DE2428641A1 - Antibiotika und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Antibiotika und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
DR.-ING. WOLFRAM BUNTE ? A 0 8 6 U 1
D-BOOO MÜNCHEN 4Ο. BAUERBTRASSE 22 · FERNRUF (Οββ) S7 ββ 03 ■ TELEX 581020· ISAN D
POSTANSCHRIFTt Ο-βΟΟΟ MÜNCHEN 49, POSTFACH 7SO
München, den 14. Juni 1974 M/15283
BRISTOL-MYERS COMPANY, 345 Park Avenue, New York, New York, V.St.v.A.
Antibiotika und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein halbsynthetisches Derivat von 4'-Desoxyambutyrosin A mit der Formel:
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M/15283
CH2NH2
HO
HO -CH2
NH-G-CH-CH2-CH3NH2
O OH
wobei diese Verbindung als 5"-AmInO-^t5"-di-desoxyambutyrosin
A (V, BB-K 137) bekannt ist und die Formel:
CH2NH2
H2N-H2C
NH-C-CH-CH, -CH0 -NH,
Il I 2 2 2 O OH
V (BB-K137)
besitzt.
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Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "nichttoxisches
pharmazeutisch verträgliches Additionssalz" ein
Mono-, Di-, Tri-, Tetra- oder Pentasalz, das durch die Wechselwirkung
von 1 Mol der Verbindung V mit 1 bis 5 Mol einer nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Säure gebildet
wird. Zu diesen Säuren gehören Essigsäure, Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure,
Bromwasserstoffsäure, Ascorbinsäure, Apfelsäure und Zitronensäure und alle anderen Säuren, die allgemein zur
Herstellung von Salzen amin-enthaltender Pharmazeutika verwendet
werden·
Das folgende schematische Diagramm dient zur Erläuterung der
Aufeinanderfolge von Stufen, die bei der Herstellung der er findungs gemäßen Verbindungen durchschritten werden. Es ist
jedoch keine Beschränkung bezüglich der Typen von Reaktionsteilnehmern und Reagentien, die man zur Ausführung dieser
Stufen verwenden kann.
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1) 4·-Desoxyambutyrosin A (I)
Benzyloxycarbonylchlorid
VJl W
ω vx
IH2NH-C-O-CH2-C6H5
OH
Ha
CCHK-CH,-O-C-HII
K)
ro co ep
2) Verbindung II Tosylchlorid
HO
OO CO NJ
C6H5-CH2-O-C-NH J
SO2-O-H2C
It
NH-C-O-CH.-C-H,.
^ ο ο
I VJI
H-C-CH-CII2-CH2
3) Verbindung IH
NaN,
CH^-NH-C-O-CH2-C6H5
HO
O
I
C6H5-CH2-O-C-NH
NH-C-O-CH2-C6H5
Il
NH-C-CH-CH0-CH0
2I2
OH
NII
c«o
ο
I
IVa
Verbindung IV H2/Pd
Verbindung V
OO
cn
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung der Formel V oder ein pharmazeutisch verträgliches
Säureadditionssalz davon.
Zu weiteren bevorzugten AusfUhrungsformen gehören das Mono-
oder Polysulfatsalz der Verbindung der Formel V oder das Mono- oder Polyhydrat davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel
CH2NH2
NH-C-CH-CH2-CH2-NHj
O OH
oder eines nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß
man in aufeinanderfolgenden Stufen
A) A-'-Desoxyambutyrosin A mit einem aminoblockierenden
Acylierungsmittel, bevorzugt einem aminoblockierenden Acylierungsmittel, das durch Hydrierung abgespalten werden
kann, beispielsweise Benzyloxycarbonylchlorid oder seinem funktioneilen Äquivalent in einem Verhältnis von
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mindestens 4 Mol, Jedoch bevorzugt 4 bis 4,5 Mol Acylierungsmittel
pro Mol 4'-Desoxyambutyrosin A in einem polaren
Lösungsmittel, bevorzugt ausgewählt unter Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Dioxan,
1,2-Dimethoxyäthan, Methanol, Äthanol, V/asser, Aceton, Pyridin, N-(Niedrig)-alkyIpiperidin oder Mischungen davon,
jedoch bevorzugt 20 % wäßrigem Aceton, bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr 100C bis ungefähr 500C,
jedoch vorzugsweise bei ungefähr 250C, acyliert, um die
Verbindung der Formel
CH2NHB
NHB
NH-C-CH-CH5-CH,
Il j
Ji NH-B
ZI
herzustellen,
B) die Verbindung II mit einem Sulfonylhalogenid der Formel
B) die Verbindung II mit einem Sulfonylhalogenid der Formel
W - SO0 - Z
worin Z die Gruppen Chlor, Brom oder Jod bedeutet und W Niedrigalkyl"oder einen Arylrest der Formel
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M/15283
darstellt, worin R .und R gleich oder verschieden sind
und jeweils H, (Niedri^alkyl,-Nitro, (Niedri^alkoxy, Chlor,
Brom, Jod und dergleichen bedeuten, in einem Verhältnis von mindestens 1 Mol Sulfonylhalogenid, jedoch bevorzugt
1,0 bis 1,2 Mol pro Mol Verbindung II in Gegenwart einer überschüssigen Menge einer organischen Base, beispielsweise
einem tertiären Amin, wie Triäthylamin, jedoch bevorzugt Pyridin und gegebenenfalls in Gegenwart eines
inerten Lösungsmittels, wie Benzol, Toluol, Dimethylformamid, Aceton und dergleichen, bei einer Temperatur
im Bereich von ungefähr -100C bis ungefähr 150C, jedoch
bevorzugt im Bereich von O0C bis 100C,' acyliert, um die
Verbindung der Formel
CH2NHB
• NHB
W-SO-O-H2C
NH-C-CH-CH0-CH0
Il I 2I2
ο oh
NH-B
III
OH
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Jo
herzustellen, worin B und W die obigen Bedeutungen besitzen;
C) Verbindung III mit einem großen Überschuß eines Alkalimetallazids,
beispielsweise Natrium- oder Kaliumazid in einem wäßrigen organischen Lösungsmittel, wie Aceton,
Dimethylformamid, Dimethylacetamid und dergleichen mit
ungefähr 5 bis 10 % Wasser bei erhöhten Temperaturen, vorzugsweise bei ungefähr 80 bis 1200C mindestens 4 Std.
behandelt, um die Verbindung der Formel
CH2NHB
NH-C-CH-CH2-CH2 OH
NH-B
herzustellen, und
D) Verbindung IV mit Wasserstoff in Gegenwart eines Metallkatalysators,
bevorzugt ausgewählt unter Palladium, Platin, Raney-Nickel, Rhodium, Ruthenium und Nickel, Jedoch
bevorzugt Palladium und am bevorzugtesten Palladium auf Aktivkohle in einem aus Wasser bestehenden und mit
Wasser mischbaren Lösungsmittel bestehenden Lösungsmittel·
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system, vorzugsweise ausgewählt unter Wasser und Dioxan, Tetrahydrofuran, Athylenglykoldimethyläther, Propylenglykoldimethyläther
oder dergleichen, jedoch bevorzugt 1:1 Wasser-Äthanol, hydriert, um die Verbindung der
Formel Y herzustellen und gegebenenfalls diese Verbindung in ein nicht-toxisches, pharmazeutisch verträgliches
Säureadditionssalz davon umwandelt.
