DE2456589A1

DE2456589A1 - Verfahren zur herstellung eines plasminogen-aktivators und denselben enthaltendes mittel

Info

Publication number: DE2456589A1
Application number: DE19742456589
Authority: DE
Inventors: Jacques Durand; D Hinterland Lucien Dussourd; Gerard Normier
Original assignee: Pierre Fabre SA
Current assignee: Pierre Fabre SA
Priority date: 1973-12-03
Filing date: 1974-11-29
Publication date: 1975-06-05
Also published as: ES432404A1; GB1492959A; FR2252842A1; FR2252842B1; DE2456589C2; BE822531A

Description

Verfahren zur Herst ellung eines Plasminogen-Aktivators und denselben enthaltendes Mittel

Verfahren zur Herstellung eines Plasminogen-Aktivators und denselben enthaltendes Mittel

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion und Reinigung eines bei der Aktivierung des Plasminogens eine Rolle spielenden Enzyms und sie betrifft ferner dessen Verwendung für Arzneimittelzwecke.

Nach dem erfindungsgemäßen Extraktions- und Reinigungsverfahren wird der im endocellulären Gewebe vorliegende Aktivator für Plasminogen aus tierischen Organen extrahiert. Dieser Aktivator wirkt auf die Arginin-Valin-Peptidbindungen des Plasminogens durch Öffnung dieser Bindungen ohne Aufspaltung der Disulfidbrücken, wobei Plasminogen in Plasmin überführt wird gemäß folgendem Glöbalschema: ·

(S - S)-

- S)

Arg - VaI-

(S - S)

S-S

+ Aktivator

ArgCOOH

S-S

N₂NVaI

Plasminogen

Plasmin

(S - S)

6Ο0&23./Ό061

In obigem Schema bedeuten: Lys = Lysin

Arg = Arginin und VaI = Valin

Das auf diese Weise gebildete Plasmin oder Fibrinolysin, erweist sich, da es die Geschwindigkeit der Lysis von Fibringerinnseln erhöht, als besonders wertvolles Medikament, insbesondere zur Behandlung von arteriellen und venösen Thrombosen.

Ein Aktivator des erfindungsgemäßen Typs ist bereits bekannt, nämlich die Urokinase, die aus dem Urin von Säugetieren extrahiert wird (verwiesen sei z. B. auf die USA-Patentschriften 2 961 382, 2 983 647 und 2 989 440). Nachteilig ist jedoch, daß Urokinase sehr empfindlich gegenüber induzierten Inhibitoren ist und daß seine Wirkung sehr rasch abnimmt·

Es besteht daher das Bedürfnis nach einem Aktivator, dessen Aktivität zumindest gleich derjenigen von Urokinase ist, der jedoch eine geringere Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren aufweist, wie dies beim erfindungsgemäß hergestellten Plasminogen-Aktivator der Fall ist.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Plasminogen-Aktivators, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Acetonpulver aus tierischen Organen, bestehend aus den Lungen und Nieren von Schweinen, Kälbern, Rindern, Pferden, Lämmern oder Schafen , oder aus Schweine-, Rinder-oder Schafeierstöcken, behandelt durch

a) Suspendierung des angegebenen Pulvers in einer wäßrigen Salzlösung schwacher Ionenetärke bei ungefähr neutralem pH-Wert,

b) Aufnahme des in Verfahrensstuft (a) erhaltenen Niederschlage in einer wäßrigen Salzlösung mit einer Ionenetärke zwischen etwa 0,6 und 1 bei einem pH-Wert zwischen etwa 3 und 5,

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c) Ausfällung der nach Abdekantieren der in Verfahrensstufe (b) erhaltenen Lösung durch Zugabe eines Salzes oder eines organischen Lösungsmittels bei einem pH-Wert zwischen etwa 3 und 5,

d) Aufnahme des in Verfahrensstufe (c) erhaltenen Niederschlags in Wasser oder einer Salzlösung und Ausfällung durch Zugabe eines Salzes bei einem pH-Wert nahe oder leicht über 7»

e) Aufnahme des in Verfahrensstufe (d) erhaltenen Niederschlags in Wasser und Dialyse der erhaltenen Lösung bis zu einem spezifischen Widerstand in der Größenordnung von 1000 Ohm.cm bei 10 ^PC und

f) gegebenenfalls Reinigung der erhaltenen Lösung.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein pharmazeutisches Mittel, das gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an einem Produkt, das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt ist.

