DE2440011B1

DE2440011B1 - Verfahren und Reagenz zur enzymkinetischen Konzentrationsbestimmung eines Substrates

Info

Publication number: DE2440011B1
Application number: DE2440011A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr. 8132 Unterzeismering Gruber; Reinhard Dipl.- Chem. Dr. 2000 Norderstedt Mueller-Matthesius
Original assignee: Eppendorf Geraetebau Netheler and Hinz GmbH; Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Eppendorf SE; Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1973-10-04
Filing date: 1974-08-21
Publication date: 1975-10-23
Also published as: HU172778B; FI57782C; AU7397574A; NL7413057A; NL181936B; FI287674A; FR2257905A1; IT1030641B; FI57782B; DE2349819A1; DE2440011A1; SE7412391L; GB1486474A; BE820736A; CA1031676A; US3977944A; NL181936C; FR2257905B1; JPS5084298A; JPS5724119B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymkinetischen Bestimmung der Konzentration eines Substrates, insbesondere eines in Blutserum oder Blutplasma gelösten oder suspendierten Substrates, bei welchem wenigstens ein oder mehrere spezifischeis) Enzym(e) zugesetzt und die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion gemessen wird. Die Erfindung betrifft ferner Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens. Die Bedeutung der Erfindung liegt insbesondere auf den Gebieten der klinischen Chemie, Biochemie, Lebensmittelchemie und Pharmazie.

Enzymatisch katalysierte Umsetzungen sind besonders bei der Analyse biologischer Flüssigkeiten, die eine komplizierte Zusammensetzung aufweisen, wegen ihrer Substrat-Spezifität bei der Reaktion und wegen ihrer hohen Ejmpfindlichkeit bevorzugt. Viel-

fach ist eine genaue Substratbestimmung nur auf enzymatischem Wege möglich.

In der Routine werden Substratkonzentrationsbestimmungen bei enzymatisch katalysierter Umsetzung bisher üblicherweise als Endwertbestimmung durchgeführt. Bei der Endwertbestimmung wird ein Parameter vor und nach der Umsetzung gemessen und daraus die Differenz gebildet.

Eine Ausnahme bildet die Harnsäurebestimmung nach der Kageyama-Methode, bei der zwei Enzyme zugegeben werden. Kinetisch gemessen wird jedoch der langsam ablaufende nichtenzymatische Teilschritt, so daß es sich um ein grundsätzlich anderes Verfahren handelt. Diese bekannte Methode benötigt einen erheblichen Zeitaufwand, da Messungen nach 6 und 12 Minuten erfolgen müssen. Daher ist dieses Verfahren aufwendig, zumal eine erhöhte Temperatur von 37⁰C aufrechterhalten werden muß. Es wäre von Vorteil, auch diese Bestimmung bei der für die kinetische Bestimmung von Enzymaktivitäten meist benutzten Meßtemperatur von 25° C und damit mit den bereits vorhandenen Geräten durchführen zu können.

Eine weitere Ausnahme stellt die Glucosebestimmung mit Glucose-Oxidase dar, welche enzymkinetisch mit routineüblichen Photometern durchführbar ist, weil der Wert der Michaelis-Konstanten für die Umsetzung außergewöhnlich günstig liegt.

Gegenüber der Endwertbestimmung hat eine kinetische Bestimmung von Substratkonzentrationen, bei der die zeitliche Änderung eines Parameters im Verlaufe einer Reaktion gemessen wird, wesentliche Vorteile:

1. Der Zeitbedarf ist jeweils verglichen mit dem entsprechenden Endwertverfahren geringer.

2. Ein Probenleerwert ist meist entbehrlich; damit wird die Zahl der Arbeitsschritte beim Ansetzen der Testlösungen, der Verbrauch an Probenmaterial und Reagenzien sowie gegebenenfalls der Geräte- und der on-line-Aufwand bei der Computerauswertung reduziert.

3. Die Substratbestimmung kann mit den üblichen Geräten für die Enzymaktivitätsbestimmung erfolgen. Damit ist auch die simultane Durchführung bisher aus gerätetechnischen Gründen schwer kombinierbarer Bestimmungen möglich.

4. Die Verwendung von Einwegküvetten, durch deren Einsatz Verschleppungsfehler bei der photometrischen Messung und Spülvorgänge entfallen, ist uneingeschränkt möglich, weil durch unterschiedliche Eigenextinktionen der Küvetten keine Fehler auftreten könnten.

Trotz all dieser offensichtlichen Vorteile sind bisher enzymkinetische Substratbestimmungen in der Routine nicht üblich und nur in Ausnahmefällen sinnvoll durchführbar. Die bekannten enzymkinetischen Techniken (»initial rate«, »time-fixed«) spielen nur in der Forschung eine Rolle; ihnen ist gemeinsam, daß nur sehr kleine Substratkonzentrationen eingesetzt und damit nur sehr kleine Substratumsätze gemessen werden können.

Die Beschränkung auf sehr kleine Substratkonzentrationen in der Testlösung ist deshalb notwendig, weil sich nur so eine direkte Proportionalität zwischen der Konzentration des nachzuweisenden Substrats und der Reaktionsgeschwindigkeit, d. h. eine lineare Eichkurve ergibt, die für einfache Routinebestimmungen gefordert werden muß.

Für die Geschwindigkeit enzymatisch katalysierter Reaktionen gilt nämlich die Michaelis-Menten-Gleichung

ν =

"■Μ

(v = Reaktionsgeschwindigkeit; v_max = Maximalgeschwindigkeit im Bereich der Substratsättigung; c_s = Substratkonzentration; K_M = Michaelis-Konstante).

Auf Grund dieser Gleichung kann sich eine Proportionalität zwischen Reaktionsgeschwindigkeit υ und Substratkonzentration c_s nur ergeben, wenn c_s sehr klein gegenüber K_M ist. Das Glied c_s im Nenner darf dann vernachlässigt werden, so daß sich kinetisch eine Reaktion pseudo-erster Ordnung ergibt. Wie theoretische Betrachtungen zeigen, darf c_s maximal 0,2 K_M sein, um für kinetische Bestimmungen den analytischen Fehler noch tolerierbar zu halten.

K_M ist nun für die meisten Reaktionen selbst sehr klein und liegt in der Größenordnung 10~~³ bis 10~⁷ Mol/l. Daraus ergibt sich, daß die Messung nach den bisherigen Verfahren auf den Einsatz außerordentlich kleiner Substratkonzentrationen beschränkt ist.

Man hat versucht, dieser Schwierigkeit dadurch zu begegnen, daß man Enzyme mit einem möglichst hohen Wert für K_M einsetzt. Die zur Verfügung stehende Auswahl ist jedoch gering, und die 2C_M-Werte sind auch im günstigsten Fall für praxisgerechte Substratbestimmungen in der Regel zu niedrig (eine Ausnahme bildet wie oben erwähnt die Glucosebestimmung mit GOD).