Es ist.für den Fachmann offensichtlich, daß beim obigen Verfahren
zur Acylierung der Aminfunktionen der Zwischenverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung auch andere Mittel
verwendet werden können. Diese Erfindung schließt alle solchen Acylierungsmittel ein, die zu labilen Aminblockierungsgruppen
führen, wobei diese labilen Blockierungsgruppen bei der Synthese von Peptiden allgemein verwendet werden.
Die labilen Blockierungsgruppen müssen leicht durch aus dem Stand der Technik bekannte Methoden entfernbar sein.
Beispiele solcher labiler Blockierungsgruppen und deren Entfernung können dem Übersichtartikel von A. Kapoor,
J. Pharm. Sciences 59, Seiten 1-27 (1970) entnommen werden. Zu den funktioneilen Äquivalenten als Acylierungsmittel
für primäre Aminogruppen· gehören die entsprechenden Carbonsäurechloride -bromide, -säureanhydride einschl. gemischter
Anhydride und insbesondere der .gemischten Anhydride, die aus stärkeren Säuren, wie den niedrigeren aliphatischen
Monoestern der Kohlensäure, den Alkyl- und Arylsulfonsäuren und den sterisch gehinderteren Säuren, wie Diphenylessigsäure,
hergestellt sind. Man kann auch ein Säureazid oder e inen aktiven Ester oder Thioester (beispielsweise mit
p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, Thiophenol, Thioessigsäure)
verwenden oder die freie Säure selbst kann mit dem k'-Desoxyambutyrosin Α-Derivat (I) gekuppelt werden, nachdem
man zuerst diese freie Säure mit N,N'-Dimethylchlorforminiumchlorid
(GB-PS 1 008 170 und Novak und Weichet, Experientia XXI/6, 360 (1965)) umsetzt, oder durch Verwendung
von Enzymen oder eines NjN'-Carbonyldiimidazols oder
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eines N,N'-Carbonylditriazols (Sheehan und Hess,
J. Amer. Chem. Soc, 77, IO67 (1955)) "oder eines Alkinylamin-Reagenzes
(R. Buijile und H.G. Viehe, Angew.Chem., International Edition 3, 582 (1964)), oder eines Ketenimin-Reagenzes
(CL. Stevens und M.E. Monk, J. Amer.Chem. Soc. 80, 4065 (1958)) oder eines Isoxazoliumsalz-Reagenzes
(R.B.Woodward, R.A.Olofson und H.Mayer, J.Amer.Chem.Soc.,
83, 1010 (I96I). Ein weiteres Äquivalent des Säurechlorids
ist ein entsprechendes Azolid, d.h. ein Amid der entsprechenden Säure, deren Amidstickstoff Glied eines
quasi-aromatischen 5-Rings ist, der mindestens zwei Stickstoffatome
enthält, d.h. Imidazol, Pyrazol, die Triazole, Benzimidazol, Benzotriazol und deren substituierte Derivate.
Als Beispiel für die'allgemeine Methode zur Herstellung
eines Azolids wird Ν,Ν'-Carbonyld^imidazol mit
einer Carbonsäure in äquimolaren Verhältnissen bei Raumtemperatur in Tetrahydrofuran, Chloroform, Dimethylformamid
oder einem ähnlichen inerten Lösungsmittel umgesetzt, wobei das Carbonsäureimidazolid in praktisch quantitativer Ausbeute
unter Freisetzung von Kohlenstoffdioxyd und einem Mol Imidazol gebildet wird. Dicarbonsäuren führen zu Diimidazoliden.
Das Nebenprodukt Imidazol fällt aus und kann abgetrennt werden und das Imidazolid kann isoliert werden, jedoch
ist dies nicht wesentlich. Diese Reaktionen sind aus dem Stand der Technik wohl bekannt (US-PSen Nr. 3 079 314,
3 117 126 und 3 129 224 und GB-PSen Nr. 932 644, 957 570 und
959 054).
Der im vorliegenden gebrauchte Begriff "(hiedrig)', beispielsweise
bei Niedrig)"-alkyl oder '^TiedrigJ'-alkoxy bedeutet
eine gesättigte gerade oder verzweigte Kohlenstoffkette mit
1 bis 6 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Methyl, Äthyl, Isopropyl, Äthoxy, Methoxy, Isopropoxy und dergleichen.
Zu den neuen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung go-
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hören die Verbindungen der Formel IV, worin B eine Aminoblockierungsgruppe,
die bevorzugt durch Hydrierung abgespalten werden kann und noch bevorzugter die Benzyloxycarbonylgruppe
oder ihr funktionelles Äquivalent und insbesondere die Benzyloxycarbonylgruppe bedeutet.
Herstellung von 4'-Desoxyambutyrosin A
Der antibiotische Komplex Bu-1975 wird aus Bacillus circulans
subsp. n. croceus, Bacillus circulans subsp. n. proteophilus oder Bacillus circulans subsp. n. biotinicus fermentiert.
Die zwei neuen Komponenten des Komplexes sind 4f-Desoxyambutyrosin
A (Ib) der Formel
)H
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land 4I-Desoxyambutyrosin B (Ic) der Formel
CK2IIH2
OH OH
Die Komponente Ib ist chemisch als N -(4-Amino-2-hydroxybutyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,4,6-tri-desoxy-D-glucopyranosyl)
■ 5-0-D-xylofuranosyl-2-desoxystreptamin bekannt.
Die Komponente Ic ist chemisch als N -(4-Amino-2-hydroxybutyryl)-4-0-(2,6-diamino-2,4,6-tri-desoxy-D-glucopyranosyl)
5-0-D-ribofuranosyl-2-desoxystreptamin
bekannt.
Der antibiotische Komplex, Bu-1975, wurde aus der Fermentationsbrühe
der drei Stämme von Bacillus circulans isoliert, die in der Bristol-Banyu culture collection als Stämme Nr.
C308-B4, C436-B1 und C532-B2 bezeichnet sind. Das Antibiotikum ist ein Komplex aus mindestens fünf biowirksamen
Komponenten: A1, A«, B, Ib und Ic. Die Komponenten A1 und A2
wurden als Ambutyrosine A und B identifiziert (U.S.-Patent 3 541 078 und Tetrahedron Letters, 28, Seiten 2625-2628
(1971)) und die Komponente B war ein lösungsmittelextrahierbares Antibiotikum mit peptidartigen Eigenschaften.
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Die Komponenten Ib und Ic sind neue Aminoglycosid-Antibiotika. Es wurde festgestellt, daß Ib aus D-Xylose, 2-Desoxystreptamin,
L-(-)-Y-Amino-a-hydroxybuttersäure und 2,6-Diamino-2f4,6-tri-desoxy-D-glucose,
einem neuen Desoxyaminozucker, zusammengesetzt ist und wird als 4'Desoxyambutyrosin
A bezeichnet.