Bei dem in Verfahrensstufe (a) verwendeten Salz handelt es sich vorzugsweise um Kaliumacetat oder Kaliumchlorid, die in Konzentrationen zwischen etwa 1 und 10 g/l eingesetzt werden.

Bei dem in Verfahrensstufe (b) verwendeten Salz handelt es sich vorzugsweise um ein Kaliumsalz, insbesondere um Kaliumchlorid, Kaliumacetat odeagiCaliumsulfat, die in Konzentrationen zwischen etwa 20 und 80 g/l eingesetzt werden, wobei der pH-Wert vorzugsweise mit Hilfe einer Säure, z. B. Essigsäure oder Schwefelsäure in solcher Weise auf etwa 3 bis 5 eingestellt wird, daß die lonenstärke der Lösung zwischen etwa 0,6 und 1 liegt.

Bei dem in Verfahrensstufe (c) verwendbaren Salz handelt es sich vorzugsweise um Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, die in Konzentrationen zwischen etwa 100 und 200 g/l eingesetzt werden.

Obwohl in Verfahrensstufe (c) die Ausfällung der Lösung auch mit Hilfe eines organischen Lösungsmittels, z. B. Aceton erfolgen kann, wird vorzugsweise die Ausfällung mit Hilfe eines Salzes bewirkt, das die Ausbeute der Verfahrensoperation erhöht.

Bei dem in Verfahrensstufe (d) verwendbaren SaJ.z handelt es sich vorzugsweise um Natriumchlorid, Ammoniumsulfat oder Kaliumsulfat, wobei der pH-Wert mit Hilfe einer Base, z. B. Natronlauge, auf z. B. etwas über 7 eingestellt wird.

Die Verfahrensstufen (a) und (b) werden vorzugsweise bei etwa 4 ⁰C durchgeführt.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Organe werden gleich nach dem Tode der Tiere entnommen und danach mechanisch entfettet und zerkleinert.

Die auf diese Weise groß zerkleinerten Organe werden eingefroren und können bei Bedarf in gefrorenem Zustand erneut zerkleinert und danach aufgetaut werden in Suspension in einer Pufferlösung von schwacher Ionenstärke und einem pH-Wert zwischen 5 und 7 um sie zu homogenisieren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Acetonpulver der tierischen Organe hergestellt durch Dispergieren der zerkleinerten und homogenisierten Organe in einem Acetonbad bei niedriger Temperatur, z. B. bei etwa -10 ⁰C. Das Acetonpulver wird aus dieser Suspension durch Filtration und Trocknung erhalten.

Die Reinigungsschritte umfassen vorzugsweise eine Ausfällung beim isoelektrischen pH-Wert und zur Durchführung derselben wird die in Verfahrensstufe (e) erhaltene, einen spezifischen Widerstand von 1000 Ohm.cm aufweisende Lösung auf einen pH-Wert

von etwa 6,8 gebracht, worauf die Ionenstärke der Lösung auf 10"* gebracht wird mit Hilfe eines Salzes, z. B. mit Calciumchlorid, vorzugsweise jedoch mit einem Zinksalz, z. B. Zinkacetat oder Zinkchlorid, worauf schließlich die Lösung bei

0 ⁰C zur Vervollständigung der Ausfällung stehen gelassen wird. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag kann nach Dialyse durch Lyophilisation konserviert werden.