Aus dem Gesagten ergeben sich für die bekannten enzymkinetischen Verfahren folgende Nachteile:

1. Es sind außerordentlich präzise, hochauflösende und teure Meßgeräte notwendig, da der Meßausschlag bei sehr kleinen Substratumsätzen im Schwankungsbereich der herkömmlichen Geräte, z. B. Photometer, liegt.

2. Es kann nur der niedrige Teil des Konzentrationsspektrums der Proben ohne Vorverdünnung erfaßt werden; eine Vorverdünnung bedingt weitere Fehler und zwingt zur Wiederholung der Analyse.

3. Schmutzpartikeln und Luftblasen können das Meßergebnis sehr stark verfälschen; in der Routine kann die erforderliche extrem saubere Arbeitsweise nicht immer gewährleistet werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine einfache, auch für die Routine geeignete enzymkinetische Bestimmung von Substratkonzentrationen zu ermöglichen und die bisherigen Verfahren dahingehend zu verbessern, daß sie allgemein anwendbar werden und Messungen in praxisgerechten Zeiten zulassen, sowie einen größeren Konzentrationsbereich ohne zusätzliche Vorverdünnung zu erfassen gestatten.

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man durch Zugabe mindestens eines auf den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der enzymatischen Substratumsetzung abgestimmten kompetitiven Inhibitors das Verhältnis von Substratkonzentration c_s zur scheinbaren Michaelis-Konstanten K'_M auf < 0,2:1 bringt und dadurch die Bedingungen einer Reaktion pseudo-erster Ordnung einstellt, die Mischung homogenisiert, in vorbestimmten Zeitabstän-

den die Änderung eines für die Umsetzung spezifischen Reaktionsparameters bestimmt und daraus die Substratkonzentration ermittelt.

Vorzugsweise wird das Verhältnis von c_s zu K'_M auf einen Wert unter 0,05:1, insbesondere unter 0,01 : 1 gebracht.

Unter »kompetitiven Inhibitoren« werden im Rahmen der Erfindung zwei Gruppen von Stoffen verstanden:

a) Stoffe, die (nach dem Massenwirkungsgesetz) mit dem Substrat um das Enzym reversibel konkurrieren, dabei aber nicht oder nur vernachlässigbar langsam umgesetzt werden (kompetitive Inhibitoren im herkömmlichen Sinn).

b) Stoffe, die das Substrat reversibel binden und dadurch seine freie Konzentration (nach dem Massenwirkungsgesetzt) vermindern, wobei der Substrat/Inhibitor-Komplex unter Einwirkung des Enzyms nicht umgesetzt wird.

Bevorzugt werden als geeignete kompetitive Inhibitoren Stoffe gewählt, die einem der Ausgangsstoffe und/oder einem der Endprodukte der geschwindigkeitsbestimmenden Reaktion strukturverwandt sind, jedoch nicht von dem in dieser Reaktion verwendeten Enzym umgesetzt werden.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird die Messung durch einen größeren Substratumsatz präziser. Es kann mit einfachen Mitteln gearbeitet werden. Ein Meßzeitraum kann vorteilhaft im Bereich von 0,5 bis 3 Minuten liegen. Die Proportionalität zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Substratkonzentration wird soweit angenähert, daß eine für analytische Zwecke ausreichende Genauigkeit erreicht wird.

Die Vielseitigkeit und Anpassungsfähigkeit des Verfahrens wird gegenüber bekannten Verfahren dadurch erheblich verbessert, daß über das Verhältnis der Konzentrationen von Substrat zu Enzym zu kompetitivem Inhibitor eine für analytische Zwecke ausreichende Empfindlichkeit für die Messung, auch bei geringerer Substratkonzentration, eingestellt und die Messung in einem praktisch günstigen Zeitraum durchgeführt werden kann.

In diesem Zusammenhang sieht eine zweckmäßige Ausführungsform vor, daß einerseits die Proportionalität zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und höheren Substratkonzentrationen durch Zugabe des Inhibitors verbessert und andererseits die Verminderung der Reaktionsgeschwindigkeit durch Erhöhung der Enzymkonzentration kompensiert wird. Eine Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit könnte auch durch Erhöhung der Reaktionstemperatur erreicht werden.

Trotz Einsatz eines kompetitiven Inhibitors wirkt sich die Erhöhung der Enzymkonzentration günstig aus, wenn die Empfindlichkeit angehoben werden und in gleicher Meßzeit ein größerer Umsatz erfaßt werden soll, der seinerseits zu einer Verbesserung der Proportionalität zwischen Reaktionsgeschwindigkeit und Substratkonzentration in der Probe führt. Vor allem braucht die Erhöhung der Enzymkonzentration nicht mit einer unverhältnismäßig kurzen Meßzeit erkauft zu werden, da die Geschwindigkeit der Reaktion in flexibler Weise durch, Wahl der Konzentration des kompetitiven Inhibitors gesteuert werden kann. Es ergibt sich damit der entscheidende Vorteil, bei höheren Substratkonzentrationen in einer praktischen Meßzeit mit herkömmlichen Geräten messen zu können. Insbesondere ist es möglich, durch geeignete Wahl der Probenmenge, der Konzentration des Enzyms und der Konzentration des Inhibitors den gesamten relevanten Konzentrationsbereich eines Substrates in der Probe ohne vorherige oder nachträgliche Verdünnung messen zu können.

Die Fachwelt ist an der Möglichkeit, diesen Effekt der kompetitiven Inhibitoren für enzymkinetische Bestimmungen auszunutzen, bislang vollkommen vorbeigegangen. Der Effekt kann nachträglich dadurch erläutert werden, daß in den Nenner der oben beschriebenen Michaelis-Menten-Gleichung ein zusätzlich additives Glied eingeführt wird:

v =

wobei

K₁=

C₅-C₁

wenn das Substrat gebunden wird, und

K₁ =

^EI

' c_E-c_t

wenn das Enzym gebunden wird.

c, = Konzentration des Inhibitors,
c_Si = Konzentration des Substrat/Inhibitor-Komplexes,

c_s = Konzentration des freien Substrats,
c_El = Konzentration des Enzym/Inhibitor-Kom-

plexes,
c_E = Konzentration an freiem Enzym.

Weil der Term K_M + K_M ■ C₁- K₁ (scheinbare Michaelis-Konstante K'_M) stets größer als K_M ist, kann die Proportionalität zwischen Reaktionsgeschwindigkeit ν und Substratkonzentration c_s in einem definierten Zeitraum bei höheren Substratkonzentrationen erreicht werden, als dies ohne Zugabe eines kompetitiven Inhibitors möglich ist.