Es wurde gefunden, daß Ic aus D-Ribose, 2-Desoxystreptamin, L-(-)-Y-Amino-a-hydroxybuttersäure und 2,6-Diamino-2,4,6-tri-desoxy-D-glucose
zusammengesetzt ist und es handelt sich daher hierbei um 4'-Desoxyambutyrosin B.
Der Komplex wird aus einer der drei Unterklassen des Mikroorganismus
Bacillus circulans fermentiert.
Eine Kultur von jedem lebenden Organismus wurde in der
American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockvllle,- Maryland 20852, hinterlegt und wurde mit den
folgenden Namen und'Katalognummern versehen.
Bacillus circulans subsp. n., croceus (Stamm Nr. C308-B4) A.T.C.C. 21820. ;
Bacillus circulans subsp. n. proteophilus (Stamm Nr. C436-B1) A.T.C.C. 21821.
Bacillus circulans .subsp. n. biotinicus (Stamm Nr. C532-B2)
A.T.C.C. 21822.
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Antibiotikum-Herstellung
Eine gut gewachsene Agar-Schrägkultur des Bu-1975-produzierenden
Organismus wird verwendet, um das Saatmedium zu inokulieren, das 1,5 % Glucose, 0,5 % Polypepton, 0,2 % Hefeextrakt,
0,05 % K2HPO4 und 0,05 % MgSO^·7H2O besitzt, wobei
der pH vor der Sterilisation auf 7»5 eingestellt wird. Die Saatkultur wird bei 37°C 24 Std. auf einer Rotations-Schüttelvorrichtung
(250 Upm) inkubiert und 2 ml der Züchtung werden auf 100 ml des Fermentationsmediums in
einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben übertragen, das eine Zusammensetzung aus 3 % Sojabohnenmehl, 2 % Maisstärke,
1 % Kalziumcarbonat und 0,33 % MgSO4*7H2O besitzt. Die
Produktion an Antibiotikum erreichte nach 3 bis 6 Tage^/
Schütteln bei 28°C ein Maximum.
Die antibi-otische Aktivität in der Fermentationsbrühe wird
durch den. Papiers ehe iben-Agar-Diffus ions te st unter Verwendung
von Bacillus subtilis PC1219 und Klebsiella
pneumoniae A20680 bestimmt. Alle Komponenten des Bu-1975-Komplexes
(A1, A2, B Ib und Ic) zeigten"Aktivität gegenüber
B. subtilis PCI219, jedoch waren nur zwei Komponenten,
Ib und Ic, wirksam gegen K. pneumoniae A20680.
Die Produktivität der Komponenten Ib und Ic bezüglich der anderen Komponenten war unter den Stämmen verschieden. Bei
der Schüttelkolben-Fermentation produzierte der Stamm C532-B2 50 bis 100 γ/ml der Komponenten I, was etwa 30 bis
50 % der durch B.subtilis festgestellten gesamten Bioaktivität
bedeutet. Andere Stämme waren weniger produktiv an Komponenten I als der Stamm C532-B2.
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Die geerntete Brühe wird unter Verwendung von Filterhilfe filtriert und die Bioaktivität im Piltrat (pH 8,0) wird
durch eine Säule Amberlite IRC-50, (NH^-Form) absorbiert.
Man wäscht die Säule mit Wasser und entwickelt dann mit 1n NH^OH-Lösung. Die aktiven Eluate vereinigt man, konzentriert
im Vakuum und extrahiert mit n-Butanol, um die Komponente B im Konzentrat zu entfernen. Die wäßrige
Schicht wird abgetrennt und auf eine Säule mit Amberlite CG-50 (NH^-Form) aufgegeben. Man wäscht die Säule mit
Wasser und anschließend n/4 NH^OH-Lösung und eluiert die
Aktivität mit n/2 NH4OH, wobei das Eluat fraktioniert aufj
gefangen wird. · |
■ Die aktiven Komponenten werden in der Reihenfolge AP, A1, j
j Ib und Ic eluiert, wobei Jedoch eine beträchtliche Überlappung
; der Komponenten auftritt und die völlige Abtrennung jeder :
! Komponente wurde errreicht, nachdem man die GG-50-Säulenchromator
: graphie wiederholte.
Wie in Tabelle I gezeigt, wurden zwei TLC (Dünnschichtchromatographie)
-Systeme, nämlich S-110 und S-II7 als geeignet
gefunden, die Komponenten A1 und A2 von den Komponenten
Ib und Ic zu differenzieren und das System S-II5
erlaubte bei 16-stündiger Entwicklung die Trennung des A1
von A2 und des Ib von Ic.
Die Komponenten A2 und A wurden als Ambutyrosine A bzw. B*
identifiziert und zwar durch die physiochemischen Eigenschaften (TLC, IR und NMR) und das antibakterielle Spektrum.
Die folgenden Beschreibungen sind in der Hauptsache auf die Komponenten Ib und Ic des antibiotischen Bu-1975 beschränkt.
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*Der antibiotische Komplex, der als Ambutyrosine A und B
identifiziert wurde, wurde im Screening Programm isoliert und als Referenz-Substanz in der vorliegenden Untersuchung
verwendet. ' \
- 18 -
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TAB5IIS I
Dünnschichtchromatographie der Bu-1 | 975 Komponenten | A1 A2 | Ib | Ic | Ί528 | |
System | Platte ' Lösungsmittelsystem | Rf | 0,41 0,41 | 0,51 | 0,51 | |
S-110* | Silicagel ' CHCl3-MeOH-SeJSNH4OH-H2O (1:4:2:1) |
■ S-117 Silicagel CHCl,-MeOH-28?$NH,OH 0,20 0,20 0,26 0,26
^ . (1:3:2)
VO
<-> λ λ erJLJi. «τ j_^„„^„ λ
Λ(ττητ n/r-/-\rr oor/τιτττ ηττ "ζ rrCm « ^,CVH
c —Cm ,-. r-CIH
S-115** Aluminiumoxyd CHCl5-MeOH-285SHH4OH 3,7Cm 0,2cm 5,3°m 0,5
(2:1:1)
* dreimalige Entwicklung
** 16 Std. Entwicklung; der Ort ist in cm vom Ausgangspunkt angegeben.
Die Komponenten'Ib und Ic sind weiße, amorphe feste Basen,
die in Wasser leicht löslich, etwas löslich in Methanol und Äthanol und praktisch unlöslich in n-Butanol, Aceton und
anderen organischen Lösungsmitteln sind. Beide Komponenten geben mit Ninhydrin- und Anthron-Reagentien positive Reaktionen, sprechen jedoch nicht auf Tollens-, Fehling-und
Sakaguchi-Reaktionen an.
anderen organischen Lösungsmitteln sind. Beide Komponenten geben mit Ninhydrin- und Anthron-Reagentien positive Reaktionen, sprechen jedoch nicht auf Tollens-, Fehling-und
Sakaguchi-Reaktionen an.
Eine Analysenprobe von Ib wurde in Form des Dicarbonats
isoliert, das bei ungefähr 1550C (Zersetzung) schmilzt
O]2J5= +26,7° (c 1,0, Wasser) und das als C21 H41 N5O1 Λ
analysiert wurde.