Wird eine weitere Reinigung gewünscht, so kann hierzu eine Abscheidungschromatographie verwendet werden auf einem Gel aus einem Gemisch aus'Dextran-Agarose und Polyacrylamid, z. B. einem sogenannten "Sepharöse 6 B^M-Gel zur Abtrennung bestimmter molekularer Verunreinigungen, und/öder eine Ionenaustausch-Chromatographie zur Abtrennung der ionogenen Verunreinigungen. Typische geeignete Harze sind z. B. schwach saure Ionenaustauscher oder Gemische, z. B. die sogenannten "Bio rex 70"-Harze zur Elution bei konstanter Ionenstärke und steigendem pH, die sogenannten "AG 11 Ao Bio-rad"-Harze zur Elution bei konstantem pH und steigender Ionenstärke, oder die sogenannten "Biogel H.T.P."-Harze, bei denen die Ionenstärke verändert wird.

Die Ionenstärken der Lösungen werden aus den nach üblichen bekannten Methoden gemessenen Widerstandswerten der Lösungen berechnet.

Im folgenden wird ein allgemeines Schema zur Herstellung von enzymatisch aktiven Verbindungen nach der Erfindung gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform gegeben.

1 Herstellung des Acetonpulvers ..

Die angegebenen Organe werden nach dem Tod der Tiere entnommen und danach mechanisch entfettet und zerkleinert.

Nach der Zerkleinerung werden die Organe rasch eingefroren. Sie werden schließlich in gefrorenem Zustand einer Zerkleinerungs-

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operation unterworfen und danach homogenisiert, nachdem sie in einer Phosphat-Pufferlösung von schwacher Ionenstärke und einem pH-Wert zwischen 5 und 7 aufgetaut worden war.

Die auf diese Weise erhaltenen Organe werden in einem Acetonbad, di

giert.

bad, dessen Temperatur nicht über -10 ⁰C liegen darf, disper-

Nach Herstellung eines genügend langen innigen Kontakts wird die Suspension unter schwachem Vakuum filtriert.

Der Filterkuchen wird sorgfältig getrocknet durch Zirkulation von Stickstoff bei niedriger Temperatur.

Das auf diese Weise erhaltene Acetonpulver ist von rosa Farbe und kann nach beendeter Trocknung einer feinen Homogenisierung unterworfen werden.

II Herstellung eines angereicherten Extrakts a) Vorwaschen des Acetonpulvers:

Diese Operation dient dazu, zuvor eine Reihe von Pigmenten und schwach gebundenen Proteinen abzutrennen, die bei der weiteren Verarbeitung die Extraktion stören können.

Das Acetonpulver wird suspendiert in einer wäßrigen Lösung eines Salzes, deren Ionenstärke schwach ist, wobei der pH-Wert der Lösung zwischen 5 und 8, vorzugsweise nahe dem Neutralpunkt liegt. Die Suspension wird bei 4 ⁰C 1 Stunde lang unter Rühren belassen. Vom Rückstand des Acetonpulvers wird abdekantiert, die Lösung wird geklärt, z. B. in einer Dekantier-Schleudervorrichtung und der auf diese Weise erhaltene Bodensatz wird zu dem angegebenen Rückstand gegeben.

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b) Extraktion:

Der in Verfahrensstufe (a) erhaltene Rückstand wird in einer Lösung mit erhöhter Ionenstärke und einem pH-Wert zwischen 3 und 5 aufgenommen, wobei die lonenstärke der Lösung auf 0,6 bis 1 eingestellt wird' durch Zugabe eines Kaliumsalzes.

Die erhaltene Extraktionslösung wird mindestens 2 Stunden lang gerührt unter Aufrechterhaltung der Temperatur bei 4 ⁰C

Das Gewichtsverhältnis von Acetonpulver und Lösungsmittel darf 5 i° nicht übersteigen.

Der nicht extrahierte Rest an Acetonpulver wird durch Abschleudern abgetrennt und die anfallende Lösung wird unter Stickstoffdruck auf einem sogenannten EKS-FiIter filtriert.

c) Ausfällung in saurem Milieu:

Diese erste Ausfällung der wie angegeben erhaltenen Lösung wird in saurem Milieu bewirkt bei einem pH-Wert von etwa 4,5 mit Hilfe eines zu einer Ausdehnung führenden Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, bei Halbsättigung bei 10 ⁰C. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wird in einem Wasservolumen oder einer Salzlösung aufgenommen, deren spezifischer Widerstand unter 800 Ohm.cm bei 10 ⁰C liegt, wobei das Volumen dieser Lösung vorzugsweise ein Viertel des Volumens der extrahierten Lösung nicht übersteigt.