Die Konzentration des freien Enzyms und das Verhältnis c_EI/c_E bzw. c_sl/c_s werden so auf die Substratkonzentration abgestimmt, daß bei ausreichender Proportionalität in einer angemessenen Zeit mit ausreichender Empfindlichkeit gemessen werden kann. Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung besteht darin, die Empfindlichkeit nicht nur über die Substrat- und Enzymkonzentration, sondern auch über die Konzentration des kompetitiven Inhibitors steuern zu können.

Unter diesem Gesichtspunkt wird vorteilhaft eine zum sicheren Nachweis kleiner Substratkonzentrationen ausreichende Empfindlichkeit über das Verhältnis der Konzentrationen von Substrates zu Enzym c_E zu kompetitivem Inhibitor C₁ eingestellt.

Wenn ein eventuell anhaltender Leerschleich nicht abgewartet werden soll, kann er zweckmäßig durch Aufnahme eines Leerwertes korrigiert werden.

Die Messung wird zweckmäßig unmittelbar nach Homogenisierung der Mischung und Ausgleich eines eventuell auftretenden Temperatursprungs bevorzugt nach der »tirriefixed«-Technik ausgeführt. Dabei wird im Bereich der Reaktion pseudo-erster Ordnung bei allen Messungen in einer Analysenserie in einer gleichen Zeitspanne nach einer bestimmten gewählten Zeit gemessen. Vorzugsweise wird nach der bestimm-

ten gewählten Zeit eine Mittelung der Meßwerte in der Zeitspanne für die Messung oder eine kinetische Zweipunktmessung am Anfang und Ende der Zeitspanne oder eine Bestimmung der Momentangeschwindigkeit zu einem festen Zeitpunkt, z. B. durch Bestimmung des Steigungswinkels der Meßkurve, vorgenommen. Die Zeitspanne kann innerhalb der Reaktion vom Typ erster Ordnung beliebig, muß jedoch für alle Messungen in einer Analysenserie gleich gewählt werden. Es können daher praktische und kurze Meßzeiten gewählt werden. Vor allem ist es möglich, eine zweckmäßige, auch kurze Meßzeit nach der »time fixed«-Technik ausgeführt. Dabei wird fangsgeschwindigkeit zu ermitteln (»initial rate«-Technik).

Unter bestimmten Umständen kann es günstig sein, nicht nur einen Inhibitor, sondern mehrere Inhibitoren einzusetzen.

Es ist möglich, das erfindungsgemäße Verfahren auf mehrstufige Reaktionen anzuwenden, wobei nicht alle Teilschritte enzymatisch katalysiert zu sein brauchen. Beispielsweise kann das nachzuweisende Substrat in einem geschwindigkeitsbestimmenden enzymatischen Schritt umgesetzt werden, an den sich eine schnelle nichtenzymatische Indikatorreaktion anschließt. In diesem Fall wird der Inhibitor der ersten (enzymatischen) Reaktion zugesetzt. Analog kann man vorgehen, wenn auch die Indikatorreaktion enzymatisch katalysiert wird. Jetzt gibt es jedoch eine zweite Möglichkeit, indem man vor der eigentlichen Messung die erste Stufe quantitativ ablaufen läßt und ihre Reaktionsprodukte damit speichert; anschließend wird die zweite Stufe unter Zusatz eines auf die zweite Stufe abgestimmten Inhibitors kinetisch verfolgt.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform wird ein auf den Meßansatz abgestimmter Puffer verwendet. Im Hinblick auf in verschiedenen Fällen mögliche Teilreaktionen wird dabei der pH-Wert des Puffers so gewählt, daß er möglichst mit dem pH-Geschwindigkeits-Maximum in bezug zur gesamten Reaktionsgeschwindigkeit des Meßansatzes übereinstimmt und den 1£_M-Wert des Enzyms nicht merklich erniedrigt.

Ein besonders überraschender Effekt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht ferner darin, daß eventuell in der Probe bereits vorhandene Inhibitoren, welche die Analysenergebnisse verfälschen können, durch Erhöhung der Inhibitorkonzentration in den Hintergrund gedrängt werden können. Derartige Störeffekte spielen in der Praxis eine nicht unbedeutende Rolle, da beispielsweise viele im Blutserum von Patienten vorhandene Pharmaka inhibitiv wirken können. Auch natürlich vorkommende Begleitstoffe haben häufig eine Inhibitorwirkung. Das erfindungsgemäße Verfahren eröffnet damit einen Weg, auch in solchen Fällen korrekte Analysenergebnisse zu erhalten, in denen ein unbekannter Inhibitor in nicht bekannter Menge vorhanden ist.

Eine weitere Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung des zu bestimmenden Substrats verwendet wird, welche bereits einen kompetitiven Hemmeffekt auf das zur Bestimmung verwendete Enzym ausübt. Vorzugsweise wird hierbei der absichtlich zugesetzte kompetitive Inhibitor in einer Menge eingesetzt, welche eine 60- bis 95%ige Hemmung des Enzyms hervorruft. Die besten Ergebnisse werden hierbei dann erhalten, wenn die zu bestimmende Substratlösung bereits einen Hemmeffekt auf das zur Bestimmung verwendete Enzym ausübt, welcher eine bis zu 50%ige Hemmung des Enzyms hervorruft.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur enzymkinetischen Substratbestimmung in Gegenwart unbekannter Inhibitoren durch Zusatz bekannter Inhibitoren in bekannter Menge ist höchst überraschend und überwindet das Vorurteil der Fachwelt, daß kinetische Substratbestimmung in Gegenwart unbekannter Hemmstoffe nicht möglich seien. So ist es aus Analytical Chemistry, 31, S. 980 (1959) bekannt, daß das Vorhandensein von hemmenden Aktivitäten für die enzymkatalysierte Reaktion das schwerwiegendste Problem der enzymatischen Substratbestimmung darstellt und sich eine solche Bestimmung nicht durchführen läßt, wenn unbekannte und unspezifische Hemmstoffe vorhanden sind. Besonders wird darauf hingewiesen, daß auch Hemmstoffe selbst nicht mehr bestimmt werden können, wenn sie andere hemmende Verunreinigungen enthalten.

