DE2448307A1

DE2448307A1 - Verfahren zur herstellung eines reagenz zur untersuchung von probandenserum auf lues-antikoerper in einem tuepfeltest

Info

Publication number: DE2448307A1
Application number: DE19742448307
Authority: DE
Inventors: Harald W Hose
Original assignee: HORPOL GmbH
Current assignee: HORPOL GmbH
Priority date: 1974-10-10
Filing date: 1974-10-10
Publication date: 1976-04-22

Description

Verfahren zur Herstellung eines Reagenz zur Untersuchung von Probandenserum auf Bues-Antikörper in einem Tüpfeltest.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Reagenz zur Untersuchung von Probandenserum auf Bues-Antikörper in einem Tüpfeltest, welches aus einer Suspension von Latexteilchen mit an den Teilchen angelagerten Bues-Antigenen besteht.
Solche Reagenzien gewinnen in letzter Zeit zunehmend Bedeutung, da ein Tüpfeltest vorzüglich zur Reihenuntersuchung, beispielsweise im Blutspendedienst oder zur Routineuntersuchung von in Krankenhäusern anfallenden Blutproben geeignet ist. Tüpfeltests zeichnen sich durch geringe Anforderungen an die Laborausstattung und das Personal und durch das rasche Vorliegen von Ergebnissen aus. Ein Test dieser Art dient als "Screeningtest", d. h. also als nicht hundertprozentig sicherer Test, der jedoch solche Blutproben nachweisen soll, in denen wahrscheinlich Bues-Antikörper vorliegen. Die genauere Untersuchung erfolgt dann mit einer aufwendigen und zumeist mehrere Tage dauenden Untersuchung, beispielsweise mittels des Wassermanntests.
Dennoch sind die Anforderungen auch an Screeningtests insbesondere hinsichtlich der Fehlergrenze bei Negativanzeigen sehr hoch, während die Fehlergrenze bei Positivanzeige verhältnismäßig unkritisch ist.
Ein bekanntes Reagenz der eingangs erwähnten Art, das von der Anmelderin vertrieben wird, benutzt als am Latexteilchen angelagertes Antigen einen Cardiolipinkörper. Cardiolipin ist bekanntermaßen als Antigen auch für Lues-Antikörper geeignet. Bisher waren Reagenzien mit am Latex angelagertem Cardiolipin-Anti gen das einzige bekannte Reagenz der eingangs erwähnten Art, da die Anlagerung anderer Lues-Antigene an Latex nicht gelang. Nachteilig bei diesem Reagenz ist die unspezifische Reaktion des Cardiolipin mit dem Lues-Antikörper im menschlichen Serum. Fehlreaktionen von je etwa 10 °h sowohl auf positivem als auch auf negativem Gebiet waren unvermeidlich.
Auch war die Erkennbarkeit einer Reaktion nicht sehr gut, da die vom Bues-Antikörper bewirkte Agglutination im Mittel nach etwa 10 Minuten, also einer verhältnismäßig langen Zeit, in vielen Fällen aber erst wesentlich später eintrat. Schließlich war die Agglutination oft nur schwer erkennbar, da sie nicht vollständig, sondern nur in Form von MikroteSchen erfolgte. Hinzu kam eine nur geringe Lagerfähigkeit des bekannten Reagenz.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, bei ebenfalls sehr einfacher Anwendbarkeit im Tüpfeltest und bei erheblich schnellerer Reaktionszeit ein hochspezifisches Reagenz für Lues-Antikörper zu schaffen Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß ein Reagenz der eingangs genannten Art in den folgenden Schritten hergestellt wird: 1. Herstellung einer Suspension von Treponemenfragmenten in einem Phosphatpuff er pH 7,4 durch Ultraschall zerkleinerung, wobei die Xonzentration der Treponemenfragmente einer Eonzentration von Treponemen (Treponema pallida) von mindestens 5 x 107 pro ml entspricht, 2. Zugabe von 0,05 bis 0,10 Vol % der Fragmentsuspension zu einer Mischung von 5,5 bis 7 Vol % einer wässrigen Standardlatexsuspension in Rest "Glycin-Puffer Nah1" pH 8,2 der Firma Bering, 3. Zugabe von 0,3 bis 1 Vol Li/o "Puffer nach Sörensen" pH 7,2 (Na2 HP04 + 2H20 10,973 g KH2P04 2,505 g Na Cl 91,800 g pro 1 Wasser).
Auf diese Weise wird ein hochspezifischer Test ermöglicht, da Treponemenfragmente das höchstspezifische Antigen darstellen. Das Reagenz ist sehr lange lagerbar, ohne daß das bisher beobachtete Zerfallen von Latex und Treponemenfragmenten bei der Lagerung zu befürchten ist. Die Reaktion führt auch nach langer Lagerzeit des Reagenz stets zu vollständigem Zusammenklumpen (Agglutination) des Latex und zum Absetzen des Agglutinats von klarer Flüssigkeit. Die Erkennbarkeit ist daher ausgezeichnet. Schließlich erfolgt die Reaktion schon nach etwa einer Minute, gerechnet bis zum vollständigen Ausfallen des Agglutinats.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die Herstellung des erfindungsgemäßen Reagenz sei nun an einem Ausführungsbeispiel erläutert. Ziuiächst werden virulente Spirochäten des Lueserregers (Treponema pallida), die beispielsweise einem der bekannten Zuchstämme entstammen, in einen Phosphatpuffer mit einem pH von 7,4 überführt. Die Konzentration der Treponemen wird so eingestellt, daß mindestens 5 x 107 Treponemen pro ml Puffer vorliegen.
Die Suspension wird sodann mit Ultraschall homogenisiert, wodurch eine Zerlegung der Treponemen in die gewünschten-Fragmente erreicht wird.
In einem getrennten Ansatz wird eine Standardlatexsuspension in wässriger Phase in einem Volumenanteil von 5,80 % mit einem "Glycin"-Puffer (pH 8,2) der Firma Bering vermischt. Die Größe der Latexteilchen beträgt vorteilhaft 1 gu.
Nun kann die Anlagerung der Treponemenfragmente, die im vorliegenden Fall als hochspezifisches Lues-Antigen wirken, an die Latexteilchen erfolgen. Dazu werden 0,08 Vol 9/0 der wie oben beschrieben hergestellten Treponemen-Fragmentsuspension zu der im Glycin-Puffer befindlichen Latexsuspension gegeben.
Unter den gewählten Bedingungen tritt eine feste und über lange Zeit stabile Anlagerung der Treponemenfragmente an die Latexkörper ein.
Anschließend werden 0,5 Es 0,8 Vol /0 "Puffer nach Sörensen" pH 7,2 zugegeben. Dieser Puffer besitzt in 1 1 Wasser die folgende Zusammensetzung: Na2 HP04 + 2H2° 10,973 g KH2P04 2,505 g Na Cl 91,800 g.
Die genaue Dosierung dieses Bestandteiles des Reagenz erfolgt in Abhängigkeit vom Verhältnis zwischen Latexteilchen und Treponemenfragmenten, die von Ansatz zu Ansatz leicht schwanken können. Vorteilhaft wird für jeden Ansatz herzustellenden Reagenz die genaue Dosierung des "Puffer nach Sörensent' in einem kurzen Versuch ermittelt.
Der "Puffer nach Sörensen" ergibt eine besser erkennbare Fällung.
Die ausgefällten Latexklumpen sind bei Zugabe dieses Puffers im angegebenen Bereich größer und somit auch mit dem bloßen Auge wesentlich leichter erkennbar.
Die Durchführung eines Tüpfeltests mit dem beschriebenen Reagenz geschieht wie folgt: Auf einer sauberen Unterlage, vorzugsweise auf einem schwarzen Objektträger, werden ein Tropfen (etwa 30 mg) in bekannter Weise vorbereitetes Probandenserum, ein Tropfen (etwa 33 mg) physikalische Kochsalzlösung und ein Tropfen (etwa 25 mg) des erfindungsgemäßen Reagenz aufgebracht. Sodann werden die Tropfen durch Ineinanderlaufenlassen miteinander vermischt.
Nach einer Wartezeit von genau 60 Sekunden wird abgelesen.
Es findet in der überwiegenden Zahl der Fälle bei positiver Reaktion eine klar sichtbare Absetzung des agglutinierten Latexklumpens statt. Darüber befindet sich eine klare Flüssigkeit. Bei negativer Reaktion bleibt die Latexsuspension unverändert milchig.
Das weiß ausfallende Latexagglutinat ist gegen den schwarzen Untergrund des Ottktträgers gut zu erkennen. Sollte die Reaktion dennoch unklar sein, so liegt dies zumeist an einer zu hohen Konzentration der Lues-Antikörper im Serum. Der Rest muß daher mit um ein Mehrfaches, vorteilhaft in einer geometrischen Verdünnungsreihe, verdünntem Serum wiederholt werden.
Es tritt dann stets ein sauber erkennbares Absetzen von Latexagglutinat ein bzw. bleibt bei negativem Ergebnis die Probe einwandfrei milchig.