Analyse:
41 | C | V | 6 | H | N | 55 | |
ber.: | 41 | ,63 | ■ 6 | ,83 | 10, | 47 | |
gef.: | ,52 | ,47 | 10, | ||||
Man erhält das Tetra-N-acetat vom Schmelzpunkt >250 C,
[cc]D »5 ■ +26,0° (c 0,5,.Wasser), das als C21H41N5O11
(C2H2O)4*3/2 H2O analysiert wird.
Analyse:
C | 40 | 7 | H | 9 | N | * | |
ber.: | 47, | 30 | 7 | ,13 | 9 | ,53 | |
gef.: | 47, | ,47 | ,65 | ||||
Die Komponente Ic schmilzt bei 172 bis 1780C (Zersetzung)
[a]D 5 m +30,0° (c 1,0, Wasser) und wird als
C21H41N5O11^H2CO, analysiert.
Analyse:
- | 20 | C | - | 63 | 6 | H | N | * | |
ber.: | 41, | 22 | 6 | ,83 | 10,55 | ||||
gef.: | 41, | ,67. | 10,82 | ||||||
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Es wurde auch das Tetra-N-acetat von Ic hergestellt, das
einen Schmelzpunkt >250°C besitzt, [a]D =» +43° (c 0,5, Wasser), und das als
C21 H^1 N5O1 ^ · (C2H2O)^*H2O analysiert wird';
Analyse: ,·
C | 99 | 7, | H | 9, | N | |
ber.: | 47, | 09 | 7, | 08 | 9, | 65 |
gef.: | 48, | 20 | 42 | |||
Die Antibiotika Ib und Ic zeigen eine Endabsorption nur
im ultra-violetten bereich. Die Infrarotspektren (IR)
von Ib und Ic sind denen des Ambutyrosin A und B sehr ähnlich. Das kernmagnetische Resonanzspektrum (NMR) von Ib
zeigt zwei anomere Protonen bei cT5,28'(s) und 6,10 (d,
J = 3,5 Hz) ppm, wobei das Signal bei tieferem Feld sich von dem im-NMR-Spektrum von Ic unterscheidet, das die
anomeren Protonen bei cT5,28 (s) und 5,98 (d, J =» 3,5 Hz)
ppm zeigt. Gleiche Unterschiede im Chemical Shift der zweiten anonreren Protonen wurden in den NMR-Spektren von
Ambutyrosin A und B gesehen. Die NMR-Vergleichsdaten von
Ib und Ic zusammen mit Ambutyrosin A und B sind in Tablle II dargestellt. In der Tabelle ist auch gezeigt, daß das
Verhältnis der integralen Protonen bei den höheren (cfi,2
bis 2,4 ppm) und den niedrigeren (cT 2,5 bis 4,4 ppm)
Methylen-Methin-Bereichen 6:18 für Ib und Ic beträgt, was im Gegensatz zum Verhältnis von 4:19 für Ambutyrosin A und B
steht.
- 21 -
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Vergleichende kernmagnetische Resonanz-Daten (NMR) der Komponenten S
Ib und Ic mit den Ambutyrosinen A und B
(60 MHz, in D2O pH 2,0)
Chemical Shift · Ä
(chemische Verschiebung) Anzahl von Protonen und Typ von Signalen
I | (cT, ppm) | 6H 18H |
Ib- | - | (s) | Ic | * | 1H (s) | -Ambutyrosin A | Ambutyrosin B | |
409882 | ro ro |
1,2 - 2,4 2,5 - 5,4 |
(m) (m) |
,J=3, | 6H (m) 18H (in) |
1H (d, J»3,5Hz) ' 5Hz) |
4H (m) 19H (m) |
4H (m) 19H (m) |
|||
I | 5,16 | 1H | 1H (s) | JH (s) | |||||||
co OT |
5,28 | 1H(d | — | - | |||||||
5,98 6,10 |
1H (d,J=3,6Hz) | 1H (d, J=3,6Hz) | |||||||||
Beispiele für die Herstellung und Reinigung von 4'-Desoxyambutyrosin
A
Man verwendet eine Agar-Schrägkultur von B. circulans Stamm
C532-B2, um 100 ml des Mediums Nr. YGP-1 (1,5 % Glucose,
0,5 % Polypepton, 0,2 % Hefeextrakt, 0,05 % K2HPO^ und
0,05 %. MgSO^H2O) in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben zu
inokulieren. Man inkubiert die Saatkultur 24 Std. bei 37°C auf einer Rotations-Schüttelvorrichtung (250 Upm) und gibt
Jeweils 2 ml des Wachstums auf 100 ml Fermentationsmedium Nr. 132 (3 % Sojabohnenmehl, 2 % Maisstärke, 1 % CaCO3 und
0,33 % MgS04*7H20). Nach 6-tägigem Schütteln der Kultur
bei 280C zeigt der Papierscheibentest (8 mm) der Fermentationsbrühe,
eine Inhibitionszone von 25 mm auf einer B. subtiles PCI219-Platte und eine 16 nun 2one auf einer
K. pneumoniae A20680-Platte. Die vereinigte Fermentationsbrühe (200 Kolben, I7 Ltr.) wird filtriert und durch eine
Säule von Amberlite IRC-50 (NH^-Form, 500 ml) absorbiert.
Man wäscht die Säule mit Wasser und eluiert dann mit 2,2 Ltr. 1n NH^OH-Lösung. Die aktiven Eluate werden vereinigt, im
Vakuum konzentriert und mit n-Butanol extrahiert. Eindampfen
des Butanolextrakts ergibt 1,3 -g rohen Feststoff (Komponente B)
Die wäßrige Schicht wird"im Vakuum auf ungefähr 30 ml konzentriert,
die auf eine Säule Amberlite CG-5Ö (NH^-Form) ' aufgegeben werden. Man wäscht die Säule nacheinander mit
500 ml ri/10 NH^OH und 700ml n/4 NH^OH und die Bioaktivität
eluiert man mit n/2 NH^OH-Lösung. Das Eluat wird fraktioniert,
gesammelt und durch Biountersuchung, Ninhydrin-Reaktion und TLC markiert. Die aktiven Komponenten werden in der Reihenfolge
A2, A1, Ib und Ic eluiert.
- 23 -
409882/1196
M/15283
Röhren- nummern |
Volumen | A2 A1 |
TLC | Verhältnis, bestimmt zu |
Feststoff |
69-87 88-111 112-159 |
200 ml· 250 ml 200 ml |
+ A1 + Ic Ib |
4:6 3:7 |
228 mg 193 mg 201 mg |
|
Wiederholte Säulenchromatographie (CG-50, NH^+-Form) der
zweiten und dritten Feststoffe ergibt reine Präparationen von 120 mg Ic und 180 mg Ib.
Man untersucht B.circulans, Stamm C532-B2-H48, der durch
die Monosporen-Isolationstechnik aus dem Ausgangsstamm C532-B2 erhalten wurde. Die gleiche Schüttelkolben-Fermentation
wie in Beispiel 1 ergibt eine maximale Wirksamkeit am 5.Tag (pH 9*3), die eine 30' mm Inhibierungszone
auf einer B. subtilis PCI 219-Platte und eine 21 mm
Zone auf einer K. pneumoniae' A20680-Platte zeigt. Der Untersuchungswert zeigt an, daß die Brühe ungefähr 150 γ/ml
an Komponente A und ungefähr 100 γ/ml an Komponenten Ib und
Ic enthält.