Für die Durchführung dieser Ausführungsform des Verfahrens gelten die obigen Angaben in gleicher Weise. Zweckmäßig wird jedoch in einem Vorversuch bei einer unbekannten Probe festgestellt, ob sie bereits hemmende Aktivitäten enthält, welche das Enzym zu nicht mehr als 50% zu hemmen vermögen. Dies läßt sich einfach durchführen durch Zusatz einer bekannten Menge Substrat und einer bekannten Enzymaktivität. Werden kinetisch oder durch Endwertbestimmung wenigstens 50% des zugesetzten Substrates wiedergefunden, so läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren anwenden, ohne daß ein merklich größerer Fehler als bei Durchführung der Messung in einer hemmstofffreien Lösung in Betracht gezogen werden muß. Liegt die Wiederfindung erheblich unter 50%, so läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren immer noch durchführen, es muß jedoch ein etwas größerer Fehler in Kauf genommen werden. Im letzteren Fall ist es zweckmäßig, mit der Menge der absichtlich zugesetzten Inhibitormenge bis an die obere Grenze des anwendbaren Hemmungsbereiches zu gehen, die bei etwa 95% liegt. Bei Fremdhemmungen unter 40% wird vorzugsweise eine solche Menge an kompetitivem Inhibitor eingesetzt, daß eine Enzymhemmung zwischen 65 und 85% erzielt wird.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Reagenz zur enzymkinetischen Bestimmung der Konzentration eines Substrates nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Ein derartiges Reagenz enthält ein System zur enzymatischen Messung dieses Substrates und ist gekennzeichnet durch einen Gehalt an wenigstens einem kompetitiven Inhibitor für die zu messende Enzymsubstratreaktion. Grundsätzlich geeignet für dieses Reagenz sind die bekannten Systeme zur enzymatischen Substratbestimmung nach der Endwertmethode, die in vielen Formen im Handel erhältlich sind. Das erfindungsgemäße Reagenz enthält neben einem derartigen System zusätzlich wenigstens einen kompetitiven Inhibitor. Inhibitor und Enzym können dabei in Form eines gemeinsamen Komplexes vorliegen, der eine zusätzliche Stabilisierung des Enzyms analog zur Substratstabilisierung eines Enzyms bewirkt.

Ein System zur enzymatischen Messung eines Substrates enthält im allgemeinen ein für das Substrat spezifisches Enzym, einen auf dieses Enzym abgestimmten Puffer sowie gegebenenfalls Cofaktoren und/oder Hilfsenzyme und/oder Stabilisatoren. Unter

509 543/384

24 40 Oil

ίο

Cofaktoren werden hierbei Coenzyme, darunter auch als Coenzyme wirksame Metallionen, und Cosubstrate verstanden.

Die erfindungsgemäßen Reagenzien oder Reagenzienkombinationen können sowohl in Form von Lösungen als auch in Form von lyophilisierten, gefriergetrockneten Gemischen vorliegen. Eine besonders günstige Ausführungsform ergibt sich bei Abpackung von lyophilisierten Reagenzien in Einwegküvetten, welche nach Zugabe eines Lösungsmittels (z. B. des Puffers) sofort gebrauchsfertig sind und nach Durchführung der Bestimmung fortgeworfen werden.

Zur näheren Erläuterung der Erfindung sollen die nachfolgenden Beispiele dienen, welche eine Harnsäurebestimmung und eine Glucosebestimmung im einzelnen wiedergeben. In analoger Weise können beispielsweise Triglyzerid mittels der Glyzerokinase-Methode, Harnstoff mittels der U rease/Gl DH-Methode, Cholesterin mittels der Choiesterin-Dehydrogenase-Methode oder Lactat mittels der LDH-Methode bestimmt werden. Weitere enzymatische Bestimmungen, welche erfindungsgemäß kinetisch durchführbar sind, finden sich z. B. in H. U. B e r g m e y e r, Methoden der enzymatischen Analyse, Verlag Chemie Weinheim, 1974.

Beispiel 1

Photometrische Harnsäurebestimmung nach der ungekoppelten Uricase-Reaktion

Dabei läuft die bekannte Umsetzung ab:

Uricase

EC 1.7.3.3

Harnsäure + 2 H,0 + O,

Allantoin + CO₇ + H₇O₇

35

40

45

Meßgröße ist die Extinktion der Harnsäure nahe deren Absorptionsmaximum bei 293 nm.

Geräte

Ein Enzymmeßplatz (Photometer mit Filter Hg 302 nm, Multiplier und Spektrallampe), Pipetten bzw. Probe-Reagenz-Dosierer.

Reagenzien

1. Kaliumthiocyanat,

2. Harnsäure,

3. Lithiumcarbonat,

4. 0,1 Mol/l Boratpuffer, pH 9,5,

5. Uricase 5 U/ml (hergestellt aus Schweineleber).

Arbeitsweise
Ermittlung des Hemmtyps

50 μΐ Standardlösung mit 0,178-0,297-0,476 0,595-0,733-0,892-1,19 mMol/1 Harnsäure (durch Verdünnen einer Stammlösung von 5,95 mMol/1 Harnsäure in 54 mMol/1 Lithiumcarbonat mit bidest. Wasser) werden mit 500 μΐ Puffer ohne Inhibitor bzw. mit 500 μΐ 103 mMol/1 Kaliumthiocyanat Puffer in der Küvette (Schichtdicke 1,00 cm) auf 25° C inkubiert und die Reaktion durch Zumischen von 50 μΐ 1 + 10 mit bidest. Wasser verdünnter Uricase gestartet. 20 Sekunden nach Reaktionsstart wird registriert: Papiervorschub 2 cm/Min., Spreizung 20 cm für E = 0— 1. Mit einem Winkelmeßgerät wird der Winkel « mit der Zeitachse jeweils zu Registrierbeginn gemessen. Die Reziprokwerte der tan « werden als Ordinate gegen die zugehörigen reziproken Harnsäurekonzentrationen aufgetragen (Lineweaver-Burk-Diagramm). Durch die jeweils mit bzw. ohne Kaliumthiocyanat-Zusatz erhaltenen Punkte wird die Ausgleichsgerade gelegt. Bei Vorliegen eines kompetitiven Hemmtyps muß die Verlängerung der Geraden die Ordinate im gleichen Punkt schneiden.

Optimierung der Testbedingungen

50 μΐ der Standardlösungen inkubiert man mit 500 μΐ 825 mMol/1 Kaliumthiocyanat in Puffer auf 25° C, startet durch Zugabe von 50 μΐ unverdünnter Uricase und mißt wie vorstehend. Zur Ermittlung der scheinbaren Michaelis-Konstante werden die Reziprokwerte der tangens α als Ordinate, die reziproken molaren Substratkonzentrationen im Testansatz als Abszisse aufgetragen. Die scheinbare Michaelis-Konstante ergibt sich als negativer Reziprokwert der Abszissenschnittpunkte der Regressionsgeraden (Einsetzen geeigneter kleiner Werte für l/c_s, danach graphische Auswertung). Der Wert der scheinbaren Michaelis-Konstanten K'_M ist wichtig für die Beurteilung der maximal in den Test einsetzbaren Harnsäurekonzentration, die möglichst kleiner als 0,05 K'_M sein soll.

