DE2643829A1 - Verfahren zum feststellen der anwesenheit eines der hepatitis zuzuordnenden antigens - Google Patents
Verfahren zum feststellen der anwesenheit eines der hepatitis zuzuordnenden antigensInfo
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Description
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27.September 1976
Cordis Corporation Miami, Florida, 33137 U.S.A.
Verfahren zum Feststellen der Anwesenheit eines der Hepatitis zuzuordnenden Antigens
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Feststellen der
Anwesenheit eines der Hepatitis zuzuordnenden Antigens in einer Probe.
Hepatitis, d.h. Leberentzündung B tritt meistens als Folge einer
Infektion oder eines Verschlusses der Gallenkanäle aufo Man
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nimmt an, dass es zwei verschiedene Arten einer Virus-Hepatitis gibt, von denen eine eine längere Inkubationszeit hat als die
andere. Wenn ein Patient an Hepatitis erkrankte und sie sich bekanntermassen parenteral zugezogen hatte, dann nannte man
diese Art der Hepatitis in der Vergangenheit "Serum-Hepatitis". Wenn jedoch der Patient sich die Hepatitis nicht bekanntermassen
parenteral, sondern oral zugezogen hatte, nannte man diese Art der Hepatitis "infektiös". Es ist jedoch berichtet
worden, dass abgesehen davon, dass sie überlappende Inkubationszeiten haben, man sich die "infektiöse Hepatitis" auch
parenteral, und die sogenannte "Serum-Hepatitis" auch oral zuziehen kann. Daher sollten die Ausdrücke "Serum-Hepatitis"
und "infektiöse Hepatitis" nicht zur Unterscheidung dieser zwei Formen der Hepatitis verwendet werden, obwohl man annehmen
kann, dass es zwei verschiedene, von mindestens zwei unterschiedlichen Wirkstoffen erzeugte Formen der Hepatitis gibt.
Aus diesem Grund hat man vorgeschlagen, die Ausdrücke "Hepatitis A" für die der "infektiösen Hepatitis" ähnliche Form und
"Hepatitis B" für die der "Serum-Hepatitis" ähnliche Form zu verwenden.
Die vorliegende Erfindung ist vorzugsweise auf den Nachweis des Antigens oder der Antigene gerichtet, die der Hepatitis
vom Typ B zuzuordnen sind. Patienten, die an dieser Form der der Serum-Hepatitis äusserst ähnlichen Hepatitis erkranken, haben
diese Antigene oft in ihrem Blut, unabhängig davon, auf welchem Wege sie sich die Hepatitis zugezogen haben. An dieser Stelle
soll darauf hingewiesen werden, dass es keinen zuverlässigen Nachweis für die Anwesenheit eines der Hepatitis A oder einer
hypothetischen Hepatitis C zuzuordnenden Antigens gibt.
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Die Erkrankung an "Serum-Hepatitis" oder Hepatitis B stellt
ein ernstes und nicht zu vernachlässigendes klinisches Problem dar. Wegen der Bedeutung dieses Problemes ist eine Vielzahl
von Nachweismethoden für Hepatitis entwickelt worden. Zu diesen
gehören "Mikro-Ouchterlony", Immunodiffusion, Komplementbindung
(complement fixation), Immunoelektro-Osmophorese, Hämagglutination
und Hämagglutinations-Inhibition, Elektronenmikroskopie und Radioimmunonachweis in der festen Phase. Eine kurze Beschreibung
jeder dieser Methoden findet sich in British Medical Bulletin, 1972, Band 28, Nr. 2 (Viral Hepatitis), Seiten 138
bis 141.
Die Immuno-Elektro-Osmophorese oder Gegenelektrophorese
(counterelectrophoresis CEP) stellt eine schnelle und einfache Methode für den Nachweis des Hepatitis-Antigens und seines
Antikörpers dar. Allerdings ist diese Technik etwas weniger empfindlich als beispielsweise die Komplementbindung. Ihr
hauptsächlicher Vorteil liegt darin, dass der Nachweis in zwei Stunden beendet werden kann. Wegen der geringen Empfindlichkeit
wird der CEP-Methode jedoch von der Food and Drug Administration,(Lebens- und Arzneimittelbehörde) nicht länger
zugestimmt.
Die Anwendungsmöglichkeit des Radio-immuno -nachweises (radioimmunoassay
RIA) für diagnostische Routineuntersuchungen ist als etwas beschränkt anzusehen, und zwar nicht nur wegen der
relativ komplizierten, spezialisierten und teuren Ausrüstung, die für die Durchführung des Tests nötig ist, sondern auch
wegen der äussersten Vorsicht, mit welcher beim Umgang mit radioaktiven Isotopen vorgegangen werden muss. Die Markierung
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mit radioaktiven Isotopen stellt ein ernsthaftes Gesundheitsrisiko dar, erfordert dauernde Überwachung und eine Erlaubnis
der Atomenergiebehörden (für Benutzer und Hersteller) und wirft schliesslich Probleme bei der Beseitigung der Abfälle auf.
Trotzdem ist diese Technik für den Immunonachweis im Augenblick recht weit verbreitet.
Alle immunologischen Nachweismethoden hängen natürlich von einer Grundcharakteristik aller Antikörper und Antigene ab,
nämlich ihrer Fähigkeit mit einem spezifischen komplementären Antigen oder Antikörper zu reagieren. Wenn ein Antikörper
einem sein Antigen enthaltenden Serum zugesetzt wird, bilden der Antikörper und das Antigen eine Verbindung oder einen
Komplex und können aus der Lösung ausfallen. In den meisten der oben erwähnten Testverfahren wird die Anwesenheit des
Antigens in menschlichen Seren unter Verwendung dieses einfachen Vorganges nachgewiesen.
Man hat bereits markierte Antikörper zur Identifikation verschiedener
Antigene benutzt. Wenn ein in bekannter Weise mit einem bestimmten Antigen spezifisch reagierender Antikörper
aus dem Globulin-Teil des Serums oder Plasmas eines Gasttieres
isoliert wird, welches zur Bildung dieses Antikörpers angeregt worden ist, kann der Antikörper in bekannter Weise markiert
werden. Indem man den Antikörper mit einer Markiersubstanz verbindet, z.B. - wie oben erwähnt - mit einer physikalisch
nachweisbaren Substanz wie einem Radioisotop pder mit fluoreszierenden Chemikalien, kann die Gegenwart des Antikörpers nachgewiesen
werden. Bei der diagnostischen Anwendung wird sich
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der markierte Antikörper selbst an das nachzuweisende Antigen anlagern, sofern dieses Gegen-Antigen in einer vorbereiteten
Probe vorliegt. Die Anwesenheit des Antigens in der Probe kann dann, durch den Nachweis des markierten Antikörpers in der
Probe bestätigt werden.
Für diagnostische Zwecke sollte ein markierter Antikörper
genügend spezifisch für ein bestimmtes Antigen sein, so dass er nur mit den Antigenen reagiert, deren Nachweis gewünscht
wird. Kreuzreaktionen mit anderen, ähnlich aufgebauten Antigenen, die jedoch ganz verschiedene und insignifikante Konsequenzen
haben, müssen vermieden werden. Aus diesem Grunde ist
es klar, dass sowohl die Herkunft als auch die Präparation des Antikörpers in jedem Immunonachweis recht kritisch sind.
Wie bereits ausgeführt, umfasst eine der Methoden zum Nachweis des der Hepatitis zuzuordnenden Antigens den Radio-Immunonachweis
in der festen Phase. Ein derartiges Verfahren ist in dem US-Patent Nr. 3,867,517 beschrieben. Danach wird bei der
Durchführung dieses Nachweises zunächst ein einseitig geschlossenes
Rohr oder ein mit diesem zusammen zu verwendender Einsatz
aus gegossenem Polystyrol mit einer Antikörper-Schicht belegt. Dies erreicht man dadurch, dass man das zu belegende Teil mit
einer Antikörper-Lösung zusammenbringt oder inkubiert. Anschliessend
wird die unbekannte Probe mit dem derart beschichteten Röhrchen oder Einsatz zusammengebracht, damit die Antikörper
mit den in der Probe anwesenden Antigenen reagieren. Das Röhrchen wird dann gewaschen und mit Antikörpern zusammengebracht,
die mit dem radioaktiven Isotop J-125 markiert sind. Anschliessend wird es wieder gewaschen, um alle nichtgebundenen,
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markierten Antikörper zu entfernen. Wenn sich in der Probe Antigene befinden, wird also ein Sandwich aus dem Polystyrolröhrchen
(oder Einsatz), dem Antikörper, dem Antigen und dem mit J-125 markierten Antikörper gebildet. Die von dem mit J-125
markierten Antikörper ausgesandte Strahlung wird dann gezählt und mit einer Vergleichsprobe verglichen.
Es ist auch berichtet worden, dass bei der Durchführung des Radio-Immunonachweises eine Polytetrafluoräthylen-Scheibe
nützlich sein kann, auf welche ein substituiertes Polystyrol, z.B. Isothiocyanostyrol, geschichtet oder "gepfropft" ist.
Dieses Polystyrol ist eine unlösliche Substanz mit spezifisch ausgebildeten Oberflächen von protein-reaktiven Gruppen, die
verwendet werden können, um im Bionachweisverfahren als Reagenzien Proteine kovalent zu binden.
In jüngster Zeit ist eine wichtige Alternative zum Markieren von Antikörpern mit Radioisotopen oder fluoreszierenden Chemikalien
entwickelt worden. Diese besteht darin, Antikörper mit einem Enzym zu markieren. Ein derartiges Verfahren ist in den
US-Patenten 3,654,090 und 3,791,932 beschrieben. Ein enzymgebundener Immunonachweis für Alphafetoprotein nach der kompetitiven
oder der Sandwich-Methode ist in Clinica Chemica Acta, Band 48 (1973), Seiten 15-18, beschrieben.
Im Vergleich mit dem Radio-Immunonachweis, bietet die Markierung
mit Enzymen eine Reihe von wichtigen Vorteilen. So nimmt z.B. jedes enzym-markierte Molekül in der .Endmischung am Nachweis
bzw. an der Messung teil. Bei der Radioisotop-Markierung andererseits nimmt nur ein geringer Teil der markierten Moleküle
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an der eigentlichen Messung teil, da während der Messzeit nur ein sehr kleiner Teil der Radioisotope in der Endmischung zerfällt.
Bei der Markierung mit Enzymen nimmt jedes markierte Molekül wiederholt am Nachweis bzw. der Messung teil, da das
Enzym viele Substratmoleküle beeinflusst, die dann nachweisbare Endprodukte bilden. Derartige Reaktionen können bis zu 100
mal in der Minute stattfinden, wodurch die Empfindlichkeit erheblich vergrössert wird. Ein Radioisotop zerfällt dagegen
nur einmal während der Messung, anschliessend nimmt es am Nachweis nicht mehr teil. Ein enzym-markiertes Reagenz hat ausserdem
eine lange Lebensdauer, während die isotopen-markierten Reagenzien laufend zerfallen und dadurch ernsthafte Aufbewahrungsprobleme
aufwerfen. Enzym-markierte Reagenzien stellen auch nur minimale Gesundheitsrisiken dar, während beim Umgang
mit Radioisotopen und damit markierten Molekülen erhebliche Gesundheitsrisiken auftreten. Schliesslich kann man bei einem
Immunonachweis mit enzym-markierten Molekülen eine einfache
und relativ billige Ausrüstung verwenden. Im Gegensatz dazu hängt der Erfolg des Radioimmuno-Nachweises von der Effizienz
des Zerfallsnachweises und damit von der Qualität einer sehr teuren Nachweisapparatur ab.