d) Ausfällung in schwach basischem Milieu:

Der pH-Wert der wie angegeben erhaltenen Lösung wird auf einen leicht über 7 liegenden Wert erhöht mit Hilfe von Natronlauge (pH-Wert zwischen 7 und 8). Die auf diese Weise erhaltene Lösung wird ausgefällt durch Zugabe eines Salzes in großer Menge, z. B. durch Zugabe von Ammoniumsulfat in einer Menge von 200 g/l,

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von Kaliumsulfat in einer Menge von 200 g/l oder von Natriumchlorid in einer Menge von 185 g/l.

Der gebildete Niederschlag wird in Wasser aufgenommen, wobei das Volumen des zur Aufnahme verwendeten Wassers etwa 1/1O des Volumens des in Verfahrensstufe (b) behandelten Extrakts beträgt.

e) Dialyse:

Die erhaltene Losung wird dialysiert bis zu einem spezifischen Widerstand in der Größenordnung von 1000 Ohm*cm bei 10 ⁰C, wobei das erhaltene Produkt anschließend den abschließenden Reinigungsverfahren unterworfen oder durch Lyophilisation konserviert werden kann.

III Reinigung des angereicherten Extrakts

1. Reinigung durch Ausfällung nahe dem isoelektrischen pH-Wert

Das in Verfahrensstufe (e) erhaltene Dialysat wird auf den isoelektrischen pH des Enzyms, d. h. auf pH 6,8 gebracht, worauf vorsichtig eine Salzlösung, vorzugsweise Zinkacetat, zugegeben

—2
wird, um die Ionenstärke auf 10 zu bringen. Dann wird die Niederschlagsbildung über Nacht bei 0 ⁰C ohne Rühren vor sich gehen gelassen.

Der gebildete Niederschlag wird isoliert und aufgenommen in 1/20 des Volumens des Ausgangsextrakts«

2. Ausschluß-Chromatographie (Exclusions-Ghromatographie)

Das in vorstehender Verfahrensstufe oder in Verfahrensstufe (e) erhaltene Produkt wird durch eine Säule von "Sepharose 6 B^H geleitet, die ins Gleichgewicht gesetzt ist mit Hilfe einer Phosphatpufferlösung, deren Ionenstärke durch Zugabe von Natrium-

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oder Kaliumchlorid auf 0,6 eingestellt ist.

Das Verhältnis der Höhe des Gels zum Durchmesser der Säule darf nicht unter 10 betragen. Der Chromatographie-Durchfluß wird zwischen 0,8 und 1 l/Std. für eine Säule von 10 1 Volumen festgesetzt, wobei das Volumen der aufgebrachten Probe zwischen 500 und 800 ml für eine Säule des angegebenen Typs liegt (was etwa 10 kg Rohorganen entspricht).

Die Chromatographie wird bei 4 ⁰C durchgeführt und es werden eluierte Fraktionen zwischen 15 und 25 1 bei Verwendung einer Säule von 10 1 Volumen aufgefangen.

Das erhaltene Produkt kann durch Ausfällung mit Alkohol oder Aceton (dreifaches Volumen) in der Kälte konzentriert oder auch nach Dialyse lyophilisiert werden.

3. Reinigung mit Ionenaustauschern

Unter Verwendung eines schwach sauren Kationenaustauscherharzes:

Verwendet wird ein sogenanntes "Bio rex 70"-Harz, das im Gleichgewicht steht mit einer Acetatpufferlösung von pH 4,5. Die KLution wird mit Hilfe von Lösungen konstanter Ionenstärke, jedoch steigenden pH-Werts bewirkt. Isoliert wird das Produkt in der eluierten Fraktion zwischen pH 5,2 und 5,7.