Ergebnisse und Diskussion

Mit dem Literaturwert 17 μΜοΙ/1 Harnsäure für die Michaelis-Konstante der aus Schweineleber gewonnenen Uricase (T. O. T if fan y et al. Anal. Chem.45, 1716-23 [1973]) ergibt sich eine maximal einsetzbare Konzentration von 0,85 μΜοΙ/l Harnsäure, wenn das Verhältnis c_sJK_M = 0,05 für die Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit zugrunde gelegt wird. Geht man von einem Testvolumen von 600 μΐ aus, muß der eingesetzte Serumanteil auf 0,85 μΐ beschränkt werden, um bis zu einem Gehalt von 0,6 mMol/1 Harnsäure im Serum ohne zusätzliche Vorverdünnung messen zu können. Abgesehen davon, daß das Serum vorverdünnt werden muß, weil sich ein so geringes Volumen von 0,85 μΐ nicht direkt genau dosieren läßt, läßt sich unter diesen Bedingungen selbst für das Endwertverfahren an der unteren Normalwertgrenze für Humanseren (0,12 mMol/1 Harnsäure) nur eine Extinktion von 0,002 erreichen, bezogen auf den Extinktionskoeffizienten der Harnsäure 12,6 αη²/μΜο1 bei 293 nm (Boehringer Mannheim GmbH, Testfibel, 3. Aufl., 1969, Abschnitt Harnsäure). Das Verfahren ist für eine kinetische Bestimmung zu unempfindlich.

Durch Verwendung bakterieller Uricase läßt sich die Anfangskonzentration zwar um den Faktor 6 steigern. Eine hinreichende Empfindlichkeit ergibt sich jedoch nur, wenn der erste Meßpunkt bereits 4 Sekunden nach Reaktionsstart aufgenommen und ein »time fixed«-Intervall >1,5 Minuten gewählt wird (Tiffany, a.a.O.).

Mit Kaliumthiocyanat wurde ein geeigneter kompetitiver (gleicher Ordinatenschnittpunkt bei der Auftragung nach Lineweaver-Burk bei gleicher Enzymaktivität) Inhibitor gefunden, der bei einer Konzentration von 687 mMol/1 Testlösung eine scheinbare Michaelis-Konstante von 1 mMol/1 ergab. Damit errechnet sich bei einem Einsatz von 50 μΐ unverdünnter Probe und einem Testvolumen von 600 μΐ ein c_s/K_M-Wert von 0,05 für die Konzentration 0,6 mMol/1 Harnsäure in der Probe, so daß hinsichtlich Empfindlichkeit und Linearität der Eichkurve die Voraussetzungen für ein einfaches Routineverfahren gegeben erscheinen.

In Übereinstimmung mit dieser Berechnung wurde für die Winkelablesung bei 20 Sekunden Proportionalität zwischen dem tangens und Konzentrationen bis 0,6 mMol/1 Harnsäure in Wasser mit einem Fehler von -3% für den höchsten Gehalt gefunden, der toleriert werden kann, wenn man an die Übertragung der Bedingungen auf die Serumanalyse denkt. Der Winkel betrug an der unteren Normalwertgrenze unter den Bedingungen etwa 8°, so daß die Empfindlichkeit des Verfahrens auch für kleine Substratkonzentrationen ausreicht.

Die für wäßrige Harnsäurelösungen gefundenen Bedingungen können damit für die Serumanalyse beibehalten werden. Allerdings sollte vor Zugabe der Uricase der Leerschleich abgewartet werden, der durch eine Oxydation der im Serum in variabler Menge enthaltenen Ascorbinsäure bedingt ist.

Durch Erhöhung der Inhibitorkonzentration kann der lineare Meßbereich ausgedehnt und die Richtigkeit bei höheren Harnsäure-Konzentrationen gesteigert werden, wobei gleichzeitig die Empfindlichkeit durch Übergang auf die Meßwellenlänge 293 nm und/ oder weitere Erhöhung der Enzymaktivität und/oder Erhöhung der Temperatur verbessert werden sollte.

Beispiel 2

Photometrische Bestimmung der Glucose nach der Glucose-Dehydrogenase-Methode

Es läuft die bekannte Umsetzung ab:

Mutarotase
α-Glucose /^-Glucose

(EC 5.1.3.3)

/5-D-Glucose + NAD®

Glucose-Dehydrogenase

(EC 1.1.1.47)

->■ Gluconsäure+NADH + H®

Geräte

Ein Enzymmeßplatz (kinetische Bestimmungen), ein Substratmeßplatz (Endwertbestimmungen), Pipetten bzw. Probe-Reagenz-Dosierer (Mikroliterbereich), geeichte Vollpipetten (Milliliterbereich). — LaborpH-Meter. — Tischrechner mit Programm für Mittelwert, Standardabweichung und Variationskoeffizient sowie Sonderprogramm für lineare Regression, Korrelationskoeffizient und Streuung um die Regressionsgerade.

Reagenzien

1. Kaliumthiocyanat,

2. Kaliumchlorid,

3. Dinatriumsalz der Äthylendinitrilotetraessigsäure,

4. d( + )-Glucose, wasserfrei, puriss.,

5. wäßr. Glucosestandardlösung,

6. Nicotinamid-adenin-dinucleotid, freie Säure (150 mg/ml H₂O),

7. »Blutzucker, GlucDH-Methode«.

Lösungen

1. Puffer: 120mMol/l Phosphatpuffer, pH 7,6,

2. Puffer-Enzym-Gemisch: Lösung von Glucose-Dehydrogenase und Mutarotase in Puffer, hergestellt entsprechend Begleitzettel der Probepakkung,

30

3. Stabilisiertes Puffer-Enzym-Inhibitor-Gemisch: Lösung mit 825 mMol Kaliumthiocyanat und 55 mMol Dinatriumsalz der Äthylendinitrilotetraessigsäure im Liter Puffer-Enzym-Gemisch. pH-Wert:6,6.

Arbeitsweise

1. Charakterisierung der

Glucose-Dehydrogenase-Aktivität

20 μΐ 1 + 10 mit Puffer verdünntes Puffer-Enzym-Gemisch wurde mit 500 μΐ 280 mMol Glucose/1 Puffer (bei höheren Glucosekonzentrationen Substrathemmung) auf 25⁰C inkubiert und die Geschwindigkeit der Extinktionszunahme über 3 Minuten nach Zumischen von 20 μΐ 150 mMol/1 NAD® verfolgt.