Obwohl der Nachweis eines der Hepatitis zuzuordnenden Antigens im Blut einer Person nicht gleichbedeutend ist mit einer Krankheitsgeschichte
der Hepatitis, haben Untersuchungen gezeigt, dass dann eine hohe Häufigkeit einer Hepatitis-Erkrankung auftritt,
wenn ein Patient Blut erhalten hat, in welchem durch Tests die Gegenwart von der Hepatitis zuzuordnenden Antigenen
festgestellt worden ist. Da die Entscheidung, ob bestimmte in einem Blutzentrum erhältliche Blutreserven verwendet werden
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können, oft in relativ kurzer Zeit getroffen werden muss, ist
ein empfindlicher, schneller und leicht durchzuführender Übersichtstest für Hepatitis, der ohne teure Apparaturen auskommt,
von äusserster Wichtigkeit. Obwohl die verschiedenen in der Vergangenheit für den Nachweis der Hepatitisantigene verwendeten
Tests bis zu einem bestimmten Grad zufriedenstellend waren, sind sie doch alle mit einem oder mehreren Nachteilen
behaftet.
In jedem Jahr sterben Tausende an Hepatitis oder müssen in ein
Krankenhaus eingewiesen werden. Man hat lange angenommen, dass der Ausgangspunkt, um diese Krankheit unter Kontrolle zu bringen,
darin liegen müsste, eine Technik zur Untersuchung des Blutes zu entwickeln, die weltweit zur Verfügung gestellt
werden und einfach und routinemässig ausgeführt werden könnte. Obwohl inzwischen eine ganze Anzahl von derartigen Nachweismethoden
vorhanden sind, haben sie doch die Anforderung dieses Idealtests bisher nicht erfüllen können, da sie relativ unempfindlich
sind/ mit langen und detaillierten Verfahren verbunden
sind, die Verwendung komplizierter, in den meisten hämatologischen Laboratorien nicht ohne weiteres verfügbarer Geräte und
Ausrüstungen erfordern oder nur mit Reagenzien durchgeführt werden können, die hochgradig unstabil sind und daher weder
über einen längeren Zeitraum aufbewahrt noch ohne Gesundheitsrisiko gehandhabt werden können.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis von der Hepatitis zuzuordnenden Antigenen vorzuschlagen, welches
schnell, einfach, genau und routinemässig in Körperflüssigkeiten die Anwesenheit der Antigene feststellt. Diese Aufgabe
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wird erfindungsgemass durch ein Verfahren, gelöst, welches die
folgenden Schritte umfasst:
(a) Zusammenbringen (Inkubation) der Probe mit einem
; unbeweglich an einem unlöslichen Körper gehaltenen,
mit dem Hepatitis-Antigen reaktionsfähigen Antikörper, wobei sich bei dem Zusammenbringen eine Bindung zwischen
Antikörper und in der Probe vorliegendem Antigen ausbildet und ein unlöslicher Körper mit daran gebundenem
Antigen entsteht, falls Hepatitis-Antigene in der Probe vorliegen,
(b) Trennen des unlöslichen Körpers von jeglicher nichtgebundenen Substanz,
(c) Zusammenbringen (Inkubation) des unlöslichen Körpers
mit einer markierte, mit den Hepatitis-Antigenen reaktionsfähige Antikörper enthaltenden Lösung, wobei die
markierten Antikörper mittels eines Enzyms markiert sind, welches derart auf ein Substrat einwirken kann,
dass ein nachweisbares Reaktionsprodukt entsteht, und
wobei das Zusammenbringen derart geführt wird, dass die markierten Antikörper mit jedem im Schritt (a)mit
einem Antikörper an dem unlöslichen Körper gebundenen Antigen eine Bindung eingehen können,
Cd) Trennen des unlöslichen Körpers von der die enzym-markierten
Antikörper enthaltenden Lösung, um jeglichen ungebundenen, markierten Antikörper davon zu entfernen,
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(e) Zusammenbringen (Inkubation) des unlöslichen Körpers mit einer Substratlösung, auf die das Enzym des markierten
Antikörpers einwirkt und dadurch eine chemische Veränderung des Substrates herbeiführt, bei welcher
ein nachweisbares Reaktionsprodukt gebildet wird,
(f) Nachweisen jeglichen in der Lösung vorliegenden Reaktionsproduktes,
um die Anwesenheit von Hepatitis-Antigenen nachzuweisen.
Weitere bevorzugte Ausgestaltungen des erfindungsgemässen Verfahrens
sind Gegenstand der Unteranspriiche.
Die Erfindung stellt also einen direkten Immunonachweis für der Hepatitis zuzuordnende Antigene dar, wobei das "Sandwich"-Prinzip
angewandt wird. Bei der Durchführung des Nachweises wird das nachzuweisende Antigen zwischen mit ihm reagierenden
Antikörperschichten eingelagert. Eine Antikörperschicht ist
mit einem Enzym markiert. Die andere Antikörperschicht ist
kovalent an einen unlöslichen Körper gebunden. Das Enzym wird mit einem chemischen Substrat zusammengebracht, welches in
Anwesenheit des Enzym-Katalysators eine chemische Veränderung erfährt und dabei ein Reaktionsprodukt bildet. Die Gegenwart
des Hepatitis-Antigens wird durch die Gegenwart des Reaktionsproduktes nachgewiesen.
Gemäss der Erfindung ist auch vorgesehen, eine Nachweiseinheit
oder ein Nachweisset für Hepatitis-Antigene zu schaffen. Die drei wichtigsten Reaktionspartner des Testsets sind der unlösliche,
polymere feste Körper, an welchen mit Hepatitis-Antigenen
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reaktive Antikörper gebunden sind, die enzym-markierten Hepatitis-Antikörper
und ein Enzymsubstrat, welches unter dem katalytischen Einfluss des Enzyms chemisch verändert wird und
dabei ein nachweisbares Endprodukt bildet. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Enzym, mit welchem der
sich mit dem Antigen verbindende Antikörper markiert ist, eine Alkali-Phosphatase und das Enzymsubstrat p-Nitrophenylphosphat.
Das Testset kann auch Kontrollseren enthalten, u.a. bezüglich der Anwesenheit von Hepatitits-Antigenen negative, schwach
positive und stark positive Seren, eine Lösung von Pferdeglobulin,
welches der Testprobe zugesetzt wird, um die Häufigkeit nichtspezifischer Reaktionen zwischen der Testprobe und
(herdem unlöslichen, polymeren Körper\abzusetzen, einen Puffer,
um den pH-Wert der Enzymsubstratlösung in dem für die Reaktion günstigsten Bereich zu halten, und eine Vielzahl von Fläschchen,
deren Grosse so gewählt ist, dass der Kontakt zwischen dem unlöslichen
Körper und den kleinen Mengen der beim Zusammenbringen verwendeten Reaktionspartner gefördert wird. Wenn Alkali-Phosphatase
und p-Nitrophenylphosphat als Enzym-Enzymsubstrat-System verwendet werden, ist der Puffer eine wässrige
0,028 molare Na2CO3- und 0,001 molare Mg++-Lösung.
Im Rahmen der Erfindung wird ein immunologisch aktiver, gereinigter
'Hepatitis-Antikörper zur Verwendung bei Immunonachweisen vorgeschlagen, der mit einem Funktional-Enzym, wie beispielsweise
Alkali-Phosphatase, konjugiert, d.h. chemisch gebunden ist.
Im Rahmen der Erfindung wird weiterhin ein scheibenförmiger,
unlöslicher Körper oder eine Matrix für die Verwendung bei
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Immunonachweisen vorgeschlagen. Die Matrix weist eine Vielzahl
von mit Proteinen reagierenden Gruppen auf, die gleichmässig auf ihrer Oberfläche angelagert oder "aufgepfropft" sind.
Gereinigte Hepatitis-Antikörper sind mit diesen reaktiven Gruppen kovalent gebunden und bilden so eine äussere Schicht
von Hepatitis-Antikörpern.
Bei dem Immunonachweis wird der unlösliche Körper in ein Fläschchen mit flachem Boden eingelegt und mit einer flüssigen
Probe gerade bedeckt. Damit der Test reproduzierbar wird, ist es wichtig, dass die Antigene in der Probe mit der gesamten
Oberfläche der mit Antikörpern beschichteten Scheibe in Berührung kommen. Der Erfinder hat festgestellt, dass die Verwendung
einer flachen oder an der Oberfläche eben ausgebildeten Scheibe zu einem Empfindlichkeitsverlust geführt hat. Daher
sind die zwei gegenüberliegenden Oberflächen der Scheibe erfindungsgemäss
verformt, insbesondere ungleichmässig verformt, um den Kontakt der Scheibenoberfläche mit dem Boden des Fläschchens
oder Gläschens gering zu halten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Oberflächen der
Scheibe waffelähnlich ausgebildet, in dem man die Scheibe vor der Anlagerung der Antikörper durch Pressen laufen lässt.
Die beschriebenen Ausführungsbeispiele sind auf den Nachweis des Antigens gerichtet, das der Hepatitis B zuzuordnen ist.
Es gibt jedoch keinen Grund, warum das Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht auch zum Nachweis von Antigenen verwendet
werden könnte, die anderen Typen der Hepatitis zuzuordnen sind, falls man die Antigene dieser Hepatitis-Typen erst einmal identifiziert
hat.
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Wenn man, wie erfindungsgemäss vorgeschlagen, ein Testset mit den notwendigen Reagenzien, den Reaktxonsgefässen und dergleichen
und zusätzlich mit Standardkontrollproben, nämlich bezüglich der Hepatitis-Antigene -negativen, schwach und stark
positiven Proben, ausrüstet, kann man damit vorteilhaft Fehler bei der Durchführung des Testes weitgehend ausschliessen.
Ausserdem wird dadurch die Genauigkeit und Empfindlichkeit des Tests erhöht. Besonders vorteilhaft ist dabei, wenn das Testset Laborausrüstung enthält, mit welcher die einzelnen Schritte
des Verfahrens standardisiert werden können»
Besonders vorteilhaft ist es, wenn bei dem Verfahren ein Hepatitis-Antikörper-Enzym-Komplex
verwendet wird, in dem sowohl der Antikörper als auch das Enzym ihre interessierenden chemischen
Eigenschaften behalten. Die erfindungsgemäss vorgeschlagenen Komplexe können lange aufgehoben werden, ohne dass sie
ihre immunologischen oder katalytischen Eigenschaften verlieren; ausserdem sind sie gegenüber den der Hepatitis zugeordneten
Antigenen hochgradig reaktionsfreudig.
Vorzugsweise werden an die Hepatitis-Antikörper Enzyme gebunden, die eine Reaktion mit hoher Reaktionsgeschwindigkeit katalysieren
können, so dass die Konzentration des Endproduktes mit Hilfe eines photometrischen Nachweisgerätes genau bestimmt
werden kann.
Die unlösliche Matrix trägt erfindungsgemäss eine hohe Konzentration
von gereinigten, über die gesamte Oberfläche gleichmassig verteilten Hepatitis-Antikörpern. Diese sind an die
Matrix gebunden, so dass sie weder durch mechanische noch durch
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chemische Kräfte, denen sie während des Verfahrens unterworfen
sein mögen, von der Stelle bewegt werden können. Die Anbindung an die Matrix ist dabei so gewählt, dass die Funktion des
Antikörpers erhalten bleibt, d.h., dass er weiterhin an der immunologischen Reaktion teilnehmen kann und durch die Anbindung
an die Matrix immuno-chemisch unverändert bleibt.