Claims

Patentansprüche :

Verfahren zur Herstellung eines Reagenz zur Untersuchung von Probandenserum auf Lues-Antikörper in einem Tüpfeltest, welches aus einer wässrigen Suspension von Latexteilchen mit an den Teilchen angelagerten Lues-Antigenen besteht, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: 1. Herstellung einer Suspension von Treponemenfragmenten in einem Phosphatpuffer pH 7,4 durch Ultraschallzerkleinerung, wobei die Konzentration der Treponemenfragmente einer Konzentration von Treponemen (Treponema pallida) von mindestens 5 x 107 pro ml entspricht,.
2. Zugabe von 0,05 bis 0,10 Vol Vo der Fragmentsuspension zu einer Mischung von 5,5 bis 7 Vol % einer wässrigen Standardlatexsuspension in Rest "Glycin-Puffer NaCl" pH 8,2 der Firma Bering, 3. Zugabe von 0,3 bis 1 Vol * "Puffer nach Sörensen" pH 7,2 (Na2 HP04 + 2H20 10,973 g KX2P04 2,505 g Na Cl 91,800 g pro 1 Wasser).

2. Verfahren zur Herstellung des Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 0,08 Vol % der Fragmentsuspension zu einer Mischung von 5,80 Vol % wässrige Standardlatexsuspension Rest Glycin-Puffer gegeben wird und 0,5 bis 0,8 Vol sb "Puffer nach Sörensen zugegeben wird.
3. Verfahren zur Anwendung des gemäß Anspruch 1 oder 2 hergestellten Reagenz, dadurch gekennzeichnet, daß 1. 1 Tropfen (etwa 30 mg) in bekannter Weise vorbereitetes Probandenserum, 1 Tropfen (etwa 33 mg) physikalische Kochsalzlösung und 1 Tropfen (etwa 25 mg) des erfindungsgemäßen Reagenz auf einen Oktktträger aufgebracht werden, 2. daß die Reaktionspartner durch Ineinanderlaufenlassen miteinander vermischt werden und 3. daß nach etwa 60 Sekunden abgelesen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei unklarer Reaktion der Rest mit einem Tropfen eines um ein Mehrfaches verdünnten Serums wiederholt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Objektträger ein schwarzer Objektträger verwendet wird.