Unter Verwendung eines Harzgemisches:

Verwendet wird ein sogenanntes "AG 11 Ao"*-Harzgemisch, das eingestellt ist auf einen spezifischen Widerstand von über 8000 Ohm.cm. Es wird eine Lösung des angereicherten Extrakts· in leicht saurem Milieu behandelt. ·

Sd9d23'/U9St

Die Elution wird bei steigender ,Ionenstärke bewirkt und das Produkt in der eluierten Fraktion eines spezifischen Widerstands von etwa 5000 Ohm.cm wird isoliert«

Unter Verwendung von "Biogel H.T.P.":

Das apatische Hydroxyl wird ins Gleichgewicht gesetzt mit einer M/iOO-Phosphatpufferlösung von pH 6,8. Die Suspension des "Biogel H.T.P." wird 30 Minuten lang in der Pufferlösung gerührt unter Verwendung von 10 ml Rohextrakt pro Gramm trockenes Absorptionsmittel. Nach Abtrennung der Lösung durch Filtration oder Zentrifugation wird der Bodensatz oder Feststoffrückstand isoliert und der spezifische Widerstand des Überstands wird auf einen Wert unter 80 0hm.cm gebracht. Nach erneuter Zentrifugation wird der Überstand dialysiert und lyophilisiert.

4. Reinigung durch AffinitatsChromatographie

Die ÄffinitatsChromatographie wird auf einem Träger des Typs "AH-Sepharose 4 B" bewirkt, auf den zuvor ein spezifischer Inhibitor für den Plasminogenaktivator mit Hilfe eines Carbodiimids aufgekuppelt wurde.

Typische geeignete Inhibitoren sind z. B. £ -Aminocapronsäure, Aminoäthyl-cyclohexansäure, trans-4-Aminoäthyl-cyclohexan-cärbonsäure und p-Aminomethylbenzoesäure.

Die Affinitätschromatographie ist auch auf einer mit GNBr aktivierten Sepharose durchführbar, auf der Lysin oder eine andere der angegebenen Verbindungen fixiert werden kann.

Alle anderen Trägermaterialien, auf denen ein derartiges Aufpfropfen realisierbar ist, können ebenfalls mit Erfolg verwendet werden, z. B. Materialien aus der Reihe der Biogele.

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Der. Plasminogen-Aktivator wird in einer 0,1 M-Phosphatpufferlösung von pH 7 bis 7,2 gelöst und dann durch eine Säule geleitet, die eines der angegebenen Trägermaterialien enthält. Die aktiven Substanzen werden an das Trägermaterial gebunden, während die inaktiven Proteine eluiert werden. Die aktiven Substanzen werden sodann eluiert mit Hilfe eines Ionenstärke-Gradienten und die aktive Fraktion kann nach einer der beiden folgenden Verfahrensweisen behandelt werden:

1. Ausfällung mit Hilfe eines Salzes, z. B. Ammoniumsulfat, danach Dialyse und schließlich Lyophilisation, oder

2. Ausfällung in Form eines bei saurem pH-Wert unlöslichen Komplexes mit Hilfe eines Polysaccharids, danach Aufnahme des Komplexes in einer Lösung bei neutralem pH-Wert und schließlich Lyophilisation.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie auf die angegebene Verfahrensweise zu beschränken.

Das in den Beispielen verwendete Acetonpulver wurde nach der oben beschriebenen, mit I bezeichneten Verfahrensweise erhalten unter Verwendung'von Mutterschweineierstöcken als Ausgangsmaterial.

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Beispiel 1

a) 1 kg des wie angegeben erhaltenen Acetonpulvers wurde in 50 1 einer Kai iumac et at lösung in ,einer Menge von 10 g/l suspendiert. Es wurde 1 Stunde lang gerührt, worauf Dekantieren gelassen wurde. Der klare Überstand wurde verworfen.

b) Zu dem erhaltenen Niederschlag wurden sodann 50 1 kaltes Wasser, danach 1,5 kg Kaliumacetat und schließlich 1 1 Eisessig zugesetzt, worauf mindestens 3 Stunden lang kräftig gerührt wurde. Der unlösliche Anteil wurde durch Abschleudern entfernt, worauf die erhaltene Lösung filtriert wurde.