Die nachfolgende Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung dient im Zusammenhang mit der Zeichnung der näheren
Erläuterung. Es zeigen:
Fig. 1 ein Flussdiagramm der einzelnen Schritte des erfindungsgemässen Verfahrens;
Fig. 2 eine perspektivische Ansicht eines unlöslichen Körpers gemäss der Erfindung;
Fig. 3 eine Ansicht eines Reaktionsgefässes während der ersten Phase des erfindungsgemässen Verfahrens;
Fig. 4 eine Ansicht eines Reaktionsgefässes während der zweiten Phase des erfindungsgemässen Verfahrens;
Fig. 5 eine Ansicht eines Reaktionsgefässes während der dritten Phase des erfindungsgemässen Verfahrens
; und
Fig. 6 eine schematische Darstellung der Sandwich-Struktur,
die während des erfindungsgemässen Verfahrens aufgebaut wird.
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Die Erfindung ist im folgenden zunächst allgemein beschrieben und im folgenden dann detailliert. Das erfindungsgemässe Verfahren
zum Nachweis von der Hepatitis zuzuordnenden Antigenen wird in vier nacheinanderfolgenden Schritten durchgeführt, wie
in Fig. 1 schematisch dargestellt ist.
Im ersten Schritt des erfindungsgemässen Verfahrens lässt man
die auf einem unlöslichen Körper 10 (Fig. 2) unbeweglich angeordneten Antikörper mit dem im Testserum befindlichen Antigen
reagieren, wie dies in Fig. 3 dargestellt ist. Durch diese Reaktion werden die Antigene unbeweglich an den unlöslichen
Körper gebunden, so dass bei der Reaktion mit einem enzymmarkierten Antikörper beim nächsten Verfahrensschritt, wie in
Fig. 4 gezeigt, auch der markierte Antikörper unbeweglich gebunden wird. Wie in Fig. 5 dargestellt, wird das Enzym mit
einem geeigneten Substrat zusammengebracht, welches unter dem Einfluss des Enzymes reagiert und dabei eine Farbänderung erfährt.
Diese Farbänderung dient als Nachweis für die Gegenwart von der Hepatitis zuzuordnenden Antigenen in der Probe. Der
letzte Verfahrensschritt besteht darin, den Grad der Verfärbung festzustellen und diesen Wert mit einer Standardprobe
zu vergleichen.
Das erfindungsgemässe Nachweisset enthält alle für den oben
beschriebenen Test nötigen Materialien und ist für 100 Tests bestimmt. Grössere und kleinere Sets können selbstverständlich
dadurch hergestellt werden, dass die Menge der Reaktionspartner proportional vergrössert oder verkleinert wird. Das Set wird
üblicherweise in einem Behälter vertrieben, der die Reaktionspartner und die Kontrollsubstanzen enthält, die bis zum Gebrauch
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bei Temperaturen von 2 bis 8 C aufbewahrt werden sollen. Ausserdem sind Gläschen oder Fläschchen in einer Menge vorgesehen,
die für 100 Tests ausreicht.
100 bis 105 Polymerscheiben mit waffelähnlichen Oberflächen,
wie sie in Fig. 2 dargestellt sind, sind beigefügt. Sie tragen eine Schicht von Antikörpern, die mit Hepatitis-Antigenen reagieren
können; die Antikörperschicht ist auf der Oberfläche der Scheiben gebunden und lyophilisiert. Die genaue Natur dieser
unlöslichen, festen Scheiben und die Art und Weise, wie sie hergestellt werden, werden weiter unten erläutert.
Der zweite Reaktionspartner in dem Set umfasst eine Probe einer Verbindung von Hepatitis-Antikörpern mit Alkaliphosphatase.
Die genaue Natur dieses Reaktionspartners, das Verfahren zur Herstellung und andere alternativ verwendbare Reagenzien werden
weiter unten beschrieben. Dieser Reaktionspartner wird als gebrauchsfertige Lösung geliefert.
Ein dritter, in dem erfindungsgemässen Testset enthaltener
Reaktionspartner besteht in 400 mg eines p-Nitrophenylphosphat-Enzym-Substrates.
Diese Substanz ist in pulvriger Form stabil, wird jedoch relativ unstabil, wenn sie in einem Puffer aufgelöst
ist, um eine Lösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml zu bilden. Daher muss die Lösung jedesmal unmittelbar vor der
Verwendung hergestellt werden.
Die anderen während des erfindungsgemässen Verfahrens verwendeten
Materialien umfassen eine bestimmte Menge von Pferdeglobulin, Probenverdünnung, verschiedenen Pufferlösungen und verschiedenen
Waschlösungen. Die exakte Natur und die Herstellung
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dieser Reagenzien und Materialien werden weiter unten beschrieben.
A. Herstellung des Antikörpers
Um das erfindungsgemässe Verfahren durchführen zu können, muss
man Antikörper haben, die mit dem Antigen oder den Aritigenen reagieren, die der Hepatitis zuzuordnen sind. Es wird darauf
hingewiesen, dass ein derartiger Antikörper existiert und die vorliegende Erfindung daher nicht auf die Verwendung eines
bestimmten Antikörpers beschränkt werden soll.
Ein reaktionsfähiger Antikörper kann dadurch präpariert werden, dass Blut von einem Gasttier gereinigt wird, dem eine bekannte
Antigenprobe injiziert worden ist.. Ein mit einem Hepatitis-Antigen
reagierender Antikörper kann im wesentlichen mit dem im britischen Patent 1,387,625 beschriebenen Verfahren präpariert
werden.
Die Präparation von Hepatitis-Antikörpern hängt zunächst einmal
davon ab,Blut zu erhalten, welches bekanntermaßen positiv
bezüqLichfder Hepatitis zuzuordnendenAntigenenist. Daher müssen
Blutproben aus verschiedenen Quellen zuerst einmal auf ihre
Eignung untersucht werden, die Präparation immunospezifischer, gereinigter Antikörper gemäss der Erfindung zu erlauben.
Ein Blutgefässegment mit Blut, von dem man glaubt, daß es bezüglich
Hepatitis-Antigenenpositiv ist, wird bei einer Temperatur von 2 bis 8°C in einer aufrechten Position gehalten, damit
sich die Blutzellen in der unteren Hälfte absetzen. Das Plasma
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wird von den Zellen abgetrennt und der Titer des unverdünnten Plasmas und einer im Verhältnis 1:16 verdünnten Probe in,
normaler Salzlösung wird mit Hilfe der bekannten Technik Ser~~
Counterelektrophorese (CEP) gegen einen Standardantikörper bestimmt. Wenn sowohl die unverdünnte Plasmaprobe als auch die
im Verhältnis 1:16 verdünnte Probe positiv sind, wird das Blut als brauchbar für die Präparierung von gereinigten Antikörpern
angesehen. Diese Präparierung wird im folgenden beschrieben.
Teil der aus dem Blut isolierten Antigene wird entweder zur Anregung der Antikörperproduktion in den Gasttieren verwendet
oder zur Reinigung der von dem Tier produzierten Antikörper. Bevor die Antigene zu einem der angegebenen Zwecke verwendet
werden können, müssen sie einem vorherigen Isolierungsprozess unterworfen werden.
Das Plasma wird in einen sterilen Vakuumbehälter gebracht und durch Zugabe einer 5 molaren CaCl^-Lösung ausgeklumpt, wobei
0,75 ml CaCl auf 200 ml Plasma zugegeben werden. Diese Lösung wird dann etwa eine Stunde lang in einem Wasserbad bei etwa
37°C gehalten, bis ein Klumpen geformt ist. Nachdem sich ein fester Klumpen gebildet hat, wird das Plasma bei -20°C gefroren
und bei 2 bis 8°C wieder aufgetaut, um die Schrumpfung oder Retraktion des Klumpens zu ermöglichen. Das Serum wird
von dem Klumpen getrennt und falls nötig gefiltert und ist
dann fertig für die Präparierung eines Hepatitis-Antigen-Klümpchens
oder -pellets für die Immunisierung oder für die Verwendung in immuno-absorbierenden Kolumnen.
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(1) Zubereitung des Antigen-Pellets oder Antigenklümpchens
für die Immunisierung
Hepatitis positive Seren, die dem oben geschilderten Prozess
unterworfen waren, werden bei 10000 Upm 30 Minuten lang bei 4°C zentrifugiert. Der obenauf schwimmende Teil oder der überstand
wird nach dem Zentrifugieren in Ultrazentrifugen-Röhrchen verteilt und beispielsweise in einer Beckman L2-65B Ultra-.
zentrifuge bei 40000 bis 50000 Upm 4-20 Stunden bei 4°C zentrifugiert. Der überstand in jedem Röhrchen wird abgegossen und
weggeworfen; der klümpchenförmige Rückstand oder das Pellet, welches die Antigene enthält, wird vorweg mit einer normalen
(0,15 molaren) Salzlösung ausgewaschen.
Eine kleine Menge einer normalen Salzlösung wird dann jedem Zentrifugenröhrchen zugesetzt und der Inhalt einer Sonikatiön·
unterworfen, um das Klümpchen aufzubrechen. Die Suspensionen in den Sonikator-Röhrchen werden dann zusammengegeben und
gleichmässig in saubere, mit normaler Salzlösung gefüllte Röhrchen verteilt. Diese Lösung wird wieder in der Beckman L2-65B-Zentrifuge
bei 40000 bis 50000 Upm 4-20 Stunden bei 4°C zentrifugiert, wie es oben beschrieben ist.
Der in dem voranstehenden Absatz beschriebene Vorgang kann
5-mal oder öfter wiederholt werden.
Das Klümpchen- oder Pelletmaterial wird nach dem Entfernen des Überstandes aus jedem Zentrifugierröhrchen in einer möglichsi
kleinen Menge einer normalen Salzlösung zusammengegeben. Eine Probe wird mit einer Standard-Hepatitis-Antikörper-Probe ver-
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glichen. Wenn sich bei der Counterelektrophorese (CEP) ein Pellet-Titer von 1:25 oder höher ergibt, kann das Pellet oder
Klümpchen für die Immunisierung verwendet werden. Das zusammengegebene
Antigenklümpchen kann in gleichgrosse 3 ml-Mengen geteilt und bei -20°C für den zukünftigen Gebrauch eingefroren
werden.
(2) Herstellung und Vorreinigung der Hepatitis-Antikörper
Eine Probe des in der oben beschriebenen Weise präparierten Antigenklümpchens oder -pellets wird am Morgen der Immunisierung
zu einer gleichen Menge eines kompletten FREUND-Adjuvans
zugegeben, und eine Emulsion wird entsprechend den den Fachleuten geläufigen Verfahren zubereitet. Das Antigen wird dann
einem Gasttier, z.B. einem Pferd in der an sich bekannten Weise injiziert, um die Produktion von Hepatitis-Antikörpern anzuregen.
Den immunisierten Pferden wird Blut abgenommen oder sie werden einer Plasmapherese unterworfen, wobei bekannte
Techniken angewandt werden. Alternativ oder zusätzlich können Zubereitungen ohne Adjuvans bei anderer Zufügung der Immunisierungsmittel
verwendet werden.