Man verwendet B. circulans, Stamm C308-B4 als Saatkultur und führt die Schüttelkolben-Fermentation wie in Beispiel 1
durch. Die geerntete Brühe (18 Ltr.) enthält 75 mg der Komponente A (A1 4- A2), 6,4 g der Komponente B und 75 mg
der Komponenten Ib und Ic.
- 24 -
409882/Π96
M/15283 .
B e i s ρ i e 1
Man verwendet B. circulans Stamm C436-B1 als Saatkultur und
führt die Schütielkolben-Fermentation wip in Beispiel 1
durch. Die geerntete Brühe (20 Ltr.) enthält 71 mg Komponente
A (A-J + A2), 4,1 g Komponente B und 66 mg der Komponenten
Ib und Ic.
Man führt ein submerses und belüftetes Fermentationsexperiment in 20 Ltr. Fermentorbehältern durch. Man verwendet B. circulans
Stamm C532-B2-H48, um 10 Ltr. Medium Nr. YGP-1 (pH 7,2 nach
Sterilisation) zu inokulieren. Man rührt die Saatkultur mit 250 Upm bei 35°C unter einer Belüftungsrate von 10 l/min ..
und erhält nach 11 Std. (pH 6,0) ein heftiges Wachstum. Nach 11,5 Std. werden 1 Ltr. der Saatkultur auf. 10 Ltr. sterilisiertes
Produktionsmedium Nr. 132 übertragen. Die Fermentation wird bei 28°C mit einer BeIUftungsrate von 11,5 l/min
durchgeführt. Häufige Zugaben von Silikonantischaummitteln (KM-70) sind erforderlich, um. das übermäßige Schäumen unter
Kontrolle zu halten. Nach 70 Std. (pH 8,2) erhält man die Spitzenwirksamkeit und die differentielle Untersuchung unter
Verwendung von B. subtilis PCI 219 und K. pneumoniae A20680 zeigt 79 γ/ml Komponente A (A1 + A2) und 49 γ/ml an Komponenten
Ib und Ic
Eine Fermentation in größerem Ansatz wird in Pilotplant-Tanks
durchgeführt, die die Fermentierung von 100 Ltr. und 300 Ltr. Volumen erlauben. Die Fermentationsbedingungen sind wie die
in Beispiel 5 mit der Ausnahme, daß die RUhrrate 180 Upm beträgt; pH =: 8,7. . ... . ....
- 25 409882/1196
Die Brühenwirksamkeit erreicht 95 γ/ml für Komponente A
und 45 γ/ml für die Komponenten Ib und Ic.
Man filtriert eine Brühe, die aus zwei 300 Ltr.-Tanks (650 Ltr.) geerntet wurde und die ungefähr 20 γ/ml an
Komponente C enthält, bei pH 8,5 und rührt mit 8,6 Ltr. Amberlite IRC-50 (NH4 +-Form). Man trennt das Harz ab,
wäscht mit 80 Ltr. Wasser und eluiert dann chargenweise mit 1n NH^OH-Lösung (10 Ltr. χ 3). Die Eluate werden vereinigt
und im Vakuum bei 35 bis 400C auf ein Volumen von ungefähr 500 ml konzentriert, das 11,3 g Einheiten an
Komponente A und 7,3 g Einheiten an Komponenten Ib und Ic enthält. Das Konzentrat wird mit n-Butanol extrahiert, um
verunreinigte Komponente B zu entfernen und die wäßrige Schicht wird mit 200 ml Amberlite CG-5to (NH.+-Form) gerührt.
Man trennt das Harz ab, wäscht mit 5 Ltr. Wasser und gibt es-dann auf das obere Ende einer CG-50-Säule
(NH4 +-Form, I500 ml). Die Säule wird mit 7 Ltr. n/4 NH. OH
entwickelt. Man eluiert die Aktivität mit n/2 NH4OH und
sammelt die Eluate fraktioniert auf, wobei man 7,2 g Komponente A aus den Röhren Nr. 491-800 und 4,2 g an Komponente
Ia und Ib aus den Röhren Nr. 93-1-1370 erhält. Eine Mischung der Komponenten A und Ib und Ic, 1,8g, gewinnt man aus
den Röhren Nr. 801-930.
Amberlite IRC-50 ist die Handelsbezeichnung für ein schwachsaures kationisches Austauscherharz eines Carbonsäure-PoIymethacryl-Typs.
Amberlite CG-50 ist die Handelsbezeichnung für ein schwachsaures Kationen-Austauscherharz eines Carbonsäure-Polymethacryl-Typs.
Γ ,;
- 26 -
409882/1196
Die erfindungsgemäße Verbindung ist wertvoll als antibakterielles Mittel, Beifuttermittel "bei Tierfutter,
therapeutisches Mittel bei Geflügel und. Tieren, sowie dem Menschen und ist insbesonderte wertvoll'bei der Behandlung
infektiöser Erkrankungen, die durch gram-positive und gram-negative Bakterien verursacht sind.
Bei oraler Verabreichung ist- die neue erfindungsgemäße Verbindung
brauchbar als Zusatzbehandlung zur präoperativen Sterilisation des Darms. Sowohl die aerobe als auch die
anaerobe Flora, die gegenüber diesen Arzneimitteln empfindlich sind, werden im Dickdarm vermindert. In Verbindung mit
geeigneter mechanischer Reinigung ist sie brauchbar bei der Vorbereitung von Dickdarmoperationen.
Das durch die vorliegende Erfindung geschaffene neue Medikament
kann als pharmazeutisches Mittel formuliert werden, das außer dem aktiven Bestandteil einen pharmazeutisch
verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel enthält. Die Verbindung kann sowohl oral als auch parenteral verabreicht
werden. Die pharmazeutische Präparation kann in fester Form vorliegen, wie als Kapseln, Tabletten oder
Dragees, oder in flüssiger Form, wie Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Bei der Behandlung bakterieller Infektionen
beim Menschen kann die erfindungsgemäße Verbindung parenteral
in einer wirksamen Menge von ungefähr 250 mg bis ungefähr 3000 mg/Tag in aufgeteilten Dosen drei- oder viermal
täglich verabreicht werden. Im allgemeinen ist die Verbindung wirksam, wenn sie in einer Dosierung von ungefähr
5,0 bis 7,5 mg/kg Körpergewicht alle 12 Std. verabreicht wird. So wird sie bei Menschen in Dosierungseinheiten verabreicht,
die beispielsweise 125, 250 oder 500 mg aktiven Bestandteil mit 'geeigneten physiologisch verträglichen
Trägern oder Verdünnungsmitteln enthalten.
- 27 4098 82/1196
Tabelle III zeigt die vergleichenden in vitro antimikrobiellen
Aktivitäten der Verbindung V im Vergleich mit 4'-Desoxyambutyrosin A (I) gegen eine Vielzahl gram-positi
ver und gram-negativer Bakterien. '
Die MICs (minimale Hemmkonzentrationen) werden durch die
Steers Agar-Verdünnungsmethode auf Nähragarmedium erhalten
und sind in γ/ml angegeben.
