in that control signals for the increase control of parameter gradients or other parameter influences are triggered by the limit switches or touch switches.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zeitskala auf eine runde Scheibe aufgebracht wird. 12. The method according to any one of claims 8 to 11, characterized in that the time scale is applied to a round disc.

13. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Kulturgefäss (10), das eine Einrichtung zum Zwangsdurchlauf frischen Mediums durch das ganze Kulturvolumen aufweist und dessen Ablaufstutzen eine solche Höhe über dem Gefassboden besitzt, dass das Kulturvolumen konstant ist, durch eine Steuereinheit (24) zur stetig graduellen Veränderung der Zugabe von Fremdstoffen und/oder Mediumsbestandteilen sowie der Temperatur im Kulturgefäss und durch ein Registriergerät, das aus einem einstellbaren Papiervorschub (34) einem Registrierstift (30) mit einer einstellbaren konstanten Durchlaufzeit für die Registrierpapierbreite aus einstellbaren Endschaltern (33) und/oder Berührungsschaltern (37) und aus einem Zählwerk (38) in Koppelung mit einem Zeitzählwerk zum Ermitteln der Stoffwechselleistung und zum darauf bezogenen Regeln des Gradientenanstieges besteht. 13. The apparatus for performing the method according to claim 1, characterized by a culture vessel (10) which has a device for the forced passage of fresh medium through the entire culture volume and the drain pipe has such a height above the bottom of the vessel that the culture volume is constant, by a Control unit (24) for the constant gradual change of the addition of foreign substances and / or medium components as well as the temperature in the culture vessel and by means of a registration device which, from an adjustable paper feed (34), a registration pen (30) with an adjustable constant throughput time for the registration paper width from adjustable limit switches (33) and / or touch switches (37) and consists of a counter (38) in conjunction with a time counter for determining the metabolic rate and for the related regulation of the gradient increase.