Das abgenommene Blut muss zur Isolierung der Hepatitis-Antikörper vor dem endgültigen Immuno-Absorptions-Reinigungsschritt
behandelt werden. Diese Vorwegreinigung wird in drei Schritten ausgeführt. Zuerst wird das Plasma von dem Gasttier rekalzifiziert.
Dann wird das Serum mit einer ausreichenden Menge eines normalen menschlichen Plasmas (NHP) gemischt, um andere
als der Hepatitis zugeordnete Antikörper dadurch auszufällen, dass die Bildung unlöslicher Antigen-Antikörper-Komplexe ein-
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geleitet wird. Das absorbierte Antiserum wird mit Hilfe der
CEP auf Hepatitis-Antikörper untersucht. Schliesslich werden
die mit den Hepatitis-Antigenen reagierenden Antikörper mit Ammoniumsulfat ausgefällt. Dieses Material kann bis zum Gebrauch
eingefroren werden.
(3) Herstellung von Aktivkohle-Immunoabsorber-Kolumnen
Zur Zubereitung des gereinigten, zur Produktion des erfindungsgemässen
Reaktionspartners oder Reagenz verwendeten Antikörpers wird der in der vorbeschriebenen Weise gewonnene Hepatitis-Antikörper
einem immunospezifisehen Extraktionsprozess unterzogen. Zur allgemeinen Diskussion dieses Verfahrens wird auf
das britische Patent 1,387,625 (Bradish et al) vom 19.März 1975
verwiesen, welches den Titel trägt "Immunospezifische Trennung von Antigenen und Antikörpern". Durch die Nennung dieser Patentschrift
wird deren Offenbarung in die vorliegende Anmeldung übernommen.
Im allgemeinen nützt der in der vorliegenden Erfindung benutzte Reinigungsprozess die Fähigkeit der mit Hepatitis- Antigenen
reagierenden Antikörper aus, mit diesen Antikörpern Komplexe zu bilden. Diese Komplexbildung führt zum Ausschluss anderer
fremder Antikörper und Proteine, die in den aus dem entnommenen Blut gewonnenen Antikörper-Proben unweigerlich anwesend sind.
Eine Kolumne wird dadurch hergestellt, dass vorgewaschene,
sorbierende Kohle mittels bekannter Techniken in ein Glas- oder Plastikrohr gepackt wird. Eine Vereinigung von Antigenen wird
aus mindestens sechs verschiedenen Serum-Proben bereitet,um
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eine Mischung verschiedener Hepatitis-Antigene zu erhalten. Diese Vereinigung wird dann auf eine Protein-Konzentration
zwischen 1 und 2 mg Protein pro ml Lösungsmittel eingestellt, wobei dies mit Hilfe von UV-Absorption bestimmt wird.
um das Antigen an die Kohle zu binden, wird diese verdünnte
Lösung mit einer Flussrate von etwa 300 bis 1000 ml pro Stunde eingeführt. Etwa 75 mg Protein sollten pro Gramm Aktivkohle
(Holzkohle) in der Kolumne angelagert werden. Der Ausfluss der Kolumnen wird in 500 ml grossen gleichen Teilen aufgefangen,
von denen jeder auf den Proteingehalt geprüft wird. Die Kolumne kann als mit dem Antigen gesättigt angesehen werden, wenn
der Ausfluss einen Proteingehalt aufweist, der etwa dem des Ausgangsiriaterials gleich ist. Das Bett wird durch einen durch
die Kolumne fliessenden Strom von mit Phosphat gepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline PBS) gewaschen, bis der
Ausfluss bei einer Wellenlänge von 280 nm keine wesentliche nachweisbare Absorption mehr zeigt.
Um jegliche lose angelagerte Proteine auszuwaschen, wird das Kohlebett mit frisch zubereiteter 5-molarer Natriumjodidlösung
gespült, die 200 mg Natriumthiosulfat pro Liter enthält. Anschliessend
wird die Natriumjodidlösung aus der Kolumne gespült,
indem eine ausreichende Menge PBS durch diese geschickt wird. Nach einer letzten Waschung des Bettes mit PBS, welches
1 mg pro ml Natriumazid (Schutzmittel) enthält, kann die Kolumne bei einer Temperatur von 2 bis 8°C bis zum Gebrauch aufbewahrt
werden.
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Zubereitung des Antikörpers für die Verwendung in einer Enzym-Verbindung und zusammen mit einem unlöslichen festen Körper
Die in der oben beschriebenen Weise gereinigten Antikörper werden von Ammoniumsulfat befreit und mit PBS verdünnt, wobei
auf einen Teil Antikörper zwei Teile Pufferlösung kommen. Die Kolumne wird aufgestellt und so angeordnet, dass die Fraktionen
gesammelt werden können. Die Antikörper-Lösung wird der Kolumne kontinuierlich mit einer Flussmenge von etwa 200 ml pro
Stunde zugefügt. Der Ausfluss wird gesammelt und auf den Gehalt von Protein und Hepatitis-Antikörpern geprüft, um festzustellen,
wann die Kolumne mit Antikörpern gesättigt ist. Sobald die Sättigung erreicht ist, wird das Kolumnenbett mit PBS ausgewaschen,
um lose absorbierte Proteine zu entfernen.
In diesem Stadium haben die auf der Kohlekolumne unbeweglich angelagerten Antigene mit den mit ihnen reagierenden Antikörpernjeine
Bindung gebildet. Andere fremde Proteine und Antikörper, die mit den absorbierten Antigenen nicht spezifisch
reagieren, sind durch die Kolumne hindurchgelaufen und von Antikörpern getrennt worden.
Um diese Antikörper-Antigen-Bindung aufzubrechen und die gereinigten
Antikörper auszuspülen/ wird eine unmittelbar vor der Verwendung zubereitete 5-molare Natriumjodidlösung in die
Kolumne eingeführt. Die Natriumjodidmenge sollte so ausreichend
bemessen sein, dass alle in der Kolumne gebundenen Antikörper entfernt werden können. Der Durchfluss durch die Kolumne wird
auf mindestens 200 ml pro Stunde eingestellt, und die ausge-
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waschene Flüssigkeit wird in Fraktionen eines angemessenen Volumens gesammelt. Die insgesamt gesammelte Menge sollte
wenigstens so gross sein wie die der zugeführten Natriumjodidlösung.
Wenn jede Fraktion der gereinigten Antikörper gesammelt ist,
wird sie einer zweifachen Filterung unterzogen, zuerst durch eine 0,45 ,u-Membran und dann durch eine 0,22 ,u-Membran. Das
Filtrat wird im Verhältnis 1:3 mit destilliertem Wasser von 2 bis 8°C verdünnt, z.B. werden 200 ml des Filtrates zu 400 ml
destilliertem Wasser dazugegeben. Diese verdünnten Antikörperfraktionen werden dann beispielsweise in einen AMICON-Konzentrator
mit einer XM-50-Membran gegeben und konzentriert.
In einem letzten Reinigungsschritt werden die konzentrierten, gereinigten Antikörper dialysiert. Nach der Dialyse werden die
Antikörper entfernt und zentrifugiert. Der Überstand wird mindestens 24 Stunden lang gegen eine O1 01-molare Natriumphosphat-Lösung
dialysiert, während die erste Dialyse gegen PBS ausgeführt wird. Nach Beendigung dieser letzten Dialyse
wird die Antikörper-Konzentration gemessen»
Die Antikörper werden dann mit Hilfe der CEP-Technik auf ihre Aktivität im Vergleich mit einem Standardantigen untersucht,
um den Antikörpergehalt zu bestimmen. Wenn dieser annehmbar
ist„ werden sie in einen liophylen Zustand überführt und bis
zur Benutzung aufbewahrt.
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B. Zubereitung des Antikörper-Enzym-Komplexes
Alkaliphosphatase aus den Eingeweiden von Kälbern (intestinale Alkaliphosphatase von Kälbern) wird mit einer Lösung des wieder aufgenommenen Antikörpers in einem Verhältnis von Enzym
zu Antikörper wie 3:1 gemischt, bis eine Endkonzentration erreicht ist, bei der mehr als 10 mg Gesamtprotein pro ml Lösung
von PBS (pH 7,4) erreicht ist. Die Lösung wird vollständig dialysiert, um NH. -Ionen zu entfernen.
Die dialysierte Antikörper-Enzym-Mischung wird dann zentrifugiertj,
um jegliche unlösliche Substanzen zu entfernen. Der Proteingehalt des Überstandes wird durch Zufügen von PBS-Mg Lösung
auf 10 mg/ml eingestellt» Zu dieser Lösung wird 8%-Glutaraldehyd
derart zugefügt,, dass 1 ml Glutaraldehyd-Lösung
auf 10 ml Antikörper-Enzym-Lösung kommt„ Die Lösung wird 3,5
bis 20 Minuten lang langsam umgerührt„ wobei die Antikörper
und die Enzyme mit Hilfe des Glutaraldehydes eine chemische Verbindung eingehen. Anschliessend wird die Lösung des Komplexes
gegen PBS dialysiert, welches zur Entfernung des Glutaraldehydes 0,00r MMg++ enthält.
Das dialysierte Material wird anschliessend zentrifugiert, und der überstand wird durch Zufügen einer wässrigen Lösung verdünnt,
die 0-,05-rmolar in Bezug auf Tris (Hydroxymethyl)-Aminometan
(pH8)-Puffer, 1% normalem menschlichem Albumin (Kristallin), 0,02% NaN3 und 0,001-molar in MgCl2 ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind neben oder zusätzlich zu Alkaliphosphatase andere Enzyme verwendbar. In der Tat gibt
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es eine fast endlose Liste von Enzymen, die sich !covalent mit
dem Antikörper verbinden. Aus der Zahl der verschiedenen Enzyme gibt die folgende Aufsteilung besonders interessante Enzyme an.
1. Älkohol-Dehydrogenase
2. Glyzerol-Dehydrogenase
3. Glyoxylat-Reduktase
4. L-Laktat-Dehydrogenase
5. Malat-Dehydrogenase
6. Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase
7. Mannitol-1-Phosphat-Dehydrogenase
8. Glukose-Oxiäase
9ο Galaktose-Oxidase 10» L-Aminosäure-Oxidase
11. D-Aminosäure-Oxidase
12o Polyphenol-Oxidase
13o Askorbat-Oxidase
14. Katalase
15. Peroxidase
16. Cholinesterase
17. Phospholipase C
18. «C - Amylase
19. Lysozyme
20. ß -Galaktosidase
21. Amyloglukosidase
22. ß -Glukuronidase
23. Karboxypeptxdase A
24. Urease
25. Anorganische Pyrophosphatase
26. Aldolase
27. Kohlensaure Anhydrase (carbonic anhydrase)
28. Histidase.
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Das zum Markieren des Antikörpers verwendete Enzym wird unter
Berücksichtigung einer Reihe von Gesichtspunkten ausgewählt. Dazu gehören die Stabilität des Enzyms, die leichte Nachweisbarkeit
des Enzyms, die Fähigkeit des Enzyms, die Bedingungen der kovalenten Bindung mit dem Antikörper auszuhalten, die
Verfügbarkeit des Enzyms und seine Kosten.
C. Zubereitung eines mit Antikörpern beschichteten, unlöslichen Körpers
Der nächste Schritt in der Zubereitung der Reaktionspartner ist die kovalente Bindung eines Teils der gereinigten Antikörper
an einen unlöslichen Körper. Zu diesem Zweck muss der unlösliche Körper mit reaktiven Gruppen oder Anlagerungsstellen
versehen sein, die mit dem spezifischen, in den Bionachweis benutzten Antikörper reagieren.