- 28 -
409882/1196
BBRI-Code
Organismus
1
! I |
I
IV5 |
Pa-1 | P.aefuginosa | D-15 | |
i I I |
VD | Pa-2 | η | ||
-fc"S | i | I | Pa-3 | η | Η9 D-113 |
♦ O |
i | Pa-4 | π | Η9 D-113 | |
CO | j | ||||
OO | Pa-5 | η | |||
cx> ro |
i 1 ι |
Pa-6 | η | ||
i
j |
Pa-7 | π | |||
g f^ | i | Pa-9 | η | YaIe | |
(Sj
CO |
i | Pa-10 | π | ||
I
i |
Pa-11 | η | |||
j I |
Pa-12 | η | |||
I | Pa-13 | π | |||
t | Pa-15 | It | |||
Pa-16 | η | #130 | |||
Pa-17 | η | Ε6 D-114 | |||
Pa-19 | η | ||||
Pa-20 | η | ||||
Pa-21 | η | ||||
Minimale Hemiakon- zentration (MIC) (Y /ml) |
I | MIC-Ver- hältnis I/V |
UI
N) CD VX |
0 | |
V | 1,6 | ||||
1,6 | 6,3 | 1 | |||
A9923 | 6,3 | .0,2 | 1 | ||
A993O | 0,2 | 25 | 1 | ||
12,5 | 6,3 | 2 | |||
A15150 | 6,3 | 3,1 | 1 | ||
A15194 | 3,1 | 6.3. | 1 | ||
A9843 | 6,3 | 6,3 | 1 | ji | |
6,3 | 6,3 | 1 ί | OO | ||
A20479 | 6,3 | 6,3 | 1 | CD | |
A20616 | 12,5 | 100 | 1/2 | ||
A2O653 | 25 | 12,5 | 4 | ||
A9843-A | 6,3 | 3,1 | 2 | ||
A2O717 | 6,3 | 1,6 | 1/2 | ||
A20178 | 3,1 | 3,1 | 1/2 | ||
3,1 | 0,8 | 1 | |||
A20229 | 1,6 | . 3,1 | 1/2 | ||
A2O325 | 3,1 | 6,3 | 1 | ||
A20601 | 6,3 | 1 |
TABELLE III (Portsetzung):
I VjI |
BBRI-Code | Organismus | Α2Ο741 | Minimale tration (Ύ |
25 | Eemmkonzen- (MIC) /ml) |
MlC-Verhält- nis I/V |
|
O | Α20896 | V | 12,5 | I | ||||
I | Pa-23 | P. aeruginosa | Α20897 | 50 | 12,5 | f/2 | ||
Pa-24 | It | 6,3 | 12,5 | 1 | ||||
Pa-25 | Il | Α2Ο62Ο | 1,6 | 50 | 1 | |||
O | Pa-26 | " Ps. 32 | Α20817 | 0,8 | 6,3 | 1 | ||
(O
00 |
Pl-1 | P. Multophilia | Α2Ο355 | 0,8 | 0,8 | 1/2 | ||
00 | Pe-1 | P. melanogenum | Α2Ο358 | 3,1 | 0,8 | 1 | ||
■-ν | Px-1 | Pseudomonasr sp. | Α20368 | 6,3 | 0,4 | 1/2 | ||
Il | Px-2 | Il | Α20598 . | 12,5 | 1,6 * | 1/2 | ||
UJ co |
Px-3 | η | Α20600 | 3,1 | 12,5 | 2 | ||
Px-4 | π | Α2Ο6Ο3 | 6,3 | 12,5 | 1 | |||
PX-5 | ti | Α20618 | >100 | 3,1 | -"Ί | |||
PX-6 | π | Α2Ο594 | 6,3 | 6,3 | 1 | |||
Px-7 | π | Α2Ο595 | 12,5 | yioo | - | |||
Px-8 | η | Α2Ο621 | >100 | 6,3 | 1 | |||
Px-9 | η | 0,8 | 12,5 | 1 | ||||
Px-10 | η | Α15119 | 0,8 | >100 | - | |||
Ec-1 | E. coli NIHJ | Α2Ο363 | 0,8 | 0,8 | 1 | |||
Ec-3 | " Juni | 0,8 | 1 | |||||
Ec-5 | η ML-163O | 0,8 | 1 | |||||
TABSLIS III (Fortsetzung):
BBRI-Code | Organismus | - | E. coli | ■ * |
Minimale | Hemmkonzen- | I | MIC-Verhältnis |
" ' K-12 | A20365 | tration | (MIC) M) |
0,1 | I/V | |||
" .' NR79/W677 | A9632 | Y | 0,4 | |||||
Ec-7 | " JR35/C6OO | A20664 | 0,2 | 0,8 | . 1/2 | |||
Ec-8 | " W677 ' | A20665 | 0,8 | 0,2 | 1/2 | |||
Ec-9 | ■" JR66/V677 | A20684 | 1,6 | 0,4 | 1/2 | |||
Ec-10 | fl | A2068.3 | 0,4 | 0,8 | 1/2 | |||
Ec-52 | π | A9675 | 1,6 | 0,4 | 1/4 | |||
Ec-53 | π | A20766 | 1,6 | 0,8 .. | 1/2 | |||
Ec-58 | η | A20898 | 0,4 | 3,1 | 1 | |||
Ec-59 | E. Cloacae | A20895 | 0,8 | 0,4 | 1 O | |||
Ec-60 | π | A20364 | 6,3 | 0,4 | 1/2 | |||
Ec-62 | K. Pneumoniae Ό—11 | A2O65O | 0,4 | 1,6 | 1 * | |||
El-3 | η Typ 22 | 0,8 | 0,2 | ,· 1/2 | ||||
El-4 | S. Marcescens | A20680 | 3,1 | 0,8 | 1/2 | |||
Kp-1 | P. vulgaris | A20019 | 0,2 | 0,8 . | 1 | |||
Kp-8 | P. morganii | AO436 | 0,8 | 0,2 | 1 | |||
Sm-1 | P. mirabilis | A9553 | 0,8 | 0,8 | 1 | |||
Py-1 | Providencia | A9554 | 0,4 | 0,4 | 1/2 | |||
Pg-1 | A20894 | 1,6 | 25 | 1/2 | ||||
Pm-1 | 0,8 | 1/2 | ||||||
Py-1 | 6,3 | 4 |
K) CO CD
TABELLE III (Fortsetzung):
BBRI-Code | Organismus | 209Ρ | • | • | • | 607(KM-R) | Minimale | V | Hemiikonzentration | I | |
607(KM, SM-R) | (MIC) | 0,2 | (Ύ/ml) | 0,2 | |||||||
phi ei | 0,8 | 0,8 | |||||||||
Sa-2 | S. aureus Smith | B. subtilis >PCI 219 | A2O239 | 0,4 | 0,8 | ||||||
Sa-4 | rt | A15O36 | 0,4 | 0,4 | |||||||
Sa-10 | n | A2O24O | 0,4 | 0,8 | |||||||
O | ' Sa-47 | η | Mycobacterium 607 | A20240 | 0,8 | 1,6 | |||||
CD
OO |
Sa-48 | It | π | <0,05 | <0,05 | ||||||
OC K. ^ |
, Sa-49 | If | It | ||||||||
v» Bs-1 | π | 0,4 | 0,2 | ||||||||
i | ro | >100 | >100 | ||||||||
* | 1 M6-1 | >100 | >100 | ||||||||
CO | M6-2 | 0,2 | 0,2 | ||||||||
M6-3 | |||||||||||
Mp-1 | |||||||||||
MIC-Verhältnis I/V
1 1 2 1 2 2
1/2
Tabelle III zeigt die MIC-¥erte von V gegen 67 Stämme von Testorganismen einschließlich 34 Pseudomonas-Stämmen. Die
letzte Kolonne der Tabelle III zeigt die MIC-Verhältnisse
von V zu I an. \
Verbindung V ist so wirksam wie J gegenüber den meisten
Testorganismen (die MIC-Verhältnisse sind 1/2-2), besitzt jedoch unerwartet überlegene Inhibierungswirkungen gegen
PS. aeruginosa A 20653, das gegenüber V eine bescheidene Resistenz aufweist (MIC 25 γ/ml) und gegenüber I sehr
resistent ist (> 100 γ/ml) und ebenso gegenüber Providencia
sp. A 20894, das viermal empfindlicher gegenüber V (6,3 γ/ml) ist als gegenüber I (25 γ/ml).