Berechnung und Ergebnis (ε = Molextinktion NADH, d = Schichtdicke, EV = Testvolumen, PV = Probevolumen, F = Verdünnungsfaktor)

[//ml

JE IQ³ EV
min e ■ d PV

= 0,205

10³

3,3 10³ 1,00 20

S 11 = 18,5

2. Hemmtyp

100 μΐ Standard mit 27,8-33,3-38,8-44,4-50,0 — 55,5 mMol Glucose/1 wurden in der Küvette mit 500 μΐ folgender Lösungen auf 25°C inkubiert: (a) Puffer-Enzym-Gemisch, 1+40 mit Puffer verdünnt,

(b) 410mMol/l Kaliumthiocyanat in verd. Puffer-Enzym-Gemisch, (c) 620mMol/l Kaliumthiocyanat in verd. Puffer-Enzym-Gemisch. (Die thiocyanathaltigen Lösungen wurden jeweils frisch angesetzt.) Durch Zumischen von 20 μΐ 200 mMol/1 NAD® wurde die Reaktion gestartet, 10 Sekunden danach registriert: Papiervorschub 5 cm/Min., Spreizung 20 cm für £ = 0-1.

Zur Ermittlung des Winkelsa mit der Zeitachse wurde der praktisch lineare Anfangsbereich der Schreiberaufzeichnung ausgewertet, zur Bestimmung des Hemmtyps die Reziprokwerte der Tangens α (für praktische Zwecke identisch mit der Anfangsgeschwindigkeit) als Ordinate und die Reziprokwerte der in den Test eingesetzten millimolaren Glucosekonzentrationen als Abszisse aufgetragen (Lineweaver-Burk-Diagramm).

Zur Klärung der Frage, ob das Thiocyanation für die Hemmwirkung verantwortlich ist, wurde Kaliumthiocyanat durch die äquimolare Menge Kaliumchlorid ersetzt.

3. Konzentrationsbestimmungen
Allgemeiner Testansatz

20 μΐ Probe wurde mit 500 μΐ stabilisiertem Puffer-Enzym-Inhibitor-Gemisch in der Küvette auf 25° C inkubiert und die Reaktion durch Zumischen von 20 μΐ NAD® (150 mg/ml H₂O) gestartet. 20 Sekunden nach Reaktionsstart wurde mit 5 cm/Min. Papiervorschub bei Hg 366 nm und der Schichtdicke 1,00 cm registriert und der Winkel α jeweils 20 Sekunden nach Reaktionsstart ermittelt.

Berechnung über den Standard mit 5,55 mMol
Glucose/1

5,55

O, Probe = tan α p_rob_e

tan α standard

Analyse von Humanplasmen

Als Proben wurden Humanplasmen eingesetzt, die durch Zentrifugieren von mit Fluorid-EDTA-Benzoesäure-stabilisiertem Venenblut gewonnen worden waren.

Parallelanalysen wurden nach der Hexokinase-Endwertmethode mit Enteiweißung nach der Eppendorf-Vorschrift AV 707-T durchgeführt; in Abweichung von der Vorschrift wurde über den Standard berechnet.

Diskussion der Ergebnisse
Kaliumthiocyanat als kompetitiver Inhibitor

F i g. 1 zeigt ein Lineweaver-Burk-Diagramm (Ordinate : reziproker Anstieg der Extinktions-Zeit-Kurve 10 Sekunden nach Reaktionsstart; Abszisse: reziproke millimolare Glucosekonzentration im Test). Die Verlängerungen der ohne Inhibitorzusatz (a), bei Zusatz von 33OmMoI KSCN/1 Testlösung (b) sowie bei Zusatz von 500 mMol KSCN/1 Testlösung (c) gefundenen Geraden schneiden die Ordinate praktisch im gleichen Punkt, während sich der Abszissenschnittpunkt mit steigender Inhibitorkonzentration dem Ursprung nähert, was für den kompetitiven Hemmtyp charakteristisch ist.

20

Meßbereich und Empfindlichkeit

35

In Fig. 2 a und 2 b sind Eichkurven dargestellt, die sich ergeben, wenn man die scheinbare Michaeliskonstante durch Inhibitorzusatz auf 5OmMoI Glucose/1 einstellt: einmal für die Steigung der Extinktions-Zeit-Kurve 20 Sekunden nach Reaktionsstart, zum anderen für die fixed-time-Intervalle 60 bzw. 300 Sekunden, jeweils wiederum 20 Sekunden nach Reaktionsstart (Papiervorschub 10 cm/min; Meßwellenlänge Hg 366 nm).

Für die praktische Durchführung des Verfahrens sind folgende Punkte wesentlich:

1. Toleriert man einen Fehler von 3% weit oberhalb der Normalwertgrenze (etwa 5 mMol/1 Probe), liegt die Verdünnungsgrenze für die Winkelablesung bzw. das kleinere »time fixed«-Intervall bei 50mMol/l und damit sogar günstiger als bei verschiedenen herkömmlichen Endwertverfahren.

Im Falle des 300-Sekunden-Intervalls reicht die Linearität der Eichkurve bis etwa 20mMol/l aus. Unter Beibehaltung der Bedingungen kann man über diesen Wert aber nur wenig hinausgehen, weil

2. die Extinktionsdifferenz für den Meßbereich routineüblicher Photometer zu groß wird, zumal wenn man bei mechanisierter Messung die Eigenextinktionen der Proben beachten muß. Durch Änderung der Testbedingungen (z. B. höhere Inhibitorkonzentration, kleinere Probenmenge) kann die Empfindlichkeit jedoch herabgesetzt und zugleich der erfaßbare Konzentrationsbereich ausgedehnt werden.

Im Falle der Winkelablesung muß die Empfindlichkeit gesteigert werden, was z. B. durch Messung näher am NADH-Absorptionsmaximum und/oder durch Verminderung der Papiervorschubgeschwindigkeit geschehen kann. Auch bei dem 60-Sekunden-Intervall wird die Empfindlichkeit vorzugsweise erhöht. Die Empfindlichkeitsreserven des Verfahrens sind so groß, daß der einsetzbare Konzentrationsbereich auch bei kurzer Meßdauer nur von dem Meßbereich des Photometers bzw. der Ablesegrenze routineüblicher Winkelmeßgeräte limitiert wird. Eine Steigerung der Enzymkonzentration über die Angabe des Reagenzienherstellers hinaus ist dabei nicht notwendig.

Richtigkeit und Präzision

Die Richtigkeit des Verfahrens wurde an Hand der Wiederfindungsrate, durch Vergleichsmessungen mit der Hexokinase-Endwertmethode und mit Kontrollseren überprüft.