Im US-Patent 3,700,609 (G.W.Tregear et al) mit dem Titel "Gepfropfte Kopolymere", deren Offenbarung auf diesem Wege
zum Gegenstand der vorliegenden Anmeldung gemacht wird, ist eine unlösliche, fortlaufende Polymersubstanz beschrieben,
welche ein polymeres"Rückgrad'Cbackbone) oder Gerüst aufweist,
.an welches;
'Seitenketten anderer Bolymere oder Kopolymere, angehängt sind,
Bei geeigneter Wahl der angehängten oder "gepfropften" Polymere ist es möglich, biologische Substanzen chemisch an die
unlösliche Matrix zu binden. Eines der in dem oben genannten US-Patent genannten Erzeugnisse ist im Handel in Form einer
Scheibe unter dem Handelsnamen PROTAPOL DI/1 von der Firma Imperial Chemical Industries of Australia and New Zealand
(ICIANZ) erhältlich.
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Das PROTAPOL D1/1 umfasst ein Polytetrafluoräthylen-Rückgrad
oder -gerüst, an dessen Oberfläche Isothiocyanopolystyrol-Gruppen
gleichmässig angehängt oder aufgepfropft sind. Sie ist zur Verwendung beim Radio-Immunonachweis bestimmt. So wie
die Scheiben z.Zt. erhältlich sind, sind sie etwa 0,25 mm dick und haben einen Durchmesser von etwa 12,5 mm.
Entsprechend einer bevorzugten Ausbildung der Matrix gemäss der Erfindung, weist jede Scheibe 10 zwei waffelähnlich geformte
Oberflächen 11 auf, die eine erste Gruppe von linear
verlaufenden Rippen 12 und eine zweite Gruppe von linear verlaufenden Rippen 14 zeigen, wobei die Rippen 12 und 14 Gitter
bilden (Fig. 2). Die Rippen 12 und 14 sind vorzugsweise senkrecht zueinander angeordnet und bilden daher eine Vielzahl
von quadratischen Vertiefungen 16. Die Seitenflächen jeder
Rippe 12 und 14 verlaufen von nebeneinanderliegenden Paaren
von Vertiefungen 16 dachförmig nach oben und bilden an der Spitze der Rippe einen linienförmigen Grat. Es wird darauf
hingewiesen, dass die Rippen 12 und 14 zur besseren Verdeutlichung in der Zeichnung stark übertrieben dargestellt sind.
Diese gewünschte Form der Scheiben wird dadurch erreicht, dass
die Scheiben zwischen Walzen hindurchlaufen, die auf ihrer Oberfläche Vorsprünge zum Einprägen der gewünschten Konfiguration,
in die Scheiben aufweisen. Die Walzen sind dabei so ausgebildet, dass sie genügend Druck ausüben, um das Polymermaterial
in der Scheibe zu verformen, ohne dabei die Scheibe zu durchlöchern. Das ist wichtig,, da die Scheibe eine Reaktionsschicht auf ihrer Oberfläche trägt. Aus diesem Grunde würde
eine Durchlöcherung der Scheibe innere Teile derselben frei-
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legen, an welcher keine Antikörper gebunden werden können. Ein Freilegen der Polytetrafluoräthylen-Schicht würde daher
zu einer Scheibe führen, die eine niedrigere Bindungskapazität hat.
Der Hauptgedanke bei der Ausbildung der Matrix ist der, dass die scheibenförmige Matrix Oberflächen haben soll, die beim
Einlegen der Scheibe auf den flachen Boden eines Fläschchens oder Gläschens im wesentlichen vollständig im Kontakt mit der
zu untersuchenden Probe sind, d.h., die Berührungsflächen zwischen der Matrix und dem Boden des Fläschchens oder Gläs-
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chens (sollen so klein wie möglich gehalten werden. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemässen Scheibe sind die Oberflächen der Scheibe so ausgebildet, dass sie Gebiete mit hoch- und tiefliegenden Punkten aufweist.
chens (sollen so klein wie möglich gehalten werden. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemässen Scheibe sind die Oberflächen der Scheibe so ausgebildet, dass sie Gebiete mit hoch- und tiefliegenden Punkten aufweist.
Die in der oben beschriebenen Weise hergestellten und in der
lyophilisierten Form vorliegenden Antikörper werden durch Zugabe von 100 ml einer 1-molaren NaHCO' (pH 9,6)-Lösung pro
5,0 mg Antikörper wieder aufgenommen. Zur Anlagerung werden die waffeiförmigen Flächen mit der verdünnten Lösung etwa 8 bis
16 Stunden bei einer Temperatur von 2 bis 8QC unter Bewegung
zusammengebracht. Anschliessend wird die Antikörper-Lösung abgegossen,
und die Scheiben werden zweimal mit aufeinanderfolgenden Mengen von O,1M NaHCO3, pH 9,6, und phosphat-gepufferter
Salzlösung und kaltem {2-8°Cj 0,3%-igen Rinderserum-Albumin in
phosphat-gepufferter Salzlösung mit 0,5% TWEEN 20 gewaschen. Nach einer weiteren Waschung mit kristallinem Rinderserum-Albumin
und dem Frieren über Trockeneis wird die Lyophilisierung ausgeführt, und die Scheiben werden bei einer Temperatur
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von 2 bis 8 C bis zum Gebrauch aufbewahrt.
Obwohl die Beschreibung sich auf die Zubereitung von Scheiben bezieht, an welche Hepatitis-Antikörper gebunden sind, ist es
für den Fachmann klar ersichtlich, dass die erfindungsgemässen Scheiben auch zur unbeweglichen Anlagerung einer fast endlosen
Zahl von Proteinen mit Nutzen verwendet werden kann. So ist der gesteigerte Kontakt zwischen der Testprobe und der Scheibe
geeignet, die Scheibe bei Tests zu verwenden, die die Bindung folgender Proteine erfordern; Antikörper für Drogen, wie beispielsweise
Digoxin, Opiate und Steroide; Antikörper von Naturprodukten, wie beispielsweise Insulin oder anderen Hormonen/
und spezifische Stoffwechselenzyme, die im Blut und anderen
Körperflüssigkeiten gefunden werden.
Das folgende Verfahren wurde zur Zubereitung von 8000 Scheiben verwendet, von denen jede zuerst unter der Presse behandelt
wurde, um die gewünschte und oben beschriebene Formgebung zu erhalten. Für einen Posten von 8000 Scheiben braucht man 40 mg
Hepatitis-Antikörper, d.h. 5 mg pro 1000 Scheiben. Der Proteingehalt der wieder aufgenommenen Hepatitis-Antikörper wird auf
0,05 mg/ml in einem endgültigen Volumen von 800 ml in 0,1M NaHCO3 (pH 9,6) eingestellt. Die gesamte Menge von 800 ml der
gepufferten Antikörper werden dann in eine 1000 ml-Flasche mit
Schraubverschluss eingefüllt, die einen dichten, die 8000 ■Scheiben enthaltenden Behälter enthält, und die Flasche wird
16 Stunden lang gedreht, z.B. über Nacht, und bei einer Temperatur von 2 bis 8°C gehalten, so dass die Scheiben bei jeder
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Umdrehung langsam taumeln» Anschliessend wird die Flüssigkeit
aus der Flasche ausgegossen und entfernt, und die Scheiben
werden in eine eine grosse öffnung aufweisende 2-Literflasche
gegeben.
Die Scheiben werden zweimal mit aufeinanderfolgenden 1-Liter-Mengen
von kaltem (2-8°C) 0,1M NaHCO3, pH 9,6, gewaschen, wonach der Puffer entfernt wird. Die Scheiben werden dann noch
einmal gewaschen, dieses Mal mit zwei aufeinanderfolgenden 1-Liter-Mengen eines kalten Puffers (0,01M Natriumphosphat,
0,15M NaCl, pH 7,4). Wenn der restliche Puffer entfernt ist, werden die Scheiben zum dritten Mal gewaschen, diesmal mit
zwei aufeinanderfolgenden 1-Liter-Mengen einer kalten Rinderserum-Albumin-Lösung
(0,3%).
Die Scheiben werden schliesslich mit zwei aufeinanderfolgenden 1-Liter-Mengen einer Lösung von kaltem, kristallinem Rinderserum-Albumin
(pH 8) bei einer Konzentration von 2 mg/ml gewaschen. Dieser Schritt wird durchgeführt, um für die Proteine
auf der Scheibe eine Protein-Umgebung zu schaffen. Nach der Entfernung der restlichen Waschflüssigkeit werden die Scheiben
auf Schalen (etwa 23 χ 23 cm) gelegt, die jede mit einem Bogen
Filterpapier ausgelegt und mit 200 ml einer Lösung"von kristallinem
Rinderserum-Albumin gefüllt sind. Nach dem übertragen der Scheiben werden diese mittels eines Filterpapierbogens abgedeckt.
Der Puffer wird dann vollständig entfernt, und die Scheiben werden 30 Minuten lang auf Trockeneis schnellgefroren.
Der Inhalt der Schalen wird dann lyophilisiert und die trockenen
Scheiben entfernt und in einem verschlossenen Behälter aufbewahrt. .
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(1) Zubereitung des Kontrollserums
Um bei dem Immunonachweis sinnvolle Ergebnisse zu erhalten, ist es nötig, negative und positive Kontrollseren vorzusehen,
mit welchen eine gegebene Testprobe verglichen werden kann. Die Zubereitung dieser Kontrollseren wird im folgenden im
einzelnen beschrieben.
Das negative Kontrollserum wird aus menschlichem Plasma hergestellt,
das beispielsweise mit der Radio-Immuno-Nachweis-Technik untersucht worden und sich im Bezug auf Antigene, die
der Hepatitis zuzuordnen sind, als negativ herausgestellt hat. Zu jeder derartigen, in Bezug auf Hepatitis-Antigene eindeutig
negativen Menge wird eine 5M CaCl2-Lösung zugefügt, um ein Zusammenklumpen zu erreichen. Dabei werden etwa 0,75 ml
CaCl2-Lösung pro 200 ml Plasma verwendet. Dieses Plasma wird
dann in einem Wasserbad bei 37°C gehalten, bis sich ein Klumpen formt. Die ausgeklumpten Plasmateile werden dann bei -20°C
gefroren und mindestens 12 Stunden aufbewahrt. Dann werden diese Plasmateile bei 2 bis 8°C aufgetaut, und das Serum wird
gesammelt. Wenn das Serum übermässig trübe erscheint, kann es wünschenswert sein, es durch Zentrifugieren zu klären, z.B.
bei 9000 Umdrehungen während einer Zeit von 30 Minuten und einer Temperatur von 2 bis 8°C.
20 Gramm Kieselsäure, beispielsweise AEROSIL-380, werden pro
Liter Serum zugefügt und mit diesen 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gemischt, um Lipoproteine zu entfernen und das Serum
zu stabilisieren. Die Mischung wird dann zentrifugiert und der Niederschlag entfernt. Wenn es gewünscht wird, kann die Kiesel-
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säure durch Filtration mittels geeigneter Filtermedien entfernt werden.
Der überstand wird dann weiter verarbeitet, indem er filtriert
wird, beispielsweise durch MILLIPORE oder HORM-Membranen und
-Kissen mit sukzessive abnehmender Porosität,, wobei die letzte
eine 0,45/U-Membran ist. Vor der Filtration durch die 0,45 ,u-Membran
wird der Flüssigkeit Natriumazid (NaN.,) in ausreichender
Menge zugegeben, um eine Konzentration von 0,1 Gewichtsprozent zu erreichen. Wie bekannt, wirkt Natriumazid als
Schutzmittel. Die letzte Filtration durch das 0,45 ,u-Filter
oder ein Filter mit noch kleineren Poren sollte in'einer laminaren
Strömungsumgebung erfolgen; die Ausrüstung und die gesamte Durchführung sollten steril sein.