kg

c) Die erhaltene Lösung wurde mit 7,5/Ammoniumsulfat versetzt,

worauf bis zu vollständigen Lösung gerührt und schließlich mindestens 3 Stunden lang stehen gelassen wurde. Die überstehende Lösung wurde verworfen und der Niederschlag wurde

, . ._{Λ n} _ _. , , . /Konzentration , erneut m 10 1 Kaliumacetat einer/ von 10 g/l gelöst.

d) Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wurde mit Natronlauge auf 10 eingestellt, worauf 2 kg Ammoniumsulfat zugefügt wurden. Die Ausfällung wurde 2 Stunden lang vor sich gehen gelassen und der gesammelte Niederschlag wurde in 5 1 Wasser gelöst.

e) Die erhaltene Lösung wurde eine Nacht lang gegen fließendes Leitungswasser dialysiert.

f) Der im Verlaufe der Dialyse gebildete unlösliche Anteil wurde verworfen, worauf die Lösung mit 500 mg Calciumchlorid behandelt, der pH-Wert auf 6,5 eingestellt und die Lösung erneut einer Dialyse unterworfen wurde gegen 30 1 Calciumchlorid in einer Menge von 100 mg/l. Nach 4 Stunden langer Dialyse wurde der gebildete Niederschlag gelöst in 1 1 Wasser unter Zusatz von 5 ml Essigsäure. Die erhaltene Lösung wurde lyophilisiert.

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Beispiel 2

a) 1 kg des wie angegeben erhaltenen Acetonpulvers wurde in 50 1 kaltem Wasser suspendiert. Zu dieser Lösung wurden 50 g Kaliumchlorid zugefügt, es wurde gerührt, absetzen gelassen, und die Lösung wurde mit Hilfe eines Schwimmfilters abgetrennt.

b) Die feste Phase wurde in 50 1 Wasser suspendiert, das mit 1,750 kg Kaliumchlorid und anschließend mit etwa 500 ml Eisessig versetzt wurde. Es wurde homogenisiert und 6 Stunden lang gerührt, worauf die Lösung filtriert wurde.

c) Die erhaltene Lösung wurde sodann mit 5 kg Natriumchlorid

behandelt und der erhaltene Niederschlag wurde erneiit in

*_n -, π λ. ■ ,-. ·-. · /Konzentration_/n ,.. . 10 1 Natriumchlorid einer / von 20 g/l gelost.

d) Nach Neutralisation der Lösung mit Hilfe von Natronlauge wurden 1,750 kg Natriumchlorid zugesetzt. Der dabei erhaltene unlösliche Anteil wurde in 5 1 Wasser aufgenommen und eine Nacht lang gegen fließendes Wasser dialysiert.

e) Der bei der Dialyse gebildete unlösliche Anteil wurde abgetrennt und die zurückbleibende Lösung wurdemit dem dreifachen Volumen Aceton bei -2Q ⁰C ausgefällt. Der in einer minimalen Menge Wasser wieder aufgelöste Niederschlag wurde aufgebracht auf das Kopfende einer Säule von "Sepharose 6 B" "(1.0 χ 200) das ins Gleichgewicht geseizt war mit einer Phosphatpufferlosung von pH 7»2* Das Verfahrensprodukt wurde aufgefangen in der eluierten Fraktion zwischen dem 2-fachen und 2 1/2-fachen des Volumens der Säule. Die auf diese Weise"erhaltene.Lösung wurde dialysiert und lyophilisiert.

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Beispiel 3

a) 1 kg des wie angegeben erhaltenen Acetonpulvers wurde in 50 kaltem Wasser suspendiert, zu dem 200 g Kaliumacetat zugefügt wurden. Der pH-Wert der Lösung wurde mit Natronlauge auf 8 eingestellt. Es wurde 15 Minuten lang gerührt, worauf absetzen gelassen wurde. Die überstehende Lösung wurde verworfen.