Die Wiederfindungsrate (Tab. 1) ist als sehr gut zu bezeichnen. Für die Parallelmessung mit der Hexokinase-Endwertmethode wurde Plasma eingesetzt, weil die Glucose-Dehydrogenase-Reaktion aus noch ungeklärter Ursache gehemmt wird, wenn in größerem Ausmaß Blutzellen in den Testansatz gelangen. (Vorversuche ergaben jedoch, daß die kinetische Bestimmung unter modifizierten Bedingungen auch mit überstand nach Enteiweißung durchgeführt werden kann, so daß eine Vollblut-Analyse ebenfalls möglich ist.) Die direkte Verwendung von Plasma (bzw. Serum) kommt einer schnellen Durchführung der Messung sowie allgemein simultanen kinetischen Bestimmungen mit anderen Substraten bzw. Enzymen entgegen.

Tabelle 1

Wiederfindungsraten bei Einwaage von Glucose

in Qualtrol

Konzentrationsangaben in mMol Glucose/1 Probe

Zugewogene	Gefunden	Nach Abzug	Wieder
Konzentration		des Eigen-	findungsrate
		gehältes
31,4	37,7	31,8	101,5%
15,7	22,0	15,9	101,0%
12,5	18,5	12,6	100,5%
8,99	15,1	9,21	102,0%
5,24	11,2	5,27	100,5%

Aus den Ergebnissen der an 60 Humanplasmen (Konzentrationsbereich etwa 4 bis 16 mMol/1 Plasma, vgl. Fi g. 3, welche die Korrelation der Glucosebestimmung nach der direkten kinetischen Bestimmung und der indirekten Hexokinase-Endwertmethode zeigt) durchgeführten Vergleichsuntersuchungen errechnete sich die Regressionsgerade y = 0,1255 + 0,9272 x, der signifikant von Null verschiedene Korrelationskoeffizient r= +0,9965 und die Streuung um die Regressionsgerade S_x._y = 0,2085. Nach diesen Werten besteht zwischen beiden Verfahren eine enge Korrelation. Die Ergebnisse für die kinetische Bestimmung liegen jedoch — praktisch konzentrationsunabhängig — durchschnittlich 7% tiefer als die über den gleichen Standard berechneten Konzentrationswerte der Endwertmethode. Dieser Unterschied steht mit dem Volumenverdrängungseffekt bei Enteiweißung in Einklang.

Interessant ist ein Vergleich mit den zugehörigen Werten der Vollblutanalyse aus der Routine, die nach

der Hexokinase-Endwertmethode mit Enteiweißung ermittelt wurden. Dabei lag der zur Berechnung verwendete Faktor 2,5% unter dem für wäßrige Glucose-Lösungen »theoretisch« gültigen. Gegenüber der kinetischen Analyse ergab sich ein durchschnittliches Minus von 14%, gegenüber der Plasma-Analyse nach dem Hexokinase-Endwertverfahren sogar von etwa 20%.

Die an fünf Kontrollseren nach dem kinetischen Verfahren gefundenen Glucosekonzentrationen lagen bis auf Precinorm S stets etwas höher als die deklarierten Sollwerte (Tab. 2). Das mit Hyland-Control-Serum erhaltene Ergebnis kann vielleicht mit tiefen Sollwerten erklärt werden, wie sie für die Glucose-Oxidase-Methode typisch sind.

Tabelle 2

Analyse von Kontrollseren

Konzentrationsangaben und Standardabweichungen in mMol Glucose/1

Deklariert

χ . ~x ± 2s

Gefunden VK

Hyland Control Serum II	IM¹)	10,5—12,2	12	12,44	0,25	2,0
Monitrol II	U,6²)	10,7—12,5	12	11,89	0,32	2,7
Precinorm S	5,95	5,35— 6,55	12	5,86	0,13	2,2
Pathotrol	13,9²J	13,2—14,6	12	14,67	0,29	2,0
Labtrol	5,15²)	4,80— 5,50	12	5,37	0,16	3,0

') Glucose-Oxidase.

²) HK/G6P-DH-Endwertmethode mit Enteiweißung.

In Tabelle 2 ist zugleich die an Kontrollseren gefundene Präzision in der Serie angegeben, die nach unseren Erfahrungen mit der ebenfalls manuell durchgeführten Hexokinase-Endwertmethode vergleichbar ist.

Die Präzision von Tag zu Tag wurde an Precinorm S zu VK = 3,4% ermittelt.

Beispiel 3

Die erzielbare Ausschaltung des störenden Einflusses von Fremdinhibitoren zeigen die in den nachstehend aufgeführten beiden Tabellen für zwei verschiedene Enzyme und jeweils zwei verschiedene Inhibitoren ermittelten Meßwerte.

Tabelle 3

Kinetische Glucose-Bestimmung mit GlucDH

KSCN	Phloretin	Durchmesser-
		Hemmung
(mMol)	(μΜοΙ).	(%)
310		78
—	1,4	20
310	1,4	81
38,5	—	17
—	14	76
38,5	14	78
Tabelle 4
Kinetische	Harnsäure-Bestimmung	mit Uricase
KSCN	Xanthin	Durchmesser-
		Hemmung
(mMol)	(μΜοΙ) '	(%)

82 34

KSCN	Xanthin	Durchmesser-
		Hemmung
(mMol)	(μΜοΙ) -	(%)
500	20	82 ■■■..""
10	—	17
—	80	76
10	80	72
40	—	41
—	40	60
40	40	62

35 — Die Tabellen 3 und 4 zeigen, daß der jeweils in einer Menge, die eine Hemmung von mindestens 60% hervorruft, vorliegende Inhibitor den Einfluß des zweiten Inhibitors, der in einer weniger als 50% Hemmung hervorrufenden Menge vorliegt, völlig unterdrückt und nur die Hemmung des überwiegenden Inhibitors zum Zuge kommt.

Beispiel 4

Kinetische Glucose-Bestimmung
mit Glucose-Dehydrogenase

Es wurde folgender Testansatz verwendet:

0,12 Mol Phosphatpuffer, pH = 7,6,
4OmMoI Sulfosalicylsäure,

55 mMol EDTA,
15OmMoINAD,

0,86 mMol - 2,59 mMol Glucose,
1,8 U Glucose-Dehydrogenase,
0,31 Mol KSCN bzw.

l,4nMol Phloretin.

Die Meßwerte zeigt nachstehende Tabelle 5.

509543/384

17

Tabelle 5

Glucose Ohne Inhibitor 0,31 Mol KSCN

(mMol) IE,min %Hem- IE min %Hem-[S] mung mung

77,5

10,5 80,6

8,0 80,3

4,5 85,5

1,4 nMol Phloretin

I E/min % Hemmung

2,59	75,4
1,72	54,0
1,29	40,6
0,86	31,1

62,5 17,1

45,5 15,8

30,0 26,0

24,0 22,8

0,3IMoIKSCN + 1,4 nMol

Phloretin

Λ E/min

16,0

10,5

7,0

5,0

Beispiel 5

Kinetische Glucose-Bestimmung mit Glucose-Dehydrogenase

Es wurde folgender Testansatz verwendet:

mMol Phosphatpuffer, pH = 7,6,
mMol Sulfosalicylsäure,
mMol EDTA,

4,65 mMol NAD,

0,86—3,45 mMol Glucose,
mU Glucose-Dehydrogenase,
38,5 mMol KSCN,
nMol Phloretin.