Die sterile Lösung kann dann bei Temperaturen von 2 bis 8°C
aufbewahrt werden, bis sie in kleinere Behälter aufgeteilt wird, wie sie für den Immunonachweis eingesetzt werden. In dem
bevorzugten, für 100 Tests ausgelegten Set werden 7,5 ml des negativen Kontrollserums geliefert.
Das positive Kontrollserum wird aus rekalzifiziertem Plasma aus Blutmengen gewonnen, welche in Bezug auf der Hepatitis
zugeordnete Antigene positiv sind. Von jeder positiven Einheit wird eine 1%-ige Probe abgezweigt, und diese Proben werden
zusammengeschüttet, um eine Versuchsprobe zu ergeben. Diese Versuchsprobe wird zuerst 10 Stunden lang bei 60°C wärmebehandelt,
um jeglichen Hepatitis erzeugenden Wirkstoff in der Probe zu inaktivieren. Wenn die Versuchsprobe auf Raumtemperatur
abgekühlt ist, wird ein Teil entnommen und seinTiter mit
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Hilfe der CEP-Technik gegen einen Standard-Antikörper bestimmt, um zu überprüfen, ob die Antigen-Aktivität erhalten geblieben
ist. Zu der Versuchsprobe wird dann eine genügende Menge Kieselsäure zugegeben, um eine Konzentration von 20 g pro Liter
Serum zu erhalten. Das Serum wird dann mit Hilfe eines Rührers bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt; danach wird bei
9000 üpm 30 Minuten lang bei einer Temperatur von 2 bis 8°C zentrifugiert. Der Niederschlag wird entfernt.
Der Titer des Überstandes wird dann mit Hilfe der CEP-Technik gegen einen Standard-Bezugs-Antikörper bestimmt. Wenn der
Titer auf einem ausreichenden Niveau geblieben ist, kann die Gesamtmenge aller Serum-Einheiten zusammengegeben und in der
gleichen Weise, wie es für die Versuchsprobe eben beschrieben
worden ist, behandelt werden.
Die Versuchsprobe und die Hauptprobe werden dann zusammengegeben und mit einer ausreichenden Menge eines negativen Kontrollserums
verdünnt, um mit dem pQsitiven Kontrollserum in dem erfindungsgemässen Immunonachweis optimale Resultate zu
erzielen. Vorzugsweise sollte die Anzeige des positiven Kontrollserums in dem erfindungsgemässen Test grosser als 2000
sein, gemessen in Absorptionseinheiten χ 1000. Dieses verdünnte
positive Kontrollserum wird dann - wie vorher beschrieben durch geeignete Medien gefiltert, wobei die Grosse der Poren
sukzessive abnimmt. Vor der letzten Filtration durch eine 0,45 ,u-Membran oder eine Membran mit kleineren Poren werden
0,1 Gewichtsprozent Natriurnazid zugefügt. Wie bei der negativen
Kontrollprobe, sollte die letzte Filtration unter aseptischen Bedingungen und bei laminar strömender Umgebung durchgeführt
werden.
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Das schwach positive Kontrollserum kann durch Verdünnung des stark positiven Kontrollserums mit negativem Serum hergestellt
werden. Der sich bei der Durchführung des erfxndungsgema.ssen
Nachweisverfahrens ergebende Wert des schwach positiven Serums sollte zwischen 600 und 1000 liegen. In dem für 100 Tests
ausgelegten bevorzugten Testset werden 2,5 ml des stark positiven Kontrollserums und 2,5 ml des schwach positiven Kontrollserums
beigefügt.
D. Unterschiedliche Reaktionssubstanzen und Ausrüstung
200 oder mehr gläserne Fläschchen oder Gläschen zum Wegwerfen mit einem flachen Boden werden mitgeliefert, die einen etwas
über 12,5 mm grossen Durchmesser haben, d.h., die so gross sind, dass die einen Durchmesser von 12,5 mm aufweisenden
Scheiben hineinpassen. 100 dieser Fläschchen oder Gläschen werden für das erste Zusammenbringen der Substanzen (Inkubation)
und das Auswaschen verwendet, die anderen 100 für das letzte Zusammenbringen (Inkubation) mit dem Enzym-Substrat.
Das Testset erlaubt damit die gleichzeitige Durchführung von 100 Nachweisen.
Bevor die unlösliche, feste Scheibe in jedes der 100 Fläschchen oder Gläschen eingelegt wird, werden in jedes Gläschen
0,05 ml einer Pferde-Globulin-Probenverdünnung zugefügt, wie weiter unten im einzelnen angegeben ist. Das wird als Vorsichtsmassnahme
durchgeführt, um beim ersten Zusammenbringen (Inkubation) der zu untersuchenden Probe mit der unlöslichen Scheibe
nichtspezifische Reaktionen zu vermeiden. Obwohl die Antikörperschicht auf der Scheibe gereinigt ist und hochgradig
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^0 Zb4iöZy
reaktionsfähig mit Hepatitis-Antigenen ist, findet sich gelegentlich im menschlichen Serum oder Plasma eine Substanz,
die mit Pferdeglobulin selbst reagieren kann und damit eine Brücke zwischen der Scheibe und dem enzym-markierten Komplex
bildet, wodurch sich eine falsche positive Reaktion ergibt. Das im ersten Schritt zugesetzte Pferdeglobulin bindet diese
Substanz, so dass sie nicht mehr frei ist und nicht mehr mit der Scheibe reagieren kann. Wie oben dargelegt, werden die
auf der Scheibe gebundenen Antikörper dadurch hergestellt, dass ein Pferd mit der Hepatitis zugeordneten, aus dem menschlichen
Blut gesammelten Antigenen immunisiert wird. In dem für 100 Tests bestimmten Testset werden 5,5 ml einer 330 mg
Pferdeglobulin enthaltenden phosphat-gepufferten Salzlösung (PBS) mitgeliefert.
F. Zubereitung des Substrats
Das bevorzugte Substrat für die Enzymreaktion im Test ist p-Nitrophenylphosphat, welches mit einer Konzentration von
1 mg/ml in einem Natriumkarbonatpuffer gelöst ist, dessen Konzentration 0,028 molar bezüglich Natriumkarbonat und
0,001 molar bezüglich Magnesium (pH 9,8) ist.
An dieser Stelle wird darauf hingewiesen, dass auch andere Substrate mit geeigneten pH-Puffer-Substanzen verwendet
werden können, wie sie in Tafel I unten aufgeführt sind.
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Tafel ϊ
ß-Glyzerolphosphat (^ -Glyzerolphosphat
Pheny!phosphat β-NaphthyIpho sphat
p-Nitropheny!phosphat
Phenolphtalein-Phosphat p-Nitrophenyl-Phosphat
Thymolphthalein-Phosphat p-Nitrophenyl-Phosphat 4-Methylumbelliferyl-Phosphat
(Serum)7j4 Barbital 8?6
Karbonat-Bikarbonat 9-"Barbital 9,1 2A2M1P, 10.25
2A2M1P, 9 ο 90
2Ä2M1P„ 10.17 Karbonat-Bikarbonat 10.0
Diäthanolamin, Karbonat-Bikarbonat,
Di© in der Tafel angegebenen Substrate sind alle organische
Phosphatesterο Es ist klarf dass auch andere organische
Phosphatester als Substrat für das bevorzugte Enzym Alkali-Phosphat ase verwendet werden können» Auch wenn andere Enzyme
verwendet werden als Alkali-Phosphatase„ lassen sich relativ
leicht geeignete Substrate finden»
Verfahren
Um den erfindungsgemässen Nachweis durchzuführen, werden
100 Fläschchen oder Gläschen in Gestelle gesetzt und jedes
davon wird als zu einer Probe gehörig gekennzeichnet. In jedes Gläschen werden 0,05 ml der Pferdeglobulin-Lösung gegeben,
dann werden zu 95 der Gläschen 0s5 ml Probenflüssigkeit
gegeben. Gleichzeitig werden 0,5 ml des negativen Kontrollserums in jedes von drei Gläschen gegeben, 0,5 ml des
stark positiven Kontrollserums in ein Gläschen und 0,5 ml
des schwach positiven Kontrollserums in ein weiteres Gläschen.
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In jedes Gläschen, das das Pferdeglobulin und die Probe enthält
f auch in die Kontrollgläschen, wird dann eine mit Antikörpern
beschichtete Scheibe eingelegt. Die Gläschen werden samt Inhalt eine halbe Stunde lang bei 43°C gehalten (inkubiert)
, beispielsweise in einem bewegten Wasserbad. Während dieser Inkubation verbinden sich in der Testprobe anwesende
Hepatitis-Antigene mit den Antikörpern auf den Scheiben.
Bevor das Reagens mit den enzym-marklerten Antikörpern in die
Gläschen gegeben wird„ in denen sich der unlösliche Körper
befindetj muss der überstand der ersten Inkubation entfernt
werden» Die unlöslichen Körper müssen ausserdem gewaschen
werden, um jegliches ungebundene Antigen zu entfernen. Die
Waschlösung ist vorzugsweise eine Oir85%-ige Lösung von Natriumchlorid
, pH 6,5 bis 7,5c Nach zwei Waschungen mit jeweils
2,5 ml dieser Lösung v/erden 0,3 ml des Äntikörper-Enzym-Komplexes
in jedes Glas gefüllt,-und die Gläser werden wieder bei 43°C eine Stunde lang unter Bewegung aufbewahrt(inkubiert),
Während dieser Zeit reagieren die enzym-märkierten Antikörper mit den während der ersten Inkubation an der mit Antikörpern
beschichteten Scheibe befestigten Antigenen.
Nach der Zugabe der enzym-markierten Antikörper und einer
zweiten Inkubation wird der überstand abgesaugt; die Scheiben in jedem Gläschen werden dreimal mit jeweils 2,5 ml der Waschlösung
gewaschen. Dadurch werden die Enzym-Antikörper-Komplexe entfernt, die nicht reagiert haben. Jeder unlösliche Körper
(Scheibe) wird dann in ein sauberes Gläschen gelegtiund 2,5 ml
einer p-Nitrophenylphosphat-Enzym-Substrat-Pufferlösung wird
in jedes Gläschen gegeben (1 mg p-Nitrophenylphosphat pro ml).
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Da der optimale pH-Wert des Alkali-Phosphatase-p-Nitrophenylphosphat-Systems
bei 9,8 liegt, wird das Enzymsubstrat in einem Karbonat-Mg -Puffer (pH 9,8 + O4,!) aufgelöst. Dieser
Puffer umfasst eine wässrige Lösung, die bezüglich Na-CO-.
O,O28M und bezüglich Mg O,QO1M ist. 40 ml Konzentrat werden
dem erfindungsgemässen Set beigefügt, die nach Verdünnung auf
400 ml mittels destilliertem Wasser direkt zu den 400 mg p-Nitrophenylphösphat zugegeben werden können. Nach der Zugabe
des gepufferten Substrates werden die Gläschen eine Stunde lang bei 43°C und Bewegung einer dritten Inkubation unterzogen.
Wenn ein anderer Enzym-Antikörper-Komplex verwendet wird, müssen andere Substrate verwendet werden.