b) Der erhaltene feste Rückstand wurde in 50 1 Wasser gelöst, dao mit 3 kg Kaliumsulfat und mit Schwefelsäure bis zur Erzielung eines pH-Werts von unter oder gleich 5 versetzt wurde» Es wurde homogenisiert und danach 3 Stunden lang in der Kälte gerührt. Der unlösliche Anteil wurde entfernt und die lösliche Fraktion wurde auf einem ¹¹EKS"-FiIter filtriert.

c) Das Filtrat wurde mit dem 2-fachen Volumen Aceton bei -20 ⁰G behandelt. Der nach dem Dekantieren erhaltene Niederschlag wurde in 10 1 Wasser gelöst.

d) Zu der erhaltenen Lösung wurden 2 kg Kaliumsulfat zugefügt. Nach Neutralisation der Lösung wurde der gebildete Niederschlag durch Zentrifugieren^esammelt und in 5 1 Wasser gelöst.

e) Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde durch eine Säule mit dem Ionenaustauscher "AG 11 Ag" geleitet, der in leicht saurem Milieu ins Gleichgewicht gesetzt war (500 g trockener Austauscher pro Liter zu trennende Probe). Die Elution wurde bei steigender Ionenstärke bei leicht saurem pH bewirkt. Das aktive Produkt wurde isoliert in der eluierten Fraktion, deren spezifischer Widerstand 5000 Ohm.cm betrug.

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Versuche zur Bestimmung der pharmakologischen Eigenschaften

Bei dem untersuchten Produkt handelte es sich um das Produkt, das nach Ausfällung der Lösung "beim isoelektrischen Punkt erhalten wurde.

1. Molekültyp

Es handelt sich um ein Molekül von Glycoprotein-Natur, dessen Molekulargewicht etwa 40 000 beträgt unter Bildung von Monomeren und Polymeren, die für alle enzymatischen Substanzen gleich sind._:

Sein isoelektrischer Punkt (oder isoelektrischer pH-Wert) liegt bei 6,8,

Das Molekül ist in einer Phosphatpufferlösung mit einer Ionenstärke von 2000 0hm.cm löslich.

2. Pharmakologische Eigenschaften

Das erhaltene Produkt hat ^00 bis 500 CTA-Einheiten pro mg. Das aktive Zentrum befindet sich auf den Arginin-Valin-Peptidbindungen des Plasminogens,, die geöffnet werden ohne Aufspaltung der Disulfidbrücken unter Überführung des Plasminogens in Plasmin.

Das Molekül erhält damit eine große Beweglichkeit durch Rotation um die Disulfidbrücken, was es ihm ermöglicht, seine enzymatische Aktivität zu entfalten und sich auf den Rezeptoren zu fixieren .

Die auf Fibrinplatten nach der Astrup-Methode in vitro durchgeführten Tests zeigten, daß das durch Lysis mit einer Lösung von 40 /ug/ml bewirkte Durchmesserprodukt über 400 mm beträgt.

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Auf 30 Minuten lang bei 80 ⁰G erhitzten Platten (zur Zerstörung des Plasminogens) war keine Lysiszone feststellbar.

Es war keine Esteraseaktivität festzustellen gegenüber Estern der folgenden Aminosäuren: L-Lysin, L-Phenylalanin, L-Tryptophan usw. Lediglich die Methylester von p-Tosylarginin und p-Nitrophenyl-N-carbobenzoxy-L-tyrosin werden gespalten.

Die in vivo nach der von Kaula-Technik durchgeführten Versuche durch Messung der Lysiszeit plasmatischer Euglobuline bei der Ratte durch intravenöse Injektion einer isotonischen Lösung von 25 mg/kg des angegebenen Produktes führten zu einer 50 %igen Verminderung der Lysiszeit des Euglobulingerinnsels, was eine wesentliche Aktivierung des zirkulierenden fibrinolytischen Systems bedeutet.

Das nach dem Verfahren der Erfindung gewonnene Produkt erweist sich als besonders gut brauchbar als Medikament zur Behandlung von arteriellen und venösen Thrombosen und von Fibrindepots. Das Produkt wird vorzugsweise durch langsame intravenöse Injektion oder durch Perfusion oder Infusion verabfolgt.