B e i spie 1
Herstellung von Tetra-N-*benzyloxycarbonyl-4'-desoxyambutyrosin
A (Ha)
Man gibt 1,5 g (8,8 mMol) Benzyloxycarbonylchlorid bei 100C
zu einer gerührten Mischung von 1,0 g (2 mMol) 4f-Desoxyambutyrosin
A (I) und 466 mg (4,4 mMol) Na2CO, in 25 ml
20 %igem wäßrigem Aceton und rührt die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur. Man konzentriert die Reaktionsmischung
zu ungefähr 10 ml und extrahiert das Konzentrat mehrmals mit n-Butanol. Die Extrakte werden zur Trockene eingedampft,
wobei ein öliger Rückstand entsteht, der mit Äther verrieben'wird, wobei man 1,9 g (92 %) weißes Pulver (-1Ia)
erhält.
- 33 - ■
409882/1196
MZI5283 . V,
Beispiel 2
Herstellung von Tetra-N-benzyloxycarbonyl-5"-tosyl-4·,5"-di-desoxyambutyrosin
A (lila) -,
Man gibt 366 mg (1,93 mMol) Tosylchlorid bei -1O°C zu einer
Lösung von 1,9 g (1,83 mMol) II' in 12 ml trockenem Pyridin. Die Mischung wird bei 4°C drei Tage gerührt, mit einer
kleinen Menge Wasser 1 Std. bei 40C behandelt und eingedampft,
um das Pyridin zu entfernen. Man wäscht den Rückstand mit Wasser, trocknet unter vermindertem Druck und
löst dann in einer kleinen Menge einer Mischung von CHCl j
und CH,OH (20:1). Die Lösung wird auf einer Silikagelsäule
(18 χ 70 mm) chromatographiert, wobei man dasselbe Lösungsmittelsystem verwendet. Nachdem man 180 ml des
Eluats aufgefangen hat, tritt das gewünschte Produkt in den nächsten 120 ml aus. Diese Fraktion wird eingedampft,
wobei man 723 mg (33 %) IHa erhält.
Herstellung von 5"-Amino-4·,5"-di-desoxyambutyrosin A
(V, BB-K 137)
Zu einer Lösung von 428 mg (0,36 mMol) III in 13 ml DMF (Dimethylformamid) gibt man eine Lösung von 170 mg
(2,6 mMol) NaN, in 0,7 ml Wasser und erhitzt die Mischung
über Nacht bei 105°C und konzentriert anschließend im Vakuum zur Trockene. Der ölige Rückstand wird gründlich
mit Äther und anschließend mit Wasser gewaschen, wobei man das 5"-Azido-tetra-N-benzyloxycarbonyl-4',5"-di-desoxyambutyrosin
A (IV) erhält, das man in 40 ml 50 tigern wäßrigem Äthanol löst und mit 400 mg 10 %igem Pd-C unter
Normaldruck bei* Raumtemperatur über Nacht hydriert. Die Reaktionsmischung wird filtriert und unter vermindertem
-34 -
0 9 8 8 2/1196
M/15283 3 S
Druck eingedampft. Man löst den Rückstand in einer kleinen Menge Wasser und gibt ihn auf das obere Ende einer Säule
mit Amberlite CG-50 (NH^-Form, 20 ml) ,',die man mit 30 ml
Wasser und nacheinander mit 240 ml 0,1n NH^OH, 600 ml 0,3n NH^OH und anschließend 1,2 Ltr. 0,5n NH^OH berieselt.
Das Eluat wird in 15 ml Fraktionen aufgefangen und durch
den Ninhydrin-Spot-Test (Scheibentest B.subtilis) und
TLC (Silikagelplatte, CHCl^-CHjOH-28 % NH4OH-H2O »
1:4:2:1) markiert. Die Fraktionen 74 "bis 96,, die einen
ninhydrin-positiven und bioaktiven Spot bei Rf 0,17 (durch
TLC) zeigen', werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft und lyophilisiert, wobei man 102 mg
(57 % von 10) an Verbindung V (BB-K 137) erhält. Schmelzpunkt
=164 bis 167°.
^ C=O 1640 cm"1.
^ C=O 1640 cm"1.
Analyse C21H42N5O10*5/2 H2CO3* 1/2 H2O:
C | ,17 * | 6 | H | 11 | N | |
ber..: | 40 | ,13 | 6 | ,89 | 11 | ,96 |
gef.: | 40 | ,85 | ,70 | |||
Herstellung des Monosulfatsalzes der Verbindung V
Man löst 1 Mol Verbindung V in 1 bis 3 Ltr. Wasser. Die Lösung wird filtriert, um ungelöste Feststoffe zu entfernen.
Zu der gekühlten und gerührten Lösung gibt man 1 Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml Wasser zu. Man läßt die Mischung
30 Min. rühren, worauf man zu der Mischung kaltes Äthanol zugibt, bis ein Niederschlag auftritt. Die Feststoffe werden
durch Filtrieren gesammelt und werden als das gewünschte Monosulfatsalz bestimmt.
- 35 -
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M/15283
Beispiel
Beispiel
35 g Verbindung V werden in 125 ml entionisiertem Wasser gelöst.
"Man stellt den pH mit 50 % V/V Schwefelsäure auf 7
bis 7,5 ein.
Man gibt 8 1/2 g Darco G-60 (aktivierte Aktivkohle) zu und die
Mischung wird bei Umgebungstemperatur 0,5 Std. aufgeschlämmt.
Der Kohlenstoff wird durch geeignetes Filtrieren entfernt und mit 40 ml Wasser gewaschen. Das Waschwasser wird zum
FiItrat zugegeben.