Zwei Tropfen (O,1 ml) einer 3M NaOH-Lösung werden dann in
jedes Gläschen gegeben, um die Reaktion zu beenden. Zu diesem Zweck sind jedem Testset 15 ml einer 3M-Natriumhydroxid-Lösung
beigegeben.
Die oben beschriebene Enzym-Substrat-Lösung schlägt von einer farblosen Flüssigkeit in eine gelbe Flüssigkeit um, wenn auf
der Scheibe Enzym vorhanden ist, d.h., in den Gläschen, die bezüglich Hepatitis-Antigenen positive Proben enthalten.
Der oben beschriebene Teil der Negativ-Kontrollseren wird in einem geeigneten Gläschen .zusammengeschüttet und ihre Absorption
bei 405 nm mit einem Spektrophotometer gegen den Blind-oder V^rcrleichs"?
'wert von~~äestilliertem Wasser gemessen. Wenn sich bei der negativen Kontrolle weniger als 600 (Absorptionseinheiten χ 1000) ergibt, kann man sie als geeignete Standardproben ansehen, gegen welche die Testergebnisse verglichen werden können. Mit den zusammengeschütteten negativen Kontrollproben
'wert von~~äestilliertem Wasser gemessen. Wenn sich bei der negativen Kontrolle weniger als 600 (Absorptionseinheiten χ 1000) ergibt, kann man sie als geeignete Standardproben ansehen, gegen welche die Testergebnisse verglichen werden können. Mit den zusammengeschütteten negativen Kontrollproben
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gergleichswert
als Blind-oderfwerden nun die Werte der Testproben und der positiven Kontrollproben abgelesen, wobei die Ergebnisse in Absorptionseinheiten χ 1000 registriert werden. Bei manchen Spektrophotometern kann man eine negative Kontrollsubstanz in das Instrument einsetzen, den Ablesewert auf Null justieren und den Wert der Testprobe direkt ablesen. Eine unbekannte Testprobe, deren optische Dichte mal 1000 grosser ist als 100, wenn man die zusammengefügten negativen Kontrollsubstanzen als Nullwert ansieht, wird bezüglich der Hepatitis-Antigene als positiv angesehen. Dieser Wert ist gewählt worden, um nicht reproduzierbare positive Ergebnisse zu eliminieren, die, falls sie sich ergeben, im allgemeinen das Ergebnis eines Fehlers in der Arbeitsweise sind.
als Blind-oderfwerden nun die Werte der Testproben und der positiven Kontrollproben abgelesen, wobei die Ergebnisse in Absorptionseinheiten χ 1000 registriert werden. Bei manchen Spektrophotometern kann man eine negative Kontrollsubstanz in das Instrument einsetzen, den Ablesewert auf Null justieren und den Wert der Testprobe direkt ablesen. Eine unbekannte Testprobe, deren optische Dichte mal 1000 grosser ist als 100, wenn man die zusammengefügten negativen Kontrollsubstanzen als Nullwert ansieht, wird bezüglich der Hepatitis-Antigene als positiv angesehen. Dieser Wert ist gewählt worden, um nicht reproduzierbare positive Ergebnisse zu eliminieren, die, falls sie sich ergeben, im allgemeinen das Ergebnis eines Fehlers in der Arbeitsweise sind.
Die Messwerte der Testproben können auch mit den schwach positiven und stark positiven Kontrollproben verglichen werden.
Auf diese Weise kann nicht nur die Gegenwart, sondern auch ein Hinweis auf die Konzentration der Hepatitis-Antigene in
der Probe erhalten werden.
Mit jeder Gruppe von unbekannten Substanzen sollten fünf Kontrollmessungen durchgeführt werden, drei mit einem negativen
Kontrollserum, eine mit einem stark positiven Kontrollserum
und eine mit einem schwach positiven Kontrollserum. Diese Kontrollproben sollten dem gleichen Verfahren und den
gleichen Inkubationszeiten unterworfen werden wie die Testproben. Vorsicht: Zur Verhinderung von Kreuz-Kontaminierung
sollte für jede Übertragung eine saubere Pipette oder eine Wegwerfspitze verwendet werden.
Folgende Schritte sind durchzuführen: _ 41 _
Folgende Schritte sind durchzuführen: _ 41 _
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1, Aufheizen des Wasserbades auf 43°C„
2„ Numerieren von zwei Sätzen von Gläschen, damit sie
der Kennzeichnung der Testproben und Kontrollproben entsprechen und Einsetzen der Gläschen in einen Gläschenhalter.
Der erste Satz dieser Gläschen wird für das Zusammenbringen (Inkubation) der Testproben und
Kontrollproben mit den mit Antikörpern beschichteten Scheiben und mit den enzym-markierten Antikörpern
verwendet. Der zweite Gläschensatz für die unter Ziff. 12 beschriebene Substrat-Reaktion.
3. Pipettieren von 0,05 ml (1 Tropfen) des Pferdeglobulin-Reagenz
auf den Boden des ersten Satzes von Gläschen. Nichtspezifische, falsche positive Resultate von in
manchen menschlichen Seren gegenwärtigen Antikörpern, die mit Pferdeglobulin reagieren, werden durch die
Verwendung von Pferdeglobulin als Testprobenverdünnungsmittel mit Vorteil weitgehend eliminiert.
4. Pipettieren von 0,5 ml von jeder Testprobe auf den Boden der Gläschen des ersten Satzes, wobei auf die
entsprechende Probenkennzeichnung zu achten ist; Pipettieren von 0,5 ml der positiven und negativen
Kontrollseren auf den Boden der entsprechenden Gläsehen.
5. Einlegen einer mit Antikörpern beschichteten Scheibe
in jedes Gläschen des ersten Satzes. Dabei müssen die Oberflächen der Scheiben sauber gehalten werden. Sie
sollten mittels einer sauberen Pinzette oder mittels
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einer spitzen Absaugkanüle transportiert werden, jedoch nicht mit den Fingern berührt werden.
6. Aufbewahren (Inkubieren) der Gläschen bei 43°C in einem Wasserbad während 30 Minuten, wobei die Bewecrungsvorrichtung
auf leichte Qewecrung geschaltet ist.
7. Nach dem Zusammenbringen (Inkubieren) der Probe mit der Antikörper-Scheibe vollständiges Absaugen des Überstandes
aus jedem Gläschen. Abwaschen der Scheiben, indem 2,5 ml einer isotonischen Salzlösung in jedes Gläschen geschüttet
werden. Dieser Vorgang muss wiederholt werden, so dass jede Scheibe zweimal gewaschen wird. Um die
gesamte Flüssigkeit abzusaugen, sollte der Gläschenhalter beim Absaugen geneigt werden. Nach dem Zugeben der
Waschlösung sollte der Gläschenhalter geschüttelt werden. Die in dem der Absaugvorrichtung zugeordneten Behälter
gesammelten unbrauchbaren flüssigen Substanzen sollten vor dem Wegwerfen mindestens eine Stunde bei einer
Temperatur von 121°C in einem Autoklaven gehalten werden.
8. Nach dem letzten Waschen und dem Absaugen Zufügen von 0,3 ml der enzym-markierten Antikörper-Lösung in jedes
Gläschen.
9. Einstündiges Aufbewahren (Inkubieren) der Gläschen in einem Wasserbad bei 43°C, wobei die
auf leichte Bewegung geschaltet ist.
einem Wasserbad bei 43°C, wobei die Bewegungsvorrichtung
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10. Zubereiten des p-Nitropheny!phosphat-Substrates durch
Spülen des Inhalts eines Gläschens von p-Nitrophenylphosphat (100 mg) in 100 ml eines verdünnten Substratpuffers.
(Der letztere wird durch Hinzufügen von 10 ml von konzentriertem Natrium-Bikarbonat-Puffer zu 90 ml
destilliertem Wasser zubereitet). Zur Mischung leicht im Kreise schwenken; die Lösung sollte sofort erfolgen.
Beachte: Diese Substratlösung muss an dem Tage zubereitet werden, an dem sie verwendet werden soll. Andernfalls
muss sie abgekühlt werden. Eine Lösung, die älter ist als 24 Stunden, sollte weggeschüttet werden.
11. Absaugen des Überstandes und dreimal Waschen wie in
Schritt 7.
12. Transferieren der Scheiben in den zweiten Satz von
identisch bezeichneten, sauberen, entsprechend Schritt vorbereiteten Gläschen.
13. Hinzufügen von 2,5 ml der p-Nitrophenylphosphat-Substrat-Lösung,
wie sie in Schritt 10 zubereitet worden ist, in jedes eine Scheibe enthaltende Gläschen,
14. Einstündiges Aufbewahren (Inkubieren) der Gläschen in
einem Wasserbad mit 43°C, wobei die auf leichte Bewegung geschaltet ist
einem Wasserbad mit 43°C, wobei die Schüttelvorrichtung
15. Einbringen von zwei Tropfen einer 3M Natriumhydroxidlösung (etwa insgesamt 0,1 ml) in alle Gläschen, um
die Reaktionen zu beenden. Zur guten Durchmischung der
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Reaktionspartner Schütteln des Halters. Innerhalb von vier Stunden nach Beendigung der Reaktionen müssen die
Absorptionsmessungen durchgeführt werden.
16. Zusammenschütten der drei negativen Kontrollen und Messen der Absorption bei 405 nm in einem Photometer
gegen einen Blindwert von destilliertem Wasser. Das Ergebnis wird in Absorptionseinheiten χ 1000 angegeben.
Wenn sich bei der negativen Kontrolle ein Wert ergibt, der grosser als 600 ist, ist der Nachweis unbefriedigend
und muss wiederholt werden. Wenn ein Durchflussphotometer verv/endet wird und stark positive Proben auftreten,
sollte die Küvette vor der Bestimmung der Absorption der nächsten Probe mit destilliertem Wasser
ausgespült werden. Wenn Kuvetten verwendet werden, die nicht weggeworfen werden können, muss die Küvette nach
jedem positiven Messergebnis mit destilliertem Wasser ausgespült werden.
17. Mit der zusammengeschütteten negativen Kontrollsubstanz Justieren des Instrumentes auf Absorption Null. Bestimmen
der Absorption jedes Reaktionsgemisches und Aufschreiben der Ergebnisse in Absorptionseinheiten χ 1000.
Bei manchen Photometern kann das Instrument bei der zusammengeschütteten negativen Konstrollsubstanz nicht
auf Null justiert werden. In diesem Fall muss der Wert der negativen Kontrollsubstanzen vom Wert jeder Probe
abgezogen werden.