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Claims

Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung eines Plasminogen-Aktivators, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Acetohpulver aus tierischen Organen, bestehend aus den Lungen und Nieren von Schweinen, Kälbern, Rindern, Pferden, Lämmern oder Schafen, oder aus Schweine-, Rinder- oder Schafeierstö'cken, behandelt durch

a) Suspendierung des angegebenen Pulvers in einer wäßrigen Salzlösung schwacher Ionenstärke bei ungefähr neutralem pH-Wert,

b) Aufnahme des in Verfahrensstufe (a) erhaltenen Niederschlags in einer wäßrigen Salzlösung mit einer Ionenstärke zwischen etwa 0,6 und 1 bei einem pH-Wert zwischen etwa 3 und 5,

c) Ausfällung der nach Abdekantieren der in .Verfahrensstufe (b) erhaltenen Lösung durch Zugabe eines Salzes oder eines organischen Lösungsmittels bei einem pH-Wert zwischen etwa 3 und 5,

d) Aufnahme des in Verfahrensstufe (c) erhaltenen Niederschlags in Wasser oder einer Salzlösung und Ausfällung durch Zugabe eines Salzes bei einem pH-Wert nahe oder leicht über 7,

e) Aufnahme des in Verfahrensstufe (d) erhaltenen Niederschlags in Wasser und Dialyse der erhaltenen Lösung bis zu einem spezifischen Widerstand in der Größenordnung von 1000 Ohm.cm bei 10 ⁰C und

f) gegebenenfalls Reinigung der erhaltenen Lösung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Verfahrensstufe (a) als Salz Kaliumacetat oder Kaliumchlorid in Konzentrationen zwischen etwa 1 und 10 g/l verwendet.
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in Verfahrensstufe (b) Salze des Kaliums und insbesondere Kaliumchlorid , -acetat oder -sulfat verwendet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche .1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Verfahrensstufe (c) als Salz Ammoniumsulfat oder Kaliumchlorid in Konzentrationen zwischen 100 und 200 g/l verwendet. » .
5. Verfahren nach einem der Ansprüche T bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungsmittel Aceton verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in Verfahrensstufe (d) als Salz Natriumchlorid, Ammoniumsulfat oder Kaliumsulfat verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verfahrensstufen (a) und (b) bei Temperaturen von etwa 4 ⁰C durchführt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man das Acetonpulver der tierischen Organe herstellt durch Dispergierung der zerkleinerten und homogenisierten Organe in einem Acetonbad bei niedriger Temperatur, und Filtration und anschließend Trocknung der erhaltenen Suspension.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man Verfahrensstufe (f) durchführt durch Aus-

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.«ν

fällung der in Verfahrensstufe (e) erhaltenen Lösung beim isoelektrischem pH-Wert von 6,8 mit Hilfe eines Salzes.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet^ daß man als Salz Zinkacetat, Zinkchlorid, oder Calciumchlorid verwendet .
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man in Verfahrensstufe (f) mindestens eine AusschlußChromatographie durchführt auf einem Gelgemisch aus Dextran-Agarose und Polyacrylamid, insbesondere einem "Sepharose 6 B"-Gel.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man in Verfahrensstufe (f) mindestens eine Elution der Lösung auf einem Ionenaustauscher durchführt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ionenaustauscher ein schwach saures Kationenaustauscherharz vom Typ "Bio rex 70" verwendet und die Elution mit Lösungen konstanter Ionenstärke, jedoch steigendem pH durchführt .
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ionenaustauscher ein Harzgemisch vom Typ "AG 11 Ag" verwendet und die Elution bei steigender Ionenstärke durchführt.
15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ionenaustauscher ein "Biogel H.T.P." verwendet.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man in Verfahrensstufe (f) mindestens eine Affinitätschromatographie auf einem Ionenaustauschernarζ durchführt, auf das ein spezifischer Inhibitor des Plasminogen-Aktivators gebunden ist.

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17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15» dadurch gekennzeichnet, daß man als tierisches Organ Mutterschweineierstöcke verwendet.
18. Pharmazeutisches Mittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Produkt, das nach dem Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 17 hergestellt ist.

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