Das obige vereinigte Filtrat-Waschwasser wird mit 50 % V/V Schwefelsäure auf pH 2 bis 2,6 eingestellt. Es entweicht
eine große Menge an Kohlendioxyd. Die Lösung wird unter Rühren 20 Min. am Laborvakuum gehalten, um zusätzliches
j Kohlendioxyd zu entfernen.
i Man gibt zu der entgasten Lösung 8 1/2 g Darco G-60. Die
Mischung wird 0,5 Std.-bei Umgebungstemperatur aufgeschlämmt.
j Der Kohlenstoff wird durch geeignetes Filtrieren entfernt und I mit 35 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Das Wasser wird
j zum Filtrat zugegeben.
I Das vereinigte Filtrat-Waschwasser wird mit 50 % V/V Schwe-
!feisäure auf pH 1 bis 1,3 eingestellt. Diese Lösung wird unter I schnellem Rühren im Verlauf von 10 Min. zu 600 bis 800 ml
Methanol (3 bis 4 Vol. Methanol) zugegeben. Man rührt die Mischung 5 Min. bei pH 1 bis 1,3, gibt durch ein 0,147 mm Sieb
(100 mesh screen), rührt 2 Min. und läßt 5 Min. absitzen. Die Hauptmenge der überstehenden Flüssigkeit wird dekantiert. Die
- 36 -
409882/ 1196
Μ/15283 3>
zurückbleibende Aufschlämmung wird in geeigneter Weise
filtriert, mit 200 ml Methanol gewaschen und bei 50°C 24 Std. im Vakuum getrocknet, wobei das gewünschte Disulfatsalz V
erhalten wird. '
- 37 -
409882/1196
Claims (18)
1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel CH2NH2
.H2N-H2C
NH-C-CH-CH2-CH2
O OH
oder eines nicht-toxischen pharmazeutisch' vertraglichen Säureadditionssalzes
davon, dadurch gekennzeichnet, daß man in aufeinanderfolgenden Stufen
A) 4'-Desoxyambutyrosin A mit einem aminoblockierenden
Acylierungsmittel in einem Verhältnis von mindestens 4 Mol Acylierungsmittel pro Mol 4'-Desoxyambutyrosin A
acyliert, um die Verbindung der Formel II
- 38 -
409882/1196
M/15283
CH2NHB
NHB
H-C-CH5-CH., O NH-B
worin B eine aminoblockierende Gruppe darstellt, zu
erhalten;
B) Verbindung II mit einem Sulfonylhalogenid der Formel
W - SOp - Z
worin Z die Gruppen Chlor, Brom oder Jod bedeutet und W (Niedrig)alkyl oder einen Arylrest der Formel
^ k
bedeutet, worin Ir und R , die gleich oder verschieden sind, jeweils H, (Niedrigklkyl, Nitro, (Niedrigklkoxy-Chlor, Brom, Jod, darstellen, in einem Verhältnis von mindestens einem Mol Sulfonylhalogenid pro Mol Verbindung II in Gegenwart einer überschüssigen Menge an organischer Base, acyliert, um die Verbindung der Formel
bedeutet, worin Ir und R , die gleich oder verschieden sind, jeweils H, (Niedrigklkyl, Nitro, (Niedrigklkoxy-Chlor, Brom, Jod, darstellen, in einem Verhältnis von mindestens einem Mol Sulfonylhalogenid pro Mol Verbindung II in Gegenwart einer überschüssigen Menge an organischer Base, acyliert, um die Verbindung der Formel
- 39 -
409882/1196
M/15283
HO-^
,NHB
NH
W-SO0-O-H5C
NHB
H-C-CH-CH2-CH2
' · III
herzustellen, worin B und ¥ die obigen Bedeutungen besitzen;
C) Verbindung III mit einem großen Überschuß eines Alkali· metallazids in einem wäßrigen organischen Lösungsmittel
-behandelt, um die Verbindung der Formel IV
CH-NHb
NHB
Il
NH-C-CH-CH9-CH2
OH NH -B
herzustellen und
- 40 -
409882/ 1 196
D) Verbindung IV zur Herstellung der Verbindung der Formel V hydriert und gegebenenfalls diese Verbindung in
ein nicht*-toxisches, pharmazeutisch verträgliches
Säureadditionssalζ davon überführt.
Säureadditionssalζ davon überführt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Stufe A) mit einem aminoblockierenden Acylierungsmittel
durchgeführt wird, das durch Hydrieren abgespalten werden kann.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Benzyloxycarbonylchlorid oder sein funktionelles
Äquivalent als Acylierungsmittel verwendet.
Äquivalent als Acylierungsmittel verwendet.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Acylierung mit Benzyloxycarbonylchlorid in 20 % wäßrigem Aceton durchführt.
5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Acylierung der·.Stufe B) in Gegenwart
einer überschüssigen Menge an tertiärem Amin in;
einem Temperaturbereich von ungefähr -100C bis ungefähr 150C durchführt.
einem Temperaturbereich von ungefähr -100C bis ungefähr 150C durchführt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Acylierung in Stufe B) in Pyridin in. einem
Temperaturbereich von ungefähr O0C bis ungefähr 10°C
durchführt.
Temperaturbereich von ungefähr O0C bis ungefähr 10°C
durchführt.
7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,
daß die Acylierung in Stufe B mit Tosylchlorid
durchgeführt wird.
- 41 -
409882/1196
M/15283 4^ 242864 Ί
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Verbindung der Formel III mit einem großen* Überschuß an Natrium- oder Kaliumazid in
einem organischen Lösungsmittel, das ungefähr 5 bis 10 %
■ Wasser enthält, bei erhöhten Temperaturen behandelt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung der Formel III mit Natriumazid r±n
Dimethylformamid mit ungefähr 5 bis 10 % Wasser in einem Temperaturbereich von ungefähr 8O0C bis ungefähr 1200C
behandelt.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Verbindung IV in Gegenwart eines Metallkatalysators in einem mit Wasser mischbaren
Lösungsmittel durchführt.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Verbindung IV in Gegenwart von Palladium auf Aktivkohle in 1:1 Wasser/Äthanol hydriert.
12. Verbindung der Formel
NH2
NH-C-CH-CH_-CH
IM 2I2
O OH
- 42 -
409882/119 6
M/15283
oder ein pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz davon.
13. Mono- oder Polysulfatsalz der Verbindung gemäß Anspruch 12,
14. Mono- oder Polyhydrat einer Verbindung gemäß den Ansprüchen
12 oder 13.
15. Verbindung der Formel
NH-B
NH-C-CH-CH0 -CH0 -NH-B
Il I 2 * O OH
! worin B eine aminoblockierende Gruppe bedeutet.
'
16. Verbindung gemäß Anspruch 15, worin B eine aminoblockierende
Gruppe darstellt, die durch Hydrieren abgespalten werden kann.
17. Verbindung gemäß einem der Ansprüche I5 und 16, dadurch
gekennzeichnet, daß B die Gruppe Benzyloxycarbonyl dar-
' stellt.
18. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend eine Verbindung oder ein nicht-toxisches, pharmazeutisch verträgliches Säureadditionssalz
gemäß den Ansprüchen 12 bis 14 und einen
- 43 4 0 9-882/. 1 196
pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel.
- 44 -
409882/1196
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8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
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8126 | Change of the secondary classification | ||
D2 | Grant after examination | ||
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