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Unbekannte Testproben/ deren Messwerte, gemessen in Absorptionseinheiten
χ 1000, grosser als 100 sind, wenn man die zusammengeschütteten negativen Kontrollsubstanzen als Blindwert verwendet, sind als reaktiv anzusehen. Es kann wünschenswert
sein, den Test bei den Proben zu wiederholen, die als reaktiv angesehen werden. Ehe man ein reaktives Serum als
für der Hepatitis zuzuordnende Antigene positiv klassifizieren
kann, muss die positive Reaktion durch einen Nachweis mit dem Cordis Bestätigungstestset (Cordis Confirmatory Test Set,
Katalog Nr. 783-950) bestätigt werden. Dieser Nachweis muss
bei allen reaktiven Proben durchgeführt werden« Ein reaktives Serum, das in dieser Weise durch Neutralisation mit Pferde-Antiserum
geprüft worden ist, muss als positiv für Hepatitis-B-Antigene angesehen werden. Wie oben erwähnt, muss die Bestätigungsprüfung
zur Auswertung der Ergebnisse unbedingt durchgeführt werden. Der Bestätigungsnachweis wird auch von
der Food and Drug Administration und von den Gesetzen vieler "Staaten gefordert. Kurz zusammengefasst wird der Bestätigungsnachweis gemäss der Erfindung folgendermassen durchgeführt:
Die positive Testprobe wird zweifach getestet. Nach dem ersten
Verfahrensschritt, in welchen die Probe mit der Scheibe in jedem Gläschen zusammengebracht wird, und nach dem Waschen
wird eine Scheibe mit für Hepatitis-Antigene spezifischen
Antikörpern zusammengebracht? die andere Scheibe wird mit normalen Pferdeserum zusammengebracht. Dieses Zusammenbringen
(Inkubation) dauert eine halbe Stunde, daran schliessen sich die gleichen Verfahrensschritte an wie bei dem beschriebenen
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d O
Routinenachweis. Wenn die Probe für Hepatitis-Äntigene positiv
ist, dann wird die Probe, die mit den Pferde-Antikörpern zusammengebracht worden ist, einen sehr geringen Wert haben,
während die Scheibe, die mit normalen Pferdeserum zusammengebracht worden ist einen hohen Wert zeigen wird, der dem bei
dem Routinenachweisverfahren aufgefundenen Wert entspricht.
Proben mit geringer Konzentration der Hepatitis-Äntigene haben
üblicherweise niedrige Endmesswerte. Die Proben mit hoher Konzentration der Hepatitis-Äntigene haben dagegen hohe Messwerte.
Innerhalb eines schmalen Bereiches von Konzentrationsunterschieden wird der Messwert der optischen Dichte etwa
eine quantitative Aussage über die Konzentration der in der Probe vorliegenden Hepatitis-Äntigene geben.
1. Nichtreproduzierbare Reaktivität: Wenn ein wiederholter Nachweis bei einer reaktiven Probe Werte ergibt, die
unterhalb des Grenzwertes 100 liegen, ist anzunehmen, dass der Versuch unreproduzierbar reaktiv ist; es ist
dann anzunehmen, dass die Probe für Hepatitis-Äntigene negativ ist. Das erste Ergebnis kann dann auf einen
Fehler bei der Durchführung des Nachweises zurückzuführen sein, z.B. auf ungenügendes Waschen.
2. Nichtspezifische positive Reaktionen: Nichtspezifische, falsche positive Ergebnisse von Antikörpern, die in
manchen menschlichen Seren vorhanden sind und die mit Pferdeglobulin reagieren, werden im wesentlichen durch
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die Verwendung von Pferdeglobulin in der Testprobenlösung eliminiert.
3. Plasma von Blut, das in EDTA gesammelt wird, sollte nicht verwendet werden.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die Verweilzeiten (Inkubationszeiten)
für die verschiedenen Verfahrensschritte und die Temperaturen, bei welchen das Zusammenbringen (Inkubation)
durchgeführt wird, innerhalb eines grösseren Zeit- und Temperaturbereiches variiert werden können. Die Erfindung soll
daher nicht auf bestimmte Zeiten oder Temperaturen des Zusammenbringens
(Inkubation) beschränkt werden. So kann beispielsweise die Zeit des Zusammenbringens (Inkubation) des unlöslichen
Körpers mit der' Probe zwischen 10 Minuten und 24 Stunden schwanken, wobei die Temperatur der Inkubation zwischen
2°C und 50°C liegen kann. Andererseits kann die Inkubationszeit
des unlöslichen Körpers mit dem enzym-markierten Bindungspartner zwischen 30 Minuten und 24 Stunden liegen, wobei
die Temperatur der Inkubation des unlöslichen Körpers mit dem enzym-markierten Bindungspartner zwischen 2°C und 5O°C liegen
kann.
Es ist ferner darauf hinzuweisen, dass das erfindungsgemässe
Verfahren dazu verwendet werden kann, die Anwesenheit von der
Hepatitis zuzuordnenden Antigenen in jeder Körperflüssigkeit zu bestimmen, in welcher Antigene gegenwärtig sind. So kann
dieses Verfahren verwendet werden, um die Anwesenheit dieser Antigene in Serum, Plasma, Plasmabestandteilen, Serumbestandteilen,
Urin, Speichel und Zerebrospinal-Flüssigkeit zn bestimmen.
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Eine repräsentative Angabe von Ergebnissen, die bei der Durchführung erfindungsgemässer Tests erzielt worden sind,
sind im folgenden aufgeführt. Die Ergebnisse in Tabelle A sind die Ergebnisse von Nachweisversuchen gemäss der Erfindung
für Proben, die sich bei Überprüfung mit der CEP-Methode als Hepatitis-positiv ergeben. Die Werte in Tafel B sind Werte
für Testproben, die sich bei der Untersuchung mit der Radio-Immunonachweis-Methode
als Hepatitis-positiv, jedoch bei Untersuchung mit der CEP-Methode als Hepatitis-negativ ergeben.
Die Werte in Tafel C sind Werte für Testproben, die sich sowohl mit der RIA-Methode als auch mit der CEP-Methode
als Hepatitis-negativ herausstellen. Die in den Tabellen A, B und C für die verschiedenen Testproben angegebenen Zahlenwerte sind Werte„ die beim Nachweis mit dem erfindungsgemässen
Verfahren erhalten worden sind. Die Zahlenwerte sind angegeben in Absorptionseinheiten χ 1000 (O.D.x 1000), wobei die Absorption
bei einer Wellenlänge von 405 nm (OD 405) gemessen worden ist.
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Tabelle A | Tabelle B | (O.D. χ 1000} OD4O5 |
Tabelle | C | |
CEP+ | RIA+ CEP- | 2745 | Neg | ||
Test- probe |
(O.D.x 1000) OD 40 5 |
Test- probe |
2675 | Test probe |
(O.D. χ 1000) OD4O5 |
72 | 2807 | 65 | 2266 | 88 | 0 |
73 | 2802 | 68 | 1354 | 89 | 0 |
79 | 2815 | 69 | 265 | 90 | 0 |
82 | 2822 | 75 | 953 | 91 | 23 |
121 | 2831 | 77 | 1383 | 92 | 42 |
201 | 2768 | 81 | 1688 | 93 | 0 |
202 | 2780 | 87 | 2739 | 94 | 0 |
205 | 2749 | 123 | 1741 | 97 | '38 |
206 | 2758 | 124 | 285 | 98 | 0 |
208 | 2795 | 125 | 2466 | 99 | 0 |
209 | 2800 | 204 | 2636 | 100 | 0 |
210 | 2764 | 243 | 101 | 0 | |
213· | 2776 | 261 | 102 | 0 | |
214 | 2804 | 103 | 0 | ||
217 | 2795 | 104 | 0 | ||
218 | 2800 | 203 | 0 | ||
219 | 2746 | 207 | 0 | ||
220 | 2718 | 211 | 8 | ||
226 | 2695 | 212 | 0 | ||
228 | 2782 | 215 | 0 | ||
232 | 2760 | 216 | 0 | ||
234 | 2774 | 224 | 0 | ||
235 | 2764 | 225 | 0 | ||
238 | 2760 | 227 | 0 | ||
239 | 2755 | 229 | 0 | ||
244 | 2730 | 230 | 0 | ||
250 | 2707 | 231 ' | 0 | ||
251 | 2761 | 233 | 45 |
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Tabelle A (Fortsetzung) |
|
CEP+ | |
Test probe |
(O.D.x 1000) OD4O5 |
252 | 2778 |
253 | 2783 |
254 | 2742 |
255 | 2743 |
256 | 2784 |
260 | 2775 |
Tabelle C (Fortsetzung)
N eg
Test- (O.D.x 1000) probe OD4O5
240 | 0 |
241 | 0 |
242 | 0 |
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Leerseite
Claims (9)
1. Verfahren zum Feststellen der Anwesenheit eines der
Hepatitis zuzuordnenden Antigens in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte
umfasst:
(a) Zusammenbringen (Inkubation) der Probe mit einem unbeweglich an einem unlöslichen Körper
gehaltenen, mit dem Hepatitis-Antigen reaktionsfähigen Antikörper, wobei sich bei dem Zusammenbringen
eine Bindung zwischen Antikörper
und in der Probe vorliegendem Antigen ausbildet und ein unlöslicher Körper mit daran gebundenem
Antigen entsteht, falls Hepatitis-Antigene in der Probe vorliegen,
(b) Trennen des unlöslichen Körpers von jeglicher nicht gebundener Substanz,
(c) Zusammenbringen (Inkubation) des unlöslichen Körpers mit einer markierte, mit den Hepatitis-Antigenen
reaktionsfähige Antikörper enthaltenden Lösung, wobei die markierten Antikörper
mittels eines Enzyms markiert sind, welches derart auf ein Substrat einwirken kann, dass
ein nachweisbares Reaktionsprodukt entsteht, und wobei das Zusammenbringen derart geführt
wird? dass die markierten Antikörper mit jedem im Schritt(a)mit einem Antikörper an dem unlöslichen
Körper gebundenen Antigen eine Bindung
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eingehen können,
(d) Trennen des unlöslichen Körpers von der die enzym-markierten Antikörper enthaltenden Lösung,
um jeglichen ungebundenen, markierten Antikörper davon zu entfernen,
(e) Zusammenbringen (Inkubation) des unlöslichen Körpers mit einer Substratlösung, auf die das
Enzym des markierten Antikörpers einwirkt und dadurch eine chemische Veränderung des Substrats
herbeiführt, bei welcher ein nachweisbares Reaktionsprodukt gebildet wird, und
(f) Nachweisen jeglichen in der Lösung vorliegenden Reaktionsproduktes, um die Anwesenheit von
Hepatitis-Antigenen nachzuweisen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass das Reaktionsprodukt durch Messung der optischen Absorption der Substratlösung nachgewiesen wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, dass die markierten Antikörper immunochemisch aktive Hepatitis-Antikörper umfassen, die
mit enzymatisch aktiver Alkaliphosphatase verbunden sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
dass die Substratlösung p-Nitrpphenylphosphat enthält.
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5. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der unlösliche Körper
eine wasserunlösliche Polymermatrix mit einer auf ihrer Oberfläche angeordneten Schicht reaktiver
Gruppen umfasst, die mit einem Hepatitis-Antikörper eine kovalente Bindung eingehen können, und dass die
Oberflächen des unlöslichen Körpers verformt sind, um Matrixoberflächen zu erhalten, die beim Einlegen
der Matrix in ein Gläschen mit flachem Boden im wesentlichen mit der Lösung im Gläschen in Berührung
kommen, während der Flächen-Flächen-Kontakt zwischen der Matrix und dem Gläschenboden möglichst klein
gehalten wird.
6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der sich beim Nachweis
eines jeden Reaktionsproduktes ergebende Wert mit einem Wert verglichen wird, der sich bei einer Probe
ergibt, die bekanntermassen Hepatitis-Antigene enthält.
7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt (a)verwendete
Probe eine menschliche Flüssigkeit ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die menschliche Flüssigkeit aus der Serum,
Plasma, Plasmakomponenten, Serumkomponenten, Urin, Speichel und Zerebrospinal-Flüssigkeit umfassenden
Gruppe ausgewählt wird.
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9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen bestimmt wird, das der Hepatitis B zuzuordnen ist.
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Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61774475A | 1975-09-29 | 1975-09-29 | |
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