Die Versuchsergebnisse zeigt Tabelle 6.
Tabelle 6

Glucose Ohne Inhibitor

38,5 mMol KSCN 14 nMol Phloretin

ImMoI) I£/min %Hem-.1£,min % Hern- ΙΕ/min %Hem-[S] mung mung mung

3.45	108,3
2,59	78,7
1,72	63,3
1,29	49,7
0,86	33,7

90

72,3
49,7
40,3
28,0

17
8

21,69
18,8
17

26,7 20,3 14,0 11,3 8,7

75 76 78 77 74 18

Glucose Ohne .Inhibitor '38,SmM^-OlKSCN 14 nMol

" ' '-- ' ·"■'■ Phloretin *

(mMol) l'E/min % Hem-. 1 E/min %Hem- ...IJE/mm %Hern-[S] muiig-" - mung" !mung

% Hemmung

78,8

80,6

82,7

83,9

	14 nMol Phloretin	% Hemmung	Hemmung der Uricase
	+ 38,5 mMol KSCN	75,5	wurde folgender Testansatz verwendet;
	Δ E/min	·' 75
3,45	27,7 ■- -	75
2,59	19;7 · '	78,5
1,72	15,7	83
1,29	10,7
0,86	5,7
	Beispiel 6

Es

96 mMol Boratpuffer, pH = 9,5, 114 — 7,6 μΜοΙ Harnsäure, 29 mU Uricase/ml, 0,5 Mol KSCN, ■ 0,02 mMol Xanthin.

Die Versuchsergebnisse zeigt Tabelle

Tabelle

Uricase Ohne Inhibitor 0,5 Mol KSCN

0,02jnMol Xanthin

(μΜοΙ) Λ E/min % Hem- Δ E/min- %Hem- .d E/min %Hem-[S] mung ' - mung mung

114 38 7,6

171 87 23

46	73	127	26	+ 0,02 mMol Xanthin	% Hemmung
16,3	81	66	25	Δ E/min	74
3,3	86	14	49	44,5	83
0,5 Mol	KSCN			15,0	87
3,0

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur enzymkinetischen Bestimmung der Konzentration eines Substrates, insbesondere eines in Blutserum oder Blutplasma gelösten oder suspendierten Substrates, bei welchem ein oder mehrere spezifische(s) Enzym(e) zugesetzt und die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Zugabe mindestens eines auf den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der enzymatischen Substratumsetzung abgestimmten kompetitiven Inhibitors das Verhältnis von Substratkonzentration c_s zur scheinbaren Michaelis-Konstanten K'_M auf < 0,2: 1 bringt und dadurch die Bedingungen einer Reaktion pseudo-erster Ordnung einstellt, die Mischung homogenisiert, in vorbestimmten Zeitabständen die Änderung eines für die Umsetzung spezifischen Reaktionsparameters bestimmt und daraus die Konzentration des nachzuweisenden Substrates ermittelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verhältnis von Substratkonzentration c_s zur scheinbaren Michaelis-Konstanten K'_M auf einen Wert < 0,05:1, Vorzugsweise < 0,01 : 1 bringt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als kompetitive Inhibitoren Stoffe verwendet, welche das Enzym und/ oder das Substrat reversibel binden, ohne chemisch umgesetzt zu werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als kompetitive Inhibitoren Stoffe verwendet, die einem der Ausgangsprodukte und/oder einem der Endprodukte der Meßreaktion chemisch ähnlich sind.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man über das Verhältnis der Konzentration von Substrat zu Enzym zu kompetitivem Inhibitor eine für analytische Zwecke geeignete Empfindlichkeit für die Messung einstellt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Empfindlichkeit der Messung durch Erhöhung der Enzymkonzentration und/oder Erhöhung der Reaktionstemperatur steigert.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Messung unmittelbar nach Homogenisieren der Mischung, Abwarten eines eventuell auftretenden Temperatursprungs und/oder Abklingen eines eventuell auftretenden Leerschieichs durchführt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man einen eventuell langer anhaltenden Leerschleich durch Aufnahme eines Leerwertes korrigiert.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man einen auf den Meßansatz abgestimmten Puffer verwendet, dessen pH-Wert mit dem pH-Geschwindigkeits-Maximum der Gesamtreaktionsgeschwindigkeit des Meßansatzes im wesentlichen übereinstimmt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man im Bereich der Reaktion pseudo-erster Ordnung bei allen Messungen in einer Analysen-Serie in einer gleichen Zeitspanne nach einer bestimmten gewählten Zeit nach Start der Reaktion mißt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man innerhalb einer Analysenserie nach der bestimmten gewählten Zeit eine Mitteilung der Meßwerte in der Zeitspanne für die Messung oder eine kinetische Zweipunktmessung am Anfang und Ende der Zeitspanne oder eine Bestimmung der Momentangeschwindigkeit zu einem festen Zeitpunkt vornimmt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Anfangsgeschwindigkeit bestimmt.

13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man den oder die kompetitiven Inhibitor(en) und das Enzym in einem auf den Meßansatz abgestimmten Puffer löst, diese Lösung dem Serum zusetzt und danach ein Cosubstrat zugibt.

14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung des zu bestimmenden Substrates verwendet, welche bereits einen kompetitiven Hemmeffekt zeigt.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man den kompetitiven Inhibitor in einer Menge zusetzt, welche eine 60- bis 95%ige Hemmung des Enzyms hervorruft.

16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Substratlösung verwendet, welche das Enzym bis zu 50% hemmt.

17. Reagenz zur enzymkinetischen Bestimmung der Konzentration eines Substrats nach den Ansprüchen 1 bis 16, enthaltend ein System zur enzymatischen Messung dieses Substrates, gekennzeichnet durch einen Gehalt an wenigstens einem kompetitiven Inhibitor für die zu messende Enzym-Substrat-Reaktion.

18. Reagenz nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß Enzym und Inhibitor in miteinander komplexierter Form vorliegen.

19. Reagenz nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß das System zur enzymatischen Messung eines Substrates ein für das Substrat spezifisches Enzym, einen auf dieses Enzym abgestimmten Puffer und gegebenenfalls Cofaktoren und/oder Hilfsenzyme und/oder Stabilisatoren enthält.